Martina Turk in Polona Zalar

MIKROBIOLOGIJA – VAJE (Gradivo za vaje)

za študente Univerze v Ljubljani, Pedagoške fakultete, smer Biologija, Kemija, Gospodinjstvo

Založnik: Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani

Ljubljana, 2013

2

Vse pravice pridržane. Prepovedano je sleherno reproduciranje, razmnoževanje, javno predvajanje, tiskanje ali kakršna koli druga oblika objavljanja bodisi strani bodisi izsekov tega dela brez pisnega dovoljenja avtorjev.

3

1. Vaja: Delo v mikrobiološkem laboratoriju in gojenje mikroorganizmov .............................. 9

ASEPTIČNO DELO V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU ..................................... 9 UNIČEVANJE MIKROORGANIZMOV ............................................................................. 9

A. STERILIZACIJA .......................................................................................................... 9 B. DRUGI NAČINI UNIČEVANJA MIKROORGANIZMOV...................................... 10

GOJENJE MIKROORGANIZMOV.................................................................................... 11 A. HRANILA................................................................................................................... 11 B. VIR ENERGIJE........................................................................................................... 11 C. FIZIKALNO-KEMIJSKI DEJAVNIKI ...................................................................... 12

GOJIŠČA ............................................................................................................................. 12 A. SESTAVA GOJIŠČ .................................................................................................... 12 B. OBLIKA GOJIŠČ........................................................................................................ 13 C. VRSTE GOJIŠČ .......................................................................................................... 13

MIKROBNA KULTURA .................................................................................................... 14 NACEPLJANJE MIKROORGANIZMOV NA/V GOJIŠČA ......................................... 14 REDČENJE KULTURE DO POSAMEZNIH KOLONIJ............................................... 14

NAČINI RAZŠIRJANJA INFEKTIVNIH MIKROORGANIZMOV................................. 15

1. naloga: Pomen pravilnega umivanja rok.......................................................................... 16 2. naloga: Posredni in neposredni prenos mikroorganizmov ............................................... 17 3. naloga: Mikroorganizmi v zraku in kapljične okužbe...................................................... 18 4. naloga: Mikroorganizmi v/na vsakodnevnih predmetih................................................... 19 5. naloga: Demonstracija priprave gojišč ............................................................................. 20 6. naloga: Uporaba različnih vrst gojišč............................................................................... 21

2. Vaja: Vpliv temperature in kisika na rast mikroorganizmov ............................................... 22

RAST MIKROORGANIZMOV.......................................................................................... 22 VPLIV TEMPERATURE................................................................................................ 23 VPLIV KISIKA................................................................................................................ 24

ANAEROBNE MIKROBIOLOŠKE TEHNIKE................................................................. 26 7. naloga: Vpliv temperature na rast različnih vrst bakterij ................................................. 27 8. naloga: Vpliv koncentracije prostega kisika na rast – kultura v globokem agarju........... 28 9. naloga: Gojenje bakterij v anaerobnih razmerah.............................................................. 29

3. Vaja: Metode določevanja velikosti populacije mikroorganizmov – primer kolititra ........ 30

KVALITETA PITNE VODE............................................................................................... 31 METODE ZA UGOTAVLJANJE NEOPOREČNOSTI PITNE VODE......................... 31 KOLI TITER.................................................................................................................... 31 METODA S FILTROM ................................................................................................... 32 KVALITETA VOD – MIKROBIOLOŠKI PARAMETRI (PO DIREKTIVAH EU)..... 32

10. naloga: Koli titer pitne vode........................................................................................... 33 11. naloga: Koli titer vzorca vode ........................................................................................ 34 12. naloga: Metoda s filtrom ................................................................................................ 36

4. Vaja: Izolacija čiste kulture.................................................................................................. 37

KAKO PREVERIMO ČISTOST KULTURE ..................................................................... 37 KAKO IZOLIRAMO ČISTO KULTURO .......................................................................... 37

4

SHRANJEVANJE MIKROORGANIZMOV...................................................................... 39

13. naloga: Izolacija čiste kulture......................................................................................... 40 5. vaja: Preučevanje vpliva antibiotikov na mikroorganizme - antibiogram ........................... 41

A. DIFUZIJSKI ANTIBIOGRAM ...................................................................................... 41 B. DILUCIJSKI ANTIBIOGRAM ...................................................................................... 42 C. INKORPORACIJSKI ANTIBIOGRAM ........................................................................ 42

14. naloga: Difuzijski antibiogram....................................................................................... 43 15. naloga: Primerjava antimikrobne učinkovitosti različnih zobnih past ........................... 44

6. Vaja: Mikroskopiranje bakterijskih preparatov.................................................................... 45

ENOSTAVNA BARVANJA BAKTERIJ ........................................................................... 45 DIFERENCIALNA BARVANJA BAKTERIJ.................................................................... 45 DRUGA DIFERENCIALNA BARVANJA: BARVANJA KAPSUL, FLAGELOV, SPOR ALI ZNOTRAJCELIČNIH VKLJUČKOV......................................................................... 46

16. naloga: Barvanje in mikroskopiranje bakterijskih preparatov ....................................... 47

Viri: .......................................................................................................................................... 49

5

VARNOST V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU - PRAVILA (podpišete in oddate asistentki)

►V laboratorij vstopamo v haljah, ki so namenjene samo za delo v laboratoriju. Vsa ostala oblačila in stvari shranimo izven laboratorija. Torbe, nahrbtnike in oblačila ne polagamo na površino pultov. ►V laboratoriju ne dajemo ničesar v usta, ker so usta glavna pot vstopa mikroorganizmov v telo. Zato ne jemo, ne pijemo, ne žvečimo, ne nanašamo dekorativne kozmetike in ne kadimo. Ker se lahko inficiramo skozi usta, nos, oči in kožo, pri delu ne dajemo ničesar v usta (svinčnik, nalivna peresa, steklovina..). ►Praske in ureznine zaščitimo z obliži. ►Pred začetkom vaj, še posebno pa po končanih vajah, si skrbno umijemo roke. Če je potrebno, roke razkužimo. ►Vsak mikroorganizem, s katerim delamo, obravnavamo kot potencialno patogen. ►Z živimi mikrobi delamo previdno in aseptično ob plamenu plinskega gorilnika. ►Kontaminiran material odlagamo v odlagalnike ali na označeno mesto (pozneje ga avtoklaviramo). ►Kultur ne smemo odnašati z vaj. ►Pri delu pazimo, da mikrobnih kultur ne polivamo po mizi, po tleh in po obleki. Z rokami se ne dotikamo kolonij in suspenzij živih mikrobov. Če pride kužnina v stik s kožo ali delovno površino, obvestimo asistenta. Kontaminirano delovno površino pokrijemo s papirnato brisačo in jo prelijemo z razkužilom. Razkužilo pustimo delovati najmanj 20 minut. Kontaminirano mesto na telesu ali obleki razkužimo in nato speremo z vodo. ►Pred in po opravljenem delu pospravimo za seboj in razkužimo delovne površine. ►Pri delu z gorilnikom pazimo, da nam plamen ne ožge kože, las ali halje. Dolge lase spnemo. ►Gorilniki so prižgani le takrat, ko odpiramo petrijevke, precepljamo, oz. kadar rokujemo z živimi kulturami. ►Po končanem delu se prepričamo, da so gorilniki ugasnjeni in glavna varovalka za plin izklopljena. ►Rezultate dela si sproti zapisujemo v delovni protokol. ►Mikroskope in ostale inštrumente uporabljamo po navodilih asistenta. ►Študent se mora seznaniti z mestom in uporabo varnostne opreme (aseptično milo, dezinfekcijsko sredstvo, gasilni aparat...). ►Obiskovalcem je vstop v laboratorij prepovedan. ►Študent/ka mora izkazati poznavanje vaj za nazaj (teorija in praksa) in biti seznanjenjen z naslednjo vajo. Sprotno preverjanje znanja bo na začetku vsake vaje.

Seznanjen/a sem in razumem zgoraj navedena pravila. Ravnal/a se bom po njih.

Ime in priimek (tiskane črke):

Podpis:

6

7

VARNOST V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU - PRAVILA (vaš izvod)

►V laboratorij vstopamo v haljah, ki so namenjene samo za delo v laboratoriju. Vsa ostala oblačila in stvari shranimo izven laboratorija. Torbe, nahrbtnike in oblačila ne polagamo na površino pultov. ►V laboratoriju ne dajemo ničesar v usta, ker so usta glavna pot vstopa mikroorganizmov v telo. Zato ne jemo, ne pijemo, ne žvečimo, ne nanašamo dekorativne kozmetike in ne kadimo. Ker se lahko inficiramo skozi usta, nos, oči in kožo, pri delu ne dajemo ničesar v usta (svinčnik, nalivna peresa, steklovina..). ►Praske in ureznine zaščitimo z obliži. ►Pred začetkom vaj, še posebno pa po končanih vajah, si skrbno umijemo roke. Če je potrebno, roke razkužimo. ►Vsak mikroorganizem, s katerim delamo, obravnavamo kot potencialno patogen. ►Z živimi mikrobi delamo previdno in aseptično ob plamenu plinskega gorilnika. ►Kontaminiran material odlagamo v odlagalnike ali na označeno mesto (pozneje ga avtoklaviramo). ►Kultur ne smemo odnašati z vaj. ►Pri delu pazimo, da mikrobnih kultur ne polivamo po mizi, po tleh in po obleki. Z rokami se ne dotikamo kolonij in suspenzij živih mikrobov. Če pride kužnina v stik s kožo ali delovno površino, obvestimo asistenta. Kontaminirano delovno površino pokrijemo s papirnato brisačo in jo prelijemo z razkužilom. Razkužilo pustimo delovati najmanj 20 minut. Kontaminirano mesto na telesu ali obleki razkužimo in nato speremo z vodo. ►Pred in po opravljenem delu pospravimo za seboj in razkužimo delovne površine. ►Pri delu z gorilnikom pazimo, da nam plamen ne ožge kože, las ali halje. Dolge lase spnemo. ►Gorilniki so prižgani le takrat, ko odpiramo petrijevke, precepljamo, oz. kadar rokujemo z živimi kulturami. ►Po končanem delu se prepričamo, da so gorilniki ugasnjeni in glavna varovalka za plin izklopljena. ►Rezultate dela si sproti zapisujemo v delovni protokol. ►Mikroskope in ostale inštrumente uporabljamo po navodilih asistenta. ►Študent se mora seznaniti z mestom in uporabo varnostne opreme (aseptično milo, dezinfekcijsko sredstvo, gasilni aparat...). ►Obiskovalcem je vstop v laboratorij prepovedan. ►Študent/ka mora izkazati poznavanje vaj za nazaj (teorija in praksa) in biti seznanjenjen z naslednjo vajo. Sprotno preverjanje znanja bo na začetku vsake vaje.

Seznanjen/a sem in razumem zgoraj navedena pravila. Ravnal/a se bom po njih.

Ime in priimek (tiskane črke):

Podpis:

8

9

1. Vaja: Delo v mikrobiološkem laboratoriju in gojenje mikroorganizmov

ASEPTIČNO DELO V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU Vse mikrobiološke preiskave moramo opraviti aseptično. To pomeni, da s kužnino ali kulturami mikroorganizmov delamo tako, da: 1 - onemogočimo dostop nezaželenim mikroorganizmom, ki bi kontaminirali naše kulture in zaradi katerih bi bili rezultati poskusov napačni; 2 - hkrati pazimo, da mikroorganizmov ne razširjamo, ker s tem ogrožamo sebe in druge. Za aseptično delo je nujno, da so steklovina, predmeti in pripomočki za delo ter gojišča za gojenje mikroorganizmov sterilni. Delamo ob plamenu plinskega gorilnika. Cepilno zanko in steklovino med delom obžigamo. Delovno površino redno čistimo z razkužili. Tudi ob skrbnem upoštevanju pravil aseptičnega dela je možno, da pride do kontaminacije okolice ali kulture, s katero delamo. S posebno nevarnimi mikroorganizmi je zato treba delati v laminarjih ali celo v posebej opremljenih laboratorijih s podpritiskom.

UNIČEVANJE MIKROORGANIZMOV Protimikrobna sredstva lahko v grobem razdelimo na fizikalna (temperatura, ionizirajoča

in neionizirajoča sevanja) in kemijska (antiseptiki, razkužila, antibiotiki). A. STERILIZACIJA Sterilizacija je postopek, s katerim uničimo ali odstranimo vse žive mikroorganizme. To

lahko naredimo na več načinov: 1. S toploto Mikrobi so proti temperaturi različno odporni (npr. vegetativne celice uniči 0,1–0,5-

minutno segrevanje pri 65 oC, medtem ko so spore odpornejše – uniči jih 5- do 6-minutno avtoklaviranje).

Za rutinsko sterilizacijo z vlažno toploto uporabljamo avtoklav, kjer z vodno paro pod pritiskom pri 121 oC uničimo vse žive celice in spore.

S suho toploto steriliziramo laboratorijsko steklovino v sterilizatorjih. Postopek traja dalj časa, poteka pri višji temperaturi in je manj učinkovit od sterilizacije z vlažno toploto.

Tindalizacijo (30 min. pri 100 oC, 3 dni zapored) uporabljamo za sterilizacijo snovi, ki bi jih višja temperatura uničila ali inaktivirala.

Obžiganje cepilnih zank, vratov epruvet, erlenmajer steklenic ... v plamenu. 2. S filtracijo S filtracijo steriliziramo pline ali temperaturno občutljive tekočine tako, da

mikroorganizme odstranimo. Snov prehaja skozi filter (porozen material), ki zadrži delce določene velikosti. Standardne velikosti por filtrov so 0,45 m in 0,22 m.

10

3. S sevanji Sevanje gama se uporablja komercialno, npr. za sterilizacijo večjih količin plastičnih

izdelkov ali hrane. 4. S plini Pline uporabljamo za sterilizacijo prostorov in materiala, ki ga ne moremo sterilizirati na

drugačen način, npr. plastični laboratorijski material. Najpogosteje se uporabljata etilen oksid in pare formaldehida; njuna slaba stran je, da sta zdravju škodljiva. Novejša je uporaba vodikovega peroksida, ki je manj toksičen.

B. DRUGI NAČINI UNIČEVANJA MIKROORGANIZMOV V določenih primerih ni potrebno, da snovi in predmete steriliziramo, pač pa moramo

samo zmanjšati število bakterij ali uničiti patogene mikroorganizme. 1. Pasterizacija Ne uniči vseh bakterij, temveč le zmanjša mikrobno populacijo in uniči večino patogenih

mikroorganizmov. Uporablja se za podaljšanje trajnosti mleka ali drugih živil. Poznamo več načinov pasterizacije:

- dolgotrajna pasterizacija – LTH (30 min. pri 63–66 oC), - kratkotrajna pasterizacija – HTST (15 sek. pri 71 oC), - trenutna pasterizacija pri ultravisoki temperaturi – UHT (2 sek. pri 141 oC). 2. Razkuževanje Za razkuževanje površin in prostorov uporabljamo dezinfekcijska sredstva, za

razkuževanje kože ali drugih mest po telesu pa antiseptike. Kemična sredstva lahko delujejo na mikroorganizme baktericidno (ubijajo), bakteriostatično (inhibirajo rast) ali bakteriolitično (ubijajo celice z lizo). Delujejo na vegetativne celice, le redko tudi na spore. Kemikalije, ki vplivajo na bakterije in jih samostojno ali v kombinaciji uporabljamo za razkuževanje, so alkoholi (etanol, isopropanol), jod, soli težkih kovin (srebrov nitrat), detergenti (kvartarane amonijeve soli), oksidanti (amoniak, klorove spojine) ter fenolne spojine.

3. Ultravijolično sevanje Uporablja se za zmanjšanje števila mikrobov v prostorih in laminarjih.

11

GOJENJE MIKROORGANIZMOV Gojenje mikroorganizmov je osnova za njihovo proučevanje. Rast mikroorganizmov

pomeni rast celic in povečevanje števila celic. Za rast je treba zagotoviti hranila, vir energije in ustrezne fizikalno-kemijske razmere. Gojišča in razmere, v katerih kulturo gojimo, morajo čim bolj posnemati naravno okolje.

Organizme delimo glede na: - vir energije na fototrofe in kemotrofe - vir reducirajoče moči (donor elektronov) na organotrofe in litotrofe - vir ogljika na avtotrofe in heterotrofe A. HRANILA Mikroorganizmi se močno razlikujejo glede na potrebo po hranilih. Escherichia coli

lahko raste na gojišču, ki vsebuje le enostaven sladkor, amonijev fosfat in nekaj mineralnih soli. Primer prehransko zahtevnih mikroorganizmov so mlečnokislinske bakterije, ki potrebujejo za rast številne vitamine, aminokisline in druge rastne dejavnike.

Avtotrofi so organizmi, ki kot edini vir ogljika uporabljajo ogljikov dioksid (primer so cianobakterije), heterotrofi pa potrebujejo ogljik v organski obliki.

Snovi, ki jih mikroorganizmi potrebujejo za rast, so naštete v tabeli.

snov, potrebna za rast vir v gojišču ogljik CO2, HCO3-, sladkorji, proteinski ekstrakti itd. vodik voda, organske snovi, H2 kisik voda, O2 dušik aminokisline, dušikove baze, NH4Cl,

(NH4)2SO4, KNO3, N2 fosfor Na2HPO4, KH2PO4 žveplo Na2SO4, H2S, organske snovi kalij KCl, K2HPO4 magnezij MgCl2, MgSO4 kalcij CaCl2, CaCO3 natrij NaCl železo FeCl3, Fe(NH4)(SO4)2 elementi v sledeh CoCl2, ZnCl2, Na2MoO4, CuCl2, MnSO4,

NiCl2, Na2SeO4, Na2WO4, Na2VO4 rastni dejavniki vitamini, aminokisline, purini, pirimidini, drugi

kompleksni dodatki

B. VIR ENERGIJE Mikroorganizmi se razlikujejo glede na izrabo virov energije. Fototrofi potrebujejo

svetlobno energijo. Kemotrofi energijo pridobijo z oksidacijo kemijskih spojin s fermentacijo ali z dihanjem, ki je lahko aerobno (končni akceptor elektronov je kisik) ali anaerobno (končni akceptor elektronov so lahko nitrat, nitrit, sulfati, sulfiti, žveplo ...) Glede na reducirajočo moč (donor elektronov) mikroorganizme lahko delimo na litotrofe (oksidacija anorganskih snovi, kot so H2, S-, Fe2+, NH4

+, NO2-) in organotrofe (oksidacija organskih

12

snovi). Večina bakterij je kemoorganotrofnih. Kot vir energije uporabljajo organske ogljikove spojine, ki so obenem tudi vir ogljika in drugih elementov.

C. FIZIKALNO-KEMIJSKI DEJAVNIKI Nekatere od fizikalno-kemijskih dejavnikov zagotavljamo s sestavo gojišč (aktivnost

vodikovih ionov, vodna aktivnost, osmotski pritisk, viskoznost), druge z zunanjim okoljem (temperatura, kisik, svetloba, pritisk, magnetno polje).

1. Aktivnost vodikovih ionov (pH) Večina bakterij raste v relativno ozkem območju pH, med 6,5 in 7,5. Druge so prilagojene

na bolj ekstremne vrednosti: acidofili rastejo pri pH 4 pa vse do pH 1, alkalofili pa pri vrednosti pH 9 do pH 10. Za razliko od bakterij glive rastejo v širšem pH območju (od pH 5 do pH 9).

Mikroorganizmi med rastjo v gojišče sproščajo organske kisline, ki znižujejo pH, kar inhibira njihovo rast. Nekatere sestavine gojišča imajo šibko pufersko aktivnost, večini gojišč pa dodajamo pufre, običajno tudi fosfate in karbonate.

2. Temperatura Mikroorganizme gojimo pri temperaturi, pri kateri je njihova rast optimalna (naslednja

vaja). 3. Kisik in drugi plini Atmosfera, v kateri gojimo mikroorganizme, je vir končnih akceptorjev elektronov (O2),

vir substratov za oksidacijo (H2, CH4, CO) in vir dušika ter CO2. Nekatere bakterije rastejo le v atmosferi z več CO2 (kapnofilne bakterije). O vplivu kisika na rast bomo govorili pri naslednji vaji.

3. Vodna aktivnost Voda je nujno potrebna za rast mikroorganizmov. Razen tega, da deluje kot topilo, služi

kot vir kisika in vodika ter kot zaščita pred temperaturnimi spremembami. Količino vode, ki jo bakterije lahko izrabljajo, izražamo kot vodno aktivnost (aW). Optimalna vrednost vodne aktivnosti za večino vrst bakterij je nad 0,99. Halofilni mikroorganizmi rastejo le pri višjih koncentracijah NaCl, ki znižajo vodno aktivnost.

GOJIŠČA Gojišča so substrati za gojenje mikroorganizmov v laboratorijskih razmerah. Gojišča, ki

jih uporabljamo v mikrobiologiji, so številna in raznolika, saj jih prilagajamo potrebam mikroorganizmov in načinu uporabe (izolacija, vzdrževanje, namnoževanje in karakterizacija kulture).

A. SESTAVA GOJIŠČ Gojišča so vodne raztopine snovi, ki jih določen mikroorganizem potrebuje za rast. Glede

na sestavo jih delimo na kompleksna in definirana. Kompleksna gojišča so tista, pri katerih ne poznamo njihove natančne kemijske sestave.

Njihova osnova so običajno hidrolizirani proteini iz mesa, mleka ali soje, obdelani s

13

kislinami, lugi ali encimi, tako da vsebuje krajše peptide in aminokisline, ki jih bakterije lažje uporabljajo. Temu dodajamo ogljikovodike (običajno sladkorje), ki služijo kot vir energije in ogljika, soli, ki so vir anorganskih ionov, pogosto pa tudi kvasni ekstrakt (vir vitaminov) in dodatke (glej obogatena gojišča).

Definirana gojišča vsebujejo točno določene koncentracije čistih kemikalij. Uporabna so pri študiju mikrobnega metabolizma, npr. v bakterijski taksonomiji. Primer definiranega gojišča je Chujevo gojišče.

B. OBLIKA GOJIŠČ Vsako gojišče lahko pripravimo kot tekoče, trdno ali poltrdno glede na količino dodanih

snovi, ki povzročajo strjevanje gojišča. Običajno je to agar, redkeje želatina ali silikagel. Agar-agar je polisaharid iz galaktoze in galakturonske kisline, ki ga pridobivajo iz

določenih vrst rdečih morskih alg. Dodamo ga običajno 1,5%. V mrzli vodi nabrekne, pri 100 oC pa se popolnoma raztopi in s tem preide v koloidno stanje sol. Pri ohlajanju pod temperaturo 40 oC preide ponovno v stanje gel. Želatina, ki se včasih uporablja namesto agarja, preide v stanje sol že pri 37 oC, to pa je za mnoge bakterije najugodnejša temperatura za rast. Odpornost proti encimski razgradnji je druga pomembna lastnost agarja. Le redke morske bakterije hidrolizirajo agar. Pri teh uporabljajo silikagel (H2SiO3).

V tekočih gojiščih (juhe) so sestavine raztopljene v vodi kot v trdnih gojiščih, s tem da ne vsebujejo sestavin za strjevanje. Uporabljamo jih za namnoževanje kultur v večjih ali manjših volumnih (v erlenmajericah ali epruvetah) ter za selektivno bogatitev bakterijskih vrst.

Trdna gojišča pripravljamo kot plošče v petrijevih posodicah ter kot vbodna ali poševna gojišča v epruvetah. Plošče so, tako kot tekoča gojišča, osnovna in splošno uporabna oblika gojišč. Vbodna in poševna gojišča uporabljamo za shranjevanje bakterij, za ugotavljanje potreb po kisiku in pri nekaterih biokemijskih testih.

Poltrdna gojišča vsebujejo manjšo koncentracijo agarja, zaradi česar lahko pri segrevanju prej preidejo iz trdnega v tekoče stanje. Uporabljamo jih za prelive, npr. pri študiju bakteriofagov.

C. VRSTE GOJIŠČ Osnovna gojišča so bogata kompleksna gojišča, na katerih raste večina heterotrofnih

bakterij. Primeri: hranilna juha, peptonska voda. Obogatena gojišča dobimo, če osnovnim gojiščem primešamo različne dodatke, ki so vir

aminokislin, vitaminov, purinov, pirimidinov in drugih neznanih rastnih dejavnikov. Uporabljamo jih za izolacijo in gojenje prehransko zahtevnejših bakterij. Najbolj splošno obogateno gojišče je krvni agar, ki ga pripravimo tako, da v osnovno gojišče dodamo 5% krvi. Če kri dodamo v vroče gojišče, dobimo čokoladni agar. Gojišča lahko obogatimo tudi s krvnim serumom, jajci, posnetim mlekom.

Diferencialna gojišča omogočajo rast večini bakterij, vendar se na njih kolonije različnih bakterijskih vrst razlikujejo med seboj. Krvni agar je diferencialno gojišče, na katerem ločimo hemolitične in nehemolitične vrste bakterij.

Selektivna gojišča so sestavljena tako, da omogočajo rast samo določeni skupini bakterij (negativna selekcija). To dosežemo z dodajanjem snovi, ki zavirajo rast večine drugih mikroorganizmov (antibiotiki, barvila, NaCl).

Bogatitvena gojišča enako kot selektivna omogočajo rast samo določenim mikroorganizmom, ker vsebujejo specifične vire ogljika ali drugih potrebnih elementov, ki

14

omogočajo rast samo zaželenim mikrobom (pozitivna selekcija). Običajno so tekoča in jih uporabljamo za namnoževanje določene bakterijske vrste ali skupine, ki jo želimo izolirati iz določenega materiala in za katero vemo, da v tem materialu ni številna. Primer; Chujev bujon.

Gojišča za ugotavljanje lastnosti bakterij so sestavljena tako, da lahko ugotavljamo dejavnost različnih encimov, sposobnost bakterije, da razgrajuje različne substrate in podobno.

Produkcijska gojišča se uporabljajo v industriji. Običajno niso optimalna za rast mikroorganizmov, vendar inducirajo sintezo določenih encimov za sintezo želenega biotehnološkega produkta.

MIKROBNA KULTURA

Mikrobna kultura so mikroorganizmi, ki porastejo v gojišču ali na njem. Mikrobna kultura je lahko mešana ali čista. V čisti kulturi je samo ena vrsta mikroorganizmov in zato so lastnosti kulture lastnosti te vrste mikroorganizma. V mešani kulturi je več kot ena vrsta mikroorganizmov. Lastnosti takšne kulture (npr. produkcija antibiotika, povzročanje bolezni, razgrajevanje določenih substratov) ni mogoče pripisati samo eni od vrst v mešani kulturi. Razen tega se mikroorganizmi med seboj lahko zavirajo v rasti ali pa ena vrsta omogoča rast druge. Potomke ene same celice, ki je rasla in se delila na trdnem gojišču, imenujemo kolonija (gruča celic, s prostim očesom viden kupček celic, naselek). Ko izoliramo mikroorganizem v čisti kulturi, pridobimo mikrobni sev (mikrobni izolat znotraj vrste).

V mikrobiologiji nas sicer zanima delovanje mešanih kultur, kakršne so večinoma v naravi, vendar običajno delamo s čistimi kulturami mikroorganizmov, saj je le na ta način mogoče proučevati vsako vrsto posebej.

NACEPLJANJE MIKROORGANIZMOV NA/V GOJIŠČA Mikroorganizme lahko nacepljamo na trdna ali v tekoča gojišča. Za nacepljanje ali inokulacijo uporabljamo cepilno zanko (eza), lahko pa tudi vatenko ali pipeto.

Če nacepljamo mikroorganizme na trdna gojišča, morajo biti kolonije po inkubaciji dovolj narazen, da lahko zrastejo do za vrsto značilne velikosti in da razvijejo druge značilnosti. Tak način cepljenja imenujemo redko cepljenje ali cepljenje do posameznih kolonij in bo opisano v nadaljevanju.

Kadar bakterijska kultura raste enakomerno po vsej površini trdnega gojišča in ne moremo razločiti posameznih kolonij, govorimo o konfluentni rasti. Tak način cepljenja je potreben le pri redkih tehnikah (npr. antibiogram) in ne omogoča preverjanja čistosti kulture.

REDČENJE KULTURE DO POSAMEZNIH KOLONIJ Posamezne kolonije dobimo, če kulturo ali preiskovani material nacepimo tako, da ga

"razredčujemo" na površini trdnega gojišča v petrijevki. Kulturo nanesemo na majhno površino ob robu gojišča. Vsako nadaljnjo serijo potez (glej sliko 1: poteze označene s številkami) začnemo s sterilno cepilno zanko (najhitreje delamo, če izmenoma uporabljamo dve zanki: ena se hladi, z drugo, ohlajeno, delamo).

15

Slika 1: Redčenje bakterijske kulture na ploščah do posameznih kolonij.

NAČINI RAZŠIRJANJA INFEKTIVNIH MIKROORGANIZMOV Epidemiologija je veda o pojavljanju in razširjenosti bolezni. Pojasnjuje, kako določen specifičen povzročitelj infekcije (okužbe) preživi v okolju in kako se razširja v skupini občutljivih osebkov. Način razširjanja infektivnega mikroorganizma – prenos bolezni. Najpogostejša načina vstopa povzročitelja infekcije v telo sta prek respiratornega in prebavnega sistema. Zato je umivanje rok ena od najpomembnejših metod nadzora razširjanja mikroorganizmov. Načini razširjanja mikroorganizmov: - prenos z osebe na osebo ali neposredni stik (ob rokovanju, poljubljanju ...) - prenos prek okuženega predmeta ali posredni stik (s kozarca, pribora, različnih površin, šminke ...)

16

1. naloga: Pomen pravilnega umivanja rok

Material: 4 plošče (petrijevke) krvnega agarja dezinfekcijsko milo razkužilo Spitaderm 70-odstotni etanol

Izvedba: 1. Petrijevke s krvnim agarjem razdelite na dva dela in ju označite. Ena bo služila za odtis

prstov pred (označi s »SUHO«) in po (označi z »MOKRo«) spiranju z vodo, druga pred (označi s »SUHO«) in po (označi z »UMITO«) pravilnem umivanju z dezinfekcijskim milom, tretja pred (označi s »SUHO«) in po (označi z »RAZKUŽENO«) dezinfekciji s Spitadermom, četrta pa pred (označi s »SUHO«) in po (označi s »ETANOL«) dezinfekciji z etanolom.

2. Na eno polovico plošče (»SUHO«) odtisnite blazinice prstov, roke nato umijte pod tekočo vodo tako, da drgnete eno ob drugo 30 sekund, nato vodo na rokah otresite in odtisnite blazinice prstov iste roke kot prej na ploščo (»MOKRO«).

3. Nato na drugo petrijevko na polovico plošče (»SUHO«) odtisnite blazinice prstov, roke nato umivajte pod tekočo vodo z dezinfekcijskim milom 3 minute. Posebno pozornost posvetite prostoru med prsti, pod nohti in na površini dlani. Roke sperite, nato vodo na rokah otresite in odtisnite blazinice prstov iste roke kot prej na ploščo (»UMITO«).

4. Na tretjo petrijevko na polovico plošče (»SUHO«) odtisnite blazinice prstov, nato si razkužite roke s Spitadermom tako, da pribl. 2 ml razkužila nanesete na dlani in jih toliko časa manete, da se razkužilo posuši (ponovno posebno pozornost posvetite prostoru med prsti, pod nohti in na površini dlani). Nato odtisnite blazinice prstov iste roke kot prej na ploščo (»RAZKUŽENO«).

5. Na četrto petrijevko na polovico plošče (»SUHO«) odtisnite blazinice prstov, nato si razkužite roke s 70-odstotnim etanolom tako, da pribl. 2 ml etanola nanesete na dlani in jih toliko časa manete, da se razkužilo posuši (ponovno posebno pozornost posvetite prostoru med prsti, pod nohti in na površini dlani). Nato odtisnite blazinice prstov iste roke kot prej na ploščo (»ETANOL«).

6. Gojišča inkubirajte pri 37 oC največ dva dni.

Rezultati: 1. Opazujte vzorec rasti na ploščah in primerjajte obe polovici. Prav tako primerjajte

različne načine umivanja rok. Opazujte ne samo število kolonij pač pa tudi različne tipe kolonij. Kaj lahko zaključite?

Plošče so vedno, razen pri pregledovanju, obrnjene z gojiščem navzgor.

17

2. Skicirajte rast na ploščah.

2. naloga: Posredni in neposredni prenos mikroorganizmov

Material: petrijevke hranilnega agarja lateksna rokavica epruveta s kulturo Serratia rubidea

Izvedba: 1. Razdelite se v dve skupini. Skupina A bo preučevala posredni prenos

mikroorganizmov, skupina B pa neposrednega. Vsak študent naj označi ploščo gojišča s številko skupine (A ali B) in s svojo številko v skupini (npr. pripišite si številke od 1 do 8 po vrsti, kot sedite).

2. Na desno roko si nataknite lateksno rokavico. Celotno vajo izvajate izključno s to roko!! Asistentka poda na zunanji strani kontaminirano epruveto prvemu v skupini A (vir infekcije). Ta jo poda drugemu, ta tretjemu in tako naprej.

3. Nato se prvi v skupini A rokuje s prvim v skupini B, ta se rokuje z drugim, ta s tretjim in tako naprej.

4. Različne dele roke (rokavice) odtisnite na plošče hranilnega agarja. Nato odstranite rokavico tako, da bo obrnjena narobe, in jo odvrzite v vrečko z materialom za avtoklaviranje. Roke si pravilno razkužite.

5. Asistentka bo nato vzela bris s kontaminirane epruvete in ga nanesla na polovico plošče hranilnega agarja. Nato bo epruveto dobro obrisala (razkužila) s 70% etanolom in ponovno vzela bris z razkužene epruvete ter ga nanesla na drugo polovico agarja.

5. Gojišča inkubirajte pri 25 oC do naslednjih vaj.

Rezultati: 1. Plošče postavite na pult po vrsti tako, kot so bile nacepljene (kot je potekal prenos

epruvete oz rokovanje). Opazujte vzorec rasti na ploščah od prve osebe do zadnje. 2. Zabeležite si, kje je močnejša, kje šibkejša rast, kje je ni več (+++ močna rast, ++ rast,

+ šibka rast, - ni rasti).

18

Skupina oseba 1 (vir

okužbe) oseba 2 oseba 3 oseba 4 oseba 5 oseba 6 oseba 7 oseba 8

A B

3. Kaj lahko zaključimo iz tega poskusa?

3. naloga: Mikroorganizmi v zraku in kapljične okužbe

Material: 4 petrijevke krvnega agarja

Izvedba: 1. Ploščo krvnega agarja označite z »GOVOR«, jo odprite in v odprto petrijevko govorite

10 minut z razdalje 15 cm. Nato jo pokrijte. 2. Drugo ploščo krvnega agarja označite s »KAŠELJ«, jo odprite in vanjo zakašljajte (ali

pa kihnite vanjo). Nato jo pokrijte. 3. Tretjo in četrto ploščo krvnega agarja pustite odprto za 10 minut, eno v vajalnici (to bo

tudi kontrola), drugo nesite ven. 4. Vse plošče inkubirajte pri 30 C do naslednjič. Rezultati: 1. Opazujte rast na ploščah krvnega agarja. Kaj lahko zaključite na osnovi primerjave

plošč »GOVOR« in »KAŠELJ« s kontrolo? 2. Opazujte rast na ploščah krvnega agarja, ki ste jih pustili odprti v laboratoriju in zunaj

ter si zapišite zaključke.

19

4. naloga: Mikroorganizmi v/na vsakodnevnih predmetih

Material: 4 petrijevke krvnega agarja sterilne vatenke sterilna fiziološka raztopina

Izvedba: 1. Ploščo krvnega agarja označite. Izberite neko površino ali predmet (mobitel, šminka,

WC školjka, tla, denar ...). 2. Namočite vatenko v fiziološko raztopino. S tako pripravljeno vatenko naredite bris

izbrane površine. 3. Kužnino razmažite po delu plošče krvnega agarja ob robu. S cepilno zanko naredite

nekaj pravokotnih potez čez prvi namaz, nato nadaljujte v isti smeri cepljenja, ne da bi se dotikali prvega razmaza.

4. Ploščo inkubirajte do dva dni na 37 oC. Rezultati: 1. Opazujte rast na ploščah krvnega agarja. Kaj lahko zaključite?

20

5. naloga: Demonstracija priprave gojišč (Narišite shematski prikaz priprave gojišč)

Rezultati: 1. Kakšno je zaporedje korakov pri pripravi trdnih gojišč krvnega agarja v petrijevkah? Izberite pravilne trditve in določite pravilni vrstni red! ____ umerimo pH in uravnamo volumen ____ ohladimo na 37C ____ steriliziramo z avtoklaviranjem ____ zatehtamo sestavine gojišča razen agarja ____ steriliziramo s filtriranjem ____ ohladimo na 60C ____ dodamo agar ____ razlijemo v sterilne petrijevke ____ dodamo termolabilne sestavine gojišč (kri, antibiotiki...) ____ v destilirani vodi raztopimo sestavine gojišča ____ razlita gojišča na petrijevkah steriliziramo z avtoklaviranjem

21

6. naloga: Uporaba različnih vrst gojišč Material:

hranilna juha selektivno gojišče (agar MacConkey) diferencialno gojišče (krvni agar) osnovno gojišče (hranilni agar) spatula 96% etanol za obžiganje pipete 10 ml zemlja mešana kultura (Escherichia coli in Bacillus cereus)

Izvedba: 1. Na epruveto napišite številko skupine, datum in tip gojišča. Vanjo odpipetirajte 10 ml

hranilne juhe. 2. S sterilno spatulo dajte v hranilno juho približno 1 g zemlje. 3. Hranilno juho inkubirajte na sobni temperaturi dva dni in jo nato spravite v hladilnik. 4. Pripravite po eno ploščo navadnega hranilnega agarja, krvnega agarja in agarja po

MacConkeyju ter nanje napišite številko skupine in datum. 5. Z zanko cepite mešano kulturo E. coli in B. cereus na vsako ploščo. Pazite, da boste na

ploščo nanesli dovolj kulture. Cepite redko! 4. Cepljena gojišča inkubirajte pri temperaturi 37 oC 24 ur.

Rezultati: Za vsako gojišče napišite, ali raste ena ali obe vrsti bakterij ter kakšne so posebnosti kolonij.

tip gojišča E. coli B. cereus

hranilni agar

krvni agar

agar MacConkey

Kakšna je razlika med kulturama na hranilnem in krvnem agarju in kakšna med kulturama na hranilnem in agarju MacConkey?

22

2. Vaja: Vpliv temperature in kisika na rast mikroorganizmov

RAST MIKROORGANIZMOV Rast bakterij običajno pomeni povečanje števila celic. Če inokuliramo bakterije v tekoče gojišče in ga inkubiramo pri konstantni temperaturi, opazimo značilno spreminjanje števila bakterij v času, kar nam opisuje rastna krivulja. To lahko razdelimo v več faz: 1. lag faza - začetno obdobje, ko se takoj po inokulaciji bakterij v gojišče običajno celična delitev ne prične takoj, kjer ni nobene celične delitve ali pa so te zelo redke (adaptivna faza, faza prilagajanja). Med lag fazo se celice prilagajajo na novo okolje (npr. s sintezo encimov za uporabo na novo razpoložljivih hranil). Dolžina lag faze je največkrat odvisna od pogojev, v katerih so bile celice pred vnosom v sveže gojišče in če bili ti zelo podobni je običajno skoraj neopazna. Med lag fazo sicer teče sinteza celičnih komponent, vendar vzporedno s povečevanjem skupne celične mase ne prihaja do delitve celic (neuravnotežena rast). 2. logaritemska (log) ali eksponencialna faza, ko se celice prilagodijo na nove pogoje, začno rasti in se vse hitreje deliti, pri čemer določajo hitrost rastni pogoji. V tej fazi se celično število in masa populacije podvajata s konstantno hitrostjo (uravnotežena rast). Na diagramu rasti v preprosti aritmetični skali v tej fazi dobimo strmo vzpenjajočo se krivuljo. 3. stacionarna faza, ko z rastjo celice porabljajo hranila in izločajo odpadne snovi v gojišče. Zato se rast upočasni in preide v fazo, ko se število živih celic ne povečuje. Ta faza lahko traja tudi več dni. V tej fazi se celične funkcije nadaljujejo, tvorijo se sekundarni metaboliti (antibiotiki, toksini) in sproži se sporulacija. V tem času nastopi lahko fenomen prikrite rasti, ko se nekatere celice sicer delijo, vendar jih enako število odmre. 4. faza odmiranja, kjer se število živih celic v populaciji progresivno zmanjšuje.

Slika 2: Rastna krivulja.

čas

Število celic (log) lag faza

log (eksponencialna) faza

stacionarna faza

faza odmiranja

23

VPLIV TEMPERATURE Vsak mikroorganizem ima optimalno, minimalno in maksimalno rastno temperaturo

(Slika 3). Temperaturni optimum je temperatura, pri kateri je mikrobna rast najhitrejša. Maksimum je najvišja in minimum najnižja temperatura, pri kateri še opazimo rast mikroorganizma.

mikrobna rast

temperatura

temp.minimum

temp. optimum

temp.maksimum

Slika 3: Rast kulture mikroorganizma pri različnih temperaturah. Temperaturni optimum, minimum in maksimum se nanašajo na rast mikroorganizma in

ne na preživetje. Glede na temperaturo, pri kateri rastejo, delimo mikroorganizme na: Temperatura za rast v oC

minimum optimum maksimum

psihrofilni -50 515 1520 mezofilni 1020 2040 4045 termofilni 2545 4560 6080 ekstremno termofilni

6580 80100 100

Večina znanih bakterij najbolje raste pri temperaturah od 28 oC do 38 oC. To so mezofilne

bakterije. Druge vrste, psihrofili, najbolje rastejo pri precej nižjih temperaturah, tj. 16 oC ali manj. Termofilne bakterije najhitreje rastejo pri temperaturah okoli 60 oC.

V eni izmed faz rasti se celice delijo s konstantno hitrostjo. Takšno rast imenujemo eksponencialna in je tista, ki nas zanima pri proučevanju vpliva temperature na rast bakterij.

Če bi isti sev bakterije gojili v enakem gojišču, vendar pri različnih temperaturah, bi opazili razlike v hitrosti eksponencialne rasti (slika 4).

24

log. št.celic

Slika 4: Hitrost rasti pri različnih temperaturah. Za spremljanje hitrosti rasti bi morali v časovnih presledkih ugotavljati število bakterij

(na ploščah, s štetjem, z merjenjem optične gostote). Vendar bo pri tej vaji dovolj, če bomo samo primerjali rast neke bakterije pri treh različnih temperaturah, kajti tudi tako bomo ugotovili, ali je ta bakterija psikrofilna, mezofilna ali termofilna.

VPLIV KISIKA Mikroorganizme lahko ločimo med drugim tudi glede na njihovo rast v prisotnosti kisika. Striktni ali obligatni aerobi rastejo samo v prisotnosti kisika. Običajno jih najdemo med

prašnimi delci, na površini živali in rastlin ter v vrhnjih slojih tal. Njihov metabolizem je izključno respiratoren, končni akceptor elektronov pa je kisik.

Večina znanih bakterij spada med fakultativne anaerobe. Rastejo lahko s kisikom ali brez njega. V naravi jih najdemo tam, kjer je kisik samo občasno. Če imajo na razpolago kisik, je njihov metabolizem respiratornega tipa, ob pomanjkanju kisika pa lahko preidejo na fermentacijo. Respiratorni metabolizem je energijsko ugodnejši, zato fakultativni anaerobi rastejo hitreje v aerobnih razmerah in imajo večji prirast biomase na enoto hranila.

Mikroaerofilne bakterije (npr. rodova Campylobacter in Actinomyces) za rast potrebujejo znižan parcialni tlak kisika (510%) in zvišan parcialni tlak CO2.

Striktni ali obligatni anaerobi potrebujejo za rast atmosfero brez kisika, saj je ta zanje toksičen. Običajno nimajo encimov dihalnih verig za prenos elektronov, tako da je njihov metabolizem fermentativen. Najdemo jih v močvirskem blatu, sedimentih jezer, rek in morij, v vampu prežvekovalcev, v prebavnem traktu drugih živali ali v globokih ranah. Med striktnimi anaerobi so najbolj znani rod Clostridium, metanogene in sulfat-reducirajoče bakterije ter mnoge bakterije, ki živijo v prebavnem traktu živali (Bacteroides).

Aerotolerantni anaerobi so striktno fermentativni mikroorganizmi (npr. mlečnokislinske bakterije), ki ne morejo uporabljati kisika, vendar ta zanje ni toksičen. Rast je boljša, če kisika ni. Razlog, da mikroorganizmi lahko rastejo v različnih okoljih z ali brez kisika, so njihovi encimi:

25

katalaza superoksid dismutaza striktni aerobi + + fakultativni anaerobi + + mikroaerofilne bakterije - + striktni anaerobi - - + prisotnost encima, - odsotnost encima

Poznavanje zahtev mikroorganizma po kisiku je pomembno pri gojenju in tudi pri

klasifikaciji. Eden izmed enostavnih načinov za ugotavljanje te lastnosti pri bakterijah je gojenje v kulturi globokega agarja.

Globoki agar je trdno ali poltrdno gojišče v epruveti. Pred inokulacijo globoki agar navadno segrejemo do 100 oC. Gojišče postane tekoče in zmanjša se vsebnost kisika. Pri ohlajanju se v gojišču ustvari gradient kisika, pri katerem količina kisika pada proti dnu.Cepimo ga tako, da cepilno zanko ali iglo z bakterijsko kulturo zabodemo v še tekoč agar (50 C) do dna epruvete in tako dobimo paličasto kulturo.

Po inkubaciji gojišča pregledamo. Bakterije bodo rasle vzdolž vse epruvete ali le v posameznih predelih, odvisno od njihove tolerance ali potrebe po kisiku (Slika 5). Striktni aerobi rastejo le na površini ali v vrhnjih plasteh gojišča. Striktni anaerobi rastejo le na dnu, če pa so močno občutljivi za kisik, je možno, da sploh ne rastejo. Fakultativni anaerobi rastejo vzdolž vse epruvete, prav tako tudi aerotolerantni anaerobi, vendar je njihova rast na dnu boljša.

veliko kisika

malo kisika

striktni aerobi

mikroaerofilnebakterije

fakultativnianaerobi

striktni anaerobi

Slika 5: Rast različnih tipov bakterij v kulturi globokega agarja.

26

ANAEROBNE MIKROBIOLOŠKE TEHNIKE Za delo z anaerobnimi bakterijami je treba prilagoditi mikrobiološke tehnike, saj je kisik

za te bakterije toksičen. Razlogi za toksičnost kisika so različni: nastanek toksičnih intermediatov ali produktov med aerobnim metabolizmom (H2O2, radikali O2

- (superoksid) in OH-), ki jih anaerobi zaradi pomanjkanja katalaze (peroksidaze) in superoksid dismutaze ne morejo razgrajevati; kisik oksidira in tako inaktivira pomembne encime z SH- skupinami; kisik inhibira metabolizem, ker reagira s flavoproteini in reduciranimi oksidazami NADH in s tem kritično zniža redukcijsko moč celice.

Pri delu s striktnimi anaerobi je pomembna odstranitev kisika iz okolja pri vseh postopkih dela (jemanje vzorcev, transport, precepljanje, gojenje), medtem ko je pri aerotolerantnih bakterijah pomembna le inkubacija v anaerobni atmosferi. Anaerobne razmere med vsemi postopki, in ne samo med gojenjem, zagotavlja anaerobna komora ali tehnika Hungate, kjer se vse odprte epruvete prepihava z dušikom. Za gojenje lahko anaerobno atmosfero (10% H2, 510% CO2 in 80% N2) vzpostavimo v anaerobnih vrečkah ali loncih z generatorji anaerobnih razmer (gas pak) ali s prepihovanjem s plini. Lahko se uporablja tudi globoki agar, gojišča z eritrocitnimi duhki (membrane eritrocitov, ki reducirajo gojišče) ali drugimi reducenti, kot sta cistein in tioglikolat.

Gojišča za anaerobe se ne razlikujejo bistveno od gojišč za aerobe, le da so običajno bogatejša z organskimi snovmi. Gojišča lahko vsebujejo reducente in redoks indikatorje. Tak je resazurin, ki je reduciran brez barve, oksidiran pa rožnat. Običajno uporabljamo prereducirana gojišča, ki jih dva dni inkubiramo v anaerobni atmosferi. S tem reduciramo kisik in oksidirane komponente in tako znižamo O/R potencial gojišč. Striktni anaerobi rastejo le pri nizkem redoks potencialu. Anaerobe shranjujemo v mesnem gojišču ali v globoki agar, pri sporogenih vrstah shranjujemo spore.

27

7. naloga: Vpliv temperature na rast različnih vrst bakterij Material:

kulture: E. coli Bacillus stearothermophillus Pseudomonas fluorescens

gojišče: BHI inkubatorji: 4 oC, 30 oC, 37 oC, 55 oC

Izvedba: 1. Plošče razdelite na tri enake dele ter jih ustrezno označite (oznaka skupine, ime

mikroorganizma, datum inokulacije in temperatura inkubacije). 2. Vsako od treh kultur cepite redko na tretjino plošče, in sicer na štiri petrijevke: eno za

inkubacijo pri 4 oC, drugo za 30 oC, tretjo za 37 oC in četrto za 55 oC. 3. Inkubirajte gojišča pri določeni temperaturi 48 ur. 4. Po inkubaciji preglejte cepljena gojišča ter označite rast. 5. Psikrofilni organizmi rastejo počasneje, zato bo morda potrebna daljša inkubacija

(skupaj 5 do 7 dni). V tem primeru ne pozabite nadalje inkubirati tudi standardnega mikroorganizma. Če nadaljnja inkubacija ni potrebna, pravilno zavrzite uporabljeni material.

Rezultati:

V tabelo vpišite, kje je močnejša, kje šibkejša rast, kje je ni več (+++ močna rast, ++ rast, + šibka rast, - ni rasti) in določite tip bakterije glede na optimalno rastno temperaturo.

Escherichia coli Bacillus stearothermophilus

Pseudomonas fluorescens

4 oC

30 oC

37 oC

55 oC

tip bakterije glede na

rast pri določeni temperaturi

28

8. naloga: Vpliv koncentracije prostega kisika na rast – kultura v globokem agarju

Material:

kulture: Clostridium sporogenes Micrococcus luteus

E. coli triptikazni sojin globoki agar (segret na 100 oC in inkubiran na 45 oC)

Izvedba: 1. Iz vodne kopeli jemlji le posamezne epruvete, da se agar med delom ne strdi. 2. Vsako epruveto pravilno označi. 3. S cepilno zanko cepi bakterije do dna epruvete.

Pomembno je, da je gojišče enakomerno cepljeno po vsej dolžini. Gojišča ne moremo enostavno premešati, saj bi s tem povečali količino kisika. Lahko pa ga rahlo mešamo z zanko, medtem ko jo jemljemo iz agarja, in tako enakomerno nacepimo bakterije.

4. Gojišče naj se strdi pri sobni temperaturi. 5. Cepljena gojišča inkubiraj pri 37 oC 48 ur. Če boš cepljena gojišča pregledoval kasneje,

jih je treba spraviti v hladilnik. Vsaka skupina naj ima tudi negativno kontrolo necepljeno gojišče globokega agarja. Kaj je namen negativne kontrole?

6. Po inkubaciji preglej epruvete. Pomembno je, kje in kako so zrasle bakterije. Rast lahko opaziš kot povečano motnost gojišča (inokulirane velike koncentracije bakterij) ali pa kot posamezne kolonije v agarju (manj inokuliranih bakterij). Bodi pozoren tudi na razpoke v agarju. Te so posledica v fermentaciji nastalega vodika in ogljikovega dioksida. Pri katerih organizmih se pojavljajo?

7. Zabeleži rezultate. Na sliko vriši, kje in kako so bakterije porasle. Določi tudi tip posameznega mikroorganizma glede na njegovo potrebo po kisiku.

8. Pravilno zavrzi material. Rezultati:

Narišite rast bakterijskih kultur v globokem agarju. kultura ____________ ____________ ______________ glede na potrebo po kisiku je ____________ ____________ ______________ Ali lahko temperaturo in atmosfero uporabimo kot dejavnik selekcije oz. bogatitve pri izolaciji bakterij? Razložite!

29

9. naloga: Gojenje bakterij v anaerobnih razmerah Material:

kulture: E. coli Clostridium sporogenes Micrococcus luteus

dve plošči agarja BHI Izvedba: 1. Dve plošči agarja BHI razdeli na tri enake dele in na vsak del napiši ime cepljene

bakterijske kulture. 2. Z zanko cepi vse tri kulture na obe plošči. 3. Eno ploščo inkubiraj aerobno, drugo anaerobno v anaerobnem loncu.

Rezultati: Označite, kje so bakterije zrasle.

aerobna inkubacija anaerobna inkubacija Kako smo zagotovili anaerobne razmere?

30

3. Vaja: Metode določevanja velikosti populacije mikroorganizmov – primer kolititra Rast je v mikrobiologiji povezana s povečevanjem števila celic in količine celičnih komponent (tvorba nove protoplazme, kar pomeni povečanje celične mase, števila ribosomov, podvojitev DNA, sinteza nove celične stene in plazemske membrane). Pri enoceličnih organizmih lahko rast izmerimo z dvema različnima parametroma, določimo lahko spremembe v celični masi in spremembe v številu celic. I. Metode s katerimi merimo celično maso so fizikalno-kemijske in so lahko direktne (neposredne) ali indirektne (posredne): - direktne fizikalne meritve suhe, mokre teže ali volumna celic, - direktne kemijske meritve določenih komponent celic kot so proteini, DNA, vsebnost

ATP, totalnega N, - indirektne meritve kemijske aktivnosti, poraba ali sproščanje O2 in CO2, - turbidimetrično merjenje (določevanje optične gostote ali motnosti s pomočjo največkrat

spektrofotometra, koliko svetlobe sipa neka suspenzija celic), kjer pa je omejitev na 107 bakterij na ml, tu je potrebno krivuljo optične gostote umeriti z neko drugo metodo določevanja celične mase ali števila

II. Metode s katerimi merimo število celic so ravno tako lahko direktne ali indirektne: a.) direktne ali števne metode: - štetje pod mikroskopom:

- v posebnih komorah – hemocitometer Primer: štetje v komori po Petroff-Hauserju

- metoda po Breedu (štejemo na običajnih objektnih stekelcih, kjer nanje na določeno površino (1 cm2) razmažemo določen volumen (10 l) kulture, pobarvamo in preštejemo v vidnem polju, za izračun potrebujemo še premer vidnega polja).

Pri obeh metodah dobimo tako število živih kot mrtvih mikroorganizmov, kar lahko popravimo z posebnimi fluorescenčnimi barvili, s katerimi lahko razlikujemo med živimi in mrtvimi celicami.

- elektronski števci – Coulterjev števec, kjer določamo tako število kot porazdelitev velikosti celic.

b.) indirektne ali gojitvene metode: - štetje na/v ploščah: - metoda razmaza - metoda nalivanja - filtracija Pri tej metodi določen volumen vzorca tekočine prefiltriramo skozi sterilen membranski filter (velikost por mora biti manjša od velikosti mikroorganizma, ki ga štejemo npr. od 0.22 m do 1.2 m). Filter nato položimo na ploščo gojišča in po inkubaciji preštejemo kolonije. - metoda najbolj verjetnega števila (Most Probable Number – MPN, ta metoda je sestavni del koli titra)

To je metoda, pri kateri kulturo ali preiskovani vzorec cepimo v serijo tekočih gojišč in glede na število gojišč, v katerih ugotovimo bakterijsko rast, ugotavljamo približek za število bakterij v vzorcu. Metoda se rutinsko uporablja pri ugotavljanju števila koliformnih bakterij v vodi in jo bomo spoznali pri tej vaji.

31

Gojitvene metode: določimo le žive celice, velja predpostavka 1 celica - 1 kolonija.

KVALITETA PITNE VODE S pitno vodo se lahko prenašajo povzročitelji številnih bolezni. Voda je edina pot za

širjenje kolere ter možna pot za prenos tifusa, salmonel, šigel, virusa polio, virusa hepatitisa in ameb, ki povzročajo črevesno dizenterijo. Kvaliteto pitne vode je zato treba stalno nadzorovati.

Po pravilniku za higiensko neoporečnost pitne vode so vode razdeljene v tri kvalitetne razrede:

- prečiščena in razkužena voda ter na izviru ustekleničena voda - naravna voda - zaprt vir

- odprt vir. Za vsako od teh so predpisane mikrobiološke, virološke, parazitološke in kemične

lastnosti. Predpisane so tudi metode odvzemanja in preiskovanja vzorcev. V pitni vodi ne sme biti alg in drugih organizmov, ki lahko spremenijo videz, vonj in

okus vode, bakterij vrste Salmonella, vrste Shigella, Vibrio cholerae in drugih patogenih mikroorganizmov, koliformnih bakterij in streptokokov fekalnega izvora, enterovirusov (npr. virus polio) in kemikalij (55 kemičnih snovi npr. bojni strupi, PCB ...). Določeno je število dovoljenih aerobnih mezofilnih bakterij v 1 ml vode in število koliformnih bakterij.

METODE ZA UGOTAVLJANJE NEOPOREČNOSTI PITNE VODE Preiskava vode na vse potencialno patogene mikroorganizme v vodi bi bila zamudna in

draga. Mikrobiologi zato ugotavljajo prisotnost določene skupine indikatorskih bakterij – koliformne bakterije. To je skupina črevesnih bakterij, ki so podobne E. coli in so verjetno enterobakterije. Zanje je značilno, da:

- so majhni, po Gramu negativni bacili, - niso sporogeni, - fermentirajo laktozo do kisline in plina, - rastejo na diferencialnih gojiščih za enterobakterije.

Prisotnost koliformnih bakterij v vodi kaže na onesnaženje s fekalnimi odplakami, te pa so eden največjih možnih virov potencialnih patogenih mikroorganizmov. Koliformne bakterije so primeren indikator tudi zato, ker v vodi preživijo dlje kot patogeni mikrobi; in tako lahko sklepamo, da v vodi, ki nima koliformnih bakterij, prav tako ni patogenih.

Najobičajnejša metoda za ugotavljanje neoporečnosti pitne vode je koli titer, uporablja se tudi štetje bakterij na filtru. Izjemoma je voda lahko neoporečna glede na koli titre, vseeno pa vsebuje patogene mikroorganizme.

KOLI TITER Pri tej metodi uporabimo serijo tekočih gojišč z laktozo, ki jim dodamo različne

razredčine vodnega vzorca. Po inkubaciji preštejemo epruvete, v katerih je laktoza fermentirana do kislin in plina, ter iz statistično utemeljenih tabel odčitamo najverjetnejše število koliformnih bakterij v 100 ml vode – MPN (most probable number).

Preiskava poteka v dveh korakih. Rast v tekočih gojiščih je prvi presejalni test, s katerim se ugotovi verjetne koliformne bakterije (ta del testa temelji na metodi določevanja števila

32

mikrobov MPN). Ker so tudi v tleh bakterije, ki po definiciji spadajo med koliformne (Enterobacter aerogenes), je treba gojišče iz pozitivnih epruvet cepiti še na trdna selektivna gojišča za enterobakterije. Ta potrditveni test pokaže, ali gre res za bakterije fekalnega izvora.

METODA S FILTROM Pri tej metodi prefiltriramo določeno količino vode (običajno 100 ml) skozi membranski

filter, filter položimo na ploščo s selektivnim gojiščem za enterobakterije in inkubiramo. Po inkubaciji preštejemo na filtru porasle kolonije, ki fermentirajo laktozo (ta metoda temelji na metodi štetja na ploščah).

KVALITETA VOD – MIKROBIOLOŠKI PARAMETRI (PO DIREKTIVAH EU)

Ti parametri ne smejo biti preseženi, da je vzorec vode proglašen kot ustrezen.

vzorec mikroorganizem število celic

totalne koliformne bakterije 0/ 100 ml vzorca fekalne koliformne bakterije 0/ 100 ml vzorca

pitna voda iz vodovoda

E. coli 0/ 100 ml vzorca totalne koliformne bakterije 0/ 100 ml vzorca fekalne koliformne bakterije 0/ 100 ml vzorca E. coli 0/ 100 ml vzorca preštete mikrobne kolonije pri inkubaciji 22 C

100/ml

ustekleničena pitna voda

preštete mikrobne kolonije pri inkubaciji 37 C

20/ml

totalne koliformne bakterije 10/ 100 ml vzorca E. coli 0/ 100 ml vzorca

kopalni bazeni

preštete mikrobne kolonije pri inkubaciji 37 C

100/ml

totalne koliformne bakterije 10 000/100 ml vzorca fekalne koliformne bakterije 2 000/100 ml vzorca

kopalna voda na plaži (morje, reke, jezera)

E. coli 500/100 ml vzorca

33

10. naloga: Koli titer pitne vode Material:

vzorec pitne vode (50 ml) pet epruvet z 10 ml peptonske juhe z laktozo (2x koncentracija) agar MacConkey pipete z nastavki pipete 10 ml

Izvedba: 1. V vsako od petih epruvet nacepite 10 ml vodnega vzorca. 2. Gojišča inkubirajte 24 ur pri temperaturi 37 oC. Pozitivna je tista epruveta, pri kateri se

barva spremeni iz rumene v rožnato in je v Durhamovi cevki plin. To je prvi presejalni test za koliformne bakterije fekalnega izvora.

3. Fekalno kontaminacijo vode potrdite tako, da kulturo iz pozitivne epruvete nacepite na trdno selektivno gojišče MacConkey in ga inkubirajte pri 45 oC 24 ur. Porasle kolonije so koliformne enterobakterije fekalnega vira, saj koliformne bakterije iz okolja ne rastejo pri tej temperaturi.

Vzorec: 10 ml

Gojišče (2x): 10 ml

Slika 6: Shema 1 x 5 testa. Najverjetnejše število (most probable number – MPN) s 95% mejo zaupanja za različne

kombinacije pozitivnih in negativnih epruvet, če se uporabi pet epruvet s po 10 ml (10 ml gojišča dvojne koncentracija + 10 ml preiskovane vode).

95% meja zaupanja

št. pozitivnih epruvet

MPN / 100 ml spodnja zgornja

0 < 2,2 0 6,0 1 2,2 0,1 12,6 2 5,1 0,5 19,2 3 9,2 1,6 29,4 4 16,0 3,3 52,9 5 > 16,0 8,0 neskončno

34

Rezultati:

število pozitivnih epruvet: ___________ MPN/ _____ ml : ___________

Rast na agarju MacConkey pri temperaturi 45 oC: DA NE

Je ta voda pitna? Kako ste to ugotovili?

11. naloga: Koli titer vzorca vode Material:

vzorec vode (50 ml) – če je potrebno, vzorec predhodno redčite tri epruvete z 10 ml peptonske juhe z laktozo dvojne koncentracije šest epruvet z 9 ml peptonske juhe z laktozo normalne koncentracije agar MacConkey pipete z nastavki pipete 10 ml

Izvedba: 1. Vodni vzorec nacepite v epruvete po naslednji shemi :

3 epruvete v 10 ml gojišča 10 ml vode 3 epruvete v 9 ml gojišča 1 ml vode 3 epruvete v 9 ml gojišča 0.1 ml vode

10 ml

1 ml

0,1 ml

10 ml(2 x)

9 ml(1 x)

9 ml(1 x)

Gojišče: Vzorec:

Slika 7: Shema 3 x 3 testa.

35

2. Po enem dnevu inkubacije preglejte epruvete. Število pozitivnih epruvet v vsaki seriji

nam da trištevilčno kombinacijo, ki jo poiščemo v statistično utemeljenih tabelah in odčitamo MPN.

3. Prav tako kot pri prejšnji vaji tudi tukaj cepite kulturo iz pozitivnih epruvet na trdno selektivno gojišče za enterobakterije (MacConkey).

Najverjetnejše število (most probable number MPN) za različne kombinacije pozitivnih

in negativnih epruvet, če se uporabi po tri epruvete z 10 ml gojišča in 10 ml vode ter po šest epruvet z 9 ml gojišča in 1 ali 0,1 ml vode.

število pozitivnih epruvet

95% meja zaupanja

10 ml 1 ml 0,1 ml MPN/100 ml

spodnja zgornja

0 0 0 <3 0 0 1 3 0,5 9 0 1 0 3 0,5 13 1 0 0 4 0,5 20 1 0 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 11 3 36 1 2 0 11 3 36 2 0 0 9 1 36 2 0 1 14 3 37 2 1 0 15 3 34 2 1 1 20 7 89 2 2 0 21 4 47 2 2 1 28 10 150 3 0 0 23 4 120 3 0 1 39 7 130 3 0 2 64 15 380 3 1 0 43 7 210 3 1 1 75 14 230 3 1 2 120 30 380 3 2 0 93 15 380 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 35 470 3 3 0 240 36 1300 3 3 1 460 71 2400 3 3 2 1100 150 4800 3 3 3 >2400 Standard Metods for the Examination of Water and Wastwater, 13th ed. New York

American Public Health Association, 1971.

36

Rezultati: V tabeli označite pozitivne epruvete (+) in iz števila pozitivnih epruvet določite trimestno kodo. V tabelah odčitajte MPN.

epruveta 1 2 3

10 ml vzorca 1 ml vzorca

0,1 ml vzorca koda ________________ MPN ________________ redčenje vzorca ________ Rast na agarju MacConkey pri temperaturi 45 oC: DA NE V vzorcu vode iz __________________________ je _______________ bakterij/100 ml.

Ali je ta voda onesnažena s fekalijami? Je primerna za kopanje?

12. naloga: Metoda s filtrom Material:

vzorec vode (50ml) sterilni filter in nastavek za filtriranje sterilna pinceta plošča agarja MacConkey

Izvedba: 1.Vzorec vode prefiltrirajte in filter previdno prenesite na ploščo selektivnega agarja

MacConkey. 2. Po inkubaciji preštejte lac+ kolonije (vijolično obarvane), ki vam povedo število

koliformnih bakterij v 50 ml vode.

Rezultati:

volumen vzorca ______________________ ml št. laktoza pozitivnih kolonij na filtru ___________________________ V vzorcu vode iz __________________________je __________________bakterij/100 ml.

37

4. Vaja: Izolacija čiste kulture

Mikrobna kultura so mikroorganizmi, ki porastejo v gojišču ali na njem. Mikrobna kultura je lahko mešana ali čista. V čisti kulturi je samo ena vrsta mikroorganizmov in zato so lastnosti kulture lastnosti te vrste mikroorganizma. V mešani kulturi je več kot ena vrsta mikroorganizmov. Lastnosti takšne kulture (npr. produkcija antibiotika, povzročanje bolezni, razgrajevanje določenih substratov) ni mogoče pripisati samo eni od vrst v mešani kulturi. Razen tega se mikroorganizmi med seboj lahko zavirajo ali pa ena vrsta omogoča rast druge.

V mikrobiologiji nas sicer zanima delovanje mešanih kultur, kakršne so večinoma v naravi, vendar običajno delamo s čistimi kulturami mikroorganizmov, saj je le na ta način mogoče proučevati vsako vrsto posebej.

KAKO PREVERIMO ČISTOST KULTURE Tekoče kulture pogledamo pod mikroskopom. Običajno na preparatu čiste kulture

opazimo le celice iste oblike. Izjemoma so mikrobne kulture lahko pleomorfne, tako da najdemo v njih celice različnih oblik. V primeru bakterij so si lahko celice različnih bakterijskih vrst podobne, zato je bolje, da tekočo kulturo cepimo na trdno gojišče. Na takšnem gojišču se bo vsaka bakterijska celica namnožila in nastala bo kolonija, ki jo v večini primerov dobro razločimo tudi s prostim očesom. Kulture na ploščah pregledamo in če opazimo le eno vrsto kolonij, lahko sklepamo, da je kultura čista.

Kolonije različnih vrst bakterij se med seboj ločijo po:

velikosti (premer < 1mm, 1mm …), barvi (prozorne, sivobele, bele, rumene, oranžne, zelene, vijolične …), ustroju (krhke, trde, mazave, sluzaste …), površini (gladka, mokra, suha, nagubana …), obliki (okrogle, nepravilne, filamentozne, rizoidne), profilu (ploske, dvignjene, konveksne, umbilicirane).

Da lahko preverjamo čistost kulture, mora biti plošča cepljena redko oz. cepljena do posameznih kolonij (1. vaja).

KAKO IZOLIRAMO ČISTO KULTURO Čisto kulturo neke bakterije skušamo izolirati iz materiala, kjer pričakujemo to vrsto

bakterij (npr. iz vode, zemlje, zraka, živil, kužnin, brisov ali odtisov delovnih površin). Pri vseh postopkih, od odvzema materiala do identifikacije izoliranih kultur, je treba delati aseptično.

Zaželeno vrsto mikroorganizmov lahko iz izhodnega materiala izoliramo na več načinov. Direktne metode Material resuspendiramo in primerno redčimo. Nato pod mikroskopom z

mikromanipulatorjem prenesemo eno samo celico v sveže gojišče. Metoda je uporabna predvsem za delo s kvasovkami.

38

Indirektne metode Pri indirektnih metodah mešano kulturo najprej redko cepimo na gojišče, tako da bakterije

porastejo do posameznih kolonij. Če je bakterij, ki jih želimo izolirati, v vzorcu malo, moramo paziti, da jih na ploščah ne bodo prerasle prevladujoče vrste bakterij. V tem primeru uporabimo selektivna gojišča, ki zavirajo rast večine bakterij, ali pa zaželeno vrsto bakterij najprej namnožimo v bogatitvenem gojišču. Selekcijo ali bogatitev lahko zagotovimo tudi z razmerami v okolju (nizka ali visoka temperatura, pH, atmosfera).

Na plošči z mešano kulturo izberemo kolonijo bakterije, ki jo želimo izolirati v čisti kulturi, ter jo s cepilno zanko precepimo na svežo ploščo. Pri tem pazimo, da cepimo redko, saj bomo le tako lahko preverili, ali je kultura res čista.

Pri izolaciji čiste kulture je običajno potrebnih več zaporednih precepljanj.

OBLIKA KOLONIJ

PROFIL KOLONIJ

okrogle nepravilne filamentozne rizoidne

ploske dvignjene konveksne umbilicirane

Slika 8: Tipi kolonij glede na obliko in profil

39

SHRANJEVANJE MIKROORGANIZMOV Kulture mikroorganizmov, ki smo jih izolirali ali s katerimi delamo, lahko shranjujemo na

več načinov. Primarni cilj shranjevanja je ohranjanje živega, genetsko homogenega mikroorganizma v čisti kulturi.

Načini shranjevanja mikroorganizmov: - s precepljanjem na ploščah ali poševnih gojiščih, v vbodnike (aerobi in fakultativni anaerobi) ali v različnih gojiščih za shranjevanje

anaerobov; - v hladnem pri 4 oC z zamrzovanjem (-20 oC, -70 oC, v tekočem dušiku pri -196 oC), kjer predhodno dodamo

zaščitna sredstva, ki preprečujejo nastanek kristalov v celici (dimetilsulfoksid, glicerol); - s sušenjem na sterilnem filtrirnem papirju, v želatini (kapljicah ali disku), na granulah silikagela, z liofilizacijo (odstranjevanje vode iz celic ter iz gojišča s sublimacijo iz zmrznjene

kulture v vakuumu).

40

13. naloga: Izolacija čiste kulture Material:

plošča z mešano kulturo sveža plošča hranilnega agarja

Izvedba: 1. Preglejte gojišča, cepljena pri prejšnjih vajah. Preštejte in opišite kolonije, porasle na

gojiščih. 2. Izberite eno izmed kolonij in jo izolirajte v čisti kulturi tako, da jo cepite redko na

svežo ploščo do posameznih kolonij.

Rezultati: 1. Opišite kolonije, ki so porasle na krvnem agarju. površina _______________________ gojišče _______________________ tipi kolonij 2. Narišite poraslo kulturo na svoji plošči! Koliko tipov kolonij opazite? Ali je kultura čista? Kaj bi naredili v primeru, če kultura še zmeraj ne bi bila

čista?

41

5. vaja: Preučevanje vpliva antibiotikov na mikroorganizme - antibiogram

Antibiogram je metoda, s katero ugotavljamo občutljivost bakterij na antibiotike ali

odpornost proti njim. Poznamo različne izvedbe glede na to, ali želimo testirati občutljivost določenega seva za veliko število antibiotikov ali ugotavljamo učinkovite koncentracije nekega antibiotika.

A. DIFUZIJSKI ANTIBIOGRAM To je metoda, s katero ugotavljamo občutljivost določenega seva na različne antibiotike.

Na ploščo cepimo bakterijo tako, da bo rast konfluentna. Nato na ploščo položimo diske z različnimi antibiotiki ter jih inkubiramo pri primerni temperaturi. Zaradi difuzije v gojišče, se okrog diska vzpostavi koncentracijski gradient antibiotika. Če je bakterija za antibiotik občutljiva, ne bo porasla v določeni razdalji od diska. To cono brez bakterijske rasti imenujemo cona inhibicije (slika 6). Glede na premer cone inhibicije lahko (po navodilih proizvajalca diskov) določimo, ali je sev odporen, intermediaren ali občutljiv za antibiotike, ki jih preizkušamo.

Ker cona inhibicije ni odvisna le od učinkovitosti antibiotika, pač pa tudi od drugih dejavnikov (npr. debeline gojišča), je pomembno, da je metoda standardizirana, saj so samo na ta način rezultati primerljivi v daljšem časovnem obdobju ali med laboratoriji. Ena od standardnih metod je Kirby-Bauerjeva metoda. Pri metodi po Stokesu na ploščo nanesemo tako preizkušani sev kot občutljiv kontrolni sev ter primerjamo cone inhibicije pri obeh sevih (slika 6).

Test E je oblika difuzijskega antibiograma, s katerim lahko ugotavljamo tudi minimalne inhibitorne koncentracije (glej dilucijski antibiogram). Pri tem ne uporabljamo diskov, pač pa trakove z naraščajočo koncentracijo antibiotika. Cona inhibicije ni krožna, ampak kapljičaste oblike. Na mestu, kjer se cona inhibicije konča, na traku odčitamo inhibitorno koncentracijo.

Slika 9: Primerjava različnih izvedb difuzijskega antibiograma: A – klasični difuzijski

antibiogram, B – Stokesova metoda, C – Test E. Temno sivo je označena konfluentna rast bakterijske kulture, svetlo sivo so označeni diski ali trakovi z antibiotiki in bele so cone inhibicije.

A B C

42

B. DILUCIJSKI ANTIBIOGRAM Dilucijski antibiogram je kvantitativen in z njim ugotavljamo minimalno inhibitorno

koncentracijo (MIK; koncentracija antibiotika, ki zavira rast bakterij) in minimalno baktericidno koncentracijo (MBK; koncentracija antibiotika, ki ubija bakterije). Najprej pripravimo serijo razredčin antibiotika v fiziološki raztopini, ki jo nato damo v serijo epruvet s tekočim gojiščem. V to serijo epruvet tekočega gojišča z znanimi razredčinami antibiotika cepimo razredčeno bakterijsko kulturo. Po inkubaciji opazujemo, ali je prišlo do rasti kulture (motnost gojišča). Najnižja koncentracija antibiotika, pri kateri ne opazimo več rasti, je lahko MIK. Iz te in dveh naslednjih epruvet, kjer ni rasti, cepimo gojišče na ploščo hranilnega agarja brez antibiotika. Tista koncentracija antibiotika, pri kateri bakterije niso več porasle, je MBK, koncentracija antibiotika, kjer pa so zrasle je MIK.

C. INKORPORACIJSKI ANTIBIOGRAM Pri inkorporacijskem antibiogramu gojišče, na katerega cepimo kulturo, vsebuje določeno

koncentracijo antibiotika. Uporabljamo ga pri počasi rastočih bakterijah, kakršna je Mycobacterium tuberculosis, ali če ugotavljamo vpliv enega antibiotika na številne seve.

43

14. naloga: Difuzijski antibiogram Material:

plošče z gojiščem Mueller-Hinton bakterijska kultura diski z antibiotiki epruveta s fiziološko raztopino pinceta vatenke

Izvedba: 1. Na plošče Mueller-Hinton z vatenko nanesite v vodi razredčeno 24-urno kulturo

preiskovanega seva. 2. Z vatenke odstranite odvečno tekočino z vrtenjem ob steno epruvete. Inokulum cepite

po vsej površini plošče s treh smeri, ki so med seboj pod kotom 120o. 3. Pustite, da se površina osuši, in s pinceto nanjo postavite 3 diske v taki medsebojni

razdalji, da se tudi največje inhibicijske cone med seboj ne prekrivajo (maksimum 6 diskov na ploščo s premerom 90 mm).

4. Po inkubaciji 1824 ur pri 3537 oC odčitajte inhibicijske cone in jih interpretirajte po navodilih proizvajalca.

Rezultati: Premerite inhibicijske cone in iz navodil proizvajalca ugotovite, ali je preiskovani sev občutljiv ali rezistenten na antibiotik. kultura ______________________

antibiotik premer inhibicijske cone (mm)

odpornost proti antibiotiku

Zakaj je pomembno, da so metode za ugotavljanje občutljivosti bakterij za antibiotike standardizirane in kako to dosežemo? Kaj ugotavljamo z difuzijskim in kaj z dilucijskim antibiogramom?

44

15. naloga: Primerjava antimikrobne učinkovitosti različnih zobnih past Material: plošča krvnega agarja zobna pasta fiziološka raztopina vatenka

Izvedba: 1. Z vatenko vzemite bris površine zob in ga nanesite na ploščo krvnega agarja tako, da

bodo bakterije rasle konfluentno. 2. Na sredino plošče nanesite majhno količino zobne paste (če je tekoča, si pomagajte s

sterilno vatenko). 3. Ploščo inkubirajte pri 37 oC 48 ur ter opazujte in izmerite obroč inhibicije rasti okoli

nanesene zobne paste. 4. Vpišite rezultate in jih primerjajte z ostalimi skupinami.

Rezultati: Premerite inhibicijske cone in primerjajte rezultat z ostalimi skupinami.

Zobna pasta Cona inhibicije (mm)

45

6. Vaja: Mikroskopiranje bakterijskih preparatov

V mikrobiologiji najpogosteje uporabljamo svetlobno mikroskopijo, lahko pa tudi fluorescentno ali elektronsko. Z opazovanjem mikrobioloških preparatov (razmazov kultur ali preiskovanega materiala) pod svetlobnim mikroskopom ugotavljamo:

- obliko bakterijskih celic (koki, paličaste ali spiralne bakterije), - ali se bakterijske celice barvajo po Gramu pozitivno ali negativno, - preverjamo čistost bakterijske kulture, - gibljivost bakterijskih kultur, - morfološke posebnosti, kot so spore, kapsule in flageli. Preparate moramo pred mikroskopiranjem barvati, za opazovanje neobarvanih preparatov

pa uporabljati faznokontrastni mikroskop. Glavna razlika med navadnim svetlobnim mikroskopom in mikroskopom za fazni kontrast je, da ima mikroskop za fazni kontrast pred kondenzorskimi lečami filter, ki dovoli dostop le majhnemu snopu žarkov, in v objektivu fazno ploščico, ki premakne (dodatno lomi) žarek tako, da dobimo le eno sliko. Svetloba, ki vstopa skozi kondenzor, pride do vzorca in se lomi različno na različno debelih in gostih delcih (bakterije, topilo), zato vidimo temne objekte na svetlem ozadju.

ENOSTAVNA BARVANJA BAKTERIJ Bakterije se obarvajo samo z enim barvilom. Uporabno je za opazovanje oblike celic.

Poznamo: - pozitivno barvanje, kjer vidimo temne celice na svetlem ozadju, je uporabno za

opazovanje oblike celic. Barvila so organske spojine. Pozitivno nabita (kationska), kot so metilensko modrilo, kristal vijolično in safranin, se močno vežejo na negativno nabite sestavine celice, kot so nukleinske kisline in kisli polisaharidi. Ker so površine celic navadno negativno nabite, se te barve vežejo na površino. Negativno nabita (anionska) barvila, kot so eozin, kisli fuksin in kongo rdeče, se vežejo na pozitivno nabite sestavine celice, kot so številni proteini. Sudansko črno je v maščobah topno in se veže z maščobami.

- negativno barvanje, kjer se uporabljajo barve, ki nimajo afinitete do sestavin celice, temveč le obdajo celico. Taka sta tuš in nigrozin. Opazujemo svetle celice na temnem ozadju.

DIFERENCIALNA BARVANJA BAKTERIJ Uporabljajo se glede na vir in kulturelne lastnosti bakterijske kulture. Najbolj razširjeno

in uporabno je diferencialno barvanje po Gramu, ki je zelo pomembno pri začetnih stopnjah identifikacije. Na zraku posušen razmaz kulture ali kužnine na objektniku se fiksira na plamenu in barva z raztopino kristal vijoličnega. Vse bakterije se obarvajo. Preparat se nato prelije z lugolovo raztopino joda in kalijevega jodida. Jod tvori komplekse s kristal vijoličnim in ga veže v celici. Preparat se spere z vodo in razbarva z etanolom ali acetonom. V po Gramu pozitivnih bakterijah ostanejo kompleksi kristal vijoličnega z jodom, iz po Gramu negativnih bakterij pa se sperejo. Zdaj se brezbarvne Gram negativne bakterije obarvajo s

46

safraninom rožnato, Gram pozitivne so od kristal vijoličnega modre. Sledi spiranje z vodo, sušenje na zraku in mikroskopiranje. To barvanje je v začetku 19. stoletja uvedel danski mikrobiolog Christian Gram in je zdaj znano v številnih modifikacijah. Mehanizem barvanja po Gramu ni pojasnjen, menijo pa, da je način barvanja odvisen od debeline celične stene (peptidoglikanski sloj), velikosti por in prepustnosti celične ovojnice. Po Gramu negativno se barva približno 1/3 kokov, približno pol bacilov, vse spiralne bakterije in živalske celice, pa tudi avtolizirane, stare in mrtve po Gramu pozitvne bakterije ter kvasovke, ki imajo drugačno kemično sestavo in strukturo.

Acidorezistentno barvanje (barvanje po Ziehl-Neelsenu) je drugo tako znano

diferencialno barvanje. Uporabno je za identifikacijo rodu Mycobacterium; z njim identificiramo povzročitelja tuberkuloze (M. tuberculosis) in gobavosti (M. leprae). Najprej preparat barvamo z karbolfuksinom, za razbarvanje uporabimo kisli alkohol. Obarvane ostanejo le acidorezistentne bakterije, verjetno zaradi voskov v celični steni. Kontrastno barvilo je metilensko modrilo. Acidorezistentne bakterije so rdeče, ostale pa modre.

DRUGA DIFERENCIALNA BARVANJA: BARVANJA KAPSUL, FLAGELOV, SPOR ALI ZNOTRAJCELIČNIH VKLJUČKOV

Barvanje kapsul Veliko bakterij izloča posebne snovi, ki se adherirajo na njihovi površini in tvorijo

viskozen plašč, ki mu pravimo kapsula, če ima lepo ovalno obliko. Kapsula ščiti bakterijo pred zunanjimi vplivi (prepreči vezavo virusa na površino, odporna je proti lizi itd.). Ker je kapsula največkrat iz polisaharidov, ki so v neionski obliki, se večina ionskih barvil le s težavo veže nanjo. Kapsule lahko barvamo s kongo rdečilom ali negativno z indijskim črnilom po suhem in mokrem postopku. Indijsko črnilo (tuš) je sestavljeno iz finodisperznega ogljika (delci C so manjši kot 0,1 m) v vodi. Delci ogljika so preveliki, da bi prehajali skozi kapsulo, zato ostanejo v suspenziji. Ko tako pripravljen preparat pogledamo pod svetlobnim mikroskopom, vidimo prozorne neobarvane kapsule na črnem ozadju.

Barvanje spor Endospore lahko opazujemo na preparatih, barvanih z enostavnimi barvili ali po Gramu.

Lahko pa jih dokazujemo z diferencialnim barvanjem po Schaefferju z malahitnim zelenilom. Pri tem se spore obarvajo zeleno, vegetativne celice pa rdeče.

Barvanje flagelov Barvanje flagelov (bičkov) zahteva posebno previdnost zato, da jih ne poškodujemo.

Uporabljati moramo zelo čista objektna stekelca. Preparat samo posušimo na zraku in ga ne fiksiramo. Flagele barvamo z Leifsonovim barvilom, ki je sestavljeno iz (NH4)2SO4, taninske kisline in fuksina, raztopljenega v etanolu. Barvilo, fuksin in kislina, se pri barvanju veže na bakterijo in biček, alkohol pa izpari.

47

16. naloga: Barvanje in mikroskopiranje bakterijskih preparatov Material:

objektna stekelca komplet barvil za barvanje po Gramu barvilo za enostavno barvanje (metilensko modrilo) mikroskop odlagalnik za objektna stekelca bakterijska kultura Pseudomonas sp. in Staphylococcus sp. na plošči

Izvedba: 1. Pripravite mikroskopski preparat čiste kulture s prejšnje vaje in mešane kulture

(pseudomonas in stafilokok). 2. Oba preparata barvajte po Gramu, mešano kulturo pa po Gramu in tudi z metilenskim

modrilom. 1. Priprava preparata 1. Na čist objektnik kanite kapljico kulture, jo razmažite in posušite na zraku. Če

hočete mikroskopirati kulture iz trdnih gojišč, na objektno stekelce kanite kapljico fiziološke raztopine in nanjo s cepilno zanko nanesite izbrano kolonijo. Pri tem pazite, da bakterij ni preveč. Bakterije morajo biti na preparatu dovolj redke, da lahko opazujete posamezne celice.

2. Ko je preparat posušen, ga tri- do štirikrat povlecite skozi plamen. Na ta način bakterije fiksirate, tako da jih kasneje z barvilom ne sperete.

2. Enostavno barvanje 1. Barvanje, kjer uporabljamo le eno barvilo, je enostavno barvanje. Pri naših vajah

bomo preparate barvali z metilenskim modrilom. 2. Preparat fiksirajte na objektniku in nato nanj kanite nekaj kapljic raztopine

metilenskega modrila. 3. Počakajte 3060 sekund in sperite barvilo z vodo. 4. Posušite na zraku in poglejte pod mikroskopom. 3. Barvanje po Gramu 1. Pripravite in fiksirajte preparat. 2. Prelijte ga z raztopino kristal vijoličnega, 30 sekund. 3. Odlijte raztopino kristal vijoličnega. 4. Prelijte z lugolovo raztopino, 30 sekund. 5. Sperite z vodo. 6. Razbarvajte z etanolom, 1520 sekund. 7. Sperite z vodo. 8. Prelijte z raztopino safranina, 30 sekund. 9. Sperite z vodo, posušite na zraku in poglejte pod mikroskopom. Z objektnimi stekelci ravnajte kot s kužnim materialom ter jih po mikroskopiranju

odložite v označene odlagalnike.

48

Rezultati: Skicirajte preparate! mešana kultura, barvana po Gramu mešana kultura, barvana z metilenskim modrilom (povečava ________ x) (povečava _________ x)

barvanje po Gramu oblika celic Staphylococcus sp. Pseudomonas sp.

čista kultura, izolirana pri drugi vaji

49

Viri: 1. RUPNIK, Maja, ZALAR, Polona, TURK, Martina, JANC, Miha. Splošna mikrobiologija : navodila za vaje, (Knjižna zbirka Scripta). 3., dopolnjena izd. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 2. POLLACK, Robert A., FINDLAY, Lorraine, MONDSCHEIN, Walter, MODESTO, Ronald R. Laboratory exercises in microbiology, , 3. izd. John Wiley and Sons, 2009.