Mikroskopie II.

Szilvia Barkó

2016

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Zusammenfassung der Vorlesung

Fluoreszenzmikroskopie

Fluorophoren

Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops

Konfokalmikroskopie

Evaneszentfeldmikroskopie

Multiphotonenmikroskopie

Höchstauflösungsmikroskopie

STED

SIM

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Jablonski-Schema

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Fluoreszenzmikroskopie

http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html

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Fluorophorenhttp://columbiabiosciences.homestead.com/dylightdyes.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_and_secondary_antibodies

http://www.rcsb.org/pdb/101/static101.do?p=education_discussion/educational_resources/GFP_activity.html

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Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops

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Klassische mikroskopische Methoden I.Konfokale Mikroskopie (LSCM)

www.medizin.pte.huhttp://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/confocalintro.html

3D Bild eines Pollenkorns

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Klassische mikroskopische MethodenII. Total Internal Reflection Fluorescence(TIRFM)=Evaneszenzfeldmikroskopie

Pubs.rsc.org

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Totalreflexion

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𝑠𝑖𝑛𝛼𝑠𝑖𝑛𝛽

=𝑛2𝑛1

1

2

1

2

1

2

α

β

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http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/tirf/tirfintro.html

http://cammer.net/historical/aif/instructions/tirf/index.htm

Die Intensität des evaneszenten elektrischen Kraftfeldes nimmt senkrecht zur Grenzfläche zwischen den beiden Brechmedien exponentiell ab:

z: der Abstand von der Grenzfläched: die Eindringtiefe bei Wellen, die unter einem größeren als dem kritischen Winkel einfallen

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Multiphotonenmikroskopie

https://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/fluoreszenz_mikroskop/5d_multiphoton.htm

Normale Fluoreszenz Multiphoton Fluoreszenz

1 kurzwelliges Anregungsphoton ≥ 2 langwellige Anregungsphotonen

1 langwelliges Emissionsphoton 1 kurzwelliges Emissionsphoton

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Jablonskidiagramm für 1 und 2-Photonen-Anregung von Molekülen vom Grundzustand S0 in höhere Singulett Niveaus (S1,S2).

hvA ist die Energie eines Photons bei Ein- bzw Zwei-Photonen-Anregung, hvF die Energie des induzierten Fluoreszenzphotons und hvP die Energie eines Phosphoreszenzphotons nach Intersystem-Crossing.

http://www.biophotonics.uni-hannover.de/a2biophotonik.html

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Höchstauflösungsmikroskopie

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Stimulated Emission Depletion(STED)Nobelpreis für den Vater der Höchstauflösungsmikroskopie

Stefan Hell 2014

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Stimulierte Emission: Ein Lichtquant trifft auf ein Atom, das sich bereits im angeregten Zustand befindet.

Unter Aussendung von zwei Lichtquanten kann das Atom in den Grundzustand zurückzukehren.

Die beiden Photonen (Lichtquanten) sind exakte Kopien des eingefallenen Photons: Dadurch entsteht eine Vervielfältigung einer quantenphysikalisch genau bestimmten Sorte von Photonen.

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http://www.mpg.de/815357/forschungsSchwerpunkt?c=166398&force_lang=de

Übersättigen der Abregung bedeutet, dass eine höhere Intensität verwendet wird als die zu einer weitgehenden Abregung des Markers gebrauchtwird.

Die Population des angeregten Zustands und somit nimmt die Fluoreszenz exponentiell mit der Intensität des stimulierenden Lichtstrahls ab.

Wenn eine bestimmte Schwellenintensität überschritten ist, ist das Abregen quasi komplett.

https://www.youtube.com/watch?v=uyMZPFTcXG4

Übersättigung

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Structured Illumination Mikroskopie (SIM)

Eine strukturierte Beleuchtung wird benutzt (Interferenzeffekt,

Moire-Effekt).

Die fluoreszierende Probe wird mit einem Streifenmuster

angestrahlt.

Überlagerung des bekannten Gittermusters und der unbekannten Struktur.

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Aktin-Zellskelett (rot) und mit Clathrin überzogene Vesikel (CCV, grün) in einer HeLa-Zelle, abgebildet mit klassischer Weitfeldmikroskopie (a) und Mikroskopie mitstrukturierter Beleuchtung (b). Farbstoffe: Lifeact-tdTomato zur Visualisierung von F-Aktin, Clathrin-mEmerald zur Visualisierung der CCV. Maßstabsleiste: 5 Mikrometer.

http://www.laborwelt.de/spezialthemen/mikroskopie/3d-zeitserien-live.html