modele matematyczne w in¿ynierii metabolicznej · krzysztof w. szewczyk wydzia³ in¿ynierii...

Modele matematycznew in¿ynierii metabolicznej

Krzysztof W. Szewczyk

Wydzia³ In¿ynierii Chemicznej i Procesowej, Politechnika Warszawska,

Warszawa

Mathematic’s models in metabolic engineering

S u m m a r y

Metabolic engineering is an integrating methodology of analysis and syn-

thesis for improvement of flux distribution of metabolic pathways. It has two

main aspects: modeling and analysis of metabolic networks to establish strate-

gies for pathway engineering and actual molecular level engineering the path-

way. Mathematical modeling is one of the key methodologies of metabolic engi-

neering. The review presents the currently used metabolic modeling approaches.

Metabolite balancing is the basis for analysis of metabolic flux and cell capabil-

ity to form a targeted product. The use of isotope – labeled substrates with

nuclear magnetic resonance (NMR) and gas chromatography-mass spectrometry

(GCMS) analyses of intracellular and extracellular metabolites enables determi-

nation of metabolic flux distribution. Metabolic Control Analysis (MCA) is a the-

oretical framework for investigation of control mechanism of metabolic net-

work to identify key parameters influencing productivity. Kinetics models pres-

ent a more detailed approach to simulate metabolic net behavior. Linear ap-

proximation of kinetic model, the so called (log)linear kinetics, is useful for

modeling spatiotemporal variations of the net. The including of genetic regula-

tion to metabolic models, the next step in the development of metabolism mod-

els, needs new methods of experimental approaches and mathematic and com-

putational resources.

Metabolic engineering is barely a decade old, but its significance is already

widely recognized in the research-intensive biotechnology community and at-

tracts great interest of industry.

Key words:

metabolic engineering, mathematical models, metabolic flux analysis, meta-

bolic control analysis, kinetics models.

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Krzysztof W. Szewczyk,Wydzia³ In¿ynieriiChemicznej i Procesowej,Politechnika Warszawska,ul. Waryñskiego 1,00-645 Warszawa,[email protected]

2 (69) 7–31 2005

1. Wstêp

Nazwê „in¿ynieria metaboliczna” dla nowej dyscypliny zajmuj¹cej siê „polepsza-

niem aktywnoœci komórek w wyniku zmiany funkcji enzymatycznych, transporto-

wych i regulacyjnych za pomoc¹ techniki rekombinacji DNA” wprowadzi³ J. E. Bailey

w 1991 r. [1]. Cameron i Tong [2] okreœlili tê dziedzinê jako „celow¹ modyfikacjê

metabolizmu za pomoc¹ technik rekombinacji DNA”. Pocz¹tkowo in¿ynieria meta-

boliczna stanowi³a po prostu czêœæ biologii molekularnej, ukierunkowan¹ na prak-

tyczne zastosowania. Wraz z bardzo szybkim rozwojem nowych metod analitycz-

nych oraz technik in¿ynierii genetycznej coraz ³atwiejsze stawa³o siê bezpoœrednie

wprowadzanie zmian do materia³u genetycznego, zaœ istotnego znaczenia nabiera³a

ocena efektów prowadzonych zmian genetycznych. Program in¿ynierii metabolizmu

postulowany przez Baileya zak³ada³ racjonaln¹, tzn. wykorzystuj¹c¹ iloœciowe, ma-

tematyczne metody opisu przemian wewn¹trzkomórkowych, analizê efektów zmian

genetycznych. Schemat tego podejœcia przedstawiono na rysunku 1. W tym ujêciu

in¿ynieria metabolizmu obejmuje trzy zasadnicze etapy [3]:

– analizê szlaków metabolicznych,

– projektowanie zmian genetycznych,

– syntezê tzn. tworzenie zrekombinowanych komórek o zmienionych w³aœciwoœ-

ciach.

Cykl analiza – projektowanie – synteza powtarzany jest kilkukrotnie, zaœ koñ-

cowym efektem jest uzyskanie komórek o po¿¹danych cechach.

Kinetyczna kontrola szlaku metabolicznego zwykle nie jest zwi¹zana z poje-

dyncz¹ reakcj¹, ale raczej jest roz³o¿ona pomiêdzy wiele etapów reakcyjnych (prze-

mian). Powoduje to koniecznoœæ przejœcia od analizy pojedynczych reakcji do anali-

zy sieci przemian biochemicznych [4].

In¿ynieria metaboliczna to interdyscyplinarna dziedzina wykorzystuj¹ca zasady

in¿ynierii reakcji chemicznych, technik obliczeñ numerycznych, biochemii i biologii

molekularnej dla zmiany szlaków metabolicznych w celu lepszego zrozumienia i wy-


8 PRACE PRZEGL¥DOWE

Rys. 1. Schemat postêpowania w in¿ynierii metabolicznej.

korzystania przemian wewn¹trzkomórkowych do transformacji chemicznych i uzy-

skiwania po¿ytecznych produktów [5].

W istocie in¿ynieria metaboliczna polega na zastosowaniu zasad in¿ynierii do

analizy i projektowania szlaków metabolicznych dla osi¹gniêcia okreœlonego celu.

Tym celem mo¿e byæ zwiêkszenie produkcyjnoœci metabolitów lub rozszerzenie

zdolnoœci komórek wykorzystywanych w syntezie substancji lub ich degradacji.

Dziêki wykorzystaniu opisów iloœciowych i modeli matematycznych mo¿liwe by³o

odejœcie od metody prób i b³êdów na rzecz œcis³ego planowania modyfikacji gene-

tycznych. Zagadnienia modyfikacji metabolizmu zosta³y przeniesione z obszaru

umiejêtnoœci (art) w obszar œcis³ych rozwa¿añ naukowych (science) [6].

In¿ynieria metaboliczna stanowi praktyczne po³¹czenie kilku dyscyplin (rys. 2).

Synteza rekombinowanych bia³ek zale¿y od wielu wewn¹trzkomórkowych proce-

sów molekularnych i regulacyjnych obejmuj¹cych: transkrypcjê, translacjê, modyfi-

kacjê potranslacyjn¹, indukcjê i represjê. W dodatku wiele genów jest zwykle odpo-

wiedzialnych za wiele izoprotein, a tylko jedna z nich jest po¿¹danym produktem.

In¿ynieria metaboliczna proponuje radykalnie nowe podejœcie do racjonalnego pro-

jektowania systemów biologicznych. Dziêki wykorzystaniu najnowszych metod ana-

litycznych i matematycznych do rozpatrywania reakcji w ich z³o¿onych zale¿no-

œciach, a nie w izolacji proponuje holistyczne podejœcie do opisu funkcjonowania

komórki i dziêki temu pozwala na dok³adniejsze zrozumienie interakcji pomiêdzy

sieciami metabolicznymi i regulacyjnymi, a w rezultacie staje siê wa¿nym czynni-

kiem w polepszaniu w³aœciwoœci komórek [7].

Podstawowym zagadnieniem in¿ynierii metabolicznej jest analiza zmian meta-

bolizmu wywo³ana zmianami genetycznymi. Dziedzina ta okreœlana jest jako analiza

strumieni metabolicznych (MFA – Metabolic Flux Analysis). Jej zasadnicze zagadnie-

nia to:

– identyfikacja struktury sieci metabolicznej (topologia szlaków metabolicznych),

– kwantyfikacja strumieni metabolicznych,

– identyfikacja struktury sterowania w sieci metabolicznej.

W ujêciu „klasycznym” in¿ynieria metaboliczna to droga od wiedzy o kinetyce enzy-

matycznej, szlakach metabolizmu, strumieniach i strukturze strumieni metabolicznych

do manipulacji genetycznych prowadz¹cych do po¿¹danego efektu. Interesuj¹ca jest

Modele matematyczne w in¿ynierii metabolicznej

BIOTECHNOLOGIA 2 (69) 7-31 2005 9

Rys. 2. Schemat usytuowania in¿ynierii metabolicznej.

propozycja zg³oszona przez Baileya i wsp. [8] „odwróconej in¿ynierii metabolicznej”.

Polega ona na zidentyfikowaniu w pierwszej kolejnoœci po¿¹danego fenotypu, a nastêp-

nie okreœleniu genetycznych i œrodowiskowych warunków odpowiadaj¹cych temu feno-

typowi i wreszcie, traktuj¹c ten fenotyp jako wzór, zmodyfikowaniu metodami in¿ynie-

rii genetycznej genotypu wybranego drobnoustroju. W wyniku rozwoju technik gene-

tycznych i technik modelowania przemian wewn¹trzkomórkowych [9] mo¿liwa sta³a siê

praktyczna realizacja postulatów odwrotnej in¿ynierii metabolicznej [10,11].

Podstawowymi obszarami wykorzystania in¿ynierii metabolicznej s¹ [3,4]:

– wytwarzanie produktów nowych dla komórek jak bia³ka heterologiczne, bio-

polimery,

– tworzenie szlaków do nowych produktów,

– rozszerzenie zakresu substratów asymilowanych przez drobnoustroje, a zw³asz-

cza degradacja ksenobiotyków,

– ulepszanie fizjologii komórek, np. dostosowanie do warunków hiperosmo-

tycznych, zmiana szlaków asymilacji azotu,

– eliminacja wytwarzania produktów ubocznych,

– zwiêkszanie wydajnoœci lub produkcyjnoœci natywnych produktów biosyntezy,

– wytwarzanie zwi¹zków chiralnych, jako produktów poœrednich dla farmacji.

Odrêbnym i niezwykle wa¿nym obszarem zastosowañ metodyki opracowanej

w ramach in¿ynierii metabolicznej s¹ zastosowania medyczne obejmuj¹ce analizê

metabolizmu ca³ych organów i tkanek, identyfikacjê mechanizmów rozwoju chorób,

ich kontroli i sprawdzanie efektywnoœci terapii [12-16]. Metody rozwiniête dla opi-

su metabolizmu drobnoustrojów okaza³y siê równie¿ skuteczne w iloœciowym ujê-

ciu procesów przebiegaj¹cych w komórkach roœlinnych i zwierzêcych [7,17,18]. Ró¿-

norodne zastosowania in¿ynierii metabolicznej zosta³y ostatnio przedstawione

w artyku³ach przegl¹dowych [3,10,19-24].

We wszystkich ujêciach in¿ynierii metabolicznej zasadnicz¹ rolê odgrywaj¹ mo-

dele matematyczne. Umo¿liwiaj¹ one iloœciowe okreœlenie strumieni metabolicz-

nych i analizê wp³ywu wybranych czynników na wielkoœæ tych strumieni. W pracy

przedstawiono zasady tworzenia i wykorzystania modeli matematycznych w in¿y-

nierii metabolicznej oraz przedyskutowano ich ograniczenia, a tak¿e wskazano na

perspektywy rozwoju.

2. Modele metabolizmu

Modele matematyczne systemów biologicznych mog¹ spe³niaæ wiele funkcji [6,25]:

– organizowanie rozproszonych informacji w spójn¹ ca³oœæ,

– analiza, które sk³adniki i relacje w z³o¿onym systemie s¹ istotne,

– odkrywanie nowych strategii,

– weryfikacja konwencjonalnej wiedzy,

– zrozumienie istotnych jakoœciowych zjawisk.



We wspó³czesnych naukach biologicznych, zw³aszcza w biologii molekularnej

i genetyce ujêcia iloœciowe i modele matematyczne odgrywaj¹ coraz wiêksz¹ rolê

[26]. Ogromny postêp w metodach eksperymentalnych prowadzi do nagromadzenia

olbrzymich zbiorów danych doœwiadczalnych. Ich w³aœciwa interpretacja i przetwo-

rzenie wymaga nowych technik i metod matematycznych. Zrozumienie istoty zja-

wisk komórkowych nie jest mo¿liwe bez modeli matematycznych i odpowiednich

narzêdzi analitycznych i obliczeniowych [6]. Zachowania komórek nie mo¿na spro-

wadzaæ wy³¹cznie do czynników genetycznych. Uwzglêdnione musz¹ byæ z³o¿one

zale¿noœci wynikaj¹ce z oddzia³ywañ pomiêdzy genami, bia³kami i metabolitami

[27].

Modele stosowane w in¿ynierii metabolicznej reprezentuj¹ szczególne ujêcie

procesów wewn¹trzkomórkowych. Celem ich konstruowania nie jest pe³na symula-

cja procesów ¿yciowych komórki, tworzenie komórki in silico [28-31], ale jedynie do-

starczenie w³aœciwych narzêdzi matematycznych dla rozwi¹zania praktycznie ukie-

runkowanych zagadnieñ analizy metabolizmu. To ukierunkowanie powoduje, ¿e

modele in¿ynierii metabolicznej w sposób bardzo uproszczony traktuj¹ wiele zja-

wisk komórkowych. Rozbudowane wersje tych modeli stanowi¹ podstawê szybko

rozwijaj¹cej siê dziedziny jak¹ jest biologia systemów [7,32,33].

Z kolei modele stosowane w in¿ynierii metabolicznej, mimo ¿e podobne do mo-

deli stosowanych w klasycznej in¿ynierii reakcji chemicznych wykazuj¹ kilka zasad-

niczych ró¿nic zwi¹zanych ze specyfik¹ przemian wewn¹trzkomórkowych. Najwa¿-

niejsze z nich to [4]:

– reakcje katalizowane s¹ przez enzymy, zaœ zestaw enzymów jest charaktery-

styczny dla danej komórki,

– wystêpuje kontrola (sterowanie) na poziomie genetycznym moduluj¹ca szlaki

metaboliczne,

– wystêpuje hierarchiczna struktura sterowania aktywnoœci¹ z wieloma sprzê¿e-

niami wstecznymi,

– niektóre cz¹steczki maj¹ce istotne znaczenie w systemie sterowania i kontroli

wystêpuj¹ w nieznacznych iloœciach, np. kilka egzemplarzy na komórkê,

– z³o¿one systemy reakcji chemicznych mo¿na analizowaæ wskazuj¹c etap limi-

tuj¹cy, tego typu podejœcie okazuje siê niedostateczne w analizie sieci metabolicz-

nych.

Przemiany wewn¹trzkomórkowe mog¹ byæ rozpatrywane jako sieæ reakcji che-

micznych. Biochemiczna struktura takiej sieci wynika z wiedzy biochemicznej. Dla

podstawowych szlaków metabolicznych znane s¹ wszystkie reakcje chemiczne i ich

mechanizmy [34-37], lecz czêsto brak jest danych kinetycznych. Tworzone na po-

trzeby in¿ynierii metabolicznej modele przemian wewn¹trzkomórkowych nie obej-

muj¹ wszystkich reakcji przebiegaj¹cych w komórkach. W niektórych przypadkach

wynika to z braku danych o niektórych przemianach. Uwzglêdnienie wszystkich re-

akcji powodowa³oby znaczny wzrost liczby równañ opisuj¹cych, a zatem i trudnoœci

matematycznych. Nie jest to jednak konieczne z uwagi na funkcje, które modele



metaboliczne spe³niaj¹. Wiele przemian nie jest dok³adnie reprezentowanych, gdy¿

nie odgrywaj¹ one istotnej roli (zdaniem autorów danego modelu) w przemianach

bêd¹cych g³ównym przedmiotem analizy. Najczêœciej w modelach metabolizmu

uwzglêdniany jest centralny szlak kataboliczny oraz przemiany prowadz¹ce do wy-

ró¿nionych, istotnych w danym modelu, produktów. Przemiany anaboliczne repre-

zentowane s¹ w uproszczeniu. Wykazano, ¿e mo¿na je efektywnie opisaæ jako syn-

tezê biomasy z nie wiêcej ni¿ 12 prekursorów [38]. Pozwala to na znaczne zreduko-

wanie liczby reakcji i produktów poœrednich uwzglêdnianych w modelach metaboli-

zmu. Grupowanie kilku metabolitów w tzw. pule metabolitów i traktowanie ich jako

jednego metabolitu pozwala na zredukowanie liczby rozpatrywanych reakcji i sub-

stancji oraz zredukowanie liczby równañ opisuj¹cych sieæ metaboliczn¹. Odrêbnym

zagadnieniem jest analiza poprawnoœci przyjêtej struktury sieci metabolicznej

[39,40].

3. Modele stechiometryczne

Najprostszymi modelami umo¿liwiaj¹cymi iloœciowy opis przemian metabolicz-

nych s¹ modele stechiometryczne. Modele uwzglêdniaj¹ bilans masy dla sieci reak-

cji metabolicznych. Wiêkszoœæ przemys³owych procesów produkcyjnych przebiega

w warunkach quasi-stacjonarnych. Mo¿na zatem przyj¹æ wystêpowanie warunków

ustalonych dla przemian wewn¹trzkomórkowych. Jest to znacz¹ce uproszczenie

rzeczywistych procesów biochemicznych, gdy¿ pomija wystêpowanie zjawisk oscy-

lacyjnych [41,42]. Pojedyncza komórka mo¿e wykazywaæ fluktuacje wokó³ pewnego

stanu wynikaj¹ce z jej cyklu ¿yciowego. W badaniach doœwiadczalnych uzyskuje siê

uœrednione dane dotycz¹ce pewnej populacji komórek. Metody badania metaboli-

zmu pojedynczych komórek s¹ jeszcze niedostatecznie rozwiniête, aby dostarczyæ

odpowiedniej liczby danych eksperymentalnych. Za³o¿enie o quasi-stacjonarnoœci

procesów metabolicznych mo¿e dobrze opisywaæ dane uœrednione w czasie dla po-

pulacji komórek, ale nie mo¿e byæ stosowane do opisu pojedynczej komórki.

Dla przyk³adu rozwa¿ymy prost¹ sieæ metaboliczn¹ przedstawion¹ na rysunku 3.

Sk³ada siê ona z jednego substratu (S), dwóch produktów (P1, P2 ), trzech metaboli-

tów wewnêtrznych (X1, X2, X3) tworz¹cych wêz³y sieci oraz szeœciu strumieni meta-

bolicznych: trzech zewnêtrznych (v1, v5, v6) i trzech wewnêtrznych (v2, v3, v4). W sta-

nie ustalonym bilanse metabolitów wewnêtrznych maj¹ postaæ:

v – v – v =01 2 3v – v – v =02 4 5 (1)

v + v – v =03 4 6



lub w formie macierzowej:

1 1 1 0 0 0

0 1 0 1 1 0

0 0 1 1 0 1

v

v

v

v

v

v

1

2

3

4

5

6

=

0

0

0

(2)

w której, obok wektora strumieni wystêpuje macierz zawieraj¹ca wspó³czynniki ste-

chiometryczne. Wiersze tej macierzy zawieraj¹ wspó³czynniki stechiometryczne bi-

lansu odpowiedniego metabolitu. Macierz wspó³czynników stechiometrycznych za-

wiera informacje o strukturze sieci (jej topologii). W rozpatrywanym przypadku

mamy trzy równania bilansowe i szeœæ nieznanych strumieni. Przedstawiona na ry-

sunku 3 sieæ jest wyj¹tkowo prosta. Jeœli znane s¹ wartoœci strumieni zewnêtrznych

(v1, v5 i v6) to mo¿liwe jest wyznaczenie wartoœci strumieni wewnêtrznych. Jeœli

za³o¿ymy, ¿e znany jest jedynie strumieñ v1 to uk³ad posiada dwa stopnie swobody

tzn. istnieje dwuwymiarowa przestrzeñ zawieraj¹ca wszystkie dopuszczalne roz-

wi¹zania równania (1). Przyjmuj¹c strumienie v2 i v4 jako zmienne niezale¿ne i pod-

stawiaj¹c dla uproszczenia v1 = 1, mo¿na wyznaczyæ pozosta³e strumienie:

v =1 – v3 2v = v – v5 2 4 (3)

v =1 – v + v6 2 4

Wartoœci strumieni s¹ wielkoœciami nieujemnymi. Mo¿na wyznaczyæ obszar do-

puszczalnych wartoœci strumieni v2 i v4 spe³niaj¹cych równania bilansowe (1). Na ry-



Rys. 3. Schemat prostej sieci metabolicznej.

sunku 4 przedstawiono ograniczenia bilansowe (3) i przestrzeñ rozwi¹zañ spe³nia-

j¹cych równania bilansowe. W naro¿ach trójk¹ta znajduj¹ siê rozwi¹zania ekstre-

malne (jeden ze strumieni przyjmuje wartoœæ najwiêksz¹ zaœ jeden wartoœæ zero).

Mo¿na powiedzieæ, ¿e zaznaczona na rysunku 4 przestrzeñ dopuszczalnych roz-

wi¹zañ reprezentuje fenotyp danej sieci metabolicznej, gdy¿ zawiera wszystkie mo¿-

liwe realizacje przep³ywów w sieci.

Ten prosty przyk³ad modelu stechiometrycznego mo¿na uogólniæ na dowoln¹

sieæ metaboliczn¹. Bilans masowy dla stanu ustalonego mo¿na przedstawiæ w posta-

ci równania macierzowego:

N v =�

0 (4)

gdzie N jest macierz¹ wspó³czynników stechiometrycznych zaœ v jest wektorem

strumieni metabolicznych. Je¿eli model sieci metabolicznej zawiera nR strumieni

i nM metabolitów to macierz N ma nM wierszy i nR kolumn. Ka¿dy wiersz macierzy N

jest zatem zapisem bilansu masy dla pojedynczego wêz³a sieci metabolicznej.

W typowych modelach metabolicznych liczba analizowanych strumieni metabo-

licznych zwykle nie przekracza kilkudziesiêciu. Dla przyk³adu w modelu metaboli-

zmu dro¿d¿y Saccharomyces cerevisiae [43] uwzglêdniono 31 strumieni metabolicz-

nych i 19 metabolitów. Tworzone s¹ tak¿e bardziej rozbudowane modele obej-

muj¹ce do kilkuset strumieni metabolicznych [30,44]. W modelu sieci metabolicznej

dro¿d¿y Saccharomyces cerevisiae wystêpuj¹ 723 metabolity i 1175 strumieni metabo-

licznych [45]. Operowanie tak du¿ymi zestawami danych wymaga specjalistycznego

oprogramowania [46-49].



Rys. 4. Obszar dopuszczalnych rozwi¹zañ dla przyk³adowej sieci metabolicznej.

Liczba strumieni metabolicznych jest wiêksza od liczby metabolitów uwzglêd-

nionych w modelu. Zatem z punktu widzenia matematycznego równanie (4) jest

równaniem algebraicznym niedookreœlonym; zawiera wiêcej niewiadomych ni¿ rów-

nañ. Niektóre strumienie metaboliczne tzw. zewnêtrzne – strumienie asymilowa-

nego substratu wêglowego, strumienie wydzielanych produktów metabolizmu, mo-

g¹ zostaæ zmierzone doœwiadczalnie. W przypadku prostych modeli metabolicznych

zawieraj¹cych niewiele strumieni wewn¹trzkomórkowych mo¿liwe jest zatem wy-

znaczenie ich wartoœci na podstawie pomiarów doœwiadczalnych [50-53]. Stosowa-

nie pomiarów strumieni zewn¹trzkomórkowych metabolitów wraz ze stechiometri¹

wewn¹trzkomórkowych przemian datuje siê od prac Aiby i Matsuoki z 1979 r. [54]

nad wytwarzaniem kwasu cytrynowego. Pierwsze prace nad wykorzystaniem stru-

mieni wewn¹trzkomórkowych do okreœlenia kontroli metabolizmu pochodz¹ z po-

cz¹tku lat dziewiêædziesi¹tych [53,55].

Analiza modelu stechiometrycznego mo¿e dostarczaæ wskazówek o po¿¹danych

zmianach sieci metabolicznej. Przyk³adem mog¹ byæ bakterie E. coli, które s¹ po-

wszechnie u¿ywane w in¿ynierii genetycznej i w technologiach wytwarzania cen-

nych bia³ek. W warunkach wysokiego stê¿enia komórek i du¿ej ekspresji genów od-

powiedzialnych za wytwarzanie bia³ek wystêpuje niekorzystne wytwarzanie kwasu

octowego. Przekierowanie strumieni metabolicznych, prowadz¹ce do graniczenia

wytwarzania octanu, jest jednym z rozwi¹zañ pozwalaj¹cym wyeliminowaæ tê nie-

dogodnoœæ technologiczn¹. Dla przyk³adu utworzenie nowego szlaku od pirogro-

nianiu do acetoiny prowadzi do znacznych zmian rozk³adu strumieni metabolicz-

nych i zmniejszenie wydzielania octanu poni¿ej wartoœci toksycznej dla komórek

[5].

W ogólnym przypadku sieci metabolicznej o nR strumieniach i nM wêz³ach (meta-

bolitach) istnieje przestrzeñ o wymiarze nie wiêkszym ni¿ nR - nM zawieraj¹ca wszyst-

kie rozwi¹zania równania bilansowego (4). Przestrzeñ ta, nazywana przestrzeni¹ ze-

row¹, obrazuje fenotyp danej sieci metabolicznej. Badanie w³aœciwoœci przestrzeni

zerowej danej sieci metabolicznej mo¿e dostarczaæ istotnych informacji o w³aœciwo-

œciach sieci m.in. o maksymalnych „zdolnoœciach” wytwarzania poszczególnych pro-

duktów [56-58].

Rozwi¹zanie równania (4) wymaga wprowadzenia dodatkowych warunków aby

przekszta³ciæ uk³ad niedookreœlony w uk³ad równañ liniowych okreœlony [59]. Liczbê

równañ w modelu stechiometrycznym mo¿na zwiêkszyæ uzupe³niaj¹c bilans maso-

wy o bilans czynników energetycznych tzn. bilans ATP, UTP, NADH, NADPH. Pozwala

to na uzyskanie dodatkowych równañ wi¹¿¹cych strumienie przemian katabolicz-

nych, syntezy biomasy i wytwarzania produktu. Nissen i in. [60] wykorzystali bilanse

metabolitów energetycznych do opisu metabolizmu dro¿d¿y S. cerevisiae i wykazali,

¿e mo¿liwe jest zwiêkszenie wydajnoœci etanolu poprzez redukcjê wytwarzania gli-

cerolu i zwiêkszenie czêœci wêgla dostêpnego do wytwarzania etanolu. Wytwarza-

nie glicerolu jest zwi¹zane z utlenianiem NADH powstaj¹cego w reakcjach syntezy

biomasy. Wytwarzanie etanolu z glukozy jest w sensie bilansu redoks neutralne –



na mol wytwarzanego etanolu powstaje jeden mol NADH (redukowany jest 1 mol

NAD+) i 1 mol NADH jest utleniany. Zatem utlenianie NADH powstaj¹cego podczas

syntezy materia³ów komórkowych musi przebiegaæ w innym szlaku metabolicznym

– temu s³u¿y wytwarzanie glicerolu. Autorom uda³o siê, w wyniku usuniêcia genu

GHD1 koduj¹cego zale¿n¹ od NADPH dehydrogenazê glutaminianow¹ oraz nadeks-

presji genów koduj¹cych syntetazê glutaminy (GLN1) i syntetazê galutaminianow¹

(GLT1) uzyskaæ zmianê szlaku asymilacji azotu. W miejsce syntezy glutaminianu

z amoniaku i �-ketoglutaranu, w której utleniany jest NADPH, aktywowany zosta³

szlak, w którym zu¿ywany jest ATP i NADH. W efekcie uzyskano redukcjê nadmiaru

NADH, zmniejszenie wytwarzania glicerolu o 38% i zwiêkszenie wydajnoœci etanolu

o 10% [60].

Uzupe³nienie bilansu masowego bilansem energetycznym wymaga wprowadze-

nia dodatkowych wspó³czynników stechiometrycznych, ujmuj¹cych z³o¿one proce-

sy generowania i zu¿ywania energii. Efektywnoœæ fosforylacji oksydacyjnej okreœla-

na jest tzw. wspó³czynnikiem P/O tzn. liczb¹ moli ATP wytwarzanym w ³añcuchu od-

dechowym. Zwykle przyjmuje siê wartoœæ tego wspó³czynnika równ¹ 2,5 chocia¿

dane doœwiadczalne wskazuj¹, ¿e wartoœæ ta mo¿e siê zmieniaæ w zale¿noœci od sta-

nu fizjologicznego komórek [3,61]. Z kolei zu¿ycie ATP w procesach syntezy mate-

ria³u komórkowego okreœlane jest wspó³czynnikiem wydajnoœci YX/ATP, którego war-

toœæ zale¿y od sk³adu po¿ywki i warunków wzrostu. Bilans „metabolitów energe-

tycznych” wymaga dok³adnego iloœciowego wyznaczenia wszystkich przemian,

w których s¹ one wytwarzane b¹dŸ zu¿ywane. Zwykle wystêpuje nadmiar wytwarza-

nia NADH w stosunku do potrzeb i musz¹ byæ uwzglêdnione dodatkowe reakcje

w których NADH jest utleniany. Równie¿ „nadmiar” wytwarzanego ATP jest zu¿ywa-

ny w reakcjach z ATPazami [62,63]. Z tych wzglêdów wykorzystanie bilansu czynni-

ków energetycznych ma ograniczone zastosowanie i jest czêœciej spotykane w tzw.

strukturalnych modelach wzrostu [64] ni¿ w modelowaniu procesów metabolicz-

nych.

Innym sposobem uzyskania rozwi¹zania równania (4) jest wprowadzenie dodat-

kowych zale¿noœci wynikaj¹cych z za³o¿enia o optymalnym dzia³aniu sieci metabo-

licznej tzn. przyjêciu, ¿e jest ona optymalna z uwagi na pewn¹ funkcjê celu [65].

Dziêki temu rozwi¹zanie niedookreœlonego uk³adu równañ mo¿e zostaæ potrakto-

wane jako zadanie optymalizacyjne. Je¿eli funkcja celu jest liniow¹ kombinacj¹ stru-

mieni to zagadnienie nale¿y do zakresu optymalizacji liniowej: poszukuje siê takie-

go wektora strumieni v, który spe³nia z jednej strony równanie (4) z drugiej zaœ

spe³nia kryterium optymalnoœci:

c v mini ii

(5)

gdzie wspó³czynniki c oznaczaj¹ wagi poszczególnych strumieni w funkcji celu.

W literaturze przedmiotu przedstawione by³y ró¿ne kryteria optymalnoœci: mak-

symalizacja szybkoœci syntezy biomasy [66-69], maksymalizacja wytwarzania pro-



duktu, minimalizacji wytwarzania ATP dla danej szybkoœci asymilacji substratu [70]

lub maksymalizacja produkcji ATP w mitochondriach [71]. Uzyskiwane wyniki istot-

nie zale¿¹ od zastosowanej funkcji celu. Maksymalizacja wytwarzania biomasy

w wielu przypadkach daje wyniki zgodne z danymi doœwiadczalnymi [68,72,73].

Ibarra i in. [72] wykazali, ¿e E. coli mo¿e ewoluowaæ wed³ug zasady maksymalizacji

biomasy. Jednak¿e w pewnych warunkach zachowanie komórek jest niezgodne z t¹

zasad¹ [65,72,73]. W takich przypadkach mo¿na uzyskaæ zgodnoœæ z danymi do-

œwiadczalnymi, stosuj¹c wielowymiarow¹ funkcjê celu [73]. Okazuje siê tak¿e, ¿e

w niektórych przypadkach, niezale¿nie od przyjêtej funkcji celu mo¿na, korzystaj¹c

z procedury optymalizacyjnej, jednoznacznie wyznaczyæ wartoœci niektórych stru-

mieni wewnêtrznych [74,75].

Analizy optymalizacyjne, wykorzystuj¹ce ró¿ne funkcje celu mog¹ byæ u¿yte do

badania zdolnoœci i ograniczeñ sieci biochemicznej. Dla przyk³adu stabilnoœæ prze-

mian metabolicznych mo¿e byæ badana poprzez sprawdzenie wp³ywu zmian maksy-

malnych strumieni w wybranym szlaku metabolicznym na szybkoœæ wzrostu. W ten

sposób Edwards i Palsson [57] wykazali, ¿e E. coli jest odporna na zmiany aktywno-

œci pojedynczych enzymów lub szlaku metabolicznego. Z kolei van Dien i Lidstrom

[67] wykazali doœwiadczalnie i za pomoc¹ obliczeñ modelowych, ¿e u Methylobacterium

extorquens AM1 wystêpuje kilka nadmiarowych szlaków metabolicznych. Zahamowa-

nie przemian w jednym szlaku nie wp³ywa³o na wzrost drobnoustrojów, gdy¿ pozo-

sta³e szlaki kompensowa³y wprowadzone zmiany.

Beard i in. [76] uzupe³nili bilans masy o bilans energii wprowadzaj¹c do ograni-

czeñ zmiany potencja³u termodynamicznego, a zatem ograniczenia wynikaj¹ce

z II zasady termodynamiki. Zmiana entropii w ka¿dej reakcji jest wielkoœci¹ nie-

ujemn¹ zatem dla wszystkich strumieni obowi¹zuje nierównoœæ:

v 0i i�� (6)

gdzie: ��i jest zmian¹ potencja³u termodynamicznego i-tej reakcji (ró¿nic¹ pomiê-

dzy potencja³em termodynamicznym produktów i substratów reakcji). Wyznaczenie

szybkoœci wzrostu i wartoœci strumieni wewn¹trzkomórkowych sprowadzono do

rozwi¹zania nieliniowego problemu optymalizacyjnego. Wynikowa przestrzeñ roz-

wi¹zañ jest podprzestrzeni¹ przestrzeni zerowej przewidywanej przez tradycyjn¹

analizê bilansu masowego. Z uwagi na nieliniowoœci problemu optymalizacyjnego,

mo¿liwe jest znalezienie optimum lokalnego, które nie musi pokrywaæ siê z global-

nym rozwi¹zaniem optymalnym. Stwierdzono, ¿e po³¹czenie bilansu energii z bilan-

sem masy daje szybkoœæ wzrostu zgodn¹ z doœwiadczeniami, ale obserwowane war-

toœci strumieni ró¿ni¹ siê znacz¹co od danych doœwiadczalnych [76]. Uwzglêdnienie

bilansu energii w modelu metabolizmu rozszerza mo¿liwoœci analizy i pozwala np.

wyjaœniæ, dlaczego pewne geny, które tradycyjna analiza strumieni identyfikowa³a

jako nieznacz¹ce by³y faktycznie istotnymi [65].



4. Analiza strumieni wêgla

Analiza strumieni metabolicznych wykorzystuj¹ca jedynie modele stechiome-

tryczne ma istotne ograniczenie wynikaj¹ce z trudnoœci rozwi¹zania równania bilan-

sowego. Nie udaje siê tak¿e na podstawie modeli stechiometrycznych rozró¿niæ

przemian równoleg³ych, szlaków cyklicznych i dwukierunkowych [25,77]. Wynika to

z braku dostatecznych danych pomiarowych pozwalaj¹cych zmniejszyæ liczbê stopni

swobody modelu stechiometrycznego. Te dodatkowe informacje mo¿na uzyskaæ

dziêki technikom znakowania izotopowego. Zastosowanie znaczników izotopowych,

od po³owy lat dziewiêædziesi¹tych ubieg³ego wieku, pozwoli³o na weryfikacje war-

toœci strumieni uzyskanych z bilansów masowych oraz dostarczy³o dodatkowych da-

nych o strumieniach wewnêtrznych.

Techniki znakowania izotopowego polegaj¹ na wykorzystaniu substratów zna-

kowanych wêglem 13C. Najczêœciej stosuje siê glukozê znakowan¹ izotopem wêgla

w pozycji 1. W stanie ustalonym wêgiel 13C wystêpuje w metabolitach poœrednich

szlaków metabolicznych. Wyznaczaj¹c charakterystykê widmow¹ za pomoc¹ 13C

NMR i spektrometrii masowej mo¿na wyliczyæ wartoœci strumieni metabolicznych

[78-80]. Znakowanie izotopem 15N jest przydatne w analizowaniu szlaków asymila-

cji azotu. Stosowane s¹ tak¿e substraty znakowane izotopami 17O, 18O i 2H [81].

Bilans izotopów mo¿e byæ sporz¹dzony na dwóch poziomach: atomów b¹dŸ

cz¹steczek. W przypadku bilansu na poziomie atomów wêgla, oznacza siê u³amki

wzbogacenia poszczególnych metabolitów i wykorzystuje do obliczania strumieni.

Suma znaczonych wêgli wchodz¹cych do danego wêz³a sieci (metabolitu) jest równa

sumie znaczonych atomów opuszczaj¹cych ten wêze³. Równanie bilansowe mo¿na

zatem zapisaæ w postaci:

F v =0 (7)

gdzie: F jest macierz¹ zawieraj¹c¹ u³amki wzbogacenia poszczególnych metaboli-

tów. Ten typ bilansu jest podobny do bilansu masowego, jedyn¹ ró¿nic¹ jest to, ¿e

strumienie wejœciowe i wyjœciowe s¹ zwi¹zane ze wspó³czynnikami wagi wed³ug

u³amka wzbogacenia izotopów. Uk³ad równañ (7) jest dwuliniowy. Je¿eli znane s¹

szybkoœci wszystkich reakcji to równania staj¹ siê liniowe wzglêdem u³amków

wzbogacenia i istnieje analityczne rozwi¹zanie zagadnienia. Podobnie, je¿eli znane

s¹ u³amki wzbogacenia, uk³ad staje siê liniowy wzglêdem strumieni, jednak¿e brak

jest dowodu na istnienie tylko jednego rozwi¹zania [62]. Stosowana jest procedura

iteracyjna: zak³adane s¹ wartoœci strumieni i obliczane odpowiednie u³amki wzbo-

gacenia. Wartoœci te s¹ porównywane z wartoœciami mierzonymi. Procedurê powta-

rza siê do uzyskania zadowalaj¹cego dopasowania wyników obliczeñ do danych do-

œwiadczalnych [78,82,83].

Obraz jest bardziej skomplikowany w przypadku bilansowania izotopów na po-

ziomie moleku³. Zamiast badaæ u³amek znaczonych atomów wêgla w danym meta-



bolicie, rozpatruje siê u³amek cz¹steczek maj¹cych pewn¹ kombinacjê znaczonych

wêgli. Dla cz¹steczki o trzech atomach wêgla jest 23 kombinacji. Pojedyncza taka

kombinacja nosi nazwê izotopomeru. S³owo to powsta³o z po³¹czenia s³ów izotop

i izomer. Rozk³ad izotopomerów zawiera pe³n¹ informacjê o znakowaniu metaboli-

tu. Na rysunku 5 przedstawiono izotopomery dla cz¹steczki C3 oraz schemat po-

dzia³u znakowanych atomów w przyk³adowej sieci metabolicznej. Je¿eli przez I100oznaczymy u³amek izotopomeru, który w pozycji 1 zawiera atom znaczony zaœ

w pozycjach 2 i 3 atomy nieznaczone to u³amek wzbogacenia w pozycji 1 jest równy:

f =I +I +I +I1 100 110 101 111 (8)

U³amki wzbogacenia pozycyjnego s¹ wyznaczane za pomoc¹ magnetycznego re-

zonansu magnetycznego. Z kolei ze spektrometrii masowej mo¿na wyznaczyæ

u³amki wzbogacenia cz¹steczki w izotop. Je¿eli oznaczymy przez M0 u³amek cz¹ste-

czek danego metabolitu nie zawieraj¹cy atomów znaczonych zaœ przez M1 u³amek

cz¹steczek zawieraj¹cych jeden atom znaczony to wartoœci te mo¿na wyraziæ nastê-

puj¹co za pomoc¹ u³amków odpowiednich izotopomerów:

M =I0 000M =I +I +I1 100 010 001 (9)

... itd

Zupke i Stephanopoulos [84] zaproponowali eleganck¹ metodê sporz¹dzania bi-

lansu izotopowego wykorzystuj¹c¹ tzw. macierze mapuj¹ce tzn. macierze zawie-

raj¹ce informacje o mo¿liwych przejœciach izotopów pomiêdzy substratami i pro-



Rys. 5. Schemat bilansu izotopomerów. Izotopomery cz¹steczki o trzech atomach wêgla. Ciemne

kó³ko oznacza atom znaczony.

duktami reakcji. Schmidt i in. [85,86] rozszerzyli zastosowanie macierzy mapuj¹cej

na bilans izotopomerów. We wszystkich tych metodach podstaw¹ obliczeñ jest mo-

del stechiometryczny metabolizmu. Bilans izotopomerów umo¿liwia wykorzystanie

danych pochodz¹cych z ró¿nych Ÿróde³: spektrometrii masowej i j¹drowego rezo-

nansu magnetycznego (NMR) [87,88]. Z uwagi na z³o¿onoœæ obliczeñ wynikaj¹c¹ ze

wzrostu iloœci zmiennych w porównaniu z analiz¹ wzbogacenia u³amkowego bilans

izotopomerów by³ wykorzystywany z pocz¹tku do analizy jedynie reakcji jednomo-

lekularnych takich jak cykl Krebsa [62]. Rozwój metod matematycznych pozwoli³

rozszerzyæ analizê izotopomerów równie¿ na reakcje dwucz¹steczkowe oraz od-

wracalne [79,80,82,83,89,90].

Analiza oparta na bilansie izotopomerów jest bardziej z³o¿ona ni¿ obliczenia

u³amkowego wzbogacenia [91]. Przyczyn¹ tego jest nieliniowoœæ równañ bilansu izo-

topomerów jako konsekwencja tego, ¿e niektóre metabolity s¹ z³o¿one z atomów

wêgla pochodz¹cych z kilku cz¹steczek. Nawet w przypadku gdy znane s¹ szybkoœci

wszystkich reakcji, uk³ad równañ bilansowych nadal pozostaje nieliniowy. Poniewa¿

liczba równañ w uk³adzie wzrasta w porównaniu z modelem stechiometrycznym,

analityczne rozwi¹zanie rozk³adu strumieni staje siê trudne do uzyskania. Najczê-

œciej przyjmuje siê za³o¿enie o stanie pseudorównowagi, co pozwala uproœciæ model

matematyczny. To przybli¿enie ma zastosowanie, wtedy gdy reakcja przebiega bli-

sko stanu równowagi i niektóre metabolity mog¹ byæ zebrane w pojedyncz¹ pulê

[92]. W ogólnym przypadku stosuje siê metodê iteracyjnego wyznaczania wartoœci

strumieni metabolicznych przedstawion¹ schematycznie na rysunku 6. Dla za³o¿one-

go rozk³adu strumieni wyznacza siê rozk³ad izotopomerów, a nastêpnie oblicza siê



Rys. 6. Schemat postêpowania w analizie izotopowej.

sygna³ NMR odpowiadaj¹cy temu rozk³adowi i porównuje go z sygna³em wyznaczo-

nym doœwiadczalnie. Procedura ma charakter iteracyjny: jest przerywana po uzyska-

niu odpowiedniego dopasowania wyników obliczeñ do danych eksperymentalnych.

Warto podkreœliæ, ¿e podstaw¹ obliczeñ jest przyjêty model metabolizmu.

Mierzony rozk³ad wewn¹trzkomórkowy izotopomerów nigdy nie jest komplet-

ny, gdy¿ tylko niektóre metabolity mog¹ byæ wyizolowane. Ponadto dla danej puli

izotopomerów nie wszystkie frakcje mog¹ byæ mierzalne. Skwantyfikowane zosta³y

pule metabolitów trzyatomowych i czêœciowo czteroatomowych [80]. Postêp w me-

todach badawczych pozwala na zwiêkszanie liczby oznaczanych zwi¹zków i dok³ad-

niejsze œledzenie strumieni wewn¹trzkomórkowych. W badaniach Daunera i in. [93]

mierzono 133 sygna³y NMR oraz 468 sygna³ów spektrometrii masowej, co pozwo-

li³o na pomiar ponad 1000 izotopomerów w pojedynczym eksperymencie.

Mimo ¿e modelowanie wykorzystuj¹ce bilans izotopomerów jest z³o¿one i wyma-

ga czasoch³onnych obliczeñ, ta metoda analizy umo¿liwia przetwarzanie wszystkich

rodzajów danych uzyskanych z doœwiadczeñ i jest obecnie podstawowym narzêdziem

wykorzystywanym do identyfikacji strumieni metabolicznych [77]. Wyniki badañ izo-

topowych reprezentuj¹ wartoœci œrednie dla populacji komórek („uœredniony metabo-

lizm”), a nie metabolizm pojedynczej komórki. Przysz³oœæ analizy sieci metabolicznych

le¿y w rozszerzeniu analizy metabolizmu od uœrednionego czasowo do zale¿nych od

czasu zmian w metabolizmie, które s¹ konsekwencj¹ np. rozmna¿ania komórek.

5. Analiza regulacji metabolicznej

Analiza strumieni metabolicznych ukierunkowana jest na wyznaczenie wartoœci

strumieni metabolitów w komórkach. Nie daje jednak odpowiedzi na istotne pyta-

nie jak zmieniæ wartoœci tych strumieni w po¿¹danym kierunku. Tego typu informa-

cji mo¿e dostarczyæ analiza regulacji metabolicznej (MCA – Metabolic Control Analy-

sis), która zajmuje siê wp³ywem zmian poszczególnych czynników na wielkoœæ stru-

mieni metabolicznych. Podstawowe za³o¿enia teorii MCA zosta³y sformu³owane na

pocz¹tku lat siedemdziesi¹tych ubieg³ego wieku [94]. Pocz¹tkowa metoda MCA by³a

obiektem zainteresowañ jedynie teoretyków zajmuj¹cych siê kinetyk¹ reakcji en-

zymatycznych. Nowe metody badawcze umo¿liwiaj¹ce uzyskiwanie dok³adniej-

szych danych o dynamice metabolizmu umo¿liwi³y praktyczne wykorzystanie tej

metodyki.

Teoria MCA opiera siê na nastêpuj¹cych za³o¿eniach [95,96]:

– istnieje pojedynczy stan ustalony sieci metabolicznej,

– stê¿enia metabolitów i szybkoœci reakcji s¹ funkcj¹ jedynie stê¿enia enzy-

mów,

– analizowany uk³ad jest homogeniczny.

Miar¹ stopnia regulacji danego strumienia metabolicznego s¹ tzw. wspó³czynni-

ki regulacji.



Wspó³czynnik regulacji strumienia (FCC – flow control coefficient):

C =d (lnv )

d (lnE )ij

J i

j

(10)

okreœla zmiany i-tego strumienia przy zmianach aktywnoœci j-tego enzymu.

Wspó³czynnik regulacji stê¿enia (CCC – concentration control coefficient):

C =d (lnX )

d (lnE )ij

X i

j

(11)

okreœla zmiany stê¿enia i-tego metabolity przy zmianach aktywnoœci j-tego enzymu.

Zale¿noœæ pomiêdzy zmianami i-tego strumienia a zamianami aktywnoœci j-tego

enzymu okreœla wspó³czynnik elastycznoœci:

ij

X i

j

=d (lnv )

d (lnX )(12)

Podstawowe twierdzenia teorii MCA stanowi¹ tzw. twierdzenia sumacyjne [95]:

�

�

(lnv )

E )=1i

jj (ln(13)

�

�

(lnX )

E )=0i

jj (ln(14)

Zgodnie z pierwszym twierdzeniem sumacyjnym dla danego strumienia metabo-

licznego suma wszystkich wspó³czynników regulacji strumienia jest sta³a i równa je-

den. Oznacza to, ¿e wartoœæ danego strumienia metabolicznego mo¿e byæ zale¿na

od aktywnoœci wielu enzymów. Wyznaczenie wartoœci wspó³czynników regulacji

strumienia umo¿liwia okreœlenie enzymów, które maj¹ dominuj¹cy wp³yw na war-

toœæ danego strumienia (wysokie wartoœci wspó³czynników regulacji). Drugie twier-

dzenie sumacyjne okreœla wp³yw enzymów na stê¿enie danego metabolitu.

Zwi¹zek pomiêdzy wspó³czynnikami regulacji i wspó³czynnikami elastycznoœci

podaje zale¿noœæ:

C = I + CJ X X (15)

Na podstawie wartoœci wspó³czynników regulacji stê¿enia i wspó³czynników ela-

stycznoœci mo¿na obliczyæ wartoœci wspó³czynników regulacji strumieni. Wartoœci

wspó³czynników regulacji mog¹ byæ obliczane b¹dŸ z wykorzystaniem kinetycznych

modeli metabolizmu omówionych w dalszej czêœci artyku³u, b¹dŸ na podstawie ba-

dañ efektów zaburzeñ aktywnoœci enzymów. Metoda wykorzystuj¹ca równania ki-

netyczne jest efektywna pod warunkiem, ¿e model reprezentuje rzeczywist¹ sieæ

metaboliczn¹. Tworzenie takich modeli jest bardzo trudne z uwagi na k³opoty

z identyfikacj¹ i estymacj¹ wielu parametrów kinetycznych [97]. Bezpoœrednie po-



miary in vivo dostarczaj¹ bardziej wiarygodnych danych. Podstawow¹ technik¹ po-

miarow¹ jest metoda zaburzeñ [98]. Polega ona na pomiarze rozk³adu strumieni me-

tabolicznych w pewnym stanie ustalonym, a nastêpnie na wprowadzeniu zaburzenia

tego stanu w postaci zmiany aktywnoœci enzymów (dodawanie inhibitorów, nadeks-

presja bia³ek, usuwanie genów [99]). Schlosser i in. [100] zastosowali metodê zabu-

rzeñ do analizy fermentacji glukozy przez dro¿d¿e S. cerevisiae i wyznaczenia kon-

troluj¹cych reakcji oraz okreœlenia mo¿liwoœci zwiêkszenia produkcyjnoœci etanolu.

Simpson i in. [101] wykazali przydatnoœæ metody perturbacyjnej w analizie biosynte-

zy lizyny przez Corynebacterium glutamicum. Równie¿ w analizie biosyntezy kwasu

glutaminowego wyznaczenie wartoœci wspó³czynników regulacji umo¿liwi³o zapla-

nowanie odpowiednich modyfikacji genetycznych [97]. Szczególnie u¿yteczna jest

analiza wykorzystuj¹ca grupowe wspó³czynniki regulacji [101] tzn. wspó³czynniki

odnosz¹ce siê nie do pojedynczych strumieni metabolicznych i pojedynczych meta-

bolitów, ale grup strumieni tworz¹cych bloki wokó³ g³ównych wêz³ów. Taka agrega-

cja strumieni, zmniejsza liczbê niezbêdnych danych i u³atwia obliczenia [102].

Analiza regulacji metabolicznej (MCA) opiera siê na dobrze rozwiniêtej teorii, wy-

korzystuje precyzyjnie definiowane wielkoœci iloœciowe i mo¿e byæ u¿ytecznym na-

rzêdziem analizy sieci metabolicznych. Wyniki analiz teoretycznych i badañ doœwiad-

czalnych wskazuj¹, ¿e regulacja danego szlaku metabolicznego jest rozproszona miê-

dzy wiele enzymów. Uzyskanie zatem po¿¹danych zmian w metabolizmie wymaga

zmian aktywnoœci wielu enzymów. To wskazuje na ró¿nice pomiêdzy tradycyjn¹ in¿y-

nieri¹ genetyczn¹ dzia³aj¹c¹ wg zasady „jeden gen – jeden produkt” a in¿ynieri¹ me-

taboliczn¹, która postuluje dzia³anie wg zasady „wiele genów – jeden produkt”.

Wyniki analizy regulacji metabolicznej stanowi¹ wa¿ne uzupe³nienie analizy stru-

mieni metabolicznych. Warto jednak zauwa¿yæ, ¿e z punktu widzenia matematycz-

nego, wspó³czynniki regulacji s¹ jedynie logarytmicznymi wspó³czynnikami czu³oœci

dla okreœlonego stanu ustalonego i nie daj¹ pe³nej charakterystyki dynamicznej me-

tabolizmu [6], a jedynie okreœlaj¹ lokalne w³aœciwoœci uk³adu. Wartoœci wspó³czynni-

ków regulacji silnie zale¿¹ od aktualnego rozk³adu strumieni metabolicznych. Prze-

miana metaboliczna, która nie odgrywa istotnej roli dla jednego stanu fizjologiczne-

go, mo¿e byæ g³ównym etapem w innym stanie [103]. Wspó³czynniki regulacji nie

mog¹ byæ stosowane do przewidywania zmian strumieni w wyniku du¿ych zmian (za-

burzeñ) wartoœci parametrów. Dla tego typu sytuacji bardziej przydatne s¹ kinetycz-

ne modele metabolizmu uwzglêdniaj¹ce nieliniowoœæ przemian metabolicznych.

6. Modele kinetyczne metabolizmu

W odró¿nieniu od modeli stechiometrycznych ujêcia kinetyczne, zwane czêsto

modelami mechanistycznymi [25] próbuj¹ opisaæ bezpoœrednio strukturê regulacji

metabolizmu. Podstawowym za³o¿eniem wiêkszoœci modeli mechanistycznych jest

przyjêcie, ¿e wszystkie metabolity s¹ jednorodnie rozproszone wewn¹trz komórki.



Pozwala to pomin¹æ efekty wynikaj¹ce z wystêpowania wewnêtrznych gradientów

stê¿eñ i zjawisk transportu masy wewn¹trz komórki. W modelach stechiometrycz-

nych wystêpuj¹ jedynie wartoœci strumieni metabolicznych zaœ w modelach kine-

tycznych wartoœci strumieni wyznaczane s¹ na podstawie odpowiednich równañ

opisuj¹cych szybkoœæ przemian enzymatycznych. Równania kinetyczne formu³owa-

ne s¹ na podstawie badañ in vitro, a w przypadku braku danych o kinetyce przyjmo-

wane s¹ pewne formalne równania kinetyczne. W niektórych przypadkach efektyw-

nym rozwi¹zaniem jest wykorzystanie w miejsce klasycznej kinetyki enzymatycznej

równañ kinetyki fraktalnej [104].

W stanie pseudoustalonym kinetyczny model metabolizmu mo¿na przedstawiæ

w postaci uk³adu równañ nieliniowych:

N v(S, X, E, p)= 0�

(16)

gdzie S jest wektorem zewn¹trzkomórkowych substratów, X wektorem metaboli-

tów wewn¹trzkomórkowych, E wektorem aktywnoœci enzymów zaœ p wektorem pa-

rametrów kinetycznych.

Rozwi¹zanie uk³adu (16) wymaga znajomoœci wartoœci du¿ej liczby parametrów

kinetycznych. Wiêkszoœæ niezbêdnych danych jest niedostêpna [25]. Niektóre dane,

np. dotycz¹ce fosfotransferazy uzyskane zosta³y stosunkowo niedawno [105]. Brak

jest tak¿e danych o wszystkich efektorach reakcji enzymatycznych. Wiele publiko-

wanych danych o kinetyce przemian wewn¹trzkomórkowych dotyczy ró¿nych orga-

nizmów i by³o uzyskane za pomoc¹ ró¿nych technik badawczych. Wartoœci parame-

trów kinetycznych publikowane przez ró¿nych autorów mog¹ ró¿niæ siê nawet

o rz¹d wielkoœci. Niemo¿liwe jest zatem uzyskanie, na podstawie danych literaturo-

wych, jednego spójnego zestawu danych kinetycznych dla rozwa¿anego drobno-

ustroju. Wartoœci aktywnoœci enzymów (wektor E) musz¹ byæ wyznaczane na pod-

stawie danych doœwiadczalnych. Najczêœciej przyjmuje siê, ¿e wartoœci te s¹ sta³e.

Pomija siê w ten sposób efekty nieodwracalnej inaktywacji enzymów oraz procesy

degradacji. Brak dostatecznie wiarygodnych danych doœwiadczalnych powoduje, ¿e

idea stworzenia pe³nego modelu kinetycznego procesów metabolicznych (¿ycie in

silico [28,29,31]) napotyka na du¿e trudnoœci. Niemniej jednak, próby wykorzystania

modeli kinetycznych, w ograniczonym zakresie, pozwalaj¹ na uzyskanie interesu-

j¹cych rezultatów. Ciekawym zastosowaniem modeli kinetycznych jest wyznaczenie

optymalnych wartoœci parametrów, np. maksymalizuj¹cych produkcjê okreœlonego

metabolitu [106,107]. Uzyskane dane mog¹ stanowiæ wskazania co do kierunku nie-

zbêdnych zmian genetycznych mikroorganizmu: nadekspresji jednych bia³ek i zaha-

mowania wytwarzania innych.

Równanie (16) opisuje stan ustalony. W przypadku stanu nieustalonego uk³ad

równañ ma postaæ:d

dt=

XN v(S, X, E, p) (17)



W miejsce uk³adu liniowych równañ algebraicznych wykorzystywanych w mode-

lach stechiometrycznych, w modelach dynamicznych pojawia siê uk³ad nieliniowych

równañ ró¿niczkowych. Uk³ad (17) opisuje stany nieustalone sieci metabolicznej,

zatem takie, które mog¹ byæ wywo³ane szybkimi zmianami œrodowiska. Najczêœciej

w badaniach doœwiadczalnych wykorzystuje siê impulsowe b¹dŸ skokowe zmiany

stê¿enia substratu. Metody szybkiego próbkowania [108] rozwiniête w ostatnich la-

tach pozwalaj¹ na pomiary stê¿enia 15 metabolitów z czêstotliwoœci¹ 5 Hz [109].

Szybkie oznaczenia i automatyczne metody pomiarów dostarczaj¹ olbrzymiej liczby

danych, których usystematyzowanie wymaga opracowania odpowiednich modeli

matematycznych oraz algorytmów numerycznych stosowanych do estymacji wartoœ-

ci parametrów modeli. Modele niestacjonarne pozwalaj¹ na symulacje zjawisk, któ-

rych opis innymi metodami nie jest mo¿liwy: stabilnoœæ stanów stacjonarnych, wie-

lokrotne stany ustalone, zjawiska oscylacyjne [110].

Bailey i Hazamanikatis [111,112] zaproponowali uproszenie zagadnienia opisa-

nego równaniem (17). Wprowadzaj¹c nowe zmienne:

z = lnx

xi

i

i,0

(18)

w = lnE

Ei

i

i,0

(19)

oznaczaj¹ce wzglêdne zmiany stê¿enia metabolitów i aktywnoœci enzymów wokó³

pewnego stanu ustalonego reprezentowanego przez wartoœci Xi,0 i Ei,0, mo¿na rów-

nanie (17) przybli¿yæ równaniem liniowym:

d

dt

zz+ w (20)

gdzie macierze �, � s¹ funkcjami macierzy wspó³czynników regulacji. Równanie

(20) nosi nazwê równania liniowo-logarytmicznego. Pozwala ono na opisanie dyna-

miki sieci metabolicznej dla niewielkich zaburzeñ wokó³ stanu równowagi [112-115].

W przypadku du¿ych zaburzeñ strumieni metabolicznych niezbêdne jest stosowa-

nie metod nieliniowej analizy regulacji [116]. Zalet¹ kinetyki logarytmiczno-liniowej

jest wykorzystanie wartoœci wspó³czynników regulacji metabolicznej i elastycznoœci

wyznaczanych na drodze doœwiadczalnej. Dziêki temu omija siê zagadnienie do-

k³adnego wyznaczenia równañ i parametrów kinetycznych poszczególnych reakcji

metabolicznych. Model liniowo-logarytmiczny zosta³ z powodzeniem zastosowany

do analizy mo¿liwoœci zwiêkszenia wydajnoœci lizyny [117].



7. Modele regulacji genetycznej

W przedstawionych modelach aktywnoœæ enzymów przyjmowana by³a za sta³¹.

Uwzglêdniaj¹ one mechanizmy kontroli przemian enzymatycznych wynikaj¹ce ze

zmiany stê¿enia metabolitów i ich oddzia³ywania na szybkoœæ reakcji enzymatycz-

nych. Nie ujmuj¹ zjawisk regulacji genetycznej zwi¹zanych z ekspresj¹ genów

i zmian¹ aktywnoœci enzymów. Zasadnicza ró¿nica pomiêdzy regulacj¹ metabo-

liczn¹ a genetyczn¹ zwi¹zana jest ze znacznie wiêksz¹ sta³¹ czasow¹ regulacji gene-

tycznej. Sta³e czasowe reakcji enzymatycznych wynosz¹ od 10-5 s do kilku sekund,

podczas gdy sta³e czasowe mechanizmów regulacji genetycznej wynosz¹ od 103 do

108 s, s¹ zatem o kilka rzêdów wielkoœci wiêksze [25]. W krótkich przedzia³ach cza-

sowych obserwuje siê jedynie efekty regulacji metabolicznej. Dla d³u¿szych czasów

obserwacji efekty regulacji genetycznej mog¹ odgrywaæ znacz¹c¹ rolê.

Procesy regulacji genetycznej mog¹ byæ w zasadzie opisane podobnie jak prze-

miany metaboliczne, jako zespó³ reakcji. Jednak¿e liczba elementarnych reakcji

z których sk³adaj¹ siê procesy translacji, transkrypcji, aktywacji, represji, inaktywa-

cji i degradacji pojedynczego bia³ka jest na tyle du¿a, ¿e w praktyce, w modelach

matematycznych, konieczne jest stosowanie znacznie uproszczonych opisów.

W najprostszych modelach fenomenologicznych aktywnoœæ enzymów jest przyjmo-

wana za sta³¹ i okreœlana na podstawie pomiarów doœwiadczalnych [118]. Takie mo-

dele oczywiœcie nie wyjaœniaj¹ mechanizmów regulacji aktywnoœci enzymów cho-

cia¿ mog¹ poprawnie odwzorowywaæ dane pomiarowe. W modelach mechanistycz-

nych wprowadza siê proste równania formalne opisuj¹ce zmianê w czasie aktywno-

œci enzymów i zale¿noœæ tej aktywnoœci od stanu procesów metabolicznych. Modele

mechanistyczne pozwalaj¹ na przedstawienie nawet z³o¿onych mechanizmów regu-

lacji. W pracy Tomisty i in. uwzglêdniono na przyk³ad 100 genów [119]. Metodami

mechanistycznymi mo¿na modelowaæ równie¿ z³o¿one, hierarchiczne struktury re-

gulacji [120]. Podstawowa trudnoœæ stosowania modeli mechanistycznych zwi¹zana

jest z koniecznoœci¹ wyznaczenia wartoœci du¿ej liczby nieznanych parametrów

równañ kinetycznych.

Odrêbne podejœcie do zagadnienia prezentuj¹ modele optymalizacyjne. W mo-

delach tych zak³ada siê, ¿e w wyniku procesów ewolucyjnych wykszta³cone zosta³y

mechanizmy maksymalizuj¹ce pewne wielkoœci (kryteria optymalizacji). Zalet¹ me-

tod optymalizacji jest znaczne uproszczenie problemu. W modelach jedynie czêœæ

sieci metabolicznej opisywana jest za pomoc¹ znanych równañ kinetycznych. Pozo-

sta³e przemiany opisywane s¹ za pomoc¹ arbitralnie przyjêtych równañ formalnych,

zaœ niektóre przemiany wrêcz pominiêto jako ma³o istotne. Varner i Ramkrishna

[121] opracowali sformalizowane ujêcie cybernetyczne zagadnienia optymalizacji.

Bazuje ono na za³o¿eniu, ¿e wydzielonym fragmentom sieci metabolicznej mo¿na

przypisaæ pewne kryteria optymalizacyjne, np. maksymalizacja wytwarzania koñco-

wego produktu danego szlaku metabolicznego. Poszczególne podsieci wspó³za-

wodnicz¹ o zasoby wewn¹trzkomórkowe. W modelu cybernetycznym zak³ada siê



zatem pewn¹ dekompozycjê kryteriów optymalizacji. W miejsce jednego, globalne-

go kryterium, wprowadza siê kilka kryteriów dla wybranych podsieci metabolicz-

nych. Mo¿liwe jest zatem tak¿e utworzenie hierarchicznej struktury celów optyma-

lizacji metabolicznej.

Ograniczenia regulacyjne zosta³y po raz pierwszy uwzglêdnione jako operatory

boolowskie [122]. Oddzia³ywanie poszczególnych czynników, np. metabolitów ha-

muj¹cych transkrypcjê genu koduj¹cego odpowiedni enzym opisano jako operacjê

logiczn¹: jeœli dany czynnik wystêpuje szybkoœæ reakcji katalizowanej przez enzym

jest równa zeru, w przeciwnym przypadku przyjmuje wartoœæ niezerow¹. Analogicz-

nie opisano indukcjê genu. Model stechiometryczny uzupe³niony w ten sposób do-

datkowym zestawem warunków zosta³ u¿yty do rozwi¹zania zagadnienia maksyma-

lizacji szybkoœci wzrostu. Covert i in. [123] stwierdzili, ¿e takie ujêcie jest wystar-

czaj¹ce do wyeliminowania znacznej liczby szlaków metabolicznych jako nierealizo-

walnych. Wynika to st¹d, ¿e wiele ekstremalnych szlaków wymaga dwóch lub wiêcej

niespójnych zdarzeñ regulacyjnych jednoczeœnie. Mahadevan i in. [68] opisali regu-

lacje transkrypcyjne i translacyjne w sposób bardziej iloœciowy. Autorzy porównali

dwa ujêcia dynamiki metabolizmu dla opisu zjawiska diauksji (wzrostu dwufazowe-

go): dynamiczn¹ optymalizacjê (nieliniowe programowanie) i statyczn¹ optymaliza-

cjê (liniowe programowanie). Stwierdzono, ¿e dynamiczna optymalizacja mo¿e byæ

u¿yta zarówno z wykorzystaniem chwilowej funkcji celu jak i funkcji celu okreœlonej

dla punktu koñcowego. Analiza wykorzystuj¹ca chwilow¹ funkcjê celu dawa³a wyni-

ki bardziej zbie¿ne z obserwowanymi zachowaniami. Statyczna optymalizacja by³a

efektywna jedynie z wykorzystaniem chwilowej funkcji celu.

Nowym obszarem dla in¿ynierii metabolicznej jest analiza przenoszenia sygna³u

w szlakach metabolicznych i wzajemnego oddzia³ywania pomiêdzy szlakami. Jeden

ligand mo¿e spowodowaæ ekspresjê wielu genów jednoczeœnie ekspresja pojedyn-

czego genu mo¿e oddzia³ywaæ na wiêcej ni¿ jeden ligand. Iloœciowy opis takich zja-

wisk wymaga ujêcia systemowego. Zasadnicze zagadnienia to [4]:

– okreœlenie struktury sieci przenoszenia informacji,

– opracowanie w³aœciwych technik pomiarowych,

– dostêpnoœæ technik pomiaru aktywacji bia³ek.

8. Podsumowanie

Racjonalne projektowanie szlaków metabolicznych rozwinê³o siê w ci¹gu ostat-

niej dekady w funkcjonaln¹ dyscyplinê – in¿ynieriê metaboliczn¹ [124-127]. Zainte-

resowanie t¹ dyscyplin¹ jest pobudzane istniej¹cymi i potencjalnie komercyjnymi

zastosowaniami. Dostêpne narzêdzia biologiczne pozwalaj¹ wzglêdnie ³atwo mani-

pulowaæ struktur¹ sieci metabolicznej. Ten etap w procesie projektowania nie sta-

nowi obecnie czynnika limituj¹cego, jest nim niedostatek narzêdzi matematycznych

[121].



W ostatniej dekadzie in¿ynieria metaboliczna rozwinê³a badania nad integracj¹

i systemow¹ analiz¹ szlaków biosyntezy. Wysz³a w ten sposób poza prost¹ amplifi-

kacjê genów i modulacjê ekspresji genów. Objê³a zagadnienia zwi¹zane z syntez¹

szlaków metabolicznych, okreœlaniem etapów i wêz³ów limituj¹cych, termodyna-

micznymi ograniczeniami metabolizmu oraz rozk³adem i kontrol¹ szlaków metabo-

licznych.

Rozwi¹zanie analitycznych i obliczeniowych problemów stanowi obecnie cen-

tralne zagadnienie rozwoju narzêdzi modelowych dla in¿ynierii metabolicznej.

W stosunku do klasycznych modeli u¿ywanych w in¿ynierii bioprocesowej, modele

matematyczne metabolizmu sk³adaj¹ siê ze znacznie wiêkszej liczby równañ. Wy-

maga to rozwoju i zastosowania nowych, efektywnych algorytmów tworzenia mo-

deli, ich analizy, walidacji oraz rozwi¹zywania równañ modelu. Niezbêdna jest inter-

dyscyplinarna wspó³praca obejmuj¹ca takie dziedziny jak: techniki obliczeñ nume-

rycznych, teoria systemów nieliniowych i dyskretnych, in¿ynieria programowania

i symulacji cyfrowej oraz bioinformatyka.

Spis oznaczeñ

Cij

J – wspó³czynnik regulacji strumienia

C J – macierz wspó³czynników regulacji strumieni

Cij

X – wspó³czynnik regulacji stê¿enia

CX – macierz wspó³czynników regulacji stê¿eñ

E – wektor aktywnoœci enzymów

fi

– u³amek wzbogacenia w pozycji i

F – macierz u³amków wzbogacenia

Innn – u³amek iztopomeru pozycyjnego

Mi

– u³amek wzbogacenia w i atomów znaczonych

nM

– liczba metabolitów w modelu sieci metabolicznej, liczba wêz³ów sieci

nR

– liczba reakcji metabolicznych w modelu sieci metabolicznej, liczba strumieni metabolicznych

N – macierz wspó³czynników stechiometrycznych

p – wektor parametrów kinetycznych

S – wektor substratów

v – wektor strumieni metabolicznych

X – wektor stê¿enia metabolitów wewnêtrznych

wi

– wzglêdne odchylenie aktywnoœci od wartoœci stacjonarnej

zi

– wzglêdne odchylenie stê¿enia metabolitu od wartoœci stacjonarnej

ij

X – wspó³czynnik elastycznoœci

– macierz wspó³czynników elastycznoœci

��i

– zmiana potencja³u termodynamicznego i-tej reakcji

Literatura

1. Bailey J. E., (1991), Science, 252, 1668-1674.

2. Cameron D. C., Tong I.-T., (1993), Appl. Biochem. Biotechnol., 38, 105-140.

3. Nielsen J., (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol., 55, 263-283.

4. Stephanopoulos G., Stafford D. E., (2002), Chem. Eng. Sci., 57, 2595-2602.



5. Yang Y.-T, Bennett G. N., San K.-Y., (1998), Electronic J. Biotechnol., 1, 1-8.

6. Bailey J. E., (1998), Biotechnol. Prog., 14, 8-20.

7. Kell D. B., (2004), Current Opinion in Microbiol., 7, 296-307.

8. Bailey J. E., Sburlati Ai, Hatzimanikatis V., Lee K., Renner W. A., Tsai P. S., (1996), Biotechnol. Bio-

eng., 52, 109-121.

9. Laubenbacher R., Stigler B., (2004), J. Theor. Biol., 229, 523-537.

10. Chotani G., Dodge T., Hsu A., Kumar M., LaDuca R., Trimber D., Weyler W., Sanford K., (2000), Bio-

chim. Biophys. Acta, 1543, 434-455.

11. Gill R., (2003), Current Opinion in Biotechnol., 14, 484-490.

12. Schuster S., (1999), Metabolic Engineering, 1, 232-242.

13. Bowden A. C., (1999), Nature Biotechnol., 17, 641-643.

14. Voit E. O., (2002), Drug Discovery Today, 7, 621-628.

15. Kitano H., (2002), Nature, 420, 206-211.

16. Hegde P. S., White I. R., Debouck C., (2003), Current Opinion in Biotechnol., 14, 647-651.

17. Godia F., Cairó J. J., Gòdia F., Cairó J. J., Gòdia F., Cairó J. J., (2002), Bioprocess and Biosystems Engi-

neering, 24, 289-298.

18. Voit E. O., (2004), Drug Discovery Today: Biosilico, 2, 182-189.

19. Bongaerts J., Krämer M., Müller U., Raeven L., Wubbolts M., (2001), Metabolic Engineering, 3,

289-300.

20. Kleerebezem M., Boels I. C., Groot M. N., Mierau I., Sybesma W., Hugenholtz J., (2002), J. Biotech-

nol., 98, 199-213.

21. Hanson A. D., Shanks J. V., (2002), Metabolic Engineering, 4, 1-2.

22. Verpoorte R., van der Heijden R., ten Hoopen H. J. G., Memelink J., (1999), Biotechnology Letters,

21, 467-479.

23. de Vos W., Hugenholtz J., (2004), TrendsBiotechnol., 22, 72-79.

24. Capell T., Christou P., (2004), Current Opinion in Biotechnol., 15, 148-154.

25. Wiechert W., (2002), J. Biotechnol., 94, 37-63.

26. May R. M., (2004), Science, 303, 790-793.

27. Strohman R. C., (1997), Nature Biotechnol., 15, 194-200.

28. Westerhoff H. V., (2001), Metabolic Engineering, 3, 207-210.

29. Covert M. W., Schilling C. H., Famili I., Edwards J. S., Goryanin I. I., Selkov E., Palsson B. Ø., (2001),

Trends in Biochemical Sciences, 26, 179-186.

30. Price N. D., Papin J. A., Schilling C. H., Palsson B. Ø., (2003), TrendsBiotechnol., 21, 162-169.

31. Palsson B. Ø., (2004), Current Opinion in Biotechnol., 15, 50-51.

32. Stelling J., (2004), Current Opinion in Microbiol., 7, 513-518.

33. Krzystek L., (2004), In¿. Chem. Proc., 25, 1963-1971.

34. Gerhard M., (1998), Biosystems, 47, 1-7.

35. Michal G., (1999), An atlas of biochemical and molecular biology, Wiley, New York.

36. Kanehisha M., (1999), Post-genomic informatics, Oxford University Press, London.

37. Krieger C. J., Zhang P., Mueller L. A., Wang A., Paley S., Arnaud M., Pick J., Rhee S. Z., Karp P. D.,

(2004), Nucleic Acids Res., 32, D438-D442.

38. Neidhardt F., Ingraham J., Schaechter M., (1990), Physiology of the bacterial cell – amolecular approach,

Sinauer Associates.

39. Simpson T., Follstad B., Stephanopoulos G., (1999), J. Biotechnol., 71, 207-223.

40. Papin J. A., Stelling J., Price N. D., Klamt S., Schuster S., Palsson B. Ø., (2004), TrendsBiotechnol., 22,

400-405.

41. Goldbeter A., (1996), Biochemical Oscillations and Cellular Rhytms, Cambridge Univ. Press, Cambridge.

42. Goldbeter A., (2002), Nature, 420, 238-245.

43. Zhang H., Shimizu K., Yao S., (2003), Biochem. Engng. J., 16, 211-220.

44. Reed J. L., Palsson B. Ø., (2003), J. Bacteriol., 185, 2692-2699.

45. Famili I., Forster J., Nielson J., Palsson B. Ø., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 13134-13139.

46. Wittmann C., Heinzle E., (2001), Eur. J. Biochem., 268, 2441-2455.



47. Wittman C., Heinze E., (2001), Biotechnol. Bioeng., 72, 642-647.

48. Heinrich R., Schuster S., (1996), The Regulation of Cellular Systems, Chapman & Hall, London.

49. Wittmann C., Heinzle E., (2001), Biotechnol. Bioeng., 72, 642-647.

50. Varma A., Palsson B. Ø., (1994), Bio/Technology, 12, 994-998.

51. van der Heijden R. T. J. M., Heijnen J. J.,Helling C., Romein B., Luyben K. Ch. A. M., (1994), Biotech-

nol. Bioeng., 43, 3-10.

52. van der Heijden R. T. M., Romein B., Heijnen J. J., Helling C., Luyben K. Ch. A. M., (1994), Biotech-

nol. Bioeng., 43, 11-20.

53. Vallino J. J., Stephanopoulos G., (1993), Biotechnol. Bioeng., 41, 633-646.

54. Aiba S., Matsuoka M., (1979), Biotechnol. Bioeng., 21, 1373-1386.

55. Vallino J. J., Stephanopoulos G., (1994), Biotechnol. Prog., 10, 327-334.

56. Schilling C. H., Edwards J. S., Palsson B. Ø., (1999), Biotechnol. Prog., 15, 288-295.

57. Edwards J. S., Palsson B. Ø., (2000), Biotechnol. Prog., 16, 927-939.

58. Schilling C. H., Palsson B. Ø., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 4193-4198.

59. Bonarius H. P. J., Schmid G., Tramper J., (1997), TrendsBiotechnol., 15, 227-238.

60. Nissen, T. L., Kielland-Brandt M. C., Nielsen J., Villadsen J., (2000), Metabolic Engineering, 2, 69-77.

61. Sauer U., Bailey J. E., (1999), Biotechnol. Bioeng., 66, 750-754.

62. Christensen B., Nielsen J., (2000), Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 66, 209-231.

63. van Gulik W. M., Heijnen J. J., (1995), Biotechnol. Bioeng., 48, 681-698.

64. Szewczyk K. W., (2002), Biotechnologia, 57, 15-32.

65. Segre D., Vitkup D., Church G. M., (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15112-15117.

66. Edwards J. S., Ramakrishna R., Palsson B. Ø., ( 2002), Biotechnol. Bioeng., 77, 27-36.

67. van Dien S. J., Lidstrom M. E., (2002), Biotechnol. Bioeng., 78, 296-312.

68. Mahadevan R. Edwards J. S., Doyle F. J., (2002), Biophys. J., 83, 1331-1340.

69. Edwards J. S., Palsson B. Ø., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5528-5533.

70. Edwards J. S, Palsson B. Ø., (1998), Biotechnol. Bioeng., 58, 162-169.

71. Ramakrishna R., Edwards J. S., McCulloch A., Palsson B. Ø., (2001), Am. J. Physiol., 280, R695-R704.

72. Ibarra R. U., Edwards J. S., Palsson B. Ø., (2002), Nature, 420, 186-189.

73. Burgard A. P., Maranas C. D., (2003), Biotechnol. Bioeng., 82, 670-677.

74. Klamt S., Schuster S., Gilles E. D., (2002), Biotechnol. Bioeng., 77, 734-751.

75. Klamt S., Schuister S., (2002), Mol. Biol. Rep., 29, 243-248.

76. Beard D. A., Liang S. C., Qian H., (2002), Biophys. J., 83, 79-86.

77. Wiechert W., (2001), Metabolic Engineering, 3, 195-206.

78. Marx A., de Graaf A., Wiechert W., Eggeling L., Sahm H., (1996), Biotechnol. Bioeng., 49, 111-129.

79. Möllney M., Wiechert W., Kownatzki D., de Graaf A. A., (1999), Biotechnol. Bioeng., 66, 86-103.

80. Wiechert W., Möllney M., Petersen S., de Graaf A. A., (2001), Metabolic Engineering, 3, 265-283.

81. Kelleher J. K., (2001), Metabolic Engineering, 3, 100-110.

82. Wiechert W., de Graaf A. A., (1997), Biotechnol. Bioeng., 55, 101-107.

83. Wiechert W., Siefke C., de Graaf A. A., Marx A., (1997), Biotechnol. Bioeng., 55, 118-135.

84. Zupke C., Stephanopoulos G., (1994), Biotechnol. Prog., 10, 489-498.

85. Schmidt K., Carlsen M., Nielsen J., Villandsen J., (1997), Biotechnol. Bioeng., 55, 831-840.

86. Schmidt K., Nielsen J., Villandsen J., (1999), J. Biotechnol., 71, 175-189.

87. Park S. M., Klapa M. I., Siskey A. J., Stephanopoulos G., (1999), Biotechnol. Bioeng., 62, 392-401.

88. Klapa M. I., Park S. M., Sinskey A. J., Stephanopoulos G., (1999), Biotechnol. Bioeng., 62, 375-391.

89. Wiechert W., Möllney M., Isermann N., Wurzel M., de Graaf A. A., (1999), Biotechnol. Bioeng., 66,

69-85.

90. Marx A., Eikmanns B. J., Sahm H., de Graaf A. A., Eggeling L., (1999), Metabolic Engineering, 1,

35-48.

91. Schmidt K., Marx A., de Graaf A., Wiechert W., Sahm H., Nielsen J., Villadsen J., (1998), Biotechnol.

Bioeng., 58, 254-257.

92. Marx A., Striegel K., de Graaf A. A., Sahm H., Eggeling L., (1997), Biotechnol. Bioeng., 56, 168-180.

93. Dauner M., Bailey J. E., Sauer U., (2001), Biotechnol. Bioeng., 76, 144-156.



94. Kacser H., Burns J. A., (1973), Symp. Soc. Exp. Biol., 27, 65-104.

95. Visser D., Heijnen J. J., (2002), Metabolic Engineering, 4, 114-123.

96. Kell D. B., Westerhoff H. V., (1986), FEMS Microbiol.Rev., 39, 305-320.

97. Shimizu H., (2002), J. Biosci. Bioeng., 94, 563-573.

98. Fell D. A., (1992), Biochem. J., 286, 313-330.

99. Nielsen J., (1998), Biotechnol. Bioeng., 58, 125-132.

100. Schlosser P. M., Riedy G., Bailey J. E., (1994), Biotechnol. Prog., 10, 141-154.

101. Simpson T. W., Follstad B. D., Stephanopoulus G., (1998), Biotechnol. Bioeng., 58, 149-153.

102. Stephanopoulos G., (2002), A. I. Ch. E. Journal, 48, 920-926.

103. Pissara P., Nielsen J., Bazin M. J, (1996), Biotechnol. Bioeng., 51, 168-176.

104. Savageau M. A., (1998), Biosystems, 47, 9-36.

105. Rohwer J. M., Meadow N. D., Roseman S., Westerhoff H. V., Postma P., (2000), J. Biol. Chem., 275,

34909-34921.

106. Hatzimanikatis V., Floudas C., Bayley J., (1996), Biotechnol. Bioeng., 52, 485-500.

107. Torres N. V., Voit E. O., Gonzales-Alcon C., (1996), Biotechnol. Bioeng., 49, 247-258.

108. Theobald U., Mailinger W., Baltes M., Rizzi M., Reuss M., (1997), Biotechnol. Bioeng., 55, 305-316.

109. Schaefer U., Boos W., Takors R., Weuster-Botz D., (1999), Anal. Biochem., 270, 88-96.

110. Wolf J., Passarge J., Somsen O. J. G., Snoep J. L., Heidrich R., Westerchoff H. V., (2000), Biophys.

J., 78, 1145-1153.

111. Hatzimanikatis V., Flooudas C. A., Bailey J. E., (1996), A. I. Ch. E. Journal, 42, 1277-1292.

112. Hatzimanikatis V., Bailey J. E., (1997), Biotechnol. Bioeng., 54, 91-104.

113. Visser D., Schmid J. W., Mauch, K., Reuss M., Heijnen J. J., (2004), Metabolic Engineering, 6,

378-390.

114. Visser D., Heijnen J. J., (2003), Metabolic Engineering, 5, 164-176.

115. Hatzimanikatis V., Bailey J. E., (1996), J. Theor. Biol., 182, 233-242.

116. Hatzimanikatis V., (1999), Metabolic Engineering, 1, 75-87.

117. Hua Q., Yang C., Shimizu K., (2001), Biochem. Engng. J., 9, 49-57.

118. Kanesha M., Goto S., Kawashinma S., Nakaya T., (2002), Nucleic Acids Res., 30, 42-46.

119. Tomita M., Haskimoto K., Takahashi K., Shimizu T. S., Matsuzaki Y., Miyoshi F., Saito K., Tanida

S., Yugi K., Venter J. C., Hutchison C. A., (1999), Bioinformatics, 15, 72-84.

120. Kremling A., Gilles E. D, (2001), Metabolic Engineering, 3, 138-150.

121. Varner J., Ramkrishna D., (1999), Biotechnol. Prog., 15, 407-425.

122. Covert M. W., Schilling C. H., Palsson B. Ø., (2001), J. Theor. Biol., 213, 73-88.

123. Covert M. W., Palsson B. Ø., (2003), J. Theor. Biol., 221, 309-325.

124. Sahm H., Wandrey C., (1996), Metabolic engineering, Springer, Berlin.

125. Stephanopoulos G. N., Aristidou A. A., Nielsen J., (1998), Metabolic Engineering – Principles and

Methodologies, Academic Press, San Diego.

126. Lee S. Y., Papoutsakis E. T., (1999), Metabolic Engineering, Marcel Dekker, New York.

127. Torres N. V., Voit E. O., (2002), Metabolic engineering: debottlenecking metabolic networks: Pathway

Analysis and Optimization in Metabolic Engineering, Cambridge Univ. Press, Cambridge.



modele matematyczne w in¿ynierii metabolicznej · krzysztof w. szewczyk wydzia³ in¿ynierii...

Documents