mise au point d’une technique de séparation et de...

ACRONIME_Lot 01_V1.0

0Sebastiani

Mise au point d’une technique de séparation et de quantification des composés présents dans une huile essentielle

Version 1.0

Projet d’Etude INSA de ROUEN, 30/06/2015

Institut National des Sciences Appliquées de Rouen

Mise au point d’une technique de séparation et de

quantification des composés présents dans une huile essentielle

Rapport PE huiles essentielles 2015.docx

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Département CFI Institut National des Sciences Appliquées de Rouen

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Lot 01

Mise au point d’une technique de séparation et de quantification

des composés présents dans une huile essentielle

V1.0

http://cfi.insa-rouen.fr/




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Page de Service

Historique des évolutions

Identifiant Date Auteurs Description des

modifications

Chapitres et

paragraphes modifiés

ACRONYME_Lot01_V1.0 30/06/2015

CAZZOLA

Charles

DOUBLET

Charline

Création Tous




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ABREVIATIONS °C

A

CMR

degré Celsius

Ampère

Cancérigène Mutagène Reprotoxique

CPG

EI

GC

Chromatographie en Phase Gazeuse

« Electronic Impact » (Impact électronique)

« Gas Chromatography » (Chromatographie Gazeuse)

FID

HD

HE

ID

LOQ

« Flame Ionization Detector » (Détecteur à Ionisation de flamme)

Hydrodistillation

Huile essentielle

« Internal Diameter » (Diamètre Interne)

« Limit Of Quantification » (Limite de Quantification)

MS

PPAM

Tébu

Tr

UMR

V

« Mass Spectrometry » (Spectrométrie de masse)

Plantes à Parfums Aromatiques et Médicinales

Température d’ébullition

Temps de rétention

Unité Mixte de Recherche

Volt

µg/mL

Microgramme / millilitre




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LISTE DES FIGURES

Figure 1. Illustration des principaux organes végétaux dont sont extraites les huiles essentielles 11

Figure 2. Photographie d’une coupe transversale d’un citron .............................................. 11

Figure 3. Représentation schématique du principe d’hydrodistillation traditionnelle ............ 12

Figure 4. Représentation schématique du principe de la distillation par entrainement à la vapeur d’eau où le matériel végétal est séparé de l’eau, a) à l’aide d’un panier dans la même enceinte, b) dans un réservoir différent. ............................................................................. 13

Figure 5. Représentation schématique des différents modules d’un chromatographe GC/MS ............................................................................................................................. 15

Figure 6. Représentation schématique de l’ionisation par impact électronique .................... 16

Figure 7. Représentation schématique des différents composants d’un détecteur à ionisation de flamme ........................................................................................................................ 17

Figure 8. Synoptique de l’obtention et de l’analyse d’une huile essentielle ........................... 18

Figure 9. Tableau récapitulatif des huiles essentielles testées et de leurs caractéristiques .... 19

Figure 10. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de canelle écorce de Ceylan ........ 21

Figure 11. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de camphrier ............................. 21

Figure 12. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cèdre de l’Atlas ..................... 21

Figure 13. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cèdre de Virginie ................... 21

Figure 14. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cannelle écorce analysée sur colonne capillaire polaire .................................................................................................. 22

Figure 15. Traitement des résultats d’une analyse d’une huile essentielle ............................ 23

Figure 16. Identification d’un composé à l’aide de la base spectrale NIST ............................ 23

Figure 17. Table des composés de la méthode GC/MS ........................................................ 24

Figure 18. Spectre de masse du cinnamaldéhyde ............................................................... 25

Figure 19. Recberche automatique des composés du cinnamaldéhyde ................................ 26

Figure 20. Résultats d’identification des composés du cinnamaldéhyde .............................. 26




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Figure 21. Optimisation de l’identification d’un composé ................................................... 27

Figure 22. Calibration interne............................................................................................ 31

Figure 23. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de clous de girofle ...................... 54

Figure 24. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de coriandre .............................. 54

Figure 25. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cumin ................................... 55

Figure 26. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus citronné bio ........... 55

Figure 27. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus mentholé bio ......... 56

Figure 28. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus radié bio ................ 56

Figure 29. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de genévrier .............................. 56

Figure 30. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de géranium d’Egypte bio .......... 56

Figure 31. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle du gingembre ............................ 57

Figure 32. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de laurier noble bio .................... 57

Figure 33. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de lavande aspic ........................ 57

Figure 34. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de lavandin super ...................... 57

Figure 35. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de menthe poivrée ..................... 58

Figure 36. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de menthe verte ........................ 58

Figure 37. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’origan compact bio ................. 58

Figure 38. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de patchouli .............................. 58

Figure 39. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de romarin à cinéole .................. 59

Figure 40. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de sarriette des montagnes bio .. 59

Figure 41. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’arbre à thé ............................. 59

Figure 42. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de térébenthine ......................... 59

Figure 43. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de thym saturéoïdes bio ............. 60

Figure 44. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’Ylang Ylang complète .............. 60




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SYNTHESE

L’objectif du présent projet d’étude est de mettre au point une séparation des composés

par GC/MS dans des huiles essentielles de référence, d’identifier le maximum de composés

présents, de mettre au point une méthode fiable de quantification par GC/FID, et de faire une

étude bibliographique sur les méthodes de sourcing et de contrôle des origines naturelles

(coriandre, patchouli, genévrier, etc.).

La composition chimique de 26 huiles essentielles (HE) telles que le camphrier, le

gingembre, l’eucalyptus citronné ou encore la coriandre, a été étudiée dans ce travail. Ces huiles

essentielles proviennent de XXXX, site d'aromathérapie et de vente en ligne d'huiles

essentielles pures et naturelles, huiles végétales et hydrolats BIO, ingrédients cosmétiques etc.

L'analyse des 24 huiles essentielles a été effectuée au moyen des techniques de CPG,

soit couplée à la spectrométrie de masse pour l'identification des composés, soit couplée à un

détecteur à ionisation de flamme pour leur quantification. Les performances de deux types de

colonnes capillaires, apolaire et polaire, en terme de séparation des composés, largeur de pic,

et temps d’analyse ont été évaluées. Il est ainsi notamment préférable, à cause de problématique

de co-élution, d’utiliser une colonne apolaire pour l’analyse de composés tels que l’eucalyptol

et le β-phellandrène, et une colonne polaire pour l’analyse de composés tels que l’acétate de

terpényle et l’α-terpinéol, et le menthofurane et la menthone.

En terme d’identification, 73 composés ont été identifiés avec la méthode par GC/MS

(colonne apolaire) sur 80 identifiés par XXX dans les huiles essentielles de référence, 71

composés sur 80 identifiés avec la méthode par GC/FID avec actuellement des soucis pour

l'intégration de certains composés présents à l'état de traces (< 1%).

En terme de quantification, les résultats de proportions de composés obtenus par la

méthode par GC/FID sont cohérents avec les données issues du fournisseur des huiles

essentielles testées. Cependant, certaines proportions de composés sont sous-évaluées ou sur-

évaluées.

Les calibrations internes de 9 composés disponibles à l’INSA ont été réalisées et

validées sur la méthode par GC/FID avec une gamme de calibration de 200 à 600 µg/mL.

L’éthylbenzène a été utilisé en tant qu’étalon interne à une concentration de 400 µg/mL.




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SOMMAIRE

ABREVIATIONS ............................................................................................................. 4

Liste des figures ................................................................................................................ 5

Synthèse ........................................................................................................................... 5

INTRODUCTION ............................................................................................................ 9

I. Les huiles essentielles ............................................................................................... 10

I.1 Généralités sur les huiles essentielles ....................................................................................... 10 I. 1. 1. Définition .................................................................................................................................... 10 I. 1. 2. Le matériel végétal d’origine ...................................................................................................... 10

I.2 Méthodes d’extraction des huiles essentielles ........................................................................... 11 I. 2. 1. Expression à froid ....................................................................................................................... 11 I. 2. 2. Distillation ................................................................................................................................... 12

I.3 Toxicité des huiles essentielles .................................................................................................... 13

II. contrôle analytique des huiles essentielles ................................................................ 15

II.1 Principe de la Chromatographie en Phase Gazeuse .................................................................. 15

II.2 Principe de la spectrométrie de masse ...................................................................................... 15

II.3 Principe du détecteur à ionisation de flamme ........................................................................... 17

III. Partie experimentales au cobra ................................................................................ 17

III.1 Huiles essentielles testées ........................................................................................................ 18

III.2 Analyses des huiles essentielles par GC/MS ............................................................................. 19 III. 2. 1. Analyse avec la colonne apolaire.............................................................................................. 20 III. 2. 2. Analyse avec la colonne polaire ............................................................................................... 22 III. 2. 3. Méthode automatique d’identification sur Saturn Varian ....................................................... 22

III. 2.3.1 Identification et enregistrement des composés ................................................................... 22 III. 2.3.2 Optimisation de la recherche automatique ........................................................................... 25

III. 2. 4. Comparaison des performances des deux colonnes ................................................................ 27

III.3 Analyses des huiles essentielles par GC/FID ............................................................................. 29

III.4 Calibration interne de la méthode par GC/FID ......................................................................... 30 III. 4. 1. Choix de l’étalon interne .......................................................................................................... 31 III. 4. 2. Préparation de la gamme de calibration .................................................................................. 31 III. 4. 3. Résultats de la calibration interne ............................................................................................ 33

Conclusion ....................................................................................................................... 35

Bibliographie ................................................................................................................... 36

ANNEXES ......................................................................................................................... 38




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INTRODUCTION

Les huiles essentielles sont devenues, ces dernières années, une matière d’importance

économique considérable, avec un marché en constante croissance dont les domaines

d’application sont directement liés à la consommation humaine. C’est pourquoi, les huiles

essentielles sont de plus en plus contrôlées afin de vérifier d’une part la présence de certains

composés naturels toxiques, leur origine naturelle ou non, leur source (camphrier, cumin etc.)

et la présence de certains composés actifs (géraniol par exemple).

Les huiles essentielles doivent répondre à des caractéristiques imposées par les lois des

pays producteurs et exportateurs et par les pays importateurs. Ces critères sont définis dans des

normes internationales ISO (International Organisation for Standardization) ou françaises

AFNOR (Association Francaise de Normalisation). Ainsi sont contrôlées les propriétés

organoleptiques et physiques telles que la coloration, l’odeur, la réfraction, la solubilité, le point

éclair mais également les propriétés chimiques telles que les indices d’acides et d’esters. Les

huiles essentielles sont des liquides hydrophobes et concentrés dont la composition est

complexe. La meilleure carte d’identité qualitative et quantitative d’une huile essentielle reste

cependant son profil chromatographique réalisé la plupart du temps en chromatographie en

phase gazeuse.

Dans ce contexte, de nombreuses demandes d’entreprises ou d’universités arrivent au

plateau technique du COBRA à l’INSA de Rouen qui ne peuvent être traitées faute de méthodes

développées. L’objet de ce projet d’étude est de répondre à ce besoin croissant par la mise au

point d’une technique de séparation et de quantification des composés présents dans les huiles

essentielles. Il s’agit donc ici de mettre au point une séparation des composés par GC/MS dans

des huiles essentielles de référence, d’identifier le maximum de produit, de mettre au point une

méthode fiable de quantification par GC/FID, et de faire une étude bibliographique sur les

méthodes de sourcing et de contrôle des origines naturelles (eucalyptus citronné, coriandre,

genévrier, etc.).

Tout d’abord, nous présentons l’étude bibliographique concernant les huiles

essentielles, en particulier leurs compositions physico-chimiques, les principales méthodes

d’extraction et de contrôle analytique des huiles essentielles. Ensuite, l’exposé portera sur la

mise au point de la méthode d’identification par GC/MS et de la méthode d’identification par

GC/FID des composés. Pour finir, la calibration interne de la méthode par GC/FID avec les

composés présents à l’INSA de Rouen sera expliquée.




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I. LES HUILES ESSENTIELLES

I.1 Généralités sur les huiles essentielles

I. 1. 1. Définition

Une huile essentielle ou essence se décrit communément comme un mélange de

composés aromatiques extraits d’une plante. D’un point de vue réglementaire, selon la

pharmacopée européenne, une huile essentielle est « un produit odorant, généralement de

composition complexe, obtenu à partir d’une matière végétale botaniquement définie, soit par

entrainement à la vapeur d’eau, soit par distillation sèche, soit par un procédé mécanique

approprié sans chauffage. L’huile essentielle est le plus souvent séparée de la phase aqueuse

par un procédé physique n’entraînant pas de changement significatif de sa composition ».

Le règne végétal offre une grande diversité permettant d’obtenir, aujourd’hui, 3 000 huiles

essentielles parmi lesquelles environ 300 sont importantes d’un point de vue commercial.

I. 1. 2. Le matériel végétal d’origine

En pratique, les huiles essentielles sont principalement extraites de deux types de plantes

: les hespéridés ou agrumes (citron, orange, bergamote...) et les plantes à parfums

aromatiques et médicinales (PPAM). À priori, toutes les plantes possèdent la faculté de

produire des composés volatils mais seulement à l’état de traces le plus souvent. La capacité à

accumuler l’huile essentielle est cependant la propriété de certaines familles de plantes réparties

au sein de l’ensemble du règne végétal, aussi bien représentées par la classe des gymnospermes

Cupressaceae (bois de cèdre, genièvre) et Pinacea (pin et sapin) que celle des angiospermes ou

plantes à fleurs. Les familles les plus importantes sont les dicotylédones comme l’Apiacea

(anise verte, coriandre), le Genraniaceae (géranium), la Lamiaceae (menthe, lavande), la

Lauraceae (camphre, cannelle), la Myristicaceae (noix), la Myrtaceae (eucalyptus, girofle), la

Rosacea (rose) et les Rutacea (citron, orange, bergamote). Les monocotylédones sont

principalement représentées par les familles Acoracea (jonc), Poacea (vétiver) et Zingiberaceae

(gingembre et cardamome).

Selon l’espèce considérée, l’huile essentielle sécrétée par la plante est stockée dans

divers organes tels que ceux illustrés dans la Figure 1.

Cannelle (écorce) Cèdre de l’Atlas (bois) Coriandre (semences)

Cumin (graines) Géranium d’Egypte (feuilles) Gingembre (racines)




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Pour certaines plantes, l’huile essentielle peut être extraite de plusieurs organes.

Toutefois, si tous les organes d’une même espèce peuvent renfermer une huile essentielle, sa

composition peut admettre des variations importantes selon sa localisation. De plus, il est

important de souligner que le profil chimique d’une huile essentielle est directement relié à la

procédure d’extraction employée.

I.2 Méthodes d’extraction des huiles essentielles

Parmi les méthodes d’extraction disponibles, seuls deux procédés permettent d’obtenir

des huiles essentielles conformes avec la pharmacopée européenne. Il s’agit de l’expression à

froid et de la distillation. Bien qu’elles n’aboutissent pas à des huiles essentielles au sens

réglementaire, l’extraction sans solvant assistée par micro-ondes et l’extraction en fluide

supercritique sont deux méthodes d’extraction dont l’utilisation se généralise.

Les huiles essentielles subissent généralement des modifications de leur composition

chimique lors du processus d’extraction causées par la chaleur ou bien par leurs interactions

avec l’eau. En fait, seules les huiles essentielles issues de l’expression à froid n’ayant pas eu de

contact avec le jus de fruit et protégées de l’oxydation pourraient correspondre à la véritable

huile essentielle de la plante.

I. 2. 1. Expression à froid

Appliquée exclusivement à l’extraction des huiles essentielles d’agrumes, l’expression

à froid consiste à rompre ou dilacérer les parois des sacs oléifères contenus dans le mésocarpe

situé juste sous l’écorce du fruit, l’épicarpe (Figure 2).

L’huile essentielle est également présente dans les cellules du jus de fruit en quantité

beaucoup moins importante et avec une composition qui peut être différente de celle contenue

dans les cellules du mésocarpe. Les huiles essentielles de citrus ont longtemps été extraites

manuellement, la mécanisation et l’industrialisation de la technique d’expression à froid ne

s’étant effectuées qu’au début du XXème siècle afin de diminuer les coûts de production et

d’améliorer les rendements pour faire face à l’augmentation de la demande. Les systèmes

récents comme la Food Machinery Corporation-in-line (FMC) permettent d’extraire le jus de

fruit et l’huile essentielle de citrus de manière quasi-simultanée sans contact des deux.

Le procédé consiste d’abord à amener et fixer le fruit sur une coupe équipée de lames.

Une seconde coupe, équivalente à la première, vient alors se fixer au fruit de manière à

l’enfermer. Au même moment, un couteau circulaire creuse un trou à la base du fruit.

Figure 1. Illustration des principaux organes végétaux dont sont extraites les huiles essentielles

Figure 2. Photographie d’une coupe transversale d’un citron




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L’application d’une pression sur les parois du fruit entraîne l’extraction du jus qui va être

transporté jusqu’au collecteur pendant que l’huile est extraite de la peau et collectée à l’aide

d’un jet d’eau. L’émulsion eau-huile est ensuite séparée par centrifugation.

Cette technique présente l’avantage de pouvoir être couplée avec la production du jus

de fruit qui constitue le produit commercial le plus important. C’est pourquoi l’expression à

froid est la méthode de choix pour extraire les huiles essentielles de citrus, d’autant que la

distillation n’est pas une technique très appropriée. En effet, la distillation produit des huiles

essentielles de moindre qualité principalement due au fait d’une présence importante

d’aldéhydes, composés sensibles à l’oxydation et à la chaleur. Pour les autres végétaux, la

distillation à l’eau (hydrodistillation) ou par entraînement à la vapeur d’eau reste, sans aucun

doute, la méthode la plus fréquente.

I. 2. 2. Distillation

La méthode d’extraction des huiles essentielles la plus simple est l’hydrodistillation

(Figure 3).

Elle consiste à immerger la matière première végétale dans un bain d’eau mis à

ébullition. Les composés volatils contenus dans les cellules diffusent à travers les parois

cellulaires (hydrodiffusion) sous l’action physique qu’exerce le gonflement de la matière

végétale (phénomènes d’absorption d’eau ou osmotique), via la pression interne et l’action

chimique de l’eau.

Une fois diffusée en dehors des cellules, l’huile forme avec l’eau un système liquide-

vapeur. La non-miscibilité des deux liquides confère au mélange la propriété d’avoir une

température d’ébullition inférieure aux températures d’ébullition des deux liquides purs. Cette

caractéristique explique la volatilisation des composés des huiles essentielles à une température

d’environ 100°C. Une fois vaporisés, les composés sont transportés par le flux de vapeur d’eau

refroidi plus loin et condensé dans un essencier ou un vase florentin.

Lors de la décantation, la différence de densité entre l’eau et les composés aromatiques

entraîne la formation d’une phase aqueuse et d’une phase organique : l’huile essentielle.

Cependant, le contact direct des constituants de l’huile essentielle avec l’eau occasionne

des réactions chimiques conduisant à des changements dans la composition finale de l’extrait.

Une attention particulière doit, notamment, être portée sur les huiles essentielles riches en esters

Figure 3. Représentation schématique du principe d’hydrodistillation traditionnelle




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(cas de la lavande et du lavandin) dont l’hydrolyse conduit à la formation d’alcools et d’acides.

Pour éviter ce type de réactions, la matière première peut être séparée de l’eau dans la

même enceinte à l’aide d’une grille, d’un panier ou, préférentiellement, dans un réservoir

différent ; c’est la distillation par entraînement à la vapeur d’eau (Figure 4).

Les conditions opératoires et notamment la durée de distillation ont une influence

considérable sur le rendement et la composition de l’huile essentielle. C’est pourquoi sont

développés, aujourd’hui, des modèles mathématiques qui permettent d’optimiser au mieux ces

conditions afin de produire des huiles essentielles de manière reproductible. Une amélioration

significative de la durée de distillation peut être obtenue par une macération du matériel végétal

dans un bain d’ultrasons préalablement à la distillation, ou bien avec l’utilisation assistée de

micro-ondes.

Sun Kim et Sun Lee ont comparé la composition chimique des huiles essentielles de

lavande officinale (Lavandula officinalis) obtenues par différentes méthodes d’extraction. Ils

ont trouvé que l’acétate de linalyle (35,44 %) et le linalol (18,70 %) sont prédominants dans les

huiles essentielles obtenues par distillation à la vapeur tandis que leurs valeurs étaient

respectivement de 2,63 et 4,04 % dans le cas d’extraction par solvants ; 36,80 et 43,47 % dans

le cas d’extraction par microonde.

D’après ces résultats, on remarque que la composition chimique de l’huile essentielle

de l’espèce Lavandula officinalis cultivée à Constantine est différente de celles obtenues dans

de nombreux travaux sur la même espèce, avec une prédominance des composés

monoterpéniques dans la plupart des cas, mais à des proportions différentes. Cette différence

de composition est due probablement à diverses conditions notamment l’environnement, le

génotype, l’origine géographique, la période de récolte, le lieu de séchage, la température et la

durée de séchage, les parasites et la méthode d’extraction.

I.3 Toxicité des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont des mélanges complexes de molécules, dont on peut

distinguer 2 groupes : les terpènes et les aromatiques.

Les terpènes et leurs dérivés sont formés d’unités isopréniques (unités pentacarbonnées

ramifiées). Pour cette gamme de composés, seules les molécules de poids faible, entre 10 et 20

atomes de carbones, sont présents dans les huiles essentielles. Par conséquent, elles peuvent

plus facilement pénétrer notre peau et ainsi provoquer des allergies et des inflammations.

Figure 4. Représentation schématique du principe de la distillation par entrainement à la vapeur

d’eau où le matériel végétal est séparé de l’eau, a) à l’aide d’un panier dans la même enceinte, b)

dans un réservoir différent.




sur 69

Cependant, ces effets sont provoqués majoritairement par d’autres composés comme les

lactones sesquiterpéniques, l’aldéhyde cinnamique et les phénylpropanoïdes.

Les huiles essentielles contenant certains composés aromatiques, notamment les

phénols et dérivés, comme l’eugénol, le thymol et le carvacrol, sont à utiliser avec précautions.

Ces molécules peuvent provoquer de sévères irritations sur les peaux sensibles ou les

muqueuses. De plus, les cellules du foie peuvent se trouver altérées, lorsque les doses prises

sont élevées et que la durée de la cure est longue.

D’autres familles de composés s’avèrent être également toxiques. Ceux sont les cétones,

les aldéhydes et quelques esters. Les conséquences sur notre santé vont de la

photosensibilisation aux risques d’avortement, dans les cas les plus graves.

Tableaux des propriétés et de toxicités des composés en annexes 1 et 2

L’utilisation des huiles essentielles n’est pas à prendre à la légère. Les effets toxiques

sont très variables d’une huile essentielle à l’autre et dépendent beaucoup de la sensibilité des

consommateurs.

Ainsi, il est nécessaire que les fournisseurs d’huiles essentielles identifient et quantifient

les composés potentiellement toxiques, afin d’informer au mieux les utilisateurs. Pour cela, on

utilise la chromatographie en phase gazeuse associée à un spectromètre de masse ou à un

détecteur à ionisation de flamme.




sur 69

II. CONTROLE ANALYTIQUE DES HUILES ESSENTIELLES

II.1 Principe de la Chromatographie en Phase Gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) permet de séparer des mélanges de

composés volatiles ou susceptibles d’être vaporises par suite d’équilibres entre une phase

gazeuse mobile et une phase stationnaire. Un chromatographe en phase gazeuse est constitué

de trois principales parties.

- L’injecteur : l’échantillon est introduit avec une micro seringue, à travers un septum en

élastomère, dans la chambre de vaporisation. L’injecteur a une double fonction : il porte

l’échantillon à l’état de vapeur, puis il l’amène dans le flux gazeux en tête de colonne.

- La colonne : elle est placée dans une enceinte à température régulée. Elle se présente sous la

forme d’un tube de silice, enroulée sur lui-même et de longueur allant de 1 à plus de 60 m.

Entraînés par un gaz vecteur inerte, les analytes étudiés sont séparés en fonction de leur capacité

d’interaction avec la phase stationnaire.

- Le détecteur : il s’agit du module qui va permettre de détecter voire d’identifier les composés

en sortie de colonne.

II.2 Principe de la spectrométrie de masse

Le chromatographe Saturn GC/MS utilisé crée le spectre de masse grâce à un analyseur

à trappe à ions.

Ce type d’analyseur diffère des analyseurs de transport de faisceau comme les barres

magnétiques, les quadripôles, et les instruments de temps de vol où les ions sont séparés à

travers une séquence de champs magnétiques fixes. Au contraire, la trappe à ions confine les

ions à l’intérieur d’une région dans laquelle ils sont soumis à des champs magnétiques variables

dans le temps.

Figure 5. Représentation schématique des différents modules d’un chromatographe GC/MS




sur 69

L’analyse d’un échantillon avec un analyseur à trappe à ions peut être découpée selon

plusieurs étapes :

Introduction de l’échantillon

En sortie de colonne, les composés sont introduits depuis la ligne de transfert vers

l’analyseur à trappe à ions à travers le couplage direct avec la colonne capillaire.

Ionisation de l’échantillon

Le composé est ionisé par impact électronique (EI) dans le spectromètre de masse par

déstabilisation de sa structure moléculaire, causant l’éjection d’un électron de la molécule. Le

mode d’ionisation est l’impact électronique (EI) (Figure 6).

Fragmentation de l’échantillon

En fonction de la structure initiale du composé et de l’excès déstabilisant l’énergie

interne présente dans cette structure, le composé ionisé (ion moléculaire) se disloque

(fragmentation). Ce procédé forme des fragments d’ions et des fragments neutres.

Stockage des ions

Les ions (moléculaires et les fragments d’ions) produits sont stockés et stabilisés dans

la cavité de la trappe à ions, où ils voyagent selon différentes orbites. Le gaz vecteur d’hélium

est aussi présent dans cette cavité. Il permet de concentrer les ions dans des orbites plus

compactes ce qui produit des pics de masse plus fins lors de leurs analyses. L’hélium est utilisé

car il ne se ionise pas aussi rapidement que les molécules d’analytes. Comme les ions d’hélium

sont les espèces les plus prédominantes dans la trappe, ils ne sont pas stockés et sont éjectés

lors de leur formation.

Analyse des ions Les ions sont analysés par application d’une tension de radio fréquence 1,1 MHz sur

l’électrode annulaire encerclant la cavité de la trappe. Au fur et à mesure que la tension

augmente sur l’anneau de l’électrode, les ions sont éjectés consécutivement de la trappe en

fonction de leur ratio masse-charge (m/z) croissant.

Détecteur

Le détecteur recueille alors ces ions séparés par l’analyseur en fonction de leur rapport

m/z. Puis, un micro-ordinateur va assurer le traitement des données et fournir un spectre de

masse. L’EI est un procédé reproductible qui permet des comparaisons spectrales à l’aide de

bibliothèques de spectres (NIST).

Figure 6. Représentation schématique de l’ionisation par impact électronique




sur 69

II.3 Principe du détecteur à ionisation de flamme

Le Détecteur à Ionisation de Flamme (FID) est le plus courant des détecteurs en CPG

grâce à sa sensibilité. On le considère comme un détecteur non spécifique car il peut déceler

pratiquement tous les composés combustibles, c’est-à-dire, les composés organiques.

(Figure 7).

Principe

Le courant gazeux sortant de la colonne arrive dans une flamme d’hydrogène et d’air (T

= 2100 °C). La plupart des composés organiques sont détruits par combustion et produisent des

ions capables de conduire l’électricité à travers la flamme.

Une différence de potentiel de 100 à 300 V est appliquée entre deux électrodes : une

électrode de polarisation (brûleur) et une électrode collectrice, électrode annulaire disposée au

sommet de la flamme qui collecte le courant ionique très faible (10-12 A). Le signal est

transformé et amplifié en une tension mesurable : il est donc sensible au débit massique de

l’échantillon et non à sa concentration molaire. L’aire du pic reflète donc la masse de composé

élué. Ce détecteur présente également une large gamme de linéarité et détectent des quantités

de substance de l’ordre de 20 à 100 pg.

Comme pour le catharomètre, l’hélium et l’hydrogène peuvent être utilisés comme gaz

vecteur. Il n’est pas sensible aux molécules minérales présentant un potentiel d’ionisation élevé

comme l’eau, CO, CO2, SO2, N2 et les NOx, ce qui présente un avantage lorsque l’on veut

analyser des solutions aqueuses ou des composants de l’atmosphère.

Avantages

Le détecteur à ionisation de flamme présente une sensibilité élevée (≈10-13g de soluté

par ml de gaz vecteur). Cette sensibilité évolue selon les molécules : elle est maximale pour les

molécules possédant des atomes de carbones liés à d’autres atomes de carbone ou : des atomes

d’hydrogène. La sensibilité diminue si le composé possède des groupements fonctionnels tels

que : carbonyles, alcool, halogène et amine. Il présente un domaine étendu de réponse linéaire

(≈ 107). Il est robuste et simple d’utilisation.

Inconvénient

Il détruit l’échantillon lors de sa détection.

III. PARTIE EXPERIMENTALES AU COBRA

Figure 7. Représentation schématique des différents composants d’un détecteur à ionisation de flamme




sur 69

Les huiles essentielles doivent répondre à des caractéristiques imposées par les lois des

pays producteurs et exportateurs et par les pays importateurs. Ces critères sont définis dans des

normes internationales ISO (International Organisation for Standardization) ou françaises

AFNOR (Association Française de Normalisation).

Ainsi sont contrôlées les propriétés organoleptiques et physiques telles que la coloration,

l’odeur, la réfraction, la solubilité, le point éclair mais également les propriétés chimiques telles

que les indices d’acides et d’esters.

La meilleure carte d’identité qualitative et quantitative d’une huile essentielle reste

cependant son profil chromatographique réalisé en chromatographie en phase gazeuse, même

si d’autres techniques alternatives sont utilisées. En effet, malgré les importantes innovations

instrumentales réalisées ces dernières années, la détection de tous les constituants d’une huile

essentielle reste une tâche extrêmement difficile qui nécessite souvent l’emploi de plusieurs

techniques analytiques complémentaires.

La synoptique de l’obtention et de l’analyse d’une huile essentielle est présentée ci-

dessous en Figure 8.

L'identification des constituants volatils des huiles essentielles a été réalisée au sein du

laboratoire COBRA (UMR-6014) au moyen de la CPG couplée à la spectrométrie de masse

(CPG/SM) et la détermination quantitative a été effectuée sur un appareil équipé d'un détecteur

à ionisation de flamme (CPG/FID). La quantification des constituants des huiles essentielles a

ensuite été déterminée par la méthode de calibration interne.

III.1 Huiles essentielles testées

Figure 8. Synoptique de l’obtention et de l’analyse d’une huile essentielle




sur 69

III.2 Analyses des huiles essentielles par GC/MS

Figure 9. Tableau récapitulatif des huiles essentielles testées et de leurs caractéristiques




sur 69

L’identification des composés a été réalisée sur l’appareil de chromatographie en phase

gazeuse Varian 3900 couplé au spectromètre de masse Varian 2100T (ANA 29), en utilisant le

logiciel Saturn Varian (version 6.9.1).

Deux colonnes capillaires, l’une apolaire (ZB5-MS) et l’autre polaire (Stabilwax), ont

été utilisées afin de comparer leurs performances en terme de séparation des composés, largeur

de pic, et temps d’analyse. En effet, des différences notables de performances ont été constatées

par Sebastiani et al. (1983), car sur une phase stationnaire apolaire (de type polyméthylsiloxane)

ont été observes des chevauchements partiels ou complets des pics entre l'octanal et l'α-

phellandrène, le 1,8-cinéole et le limonène, le nérol et le citronellol ; avec les phases polaires

(de type polyéthylèneglycol) une co-élution a été remarquée entre certains alcools

monoterpéniques, esters et hydrocarbures sesquiterpéniques.

III. 2. 1. Analyse avec la colonne apolaire

Dans un premier temps, nous avons utilisé une colonne capillaire apolaire : les composés

sont élués approximativement dans l’ordre de leur point d’ébullition. Les conditions opératoires

furent basées sur les recherches bibliographiques, réalisées au début du projet.

Tableau des méthodes analytiques issues des recherches bibliographiques en annexe 3

Conditions opératoires

- Colonne : Colonne capillaire apolaire

- Modèle : Phenomenex ZEBRON ZB-5MS

- Dimensions : 30 mètres, 0.25 mm (ID), 0.25 µm d’épaisseur de phase stationnaire

- Temps d’analyse : 1 heure

- Débit gaz vecteur : 1 mL/min

- Energie d’ionisation : 70 eV

- Température injecteur : 280°C

- Température du four : 50°C pendant 5 min, puis montée de 5°C/min jusqu’à 300°C (5min)

- Mode Split : 1/20

- Volume injecté : 1 µL

- Scan m/z : 40-600

Préparation des échantillons d’huiles essentielles

Une goutte d’huile essentielle est introduite dans un vial en verre de 20 mL. On ajoute

10 mL d’hexane à l’aide d’une éprouvette graduée. Le vial est ensuite sellé.

Suite au passage des premiers échantillons d’huiles essentielles, nous avons observé la

co-élution de certains pics. Ainsi, nous avons baissé la rampe de température à 3°C/min.

Cependant, aucun changement ne fût observé. La rampe de température a donc été fixée à 5

°C/min. Les chromatogrammes obtenus par GC/MS sur les huiles essentielles de cannelle

écorce de Ceylan, camphrier, cèdre de l’Atlas et cèdre de Virginie sont disponibles ci-dessous.

Les chromatogrammes des 22 autres huiles essentielles sont disponibles en annexe 4.

Chromatogrammes obtenus par GC/MS sur les huiles essentielles en annexe 4




sur 69

Figure 10. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de canelle écorce de Ceylan

Figure 11. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de camphrier

Figure 12. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cèdre de l’Atlas

Figure 13. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cèdre de Virginie




sur 69

III. 2. 2. Analyse avec la colonne polaire

Ensuite, cette identification a de nouveau été effectuée sur une colonne capillaire polaire

RESTEK Stabilwax®-MS (30 mètres, 0.25 mm (ID), 0.25 µm d’épaisseur de phase

stationnaire). Afin de respecter la contrainte de température maximale d’utilisation de cette

colonne, la température finale du four de la méthode a été diminuée à 250°C.

III. 2. 3. Méthode automatique d’identification sur Saturn Varian

Le logiciel Saturn Varian, version 6.9.1, permet de retrouver automatiquement les

composés préalablement identifiés et enregistrés. Ensuite, une optimisation de cette base de

données est nécessaire afin de minimiser les erreurs.

III. 2.3.1 Identification et enregistrement des composés

Pour chaque chromatogramme d’huile essentielle, nous avons cherché à identifier les

pics correspondant aux molécules données par XXXX XXXX.

Le travail a commencé par l’identification des composés de plus grande proportion

puisque plus la proportion d’une molécule est importante, plus la hauteur de son pic est élevée.

Le spectre de masse, associé à la fraction du pic sélectionné, s’affiche et doit être comparé à la

base de données NIST, afin de trouver la molécule correspondant à ce spectre.

Figure 14. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cannelle écorce

analysée sur colonne capillaire polaire




sur 69

Pour des pics de hauteur conséquente (supérieur à 200 Kcount), il est préférable de

placer le curseur en début de celui-ci (cf. ci-dessus). Ceci permet d’avoir une concordance de

spectre de masse ou « Match », plus importante avec celui proposé par NIST.

Liste des molécules

proposées

Information sur le

composé sélectionné

Probabilité associée

à chaque molécule

Zone

chromatogramme

Zone spectre

de masse

Base NIST

Curseur

Figure 15. Traitement des résultats d’une analyse d’une huile essentielle

Figure 16. Identification d’un composé à l’aide de la base spectrale NIST




sur 69

Pour les composés présents en maigre proportion, nous avons raisonné par tâtonnement.

Par conséquent, il a fallu être attentif à la formule de la molécule et à ces divers synonymes.

Dès qu’un composé est déterminé, il est enregistré dans la table des composés de la méthode.

Différents paramètres d’identification ou d’intégration sont disponibles et très utiles lors

de proximité entre les pics ou de ressemblance entre spectres de masse. Pour commencer, nous

avons repositionné précisément le curseur à l’endroit où la recherche NIST a été effectuée. Le

nom de la molécule est ensuite entré dans le cartouche approprié.

1

2

3

Figure 17. Table des composés de la méthode GC/MS




sur 69

Dans l’onglet « Identification », il est possible de modifier l’intervalle de temps dans

lequel peut être identifié la molécule. Par défaut, on choisit « Nearest » comme mode de

recherche dans la liste déroulante.

L’ensemble de ces étapes a été réalisé pour chaque composé contenu dans les huiles

essentielles. Au final, la table comprend 73 molécules différentes pour la colonne apolaire.

Nous avons accompli ce même travail pour la colonne polaire, dont la table contient 71

composés.

Afin que cette analyse soit efficace, différents paramètres doivent être modifiés,

optimisant ainsi l’identification.

III. 2.3.2 Optimisation de la recherche automatique

L’analyse automatique se fait grâce à « Process Data » (Cf. image ci-dessous). Par

conséquent, chaque pic est associé à un composé de notre méthode en fonction du temps de

rétention (ici, le plus proche).

Cartouche

pour le nom

Zone

chromatogramme

Zone spectre

de masse

Figure 18. Spectre de masse du cinnamaldéhyde




sur 69

Cependant, il est probable que deux molécules possèdent un temps de rétention très

proche et donc qu’il y est deux composés pour un seul pic. De plus, certain pic peuvent être

rattaché à un produit par leurs temps de rétention, mais, ils ne concordent pas, pour autant, au

niveau de leurs spectre de masse. Ces imperfections sont visibles en vérifiant une à une les

molécules dans « View Results ».

Figure 19. Recberche automatique des composés du cinnamaldéhyde

Process Data

Ouvrir un

chromatogramme

Sélectionner

une méthode

Réaliser

l’identification

View Result

Retour vers

« Process Data »

Accès aux paramètres permettant de modifier

les données affichées dans la fenêtre et ceux de

la liste des composés (RT, Height, Area…)

Passage à la

molécule suivante

Raccourci vers les

paramètres

d’identification du

composé dans la

méthode

Figure 20. Résultats d’identification des composés du cinnamaldéhyde




sur 69

Dans le cas d’une mauvaise identification, on peut diminuer l’intervalle de recherche de

la molécule en question (onglet « Identification »). De plus, il est possible de mettre le mode de

recherche « Spectrum ». Par conséquent, il faut augmenter le « Match Threshold » à 800 au

minimum, soit 80 % de concordance.

III. 2. 4. Comparaison des performances des deux colonnes

On retrouve des similitudes au sujet de l’identification des composés dans les méthodes

de la colonne apolaire et polaire. Certaines des molécules données par XXXX XXXX n’ont pas

réussis à être déterminés pour les deux colonnes. La liste de ces produits se situe ci-dessous :

Nom du composé Colonne apolaire Colonne polaire

(E)-α-atlantone Non identifié Non identifié

(E)-γ-atlantone Non identifié Non identifié

Acétate de dihydrocarvyle Identifié Non identifié

Germacrène-B Identifié Non identifié

Pogostol Non identifié Non identifié

α-terpinène-7-al Non identifié Non identifié

β-copaène Non identifié Non identifié

γ-terpinène-7-al Non identifié Non identifié

Temps de rétention des composés en annexe 5

Nous avons remarqué plusieurs différences concernant la séparation des composés

d’une huile essentielle. Le tableau suivant regroupe les observations de la colonne apolaire :

Figure 21. Optimisation de l’identification d’un composé




sur 69

Observations Composés concernés

Huiles essentielles concernés

Remarques

Co-élution

Bêta-phellandrene et

Eucalyptol

Camphrier, Eucalyptus mentholé, Gimgembre, Lavandin super, Thym

saturéoïdes

-

Co-élution Menthofurane et

Menthone Menthe poivrée -

Mauvaise séparation

p-Cymène, Limonène et Eucalyptol

Toutes

Leurs temps de rétention sont très proches. Respectivement

11,832 min ; 11,974 min ; 12,125 min

Temps d'analyse plus

court - Ylang-Ylang

Le pic du benzoate de benzyle sort à 31,642 min

Pour la colonne polaire, des améliorations sont visibles notamment pour les co-élutions

précédentes. Cependant, d’autres composés restent compliqués à bien séparer. De plus, de

nouvelles co-élutions font leur apparition comme nous pouvons le voir ci-dessous :

Observations Composés concernés

Huiles essentielles concernés

Remarques

Co-élution

Alpha-terpineol et Acetate de

terpenyle

Laurier Noble, Eucalyptus radié

Les pics sont confondus. On retrouve 2 spectres de masse

différents dans un pic. Possibilité de confondre les composés lors du process de la méthode sur un

spectre.

Co-élution Bêta-

phellandrene et Eucalyptol

Camphrier, Eucalyptus mentholé,

Gimgembre, Lavandin super, Thym saturéoïdes

-

Co-élution Pulégone et

Menthol Menthe poivrée -

Mauvaise identification

Gamma-terpinene et Terpinolene

Camphrier, Tea-Tree

Le terpinolène se situe soit à 10,540 min ou soit à 11,644 min

(comparaison SM base NIST). Problème avec le gamma-terpinene

qui doit être à 10,520.

Meilleure séparation

Limonène, p-Cymène et Eucalyptol

Toutes Le pic de p-cymène sort plus tard

que les 2 autres (11,325 min)

Temps d'analyse plus

long - Ylang-Ylang

À cause du benzoate de benzyle (pic à 40,015 min)

Conclusion




sur 69

On peut déduire qu’il est préférable d’analyser certains composés avec une colonne

apolaire. C’est le cas pour l’acétate de dihydrocarvyle, le germacrène B, l’apha-terpinéol, le

pulégone, le menthol, le γ-terpinène et le terpinolène. Pour d’autres molécules, la situation

s’inverse. Il vaut mieux réaliser une analyse avec une colonne polaire. Les composés concernés

sont le limonène, le p-cymène, l’eucalyptol, le menthofurane et la menthone. En revanche, on

constate qu’une co-élution persiste entre le bêta-phellandrene et l’Eucalyptol.

III.3 Analyses des huiles essentielles par GC/FID

La quantification des composés a été réalisée sur l’appareil de chromatographie en phase

gazeuse Bruker SCION 436 GC (ANA 08) équipé d'un détecteur à ionisation de flamme. Le

logiciel utilisé est Compass CDS.

Les conditions opératoires de la méthode GC/MS ont été transférées pour la méthode

GC/FID ; le débit initial de gaz vecteur à 1 mL/min a été optimisé pour atteindre la valeur finale

de débit à 1,6 mL/min pour minimiser les écarts entre les temps de rétention obtenus sur la

GC/MS et sur la GC/FID et assurer une meilleure correspondance entre les deux méthodes pour

l’identification des composés.

Conditions opératoires

- Colonne : Colonne capillaire

- Modèle : Phenomenex ZEBRON ZB-5MS

- Dimensions : 30 mètres, 0.25 mm (ID), 0.25 µm d’épaisseur de phase stationnaire

- Gaz vecteur : Hélium : 1,6 ml/min

- Température de l’injecteur : 280 °C

- Température de détecteur : 280 °C

- Programmation du four 50°C pendant 5 min, montée 5°C/min de 50 à 300°C (5 minutes)

- Mode Split : 1/20

- Range : 12

Préparation des échantillons d’huiles essentielles pour l’identification des composés en

GC/FID

On utilise le même protocole que celui en GC/MS. Une goutte d’huile essentielle est

insérée dans un vial de 20 mL à laquelle on ajoute 10 mL d’hexane.

Résultats de comparaison avec XXXX-XXXX

Les résultats de proportion de chaque composé dans les différentes huiles essentielles

sont très souvent cohérents avec les fourchettes de proportions annoncées par XXXX-XXXX.

Cependant, certaines proportions de composés ne concordent pas et sont souvent sur-évaluées

voire sous-évaluées par rapport à leur proportion réelle dans l’huile essentielle.

Tableaux de comparaisons des résultats GC/FID et XXXX-XXXX en annexe 6

On procède alors une calibration interne de la méthode GC/FID avec les composés

disponibles en stock à l’INSA de Rouen :

- Cinnamaldéhyde 99% ACROS Organics (lot A0245045)

- Géraniol 99% ACROS Organics (lot A0235119)




sur 69

- Citronellal 93% ACROS Organics (lot A0250745)

- Citronellol 95% ACROS Organics (lot A0246017)

- P-cymène 99% ACROS Organics (lot A0300974)

- Menthol ACROS Chemica (lot 76306/1)

- Eugénol Janssen Chimica (lot 33930/2)

- Limonène 97% ACROS Organics (lot A009871301)

- Linalol 99% ACROS Organics

III.4 Calibration interne de la méthode par GC/FID

Cette méthode consiste à introduire une quantité précise d’un étalon interne (substance

non présente dans le mélange à doser et dont les grandeurs de rétention sont différentes de la

substance à analyser) dans chaque solution contenant la substance à doser (échantillon et

étalon).

Ce mélange se traduit par deux pics sur le tracé chromatographique : le pic de surface

SA correspondant à la substance à doser A et le pic SEI correspondant à l’étalon interne.

Si la concentration de la solution à doser est CA et celle de l’étalon interne est CEI, la quantité

de chacun des composés dans le volume V de solution injecté est respectivement :

QA = CA × V

QEI = CEI × V

Il y a proportionnalité entre l’aire du pic et les quantités injectées selon :

SA=KA × QA =KA × CA× V

SEI = KEI × QEI = KEI × CEI × V

KA et KEI sont des constantes de proportionnalité.

En faisant le rapport de ces deux relations, on obtient :

𝑆𝐴

𝑠𝐸𝐼=

𝐾𝐴 × 𝑄𝐴

𝐾𝐸𝐼 × 𝑄𝐸𝐼=

𝐾𝐴 × 𝑄𝐴 × V

𝐾𝐸𝐼 × 𝑄 𝐸𝐼 × V

En posant 𝐾 = 𝐾𝐴

𝐾𝐸𝐼, on peut en déduire CA :

𝐶𝐴 =1

𝐾× 𝐶𝐸𝐼 ×

𝑆𝐴

𝑠𝐸𝐼

Pour déterminer la valeur de K, on effectue un étalonnage en ajoutant une quantité

constante et précise de l’étalon interne dans chacun des étalons de concentrations croissantes,

la concentration de l’étalon interne restant constante dans tous les échantillons. Chacun des

mélanges est injecté et la mesure du rapport des surfaces SA/SEI est directement proportionnelle

au rapport CA/CEI avec une pente égale à K.




sur 69

La même concentration connue d’étalon interne est ensuite ajoutée à la solution à doser

de concentration inconnue CAx. Après analyse chromatographique, la mesure des surfaces des

deux pics donne le rapport SAx/SEI qui à partir de la courbe d’étalonnage ou de l’expression de

CA = f(SA/SEI) permet de déduire la concentration de la solution inconnue.

III. 4. 1. Choix de l’étalon interne

Le choix de l’étalon interne doit respecter les critères suivants :

- Un comportement chromatographique très semblable à celui du composé à doser : ses

grandeurs de rétention doivent être très proches mais bien distinctes

- Il ne doit pas interférer avec les autres substances éventuellement présentes

Plusieurs possibilités d’étalons internes ont ainsi été choisies en fonction de leur absence

dans les huiles et de leurs températures d’ébullition, pour sortir à des temps de rétention non

interférents :

- Toluène (Téb : 110 °C)

- Octane (Téb : 125 °C)

- Éthylbenzène (Téb : 136 °C)

- m-xylène (Téb : 139,1 °C)

- o-xylène (Téb : 144, 43 °C)

Après analyse des chromatogrammes avec la méthode GC/FID, les temps de rétention

suivants ont été obtenus :

- Toluène (Tr : 4,6 min)

- o-xylène (Tr : 8,5 min)

- Éthylbenzène (Tr : 6,76 min)

- Octane (Tr : 5,48 min)

- m-xylène (Tr : 7,96 min)

L’éthylbenzène est donc choisi car son temps de rétention est suffisamment éloigné du

premier composé dans les huiles essentielles (Tr α-pinène : 8,546 min) et de celui de l’hexane

(Tr hexane : 4,85 min).

III. 4. 2. Préparation de la gamme de calibration

Figure 22. Calibration interne




sur 69

Préparation d’une solution mère d’éthylbenzène (étalon interne) à 1000 μg/mL

Préparation d’une solution mère à 1000 μg/mL d’éthylbenzène en pesant directement

0,2 g d’étalon interne dans une fiole jaugée de 200 mL. On ajoute ensuite le solvant de dilution

d’hexane en complétant au trait de jauge.

Préparation de la gamme de linéarité pour la gamme de calibration interne d’un composé

Préparation d’une solution mère à 1000 μg/mL du composé (ex : limonène) en pesant

directement 0,1 g du composé dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute ensuite le solvant de

dilution d’hexane en complétant au trait de jauge. On prépare à partir de cette solution mère

une gamme de linéarité de 200 à 600 μg/mL dans des fioles jaugées de 10 mL avec des pipettes

graduées de 1 mL, 2 mL, 5 mL. L’éthylbenzène (étalon interne) est également mis avec le

composé à doser dans cette fiole de 10 mL en concentration de 400 µg/mL à l’aide d’une pipette

graduée de 20 mL.

Concentration (µg/mL) 200 300 400 500 600

Vcomposé (mL) 2 3 4 5 6

Véthylbenzène (mL) 4 4 4 4 4

Vhexane (mL) 4 3 2 1 0

Vtotal fiole (mL) 10 10 10 10 10

Préparation de la gamme de linéarité pour la gamme de calibration interne de plusieurs

composés

Préparation d’une solution mère à 5000 μg/mL de plusieurs composés (ex : limonène)

en pesant directement 0,1 g de chaque composé dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute

ensuite le solvant de dilution d’hexane en complétant au trait de jauge. On prépare à partir de

cette solution mère à 5000 µg/mL une gamme de linéarité de 200 à 600 μg/mL dans des fioles

jaugées de 50 mL avec des pipettes graduées de 1 mL, 2 mL, 5 mL. L’éthylbenzène (étalon

interne) est également mis avec le composé à doser dans cette fiole de 50 mL en concentration

de 400 µg/mL à l’aide d’une pipette graduée de 20 mL.

Concentration (µg/mL) 200 300 400 500 600

Vcomposé1 (mL) 2 3 4 5 6



Véthylbenzène (mL) 20 20 20 20 20

Vhexane (mL) 24 21 18 15 12

Vtotal fiole (mL) 50 50 50 50 50

Cas du (E)-cinnamaldéhyde

Cette molécule n’est pas soluble dans l’hexane contrairement aux autres. Ainsi, nous

avons dû trouver un nouveau solvant. Notre choix s’est porté sur l’acétate d’éthyle.

Pour réaliser notre gamme d’étalonnage, nous avons donc utilisé notre premier

protocole, utilisant des fioles jaugées de 10 mL. La fiole d’éthylbenzène qui a servie pour cet

étalonnage, a également été complété avec de l’acétate d’éthyle.




sur 69

III. 4. 3. Résultats de la calibration interne

La calibration interne a ensuite été réalisée grâce au logiciel Compass CDS, pilotant le

chromatographe GC/FID. Des calculs complémentaires ont été effectués sur Excel avec les

masses de composés et les concentrations exactes en éthylbenzène pour calculer les rapport des

surfaces SA/SEI et rapport CA/CEI et obtenir la droite de calibration.

Tableaux de calculs des calibrations internes en annexe 7




sur 69

Les huiles essentielles de Géranium Egypte et de Camphrier ont été analysées afin de

tester la calibration.

Protocole de préparation des échantillons et résultats en annexe 8

Conclusion La calibration interne du linalol, géraniol, cinnamaldéhyde, citronellal, p-cymène,

eugénol, menthol, limonène et citronellol est validée puisque l’on obtient une droite

d’étalonnage du type y = a.x + b avec un coefficient de corrélation R2 supérieur à 0,99. On peut

observer que les composés répondent différemment à l’analyse GC/FID : certains composés

comme le cinnamaldéhyde et le citronellal répondent moins bien à l’analyse, d’autres composés

sont plus sensibles à l’analyse comme le p-cymène et expliquent les sur-évaluations de ses

proportions obtenues précédemment dans les huiles essentielles telles que l’eucalyptus

mentholé bio, tea tree ou encore origan compact bio.




sur 69

CONCLUSION

Les analyses effectuées en GC/MS ont permis d’identifier un grand nombre de

composés pour les deux colonnes sur lesquelles nous avons travaillé. Au final, 73 composés,

sur les 80 d’XXXX-XXXX, sont répertoriés pour la colonne apolaire. Ils sont au nombre de 71

pour la colonne polaire. Par conséquent, chaque méthode dispose d’une base de données

importante. Ainsi, l’identification de molécules à l’état de trace, non-fournis par XXXX-

XXXX, est possible pour les huiles essentielles à notre disposition.

De plus, grâce à l’optimisation de ces méthodes, les composés trouvés concordent avec

leur molécule de référence à plus de 80 %.

Plusieurs co-élutions ont été observées sur chaque colonne. Cependant, un même

problème subsiste pour les deux colonnes. Il s’agit de la co-élution de l’Eucalyptol (ou 1,8-

cinéol) et du β-phellandrene.

La méthode crée en GC/FID, sur la colonne apolaire, peut associer 71 composés, sur les

73 trouvées en GC/MS, aux pics des huiles essentielles analysées. Les deux molécules qui n’ont

pas été déterminées sont le trans-carvéol et le 10-épi-γ-eudesmol (ou γ-eudesmol).

Cependant, les composés, dont la proportion est inférieure à 0,6 %, ne sont pas

identifiés. On remarque surtout ceci pour l’huile essentielle de la menthe verte.

Une calibration interne a été réalisée pour 9 composés disponibles à l’INSA de Rouen.

Ces derniers sont le (E)-cinnamaldéhyde, le citronellal, le citronellal, l’eugénol, le géraniol, le

limonène, le linalol, le menthol et le p-cymène. Le coefficient de corrélation pour chacune des

droites d’étalonnage est supérieur à 0,99.

La méthode d’analyse GC/FID devra être validée selon plusieurs paramètres

(spécificité, linéarité, justesse, LOQ, répétabilité…). D’autres calibrations internes pourront

être faites afin de vérifier la teneur d’autres composés potentiellement toxiques ou allergènes.

L’analyse d’autres huiles essentielles, notamment des agrumes (orange, citron, …)

contenant d’autres composés, non étudiés ici, permettra d’enrichir la base de données

d’identification et d’élargir les prestations possibles du laboratoire pour répondre aux besoins

d’universités ou d’entreprises.




sur 69

BIBLIOGRAPHIE

Les huiles essentielles

Publications scientifiques

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les huiles essentielles par couplage de la chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse en

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Sun Kim N., Sun Lee D.S. Comparison of different extraction methods for the analysis of fragrances

from Lavandula species by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography,

2002, 982, 31-47.

Svoboda K. P., Hampson J.B. Bioactivity of essential oils of selected temperate aromatic plants:

antibacterial, antioxidant, anti inflammatory and other related pharmacological activities. Plant

Biology Department, SAC Auchincruive, Ayr ,Scotland, UK., KA6 5HW. 1999

Cassel, E.; Vargas, R. M. F.; Martinez, N.; Lorenzo, D.; Dellacassa, E. Industrial Crops & Products

2009, 29, 171-176.

Cerpa, M. G.; Mato, R. B.; Jose Cocero, M. AIChE Journal 2008, 54.

Kowalski, R.; Wawrzykowski, J. Flavour and Fragrance Journal 2009, 24, 69-74.

Chemat, F.; Lucchesi, M. E.; Smadja, J.; Favretto, L.; Colnaghi, G.; Visinoni, F. Analytica Chimica

Acta 2006, 555, 157–160.

Sahraoui, N.; Vian, M. A.; Bornard, I.; Boutekedjiret, C.; Chemat, F. Journal of Chromatography A

2008, 1210, 229–233.

Sites internets

http://sante-medecine.commentcamarche.net/faq/7597-huiles-essentielles-proprietes-et-

precautions-d-usage

http://www.vitakaruna.com/pages/proprietes-therapeutiques-et-toxicite-des-huiles-

essentielles.html

http://sante-medecine.commentcamarche.net/faq/7597-huiles-essentielles-proprietes-et-precautions-d-usage

http://sante-medecine.commentcamarche.net/faq/7597-huiles-essentielles-proprietes-et-precautions-d-usage

http://www.vitakaruna.com/pages/proprietes-therapeutiques-et-toxicite-des-huiles-essentielles.html

http://www.vitakaruna.com/pages/proprietes-therapeutiques-et-toxicite-des-huiles-essentielles.html




sur 69

Contrôle analytique des huiles essentielles

Documents universitaires

ROUESSAC, Françis et ROUESSAC Annick. (2009). Analyse Chimique : Méthodes et

techniques instrumentales. Paris : DUNOD, 510 p.

Cours de Chromatographie en Phase Gazeuse (L2). (2009). Université Paris Val de Marne,

Faculté de Sciences et Technologie.

Documents techniques

VARIAN, INC. Operation Manual - Saturn® 2000 GC/MS MS Workstation Version 6.

(2003-2009).

Partie expérimentale au COBRA

Publications scientifiques

SEBASTIANI E., DUGO G. et COTRONEO A., 1983 : Sulla genuinita delle essenze agrumarie. Nota

V. Valutazione di alcuni tipi di fasi stazionarie per I'analisi della frazione volatile degli olii essenziali

di limone mediante gascromatografia ad alta risoluzione. Essenz. Deriv. Agrum., Vol. 53, pp : 501-

514.

Nabil Bousbia. Extraction des huiles essentielles riches en anti-oxydants à partir de produits naturels et

de co-produits agroalimentaires. Other. Université d’Avignon; Institut national agronomique (El

Harrach, Algérie), 2011. French. <NNT : 2011AVIG0243>. <tel-00915117>

Sites internet




sur 69

ANNEXES

ANNEXE 1 : PROPRIETES DES COMPOSÉS PRÉSENTS DANS LES HUILES

ESSENTIELLES

ANNEXE 2 : TOXICITE DES COMPOSÉS MANIPULÉS

ANNEXE 3 : METHODES ANALYTIQUES ISSUES DES RECHERCHES

BIBLIOGRAPHIQUES

ANNEXE 4 : CHROMATOGRAMMES OBTENUS EN GC/MS SUR LES HUILES

ESSENTIELLES

ANNEXE 5 : TEMPS DE RETENTION DES COMPOSES

ANNEXE 6 : COMPRAISONS DES RESULTATS GC/FID COBRA ET XXXX ZONE

ANNEXE 7 : TABLEAUX DE CALCULS DES CALIBRATIONS INTERNES




sur 69

ANNEXE 8 : PROTOCOLE DE PRÉPARATION DES ECHANTILLONS ET

RÉSULTATS POUR LE GÉRANIUM EGYPTE ET LE CAMPHRIER




sur 69

ANNEXE 1 : PROPRIETES DES COMPOSÉS PRÉSENTS DANS LES HUILES ESSENTIELLES

Nom M (g/mol) Température

d’ébullition (°C) Formule

(E)-Cinnamaldéhyde 132,16 250-252

(E) β-ocimène 136,23 65-66 (E et Z) à 13

mmHg

(E)-α-atlantone 218,34 321,1

(E)-γ-atlantone 218,34

(Z)-Dihydrocarvone 152,24 221,5 (ou 87-88 à 6

mmHg)

1,8-cinéole 154,25 176-177

10-épi-γ-eudesmol 222,37 -

Acétate d’eugényle 206,24 281-286

Acétate de cinnamyle

176,21 265

Acétate de cis-carvyle

194,27 300,2




sur 69

Acétate de dihydrocarvyle

196,29 232-234

Acétate de géranyle 196,29 138 (à 25 mmHg)

Acétate de lavandulyle

196,29

Acétate de linalyle 196,26 220

Acétate de menthyle

198,3 228-229

Acétate de terpényle

196,29 220

Ar-curcumène 202,34 276,3

Benzoate de benzyle

212,24 323-324

Bornéol 154,25 213

Camphène 136,24 159

Camphre 152,23 204

Carvacrol 150,22 236,85




sur 69

Carvone 150,22 227-230 (L) et 96-98

(D)

Cédrol 222,37 273

Cis-hydrate de sabinène

154,25 -

Citronellal 154,25 207

Citronellol 156,27 225

Cuminaldéhyde 148,2 235-236

Cuparène 202,34 275 (+)

Eugénol 164,2 254

Formate de citronellyle

184,28 235

Géraniol 154,25 229-230

Germacrène-B 204,35 287,2

Germacrène-D 204,35 279,7

Isomenthone 154,25 -




sur 69

Isopulégol 154,25 212

Isopulégol-iso 154,25 91 à 12 mmHg

Limonène 136,23 170-180

Linalol 154,25 194-197

Longifolène 204,35 254 à 706 mmHg

Menthofurane 150,22 80-82 à 17 hPa soit

13 mmHg

Menthol 156,27 216

Menthone 154,25 207 à 1,013 hPa

Myrcène 136,23 167

Patchoulol 222,36 140

p-Cymène 134,22 176-178

Pipéritone 152,23 233




sur 69

Pogostol 222,37 304,4

Pulégone 152,23 224

Sabinène 136,23 163-164 à 1,013 hPa

Terpinène-4-ol 154,25 211-213

Terpinolène 136,23 184-185

Thujopsène 204,35 258-260 (-)

Thymol 150,22 232

Trans-carvéol 152,23 226

Zingibérène 204,35 134 à 14 mmHg

α-bulnésène 204,35 274,5

α-cédrène 204,35 262,5

α-farnésène 204,35 279,6




sur 69

α-guaiène 204,35 281,1

α-himachalène 204,35 268,4

α-patchoulène 204,35 -

α-phellandrène 136,23 171-172

α-pinène 136,23 157,9

α-terpinène-7-al 150,22 235,1

α-terpinène 136,23 173-175

α-terpinéol 154,25 217-218

α-thujène 136,23 151

β-bisabolène 204,35 275,4

β-bourbonnène 204,35 255,9




sur 69

β-caryophyllène 204,35 268,4 (ou 129-130 à

19hPa)

β-copaène 204,35 255,9

β-funébrène 204,35 -

β-himachalène 204,35 -

β-phellandrène 136,23 175

β-pinène 136,23 166

β-sesquiphellandrène

204,35 271,2

γ-himachalène 204,35 -

γ-terpinène-7-al 150,22 -

γ-terpinène 136,23 182




sur 69

ANNEXE 2 : TOXICITE DES COMPOSÉS MANIPULÉS

HAP CAS # Symboles de risque* Mentions de

danger** Conseils de

prudence***

Acétate d’éthyle 141-78-6

H225-H319-H336

P210-P261-P305+P351+P338

(E)-Cinnamaldéhyde 14371-10-9

H315-H317-H319-H335

P261-P280-P305+P351+P338

Citronellal 106-23-0

H315-H317-H319-H335-

H411

P273-P280-P333+P313-

P337+P313-P391

Citronellol 106-22-9

H315-H317-H319

P280-P305+P351+P338

Ethylbenzene 100-41-4

H225-H304-H332-H373-

H412

P210-P261-P273-P301+P310-

P304+P340+P312-P331

Eugénol 97-53-0

H317-H319 P280-

P305+P351+P338

Géraniol 106-24-1

H315-H317-H318

P280-P305+P351+P338

Hexane 110-54-3

H225-H304-H315-H361f-H373-H411

P201-P210-P273-P301+P310-

P308+P313-P331

Limonène 5989-27-5

H226-H304-H315-H317-

H410

P273-P280-P301+P310-P331-

P501

Linalol 78-70-6

H315-H319-H335

P261-P305+P351+P338

Menthol 2216-51-5

H315-H318-H335

P261-P280-P305+P351+P338

p-Cymène 99-87-6

H226-H315-H319-H335

P261-P305+P351+P338

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:GHS-pictogram-pollu.svg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:GHS-pictogram-silhouete.svg








sur 69

m-Xylene 106-42-3

H351 P281

o-Xylene 95-47-6

H226-H312+H332-

H315 P280

*Pictogrammes de risque :

Corrosif

Inflammable

Toxique, irritant, sensibilisant, narcotique

Sensibilisant, mutagène, cancérogène, reprotoxique

Danger pour l'environnement

**Mentions de danger :

H225 Liquide et vapeur très inflammables

H226 Liquide et vapeurs inflammables

H302 Nocif en cas d'ingestion

H304 Peut être mortel en cas d’ingestion et de pénétration dans les voies respiratoires

H312 Nocif par contact cutané

H315 Provoque une irritation cutanée

H317 Peut provoquer une allergie cutanée

H318 Provoque des lésions oculaires graves




sur 69

H319 Provoque une sévère irritation des yeux

H332 Nocif par inhalation

H335 Peut irriter les voies respiratoires

H336 Peut provoquer somnolence ou vestiges

H351

Susceptible de provoquer le cancer (indiquer la voie d'exposition s'il est

formellement prouvé qu'aucune autre voie d'exposition ne conduit au même

danger)

H361 Susceptible de nuire à la fertilité ou au fœtus

H361d Susceptible de nuire au fœtus

H373

Risque présumé d'effets graves pour les organes (indiquer tous les organes

affectés, s'ils sont connus) à la suite d'expositions répétées ou d'une exposition

prolongée (indiquer la voie d'exposition s'il est formellement prouvé qu'aucune

autre voie d'exposition ne conduit au même danger)

H410 Très toxique pour les organismes aquatiques, entraîne des effets à long terme

H411 Toxique pour les organismes aquatiques, entraîne des effets à long terme

H412 Nocif pour les organismes aquatiques, entraine des effets néfastes à long terme

*** Conseils de prudence :

P201 Se procurer les instructions avant utilisation.

P210 Tenir à l’écart de la chaleur/des étincelles/des flammes nues/des surfaces chaudes -

Ne pas fumer

P261 Éviter de respirer les poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/aérosols.

P273 Éviter le rejet dans l’environnement.

P280 Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de

protection des yeux/du visage.

P281 Utiliser l’équipement de protection individuel requis.

P301 EN CAS D’INGESTION :

P304 EN CAS D’INHALATION :

P305 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX :

P308 EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée :




sur 69

P310 Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.

P312 Appeler un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin en cas de malaise.

P313 Consulter un médecin.

P331 NE PAS faire vomir.

P338 Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être

facilement enlevées. Continuer à rincer.

P340 Transporter la victime à l’extérieur et la maintenir au repos dans une position où

elle peut confortablement respirer.

P351 Rincer avec précaution à l’eau pendant plusieurs minutes.

P501 Éliminer le contenu/récipient dans ...

****CMR : cancérigène, mutagène, reprotoxique

Classement cancérogène :

Groupe 1A : Cancérogène pour l’Homme / Substances dont le potentiel cancérogène pour

l’Homme est avéré

Groupe 1B : Cancérogène pour l’Homme / Substances dont le potentiel cancérogène pour

l’Homme est supposé (données animales)

Groupe 2A : Cancérogène probable pour l’Homme

Groupe 2B: Cancérogène possible pour l'Homme

Groupe 3: N'est pas classé comme cancérogène pour l'Homme

Groupe 4 : Probablement pas cancérogène pour l’Homme

Classement mutagène :

Groupe 1A : Mutagène pour l’Homme / Substances dont la capacité d'induire des mutations

héréditaires dans les cellules germinales des êtres humains est avérée

Groupe 1B : Mutagène pour l’Homme / Substances dont la capacité d'induire des mutations

héréditaires dans les cellules germinales des êtres humains est supposée

Groupe 2 : Substances préoccupantes car elles pourraient induire des mutations héréditaires

dans les cellules germinales des êtres humains.

Classement reprotoxique :

Catégorie 1A : Substances dont la toxicité pour la reproduction humaine est avérée.

Catégorie 1B : Substances présumées toxiques pour la reproduction humaine.

Catégorie 2 : Substances suspectées d'être toxiques pour la reproduction humaine.



sur 69

ANNEXE 3 : METHODES ANALYTIQUES ISSUES DES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES

Matériel Type de colonne

Gaz vecteur et

énergie

d’ionisation

Températures Programmation

du four Injecteur Références

Huiles

essentielles

Chromatographe

Hewlett-Packard

HP6890 couplé

à un

spectromètre de

masse HP5973

DB5 : 30 m x 0,25

mm, épaisseur de film

0,25μm

- Hélium :

1ml/min

+ Énergie

d’ionisation : 70

eV pour SM

- Injecteur :

280°C

- Détecteur :

280°C

50°C pendant 5

min, 5°C/min de

50 à 300°C, 5

min à 300°C

Durée run =

60 min

Mode

Split

1/10

https://tel.archiv

es-

ouvertes.fr/tel-

00717749/docu

ment

(page 61)

Origans

(Lamiaceae)

cultivés.

Chromatographe

Hewlett-Packard

HP5890 équipé

d'un FID

Mode

Split

1/20

Chromatographe

Perkin Elmer,

couplé à un MS

TurboMass

Elite 5MS

30mx0.25mmx0.25μ

m (95%diméthyl /

5%phénylpolysiloxan

e)

- Hélium : 1

ml/min

- Énergie

d’ionisation : 70

eV

- Injecteur :

250°C

- Interface :

250°C

Température

initiale : 70°C

Montée en

température :

20°C/min

Température

finale : 250°C

Mode

Split

1/20

Fichier PDF :

Université de

Toulouse 2006

GC-MS.

(Google :

méthode gc

pour les huiles

essentielles)

Citron et

Mandarine

Chromatographe

VARIAN

CHROMPACK

- CP 3800

CP-Chirasil-Dex CB

fusedsilica WCOT :

25 m x 0,25 mm,

épaisseur de PS 0,25

μm

- Hélium : 0,3

ml/min

- Détecteur :

250°C

70ºC pendant

2,50 min, puis

s’élève par

palier de

15ºC/min à

240ºC

pendant 20 min

- http://www.revu

e-genie-

industriel.info/d

ocannexe.php?i

d=1443

Fleur de

lavande :

Lavandula

officinalis

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00717749/document





http://www.revue-genie-industriel.info/docannexe.php?id=1443







sur 69

Matériel Type de colonne

Gaz vecteur et

énergie

d’ionisation

Températures Programmation


Huiles

essentielles

Chromatographe

Perkin Elmer

Autosystem GC,

couplé à 2 FID

60 m x 0,22 mm,

épaisseur du film

: 0,25 μm

-1 polaire : Rtx-

Wax,

polyéthylène

Glycol

-1 apolaire : Rtx-

1, polydiméthyl-

siloxane

- Hélium :

1ml/min

+ Energie

d’ionisation : 70

eV pour SM

- Injecteur :

250°C

- Détecteur :

280°C

Passage de 60 à

230°C, à

2°C/min, puis

palier de 45

mm à 230°C

Durée run =

130 min

Mode Split

1/50

https://tel.archives-

ouvertes.fr/tel-

00441322/document

(page 298)

ET

http://popups.ulg.ac.

be/0037-

9565/index.php?id=

1487&file=1&pid=1

465

Cistus

Albidus et

deux

Asteraceae

endémiques de

Corse (fleurs)

ET

Sciure de bois

et Feuilles de

Tetraclinis

articulata

Chromatographe

Perkin Elmer

Autosystem XL,

couplé à un SM

Perkin Elmer

TurboMass

Mode Split

1/80

Chromatographe

gaz Helwett

Packard 5890,

équipé d’un FID

DB-5 : 25m x

0,25 mm, 0,25

µm épaisseur de

film

- Hélium : 1,2

ml/min

+ Energie

d’ionisation : 70

eV pour SM

- Injecteur :

240°C

- Détecteur :

250°C

50°C pendant 1

min, passage à

280°C (5

minutes) à

raison de

9°C/min

Durée run ~ 32

min

Mode Split http://www.jsac.arn.

dz/Art7%20Vol(16)

N%B02.pdf

Salvia

Officinalis.L

de Tunisie.

(fleur)

Chromatographe

gaz Helwett

Packard 5890,

couplé à un SM

Helwett Packard

5972

DB-5 : 30 m x

0.25 mm, 0.25

µm épaisseur de

film




http://popups.ulg.ac.be/0037-9565/index.php?id=1487&file=1&pid=1465





http://www.jsac.arn.dz/Art7%20Vol(16)N%B02.pdf





sur 69

Matériel Type de

colonne

Gaz vecteur et

énergie d’ionisation Températures

Programmation


Huiles

essentielles

Chromatographe

SHIMADZU –

GC 17A, équipé

d’un FID

DB35 – MS :

30 m x 0,25

mm, épaisseur

PS de 0,25 µm

- Azote : 1,8

ml/min

- Injecteur :

270°C

- Détecteur :

270°C

60 °C à

220°C à raison

de 5°C /min,

puis palier à

220°C pendant

2min

- http://www.afriquesc

ience.info/docannexe

.php?id=1554

Ruta

Chalepensis

L. de

Tlemcen

(fleur)

NON

RETENUE Chromatographe

de type Varain

CP 3800, équipé

d’un SM de

type Varian

Saturn 2000

- Hélium : 1ml/min

- Énergie

d’ionisation : 70 eV

pour le SM

- Injecteur :

220°C

80°C (1min),

80 à 300°C à

raison de 10°C/

min, puis palier

à 300°C

pendant 30 min

http://www.afriquescience.info/docannexe.php?id=1554






sur 69

ANNEXE 4 : CHROMATOGRAMMES GC/MS OBTENUS SUR LES HUILES ESSENTIELLES

Figure 23. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de clous de girofle

Figure 24. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de coriandre




sur 69

Figure 25. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cumin

Figure 26. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus citronné bio




sur 69

Figure 27. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus mentholé bio

Figure 28. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus radié bio

Figure 29. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de genévrier

Figure 30. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de géranium d’Egypte bio




sur 69

Figure 31. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle du gingembre

Figure 32. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de laurier noble bio

Figure 33. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de lavande aspic

Figure 34. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de lavandin super




sur 69

Figure 35. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de menthe poivrée

Figure 36. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de menthe verte

Figure 37. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’origan compact bio

Figure 38. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de patchouli




sur 69

Figure 39. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de romarin à cinéole

Figure 40. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de sarriette des montagnes bio

Figure 41. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’arbre à thé

Figure 42. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de térébenthine




sur 69

ANNEXE 5 : TEMPS DE RÉTENTION DES COMPOSÉS

Colonne apolaire Colonne polaire

Composé Tr méthode

GC/ MS (en min)

Tr méthode

GC/ FID (en min)

Tr méthode

GC/ MS (en min)

(E) -cinnamaldéhyde 19,647 19,730 28,829

(E) β-ocimène 12,600 13,130 10,842

(E)-α-atlantone Non identifié

(E)-γ-atlantone Non identifié

(Z)-dihydrocarvone 17,379 17,700 20,386

1,8-cinéole (= Eucalyptol) 12,125 12,570 9,289

10-épi-γ-eudesmol (= γ-

eudesmol) 28,515 Non identifié 30,932

acétate d’eugényle 25,924 26,220 33,832

acétate de cinnamyle 24,223 24,230 31,951

acétate de cis-carvyle 21,918 22,200 24,165

acétate de dihydrocarvyle 20,998 21,300 Non identifié

acétate de géranyle 22,482 22,720 23,912

Figure 43. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de thym saturéoïdes bio

Figure 44. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’Ylang Ylang complète




sur 69

acétate de lavandulyle 19,877 20,300 20,461

acétate de linalyle 18,906 19,380 19,226

acétate de menthyle 20,051 20,390 19,298

acétate de terpényle 21,618 21,850 22,448

ar-curcumène 25,106 25,150 24,259

Benzoate de benzyle 31,638 31,370 40,026

bornéol 16,598 16,780 22,588

camphène 9,121 9,690 5,141

camphre 15,860 16,160 18,015

carvacrol 20,305 20,640 33,124

carvone 18,799 19,090 23,313

cédrol 28,252 27,980 31,243

cis-hydrate de sabinène (=

4-Tujanol) 13,327

trop petit non

intégré menthe

verte (13,78 min)

16,799

citronellal 16,097 16,390 17,287

citronellol 18,291 18,620 24,090

cuminaldéhyde 18,777 19,050 24,439

cuparène

25,825

problème

d'intégration cèdre

de virginie

25,286

eugénol 21,784 22,140 32,249

formate de citronellyle 19,609 19,870 20,767

géraniol 18,943 19,340 25,816

germacrène-B 23,802 23,970 Non identifié

germacrène-D 25,129 25,160 22,720

iso germacrène D 25,129 25,120 22,720

isomenthone 16,381 16,730 17,416

isopulégol (-) 15,913 16,210 19,498

isopulégol-iso (+) 19,306

limonène 11,974 12,460 9,097

linalol 14,368 14,910 18,998

longifolène 23,287 23,270 19,304

menthofurane 16,134 16,690 17,267

menthol 16,777 17,050 21,174

menthone 16,095 16,440 16,705

myrcène 10,575 10,610 8,088

patchoulol 29,612 29,210 32,350

p-cymène 11,832 12,400 11,318

pipéritone 19,062 19,350 23,157

pogostol Non identifié

pulégone 18,555 18,910

21,268 (coélution

menthol)

sabinène 9,935 10,600 6,671




sur 69

terpinène-4-ol 16,879 17,140 20,273

terpinolène 13,810 13,430 11,642

thujopsène 24,020 23,950 20,700

thymol 20,055 20,360 32,613

trans-carvéol 18,042 25,583

zingibérène 25,437 25,470 23,044

α-bulnésène (= δ-Guaiene) 25,623 25,730 22,924

α-cédrène (-) 23,536 23,490 19,372

α-farnésène 25,673 25,740 23,748

α-guaiène 23,940 24,100 19,987

α-himachalène 24,391 24,400 21,155

α-patchoulène 24,617 24,530 20,904

α-phellandrène 11,147 11,650 8,012

α-pinène 8,546 9,200 4,102

α-terpinène 11,478 12,040 8,481

α-terpinène-7-al (= 1,3-p-

Menthadien-7-al) Non identifié

α-terpinéol 17,344 17,540 22,523

α-thujène 8,276 8,990 4,224

β-bisabolène 25,786 25,760 23,213

β-bourbonnène 22,619 22,760 18,096

β-caryophyllène 23,547 23,650 20,089

β-copaène Non identifié

β-funébrène 25,580 25,600 19,449

β-himachalène 25,672 25,680 22,803

β-phellandrène 12,009 Non identifié 9,332

β-pinène 10,108 10,740 6,249

β-sesquiphellandrène 26,172 26,130 24,149

γ-himachalène 25,117 25,090 22,395

γ-terpinène 12,907 13,470 10,512

γ-terpinène-7-al Non identifié




sur 69

ANNEXE 6 : COMPARAISONS DES RESULTATS GC/FID COBRA ET XXXX ZONE

AnalyseAromaZone AnalyseCOBRA

Composé Proportion(%) Proportion(%)

Bêta-phellandrène 1,90-2,66 -

E-cinnamaldéhyde 66,39-67,70 79,59

Acétatedecinnamyle 1,73-2,71 2,27

Eugénol 3,75-4,28 3,73

Bêta-caryophyllène 3,79-4,72 3,86

LotPHE0277Cannelleécorce(réf1602)




sur 69



Bêta-himachalène 45,64-50,56 50,97

alpha-himachalène 16,17-17,08 18,67

Gamma-himachalène 10,45-11,83 10,89

(E)-alpha-atlantone 2,58-2,59 -

(E)-gamma-atlantone 1,12-1,88 -

LotPHE0277Cèdredel'Atlas(réf150)



thujopsène 20,29 25,23

cuparène 2,75 -

cédrol 26,32 28,23

LotPHE0277CèdredeVirginie(réf716)

alpha-cédrène+bêta-funébrène 23,81 35,36



Béta-pinène 3,92-5,46 4,59

Sabinène 6,15-6,31 7,07

Alpha-pinène 5,78-10,81 6,28

Alpha-terpinéol 1,68-4,60 1,75

1,8-cinéole 36,94-41,99 46,08

Acétatedeterpényle 7,05-10,46 7,15

LotPHE0225Lauriernoblebio(réf1602)



Citronnelol 31,86-33,876 40,95

Géraniol 14,07-15,22 18,55

Linalol 3,81-5,15 5,50

Formatedecitronnellyle 7,09-8,01 8,32

Isomenthone 4,75-6,83 5,82

10-épi-gamma-eudesmol 4,30-5,16 4,86

LotPHE0129GéraniumEgyptebio(réf796)



linalol 30,60-33,64 39,83

bornéol 2,75-3,08 2,73

acétatedelinalyle 36,94-42,84 30,26

acétatedelavandulyle 1,22-1,70 1,29

camphre 3,82-4,18 4,59

LotPHE0129Lavandinsuper(réf544)

1,8-cinéole+bêta-phellandrène 3,46-3,78 2,62



Germacrène-D 18,04-24,50 13,73

Bêta-caryophyllène 14,72-15,13 18,97

alpha-farnésène 9,44-10,49 10,30

Benzoatedebenzyle 5,68-7,32 8,42

LotPHE0129YlangYlangcomplètebio(réf301)



limonène 5,87-5,89 7,31

alpha-pinène 2,41-2,48 1,98

myrcène 1,26 0,96

bêta-pinène 0,59 0,57

alpha-terpinène 0,65 -

alpha-terpineol 9,37-10,12 7,82

terpinène-4-ol 1,5 1,11

linalol 0,42 -

acétated'alpha-terpényle 1,84 1,00

1,8-cinéole 68,26 74,60

LotPHE0129Eucalyptusradiébio(réf1590)



citronnellol 3,19-5,70 6,28

isopulégol 6,39-7,80 8,74

isopulégol-iso 3,89-4 -

LotPHE0129Eucalyptuscitronnébio(réf31)



menthol 40,86-41,52 41,57

1,8-cinéole 4,67-5,05 5,82

menthofurane 1,13-1,55 1,13

menthone 25,21-25,92 31,91

pulégone 1,04-1,23 1,27

acétatedementhyle 4,13-4,15 3,28

LotPHE0129Menthepoivrée(réf39)



Carvacrol 45,58-46,08 46,93

Thymol 5,41-5,86 5,69

Gamma-terpinène 14,12-15,92 17,02

p-cymène 10,91-11,52 13,20

LotOHE0461Sariettedesmontagnes(réf86)



gamma-terpinène 21,28 22,33

alpha-terpinène 9,47 9,76

terpinolène 3,38 coélutionavecgamma-terpinène

p-cymène 2,60 3,27

terpinène-4-ol 42,20 47,82

alpha-terpinéol 2,77 2,95

LotPHE0222Teatree(réf192)




sur 69



linalol 63,18 67,31

alpha-pinène 9,41 9,01


limonène 4,37 4,46

camphre 5,4 5,54

acétatedegéranyle 2,33 1,61

LotPHE0277Coriandre(réf)




p-cymène 9,32 9,70

Carvacrol 41,63-49,89 49,90

Thymol 16,38-19,50 16,37

Béta-caryophyllène 1,65-1,84 1,413

LotOHE0461Origancompactbio(réf475)AnalyseAromaZone AnalyseCOBRA


alpha-pinène 9,37-11,86 11,63

béta-pinène 4,81-7,53 7,32

Bornéol 2,35-3,09 2,49

1,8-cinéole 46,62-44,63 49,66

Camphre 11,10-14-10 11,69

LotOHE0461Romainàcinéole(réf814)



Linalol 39,92-42,54 42,52

Limonène 0,28-1,97 2,75

1,8-cinéole 25,95-29,51 28,23

Camphre 11,61-12,29 12,50

LotPHE0129Lavandeaspic(réf7)



pipéritone 35,61 41,95

alpha-phellandrène 17,92-15,88 17,46

p-cymène 2,97-4,01 3,58

alpha-thujène 1,79-2,32 1,70

terpinène-4-ol 4,00-4,54 4,88

LotPHE0129Eucalyptusmentholébio(réf540)



alpha-pinène 71,43-72,63 75,49

Bêta-pinène 14,57-18,65 14,82

limonène 2,02-4,99 4,90

bêta-caryophyllène 1,75-2,19 1,76

longifolène 1,03-1,25 0,96

LotPHE0222Térébenthine(réf542)




sur 69

ANNEXE 7: TABLEAUX DE CALCULS DES CALIBRATIONS

INTERNES




sur 69




sur 69

ANNEXE 8 : PROTOCOLE DE PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS ET RÉSULTATS POUR LE GÉRANIUM ÉGYPTE

ET LE CAMPHRIER

Préparation d’une solution mère d’éthylbenzène (étalon interne) à 1000 μg/mL

Préparation d’une solution mère à 1000 μg/mL d’éthylbenzène en pesant directement

0,2 g d’étalon interne dans une fiole jaugée de 200 mL. On ajoute ensuite le solvant de dilution

d’hexane en complétant au trait de jauge.

Préparation d’une solution mère en huile essentielle

0,25 g d’huile essentielle est pesé précisément dans une fiole jaugée de 50 mL. On

complète ensuite au trait de jauge avec de l’hexane.

Préparation des échantillons d’huile essentielle avec l’étalon interne pour l’analyse en

GC/FID

On prélève 5 ou 10 mL de solution mère d’huile essentielle, à l’aide d’une pipette jaugée

de 5 ou 10 mL, que l’on introduit dans une fiole jaugée de 25 mL. On ajoute ensuite 10 mL de

solution mère d’éthylbenzène, en utilisant une pipette jaugée de 10 mL, pour avoir une

concentration en éthylbenzène à 400 µg/mL. La fiole jaugée est ensuite complétée au trait de

jauge avec de l’hexane.

Résultats obtenus pour le Géranium Egypte avec une prise de 5 mL en solution mère de

l’huile essentielle étudiée (masse de géranium Egypte pesée = 0,2594 g)

Nom du

composé

Céchantillon

en µg/mL

Cmère

en µg/mL

Masse

composé

en µg

Proportion

en %

Proportion

XXXX-Zone

Ecart

relatif

(en %)

Linalol 42,70 213,50 10675 4,12 4,48 8,14

Citronnelal 27,86 139,30 6965 2,69 - -

Citronellol 288,60 1443,00 72150 27,81 32,868 15,38

Géraniol 164,84 824,20 41210 15,89 14,645 -8,48

Résultats obtenus pour le Géranium Egypte avec une prise de 10 mL en solution mère de

l’huile essentielle étudiée (masse de géranium Egypte pesée = 0,2594 g)

Nom du

composé

Céchantillon

en µg/mL

Cmère

en µg/mL

Masse

composé

en µg

Proportion

en %

Proportion

XXXX-Zone

Ecart

relatif

(en %)

Linalol 80,59 201,48 10074 3,88 4,48 13,32

Citronnelal 49,59 123,98 6199 2,39 - -

Citronellol 638,37 1595,93 79796 30,76 32,868 6,41

Géraniol 313,71 784,28 39214 15,12 14,645 -3,22




sur 69

Résultats obtenus pour le Camphrier avec une prise de 5 mL en solution mère de l’huile

essentielle étudiée (masse de camphrier pesée = 0,2556 g)

Nom du

composé

Céchantillon

en µg/mL

Cmère

en µg/mL

Masse

composé

en µg

Proportion

en %

Proportion

XXXX-Zone

Ecart

relatif

(en %)

p-Cymène 110,78 553,9 27695 10,84 8,22 -31,82

Limonène 284,09 1420,45 71022,5 27,79 24,64 -12,77