micromeria juliana (l.) benth. · zahvalnica zahvaljujem se svom mentoru prof. dr dragani...
TRANSCRIPT
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Marija G. Mitić
Uticaj auksina i citokinina na indukciju aksilarnih
pupoljaka na nodalnim eksplantatim
Micromeria juliana (L.) Benth.
Master rad
Niš, 2017
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Uticaj auksina i citokinina na indukciju aksilarnih
pupoljaka na nodalnim eksplantatima
Micromeria juliana (L.) Benth.
Master rad
Student: Mentor:
Marija G. Mitić Dr Dragana D. Stojičić
Broj indeksa: 199 vanredni profesor
Niš, 2017
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
The influence of auxin and cytokinin on axillary
buds induction on nodal explants
Micromeria juliana (L.) Benth.
Master thesis
Candidate: Mentor:
Marija G. Mitić Dr Dragana D. Stojičić
No. Of index: 199 Associate professor
Niš, 2017
ZAHVALNICA
Zahvaljujem se svom mentoru prof. dr Dragani Stojičić na ukazanom
poverenju, stručnoj pomoći i neiscrpnim savetima prilikom izrade ovog
master rada.
Posebnu zahvalnost dugujem dr Svetlani Tošić na pomoći prilikom
realizacije eksperimentalnog dela master rada kao i na savetima,
strpljenju i velikoj podršci.
Profesorima Stojičić i Tošić hvala što su bili moji uzori tokom
studiranja.
Mojoj porodici hvala jer je verovala u mene. Tati i mami hvala na
verovanju da u našoj porodici ima mesta za jos jednog akademskog
građanina. Bratu i mom Milošu hvala na strpljenju sa mnom tokom
studiranja, podršci i ljubavi.
Prijateljima, koji su sastavni deo mog života veliko hvala jer ste uvek tu.
Ovаj rad posvećujem mojim životnim uzorima,
mami i tati.
IAA- indol-3-sirćetna kiselina
kin- kinetin, 6-furfuril-aminopurin
MS- hranljiva podloga (Murashige i Skoog, 1962)
IBA- indol-3-buterna kiselina
NAA- α-naftilsirćetna kiselina
NOA- β-naftoksirćetna kiselina
TIBA- 2,3,5-trijod benzojeva kiselina
BAP- 6-benzil aminopurin
TDZ- tidiazuron
2iP- izopentenil adenin
ABA- abscisinska kiselina
2,4 D –2,4-Dihlorofenoksisirćetna kiselina
SAŽETAK
Micromeria juliana je endemit Balkanskog poluostrva i zbog malog broja njenih populacija
spada u ugrožene vrste. Kao i većina predstavnika familije Lamiaceae produkuje eterična ulja
koja sadrže farmakološki aktivne supstance, pa je njena primena u medicini širokog spektra. U
ovom istraživanju je ispitivan uticaj fitohormona kinetina (0,1-30µM) i 0,57µM indol-3-sirćetne
kiseline na indukciju aksilarnih pupoljaka M. juliana. Eksperimentom je utvrđeno da se najveći
prosečan broj pupoljaka po eksplantatu razvijao na podlozi sa 0,57µM IAA i 3µM kin, a
najmanji na podlozi sa 0,57µM IAA, bez prisustva kinetina. Najveća prosečna dužina pupoljaka
bila je na MS podlozi bez fitohormona, dok je najmanja na podlozi sa 0,57µM IAA i 30µM kin.
Merena je i prosečna sveža i suva masa M. juliana. Najveća sveža i suva masa je izmerena kod
eksplantata gajenih na podlogama bez fitohormona.
Ključne reči: Micromeria juliana, mikropropagacija, aksilarni pupoljci, kin, IAA
ABSTRACT
Micromeria juliana is endemic species of the Balkan Peninsula and because of its small number
of its populations it belongs to endangered species. Like most representatives of the Lamiaceae
family, it produces essential oils that contain pharmacologically active substances, so it usage in
medicine is very important. In this study, the influence of phytohormones kinetine (0.1-30μM)
and 0.57μM indole-3-acetic acid on the induction of axillary buds of M. juliana was investigated.
The experiment found that the highest average number of buds per explant was developed on the
substrate with 0.57μM IAA and 3μM kin, and the smallest on the substrate with 0.57μM IAA,
without the presence of kin. The highest average length of buds is on the MS substrate without
phytohormones, while the smallest is on the substrate with 0.57μM IAA and 30μM Kin. The
average fresh and dry mass of M. juliana is also measured. The largest fresh and dry mass was
measured on explants grown on substrates without phytohormones.
Key words: Micromeria juliana, micropropagation, axillary buds, kin, IAA.
SADRŽAJ:
1. UVOD ..................................................................................................................................................... 9
1.1 Opšte karakteristike familije Lamiaceae ....................................................................................... 9
1.2 Rod Micromeria .......................................................................................................................... 10
1.3 Micromeria juliana (L.) Benth.ex Rchb ........................................................................................ 13
1.4 Kultura in vitro ............................................................................................................................ 14
1.5 Mikropropagacija ........................................................................................................................ 17
1.5.1 Faze mikropropagacije ........................................................................................................ 17
1.6 Faktori koji utiču na rast biljnih in vitro kultura .......................................................................... 18
2. CILJ RADA ............................................................................................................................................ 23
3. MATERIJAL I METODE ......................................................................................................................... 24
3.1 Biljni materijal ............................................................................................................................. 24
3.2 MS hranljiva podloga .................................................................................................................. 24
3.3 Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka vrste M. juliana (MS podloga sa kinetinom i
0,57µM IAA) ............................................................................................................................................ 25
3.4 Sterilizacija .................................................................................................................................. 26
3.4.1 Sterilizacija biljnog materijala ............................................................................................. 27
3.4.2 Sterilizacija hranljivih podloga ............................................................................................ 27
3.4.3 Sterilizacija instrumenata i prostora ................................................................................... 27
3.5 Merenje sveže i suve mase biljaka .............................................................................................. 28
3.6 Statistička analiza podataka ........................................................................................................ 28
4. REZULTATI ........................................................................................................................................... 29
4.1 Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana....................................... 29
4.2 Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana ................................................... 39
5. DISKUSIJA ............................................................................................................................................ 40
6. ZAKLJUČAK .......................................................................................................................................... 42
7. LITERATURA ........................................................................................................................................ 43
9
1. UVOD
Još u prvim pronađenim zapisima prastarih civilizacija vidi se da su ljudi tragali za
biljkama koje bi bile korisne za njih. Pored ishrane, za izradu materijala, mnoge biljke su
korišćene i u narodnoj medicini za spravljanje melema, čajeva, tonika, lekova i dr. Sa razvojem
nauke, korišćenjem odgovarajućih analiza utvrđeno je da neke grupe biljaka sadrže raznovrsne
aktivne supstance koje na odgovarajući način koriste čoveku i njegovom zdravlju. Određene
grupe biljaka su posebno interesantne ljudima zbog svojih svojstava, a među njima se izdvaja
familija Lamiaceae. U okviru ove familije, poseban značaj imaju endemične vrste Balkanskog
poluostrva, i predstavnici roda Micromeria.
1.1 Opšte karakteristike familije Lamiaceae
U narodu poznate kao usnatice, familija Lamiaceae (Labiatae) sa još 3 familije
(Verbenaceae, Phrymaceae, Callitrichaceae) pripadaju rodu Lamiales. Sama familija Lamiaceae
je veoma bogata vrstama i gotovo kosmopolitski rasprostranjena. Njena najveća
rasprostranjenost je na Mediteranu i toplijim delovima Azije, dok samo manji broj vrsta ove
familije opstaje u hladnijim predelima Zemlje. U prilog tome ide i podatak da najbolji rast
predstavnici ove vrste pokazuju na staništu koje je dobro osunčano i otvoreno (livade, kamenjari,
pašnjaci i sl.). Familija Lamiaceae obuhvata oko 236 rodova, sa oko 6900 do 7200 vrsta (Harley,
2004). U flori Balkanskog poluostrva Lamiaceae su zastupljene sa 371 vrstom, dok su 84 vrste
Balkanski endemiti (Tatić, 2002).
Ekonomski značaj ove familije je izuzetno veliki. Ljudi ih gaje i koriste u farmaciji
(Thymus vulgaris), medicini (Salvia officinalis), u prehrambenoj industriji (Origanum vulgare) i
industriji parfema (Rosmarinus officinalis). Ova raznovrsna upotreba proizilazi iz aromatičnosti
ovih biljaka (visok sadržaj etarskih ulja koja sadrže farmakološki aktivne supstance: terpeni,
fenoli, aldehidi, aromatični alkoholi, ketoni itd.). Poznatiji aromatični rodovi ove familije jesu:
10
Rosmarinus, Lavandula, Thymus, Melissa, Lamium, Salvia i druge. Lekovita svojstva su širokog
spektra, pa se preparati ovih vrsta mogu koristiti kao: antiseptici, rubefacijensi, sedativi,
karminativi, spazmolitici, antiseptici, insekticidi, antioksidansi... Važna je ekološka uloga ove
familije, jer većina njih spada u kategoriju dobrih medonosnih biljaka. Pored značaja za ljude
neke vrste se javljaju i kao korovske: Sideritis montana, Ballota nigra. Određene vrste su
značajne sa stane bioloških istraživanja i kao Balkanski endemiti: Sideritis scardica, Micromeria
juliana...
Manji broj vrsta iz familije usnatica su drvenaste biljke i lijane, dok su većina njih
zeljaste. Stablo većine vrsta je četvorostrano zbog specifične organizacije kolenhima. Listovi na
stabljici su postavljeni jedan naspram drugog, odnosno imaju unakrsni raspored (dekusirani), bez
zalistaka, sa dobro razvijenom lisnom drškom i obodom koji može biti ceo, ili manje nazubljen.
Nadzemni vegetativni organi su prekriveni žlezdanim dlakama (trihomama). Cvetovi su retko
pojedinačni, uglavnom su grupisani u cimozne cvasti (dihazijum, dvojni uvojak...), bilateralno
simetrični, zigomorfni, ređe aktinomorfni i dvopolni. Čašica je petočlana (dvousnata), dok je
krunica cevasta, petoparna (jedno- ili dvousna). Karakteristična formacija kruničnih listića u
obliku usana daje ovoj familiji prepoznatljivi izgled, a otud i poznati naziv usnatice. Andreceum
se sastoji od 4 prašnika, ili 2 prašnika i 2 staminodije. Tučak je sinkarpan, sagrađen od 2 oplodna
listića, plodnik je nadcvetan, dvook (ili četvorook). Plod kod ove familije je orašica.
1.2 Rod Micromeria
Rod Micromeria u okviru familije Lamiaceae posebno privlači pažnju istraživača.
Predstavlja relativno raznovrsan i taksonomski jedan od najinteresantnijih rodova prethodno
navedene familije. Naziv roda potiče od grčkih reči micros (malo) i meris (deo). Prvi put je rod
opisan od strane Bentham-a 1829. godine. Veoma je bogat vrstama, preko 70 vrsta u svetu, sa
širokom rasprostranjenošću od Evrope do Južne Afrike i Madagaskara, odnosno od
Makronezijskog arhipelaga do Himalaja i Indije (Sl. 1).
11
Slika 1. Rasprostranjenje vrste roda Micromeria (Brӓuchler, 2008)
Evropski kontinent nastanjuje 21 vrsta ovog roda (Chater i Guinea, 1972; Harley i sar.,
2004). Jedan deo ovih vrsta naseljava i Balkansko poluostrvo.Brojni taksoni se odlikuju malim
arealima i pojavom lokalnog endemizma, ukazujući na izražen stepen diverzifikacije u okviru
roda. Opisani su i primeri spontane hibridizacije filogenetski bliskih taksona roda Micromeria,
ukoliko sejavljaju zajedno na staništima u prirodi (Meimberg i sar., 2006). Diverzifikacija je
značajno izražena na području Republike Srbije i njenih bivših pokrajina.
U prilog tome ide i podatak da je u Srbiji zabeleženo prisustvo7 vrsta ovog roda (Diklić,
1974). U različitim literaturnim navodima su predložene različite klasifikacije vrste roda
Micromeria. U Srbiji su zastupljene vrste iz 2 sekcije: Micromeria sect. Micromeria (M.
croatica, M. juliana, M. cristata i M. parviflora) i sect. Pseudomelissa (M. thymifolia, M.
albanica i M. pulegium).
12
Slika 2. Rasprostanjenje vrste roda Micromeria na Balkanskom poluostrvu (Slavovska i sar.,
2017.)
Vrste roda Micromeria naseljavaju manja, kamenita i dobro osunčana staništa. Sa
morfološke strane gledišta vrste ovog roda su raznovrsne. To su jednogodišnje, ili višegodišnje
biljke polužbunaste, ili žbunaste forme, niskog rasta (20-130cm). Na biljkama ovog roda su
uočljivi sitni listovi, čiji izgled varira od vrste do vrste (okrugli, široko jajasti, kopljasti, linearni).
Cvetovi su formacije metlice, ili grozda, uglavnom sedeći, raznobojni (beli, crveni, ljubičasti).
Kao i veliki broj drugih rodova iz familije Lamiaceae, i predstavnici roda Micromeria se
aktivno koriste u narodnoj medicini, za lečenje gastrointestinalnog i respiratornog trakta, kožnih
infekcija i rana, kao i za umirujuće bolove i sprečavanje nesanice (Šarić-Kundalić i sar., 2011). U
13
istraživanima (Tomas-Berberan i sar., 1991, Marin i sar., 2001.) je otkiveno prisustvo
flavonoidnih jedinjenja koji se uz fenolne kiseline smatraju za odlučujuće faktore u
antioksidativnoj aktivnosti lekovitih biljaka. Mnogobrojna primena ovog aromatičnog roda u
medicini se ogleda u njegovom: antifugalnom, insekticidnom, antibakterijskom,
antioksidativnom, bioherbicidnom i alelopatskom biološkom delovanju. (Tošić i sar., 2015).
Jedna od interesantnih vrsta roda Micromeria za proučavanje je Micromeria juliana.
1.3 Micromeria juliana (L.) Benth.ex Rchb
Vrsta pripada familiji Lamiaceae, podfamiliji Nepetoideae, plemenu Mentheae, rodu
Micromeria. U različitoj literaturi može se naći još i pod nazivima: Clinopodium julianum,
Micromeria minoa, Sabbatia corymbosa, Satureja juliana, Satureja spicata.
Kao i većini predstavnika roda Micromeria i M.juliana odgovaraju dobra osunčanost,
suva i kamenita, ređe peskovita staništa. Ova vrsta često pogodno mesto za rastenje pronalazi u
pukotinama stena (Sl. 3). U Srbiji je relativno retka vrsta, nalazi se samo u blizini Kačanika, u
pokrajini Kosovo i Metohija (Diklic, 1974.), dok je na Balkanu i Mediteranskim zemljama široko
rasprostranjena (Crna Gora, Hrvatska, Hercegovina, Makedonija, Grčka, Albanija, Bugarska,
Francuska, Portugalija, Italija, kao i zapadni deo Male Azije i Krita).
M. juliana je višegodišnja biljka, tipičnog izgleda, malog i zelenog žbuna visine 10-
40cm. Listovi su dužine 3-8cm, a široki 1-2,5 mm, donji su ovalni, srednji lancetasti, a gornji
usko lancetasti. Listovi i stablo su prekriveni žlezdanim dlakama. Cvetovi su zbijeni, sedeći,
čašični listići sivo-zelene boje, dok su krunični ljubičaste boje (Sl. 3). M. juliana cveta od maja
do juna.
14
Slika 3. Micromeria juliana (Tošić i sar., 2015)
Eterična ulja M. juliana sadrže farmakološki aktivne supstance karakteristične za rod
Micromeria. Njena upotreba je širokog spektra: od manjih problema kao što su prehlada,
mučnina, problemi pri varenju, pa sve do upale želuca i problema sa kamenom u bubregu i
bešici. M. juliana je manje poznata, ali i dobra začinska biljka.
M. juliana spada u ugrožene biljne vrste. Njene populacije su male i daju malu biomasu,
dok potražnja od strane čoveka raste. Zbog takve važnosti ove vrste, ona je od strane autora
(Tošić i sar., 2015) uvedena u kulturu in vitro. Na taj način je smanjen pritisak na prirodnu
populaciju vrste i omogućeno je uzgajanje sterilnih kultura velike biomase.
1.4 Kultura in vitro
Kultura in vitro (kultura biljnih ćelija i tkiva) obuhvata tehnike gajenja ćelija, tkiva i
organa izolovnih od majke biljke u veštačkim, kontrolisanim i aseptičnim uslovima (Parić i sar.,
2011.). Drugi naziv za kulturu in vitro je klonsko razmnožavanje (od majke biljke nastaje
genetički indentična kćerka biljka), ili in vitro propagacija (izraz je latinskog porekla, in vitro
znači u staklu, proces propagacije se odvija u posudama od stakla), ili mikropropagacija
(rezultat su dobijene male biljke).
15
Kultura in vitro omogućava dobijanje novih biljnih individua u laboratorijskim uslovima.
Biljni materijal koji se uvodi u kulturu naziva se eksplantat. Od eksplantata koji se postavlja na
hranljivu podlogu u sterilnim uslovima dobijaju se mlade, zdrave biljke indentične onima iz
prirode, ali oslobođene patogena. Ovim se omogućava brže razmnožavanje biljaka i veća
produkcija biomase i sekundarnih metabolita radi upotrebe u različitim industrijama. Moguće je
razmnožavati one vrste koje se veoma teško razmnožavaju u in vivo uslovima. Na taj način se i
čuvaju prirodne populacije datih vrsta koje mogu biti ugrožene, ili endemične.
Ideja metode kulture in vitro potiče iz sredine XVIII i početka XIX veka radovima H. L.
Duhamel du Monceau-a, Schleidena i Schwanna.Važnu osobinu biljnih ćelija (totipotentnost) za
rast u kulturi je uočio G.Haberlandt, pa se on smatra osnivačem kulture biljnih ćelija. Otkriveno
je da mikroorganizmi kompetiraju za podlogu i da su shodno tome potrebni sterilni uslovi.
Mnogobrojni eksprimenti su doveli do uspostavljanja prve uspešne kuture od strane White
(1934) koji je izdvojio i gajio vrh korena paradajza u tečnoj podlozi. Fitohormoni su dodavani za
bolji rast kultura, a prva cela biljka razvijena u kuturi je bila od strane Murashige i Skoog-a
(1962). Upravo po ovim naučnicima je dobila i naziv danas najčešće korišćena podloga (MS) u
kulturi.
Različite metode se primenjuju u zavisnosti od rezultata koje želimo da postignemo i u
zavisnosti od područja istraživanja. Metode se generalno mogu podeliti u 2 oblasti:
1) Prema tipu eksplantata koji se uvodi u kulturu (ćelije, organi, tkiva):
Rast eksplantata može biti organizovan i neorganizovan.
1.1) Organizovani rast (stvaranje i održvanje diferenciranih struktura):
a) kultura embriona - zigotskih i somatskih, kod nedovoljno razvijenih embriona, ili
radi prevazilaženja dormancije i skraćivanje ciklusa gajenja biljaka (orhideja).
b) kultura organa – dobijanje celih biljaka iz pojedinačnih organa. Može biti: -
kultura antera (polena),
-kultura ovarijuma,
-kultura izdanaka,
-kultura korenova,
16
-kultura listova.
c) kultura meristema– eksplantat je apikalni meristem korena, ili stabla.
d) kultura izdanka – apikalni meristem sa lisnim primordijama.
e) kultura internodija – koriste se bočne internodije.
f) kultura semena – zdravi klijanci se koriste kod slaboklijućih vrsta.
g) kultura izolovanih korenova – održavanje onih korenova u kulturi koji sadrže
bitne sekundarne metabolite.
1.2) Neorganizovani rast (ćelijski agregati bez prepoznatljivih struktura):
a) kalus (kultura biljnog tkiva)- agregati ćelija nastali kao posledica
neorganizovanog rastenja biljnih organa ili kultivisanih ćelija. Koriste se za
postavljanje kulture ćelija u suspenziji.
b) kultura ćelija u suspenziji – ćeliske agregacije na tečnoj podlozi.
c) kultura protoplasta – odstanjivanje ćelijskog zida, ostaje protoplast koji se kao
takav gaji.
d) kultura pojedinačnih ćelija – mehaničkim, ili enzimskim delovanjem se izdvajaju
pojedinačne ćelije.
2). Prema nameni (haploidi, somatska embriogeneza):
a) Mikropropagacija - umnožavanje izolovanih vrhova apikalnih i aksilarnih pupoljaka.
b) Somatska embriogeneza – direktno (od pojedinačnih celija), ili indirektno (iz kalusnog
tkiva) dobijanje embriona iz somatskih ćelija.
c) Samaklonalno variranje – pojava u kulturi nove nasledne varijabiljnosti.
d) Genetičke manipulacije – manipulacija genetičkim materijalom.
e) Genetička transformacija – prenos dela genoma jedne biljke na drugu uz pomoć vektora.
f) Organogeneza – obrazovanje organa biljaka.
g) Kultura haploida – razvijanje organizama bez oplođenja iz muških i ženskih polnih ćelija.
Svaka od gore navedenih metoda ima svoju primenu u nauci, ili različitim sferama industrije.
Nekada kombinacijom više tehnika dobijaju se željeni rezultati. Važne su i osobine biljanih ćelija
17
koje se uzimaju za kulturu in vitro, a to su: totipotentnost (sposobnost diferencijacije i
regeneracije gotovo cele biljke od strane početnog materijala uzetog za kulturu) i plastičnost
(sposobnost biljaka da se prolagođavaju uslovima sredine promenom svog metabolizma).
1.5 Mikropropagacija
Sam proces mikropropagacije (mikrorazmnožavanja) podrazumeva gajenje apikalnih, ili
aksilarnih pupoljaka određenih biljnih vrsta u kulturi in vitro. U širem smislu, mikropropagacija
predstavlja svaki način razmnožavanja biljaka u kulturi in vitro. Kao rezultat ovog postupka
dobija se biljni materijal, genetički identičan početnom materijalu. Proces mikropropagacije
predstavlja vid kloniranja, jer sve novodobijene biljke jesu klonovi početnog materijala.
Prednost ove metode je dobijanje zdravog biljnog materijala, velike biomase.
Mikropropagacija se primenjuje kod brzog razmnožavanja novih genotipova, održavanja
interesantnih genotipova, ubrzanja, skraćivanja, ili dovršavanja postupaka selekcije i
oplemenjivanja, regeneracije izdanaka i celih biljaka u genetičkom inženjerstvu (Vinterhalter i
Vinterhalter, 1996).Velika je primena u rasadničkoj proizvodnji ukrasnih i voćnih vrsta.
1.5.1. Faze mikropropagacije
Mikropropagacija obuhvata pet faza, 0-IV (Debergh i Maene, 1981).
Faza 0: Izbor majke biljke i njena priprema
Ovo je faza izbora i same pripreme majke biljke od koje će se uzeti početni materijal
(eksplantat) za mikropropagaciju. Naziv nulta ide u prilog tome da u ovoj fazi nema
mikropropagacije već samo odabira, prenošenja i čuvanja reprezentativne majke biljke. Za
eksplantat je najbolje uzeti vršni meristem koji je dobro zaštićen i ima najveći deobni potencijal.
Faza I: Uspostavljanje aseptične kulture
18
Podrazumeva sterilizaciju eksplantata koji se uvodi u kulturu, sterilizaciju podloge,
pribora za rad, kao i cele prostorije za rad. Ovom fazom se započinje klonsko razmnožavanje.
Faza II: Produkcija (razmnožavanje) propagula
Propagule (izdanci, mladice, klonirane biljke) u ovoj fazi ukoliko nema kontaminacije
normalno rastu i umnožavaju se kako bi se pripremile za rast izvan kulture. U zavisnosti od cilja
istraživanja, u podlogu se dodaju različiti fitohormoni koji će inicirati rast određenih organa
mladih biljaka.
Faza III: Priprema za rast u prirodnom okruženju
U ovoj fazi je ključni korak zakorenjivanje izdanaka pre prenošenja u zemlju.Proces
rizogeneze kod nekih vrsta zahteva prisustvo fitohormona auksina, a kod nekih se to odvija
spontano. Cilj ove faze je omogućiti samostalni rast biljke.
Faza IV: Priprema i prenos biljaka u uslove spoljašnje sredine:
Ovaj proces aklimatizacije biljaka na uslove spoljašnje sredine (ex vitro) se odvija
prenošenjem biljaka na seriju podloga koje su sve siromašnije nutritijentima, sve dok se konačno
ne prenesu u zemlju. Cilj ovog postupka je prilagođavanje biljaka na autotrofiju,
mikroorganizme, promenu temperature, vlažnosti i svetlosti.
1.6 Faktori koji utiču na rast biljnih in vitro kultura
Kontrolisanje svih uslova tokom eksperimentalnog rada dovodi do dobijanja validnijih
rezultata. Sam rad eksperimentatora, odabir biljke za istraživanje, uspostavljanje aspetičnih
uslova za rad je samo deo procesa na koji možemo da utičemo tokom istraživanja. Opseg faktora
koji utiču na rast biljnih in vitro kultura je veliki i teško ih je striktno podeliti.
Jednu od podela faktora koji utiču na in vitro kulture dao je Hughes (1981), gde se u
zavisnosti od načina dejstva faktora, oni mogu podeliti na interne (faktori samog medijuma,
sastav medijuma) i eksterne (abiotički faktori: svetlost, temperatura, atmosfera).
19
Razvojem kulture in vitro, razvijale su se i podloge različitog sastava, koje zadovoljavaju
nutritivne i fiziološke potrebe biljaka. Sastavne komponente svih hranljivih podloga jesu:
Voda- kao i u prirodnim uslovima i u kulturi in vitro voda je glavni činilac rasta i razvića
biljaka. Čini oko 95% kulture. Ne koristi se česmenska voda zbog mogućeg sadržaja
mikroorganizama, već se ona prečišćava. Upotrebljava se destilovana i dva puta
destilovana voda (bidestilovana- za kulturu protoplasta, ćelija, ili meristema). Može se
koristiti i dejonizovana voda, koja ipak može sadržati mikroorganizme ili neke druge
organske kontaminente. Vodu je moguće prečišćavati destilacijom, dejonizacilom, ili
reverznom osmozom.
Agar- je polisaharid velike molekulske mase, dobija se ekstrakcijom morskih algi.
Njegova sposobnost da gelira podlogu omogućava potporu biljkama u podlozi. Potrebno
ga je prečistiti i njegova koncentracija u podlogama je obično 0,6 ili 0,7%.
Mineralne soli- kao i voda i mineralne soli su sastavni deo biljaka u prirodi, pa je
njihovo prisustvo u kulturi nužno. Makroelementi (Ca, Mg, N, K, P, S) su potrebni u
koncentraciji većoj od 0,5mmol/l. Mikroelementi (Zn, Cu, Fe, Mn, Mo, Co, I) su potrebni
u koncentraciji manjoj od 0,5mmol/l. Koncentracija Fe i njegovog helatora Na2EDTA je
upravo 0,5mmol/l.
Ugljeni hidrati- su jedna od osnovnih komponenti izgradnje biljnog organizma, ali zbog
nedovoljno razvijenog autotrofnog metabolizma biljaka u kulturi in vitro, oni se dodaju u
hranljivu podlogu. Koristi se uglavnom disaharid saharoza, u manjoj meri glukoza,
fruktoza, ili maltoza.
Vitamini- u malim količinama su sastavni delovi hranljivih podloga.
-inozitol (koncentracija u podlozi 100-200 mg/l-1);
-vitamin B1 ili tiamin ( 0.1-5.0 mg/l-1);
-pantoteinska kiselina ili Ca-pantoteat (0.5-2.5 mg/l-1);
-vitamin M ili folna kiselina ( 0.1-0.5 mg/l-1);
-vitamin B2 ili riboflavin (0.1-10 mg/l-1);
-vitamin C ili askorbinska kiselina (1-100 mg/l-1);
-vitamin PP ili nikotinska kiselina (niacin, 0.1-5 mg/l-1);
-vitamin B6 ili piridoksin (0.1-1 mg/l-1);
20
-vitamin H ili biotin (0.01-1.0 mg/l-1);
-vitamin E ili tokoferol (1-50 mg/l-1), (Maric, 1995).
Regultori rastenja (biljni hormoni, fitohormoni)- regultori rastenja predstavljaju
sintetičke komponente dodate u podlogu, čija je uloga zamena fitohormona. Sa druge
strane, u biljnim tkivima se prirodno sintetišu biljni hormoni koji imaju ključnu ulogu u u
regulaciji rastenja biljnih kultura in vitro.Biljni hormni jesu:
a) Auskini- (gr.auxein-uvećavati, ili rasti) su organske supstance male molekulske
mase, slabo rastvorljive u vodi, a dobro u organskim rastvaračima. Prirodni auksin
koji sintetišu biljke jeste IAA (indol-3-sirćetna kiselina), koristi se u kulturi in
vitrou koncentraciji 0,01-10mg/l, ali on ima tendenciju da se oksidujeu podlozi i
da brzo metaboliše unutar biljnog tkiva, međutim ova karakteristika može biti i
korisna. U kulturi se češće koriste veštački auksini: IBA, NAA i 2,4 -
D,(koncentracije od 0,001-10mg/l), a ređe NOA i TIBA. Auksini prouzrokuju
izduživanje ćelija i bubrenje tkiva, ćelijsku deobu (obrazovanje kalusa) i
obrazovanje adventivnih korenova, inhibiciju obrazovanja adventivnih i bočnih
izdanaka, a često i embriogenezu u suspenzionim kulturama.Pri niskim
koncentracijama auksina preovladava obrazovanje adventivnih korena, dok visoke
koncentracije auksina sprečavaju obrazovanje korena i dolazi do obrazovanja
kalusa. Visoke doze auksina u kulturi mogu izazvati pojavu aberantnih biljaka.
b) Citokinini-biljni hormoni koji se sintetišu u celoj biljci, ali glavni organ njihove
sinteze je koren. Javljaju se kao slobodni molekuli, ali se, takođe, nalaze i u t-
RNK u citoplazmi i hloroplastu (Parić, 2011.). Prvi citokinin koji je otkriven bio
je kinetin, izolovan iz autoklavirane sperme haringe, dok je prirodni citokinin
zeatin. U kulturi se značajno koriste još i BAP, 2iP i TDZ. Snažan citokinin je i
tidiazuron, dok slabiju citokininsku aktivnost imaju: adenin, adenin sulfat i
kokosovo mleko. Citokinini su hormoni koji regulišu ćelijsku deobu, senescenciju
listova, sprečavaju starenje i zadržavanje hlorofila u listovima, poništava apikalnu
dominaciju stabla i tako potpomaže izduživanje aksilarnih pupoljaka u pazuhu
listova, imaju bakteriostatsko dejstvo. Doziranje citokinina je bitno, ili može doći
do pojave aberacija kod biljaka. Premale doze citokinina dovode do toga da
kultura neće rasti, doći će do rizogeneze i neće biti multiplikacije izdanaka.
21
Prevelike doze citokinina dovode do: virtifikacije (hiperhidričnosti, vodenasti,
staklasti izgled), epinastije (savijanja) listova, fascijacije (srastanja, bilateralna
simetrija), rozetastog rasta. U mikropropagaciji se najčešće koristi BAP u
koncentraciji 0,1-2,0mg/l.
c) Giberelini-poznato je oko 100 pripadnika ove grupe hormona. Ipak, nijedna biljka
ne sadži sve gibereline u sebi. Otkriveni su kao agens gljive Gibberella fujikuroi,
koja kod pirinča izaziva bolest prekomernog izduživanja stabla. Najaktivniji je
GA1, dok se najčešće koristi GA3ili mešavina GA7 i GA4. Retko se koriste u
kulturi, a njihovo dejstvo je stimulacija izduživanja stabla patuljastih vrsta,
regulišu cvetanje i klijanje semena i mogu inhibirati rizogenezu.
d) Etilen i ABA-poznatiji kao inhibitori rastai zato se ne dodaju u kulturi, jedino u
posebnim uslovima. Etilen je jedini fitohormon koji je u gasovitom stanju, pa se
tako i njegovo dodavanje u kulturi otežava. Problem sa etilenom je i njegovo
stvaranje i nagomilavanje u posudama za kultivaciju. Etilen ima ulogu u
sazrevanju plodova, starenju tkiva biljaka i abscisiji (opadanju) plodova. ABA
(abscisinska kiselina) reguliše dormanciju semena i pupoljaka, reguliše starenje
biljnog tkiva i inhibitorno utiče na delovanje auksina. ABA u nekim slučajevima
može izazvati inicijaciju obrazovanja kalusa i sazrevanje embriona u procesu
embriogeneze.
Pored sastavnih delova same podloge i drugi faktori utiču na rast in vitro kultura:
pH vrednost- predstavlja koncentraciju vodonikovih jona. Optimalna vrednost rasta u
kulturi je na pH 5,0-6,5, dok vrednosti ispod i iznad optimalne smanjuju, ili potpuno
onemogućavaju rast u kulturi. Prilikom kuvanja podloge podešavanje pH vrednosti se
vrši sa 1,0 N NaOH, ili HCl.
Osmotski potencijal- Osmotski potencijal jedne hranljive podloge je zbir osmotskih
potencijala agara i drugih sastojaka (minerali, šećeri itd.). Ako je osmotski potencijal veći
od 3x105 Pascala (=3 bara), zaustavljaju se rastenje i obrazovanje organa, usled prestanka
uzimanja vode. Osmotski pritisak može se lako podići na normalnu vrednost,
dodavanjem manitol-a, koji predstavlja fiziološki neaktivnu supstancu (Marić, 1995).
22
Svetlost- kao važan abiotički faktor reguliše rast biljnih in vitro kultura na više načina
(intezitet, kvalitet, fotoperiod). Zajedno sa ugljenim hidratima reguliše metabolizam
kulture. Rast i razviće biljaka su zavisni od svetlosti zbog: fotosinteze, fotomorfogeneze i
fototropizma. Fluorescentne sijalice u komorama za gajenje kultura omogućavaju
biljkama u kulturi 16h svetlosi i 8h mraka (sa izuzecima).
Temperatura- u zavisnostiod biljne vrste koja se gaji podešavati i temperaturu u kojoj
ona opstaje u uslovima u prirodnom staništu. Ipak ona se obično održava na konstantnoj
vrednosti 24-26 ˚C.
Antibiotici i fungicide - opšte je pravilo da zaraženu kulturu odmah treba odbaciti. Ipak
po nekim istraživačima je moguće koristiti kombinaciju antibiotika imipenem/ampicilin i
imipenem/penicilin (Knieifel i Leonhard, 1992.) i fungicida kao što je benomil
(Hauptmann, 1985.).
Subkultivacija- poznata i kao pasažiranje. Potrebna zbog narastanja biljnog materijala i
njegovog daljeg razmožavanja, iscrpljenosti i isušivanja hranljive podloge, gubljenja
čvrstine podloge i njenog menjanja boje.
23
2. CILJ RADA
Ciljevi ovog master rada su:
Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana
Ispitivanje uticaja različitih koncentracija fitohormona iz grupe auksina i citokinina na
rastenje aksilarnih pupoljaka, njihovu eloganciju i multiplikaciju
Ispitivanje uticaja auksina i citokinina na produkciju biomase eksplantata M. juliana
Statistička obrada dobijenih rezultata, njihovo tumačenje i izvođenje zaključka
24
3. MATERIJAL I METODE
3.1 Biljni material
Micromeria juliana je prvi put uvedena u kulturu od strane autora Tošić i sar. (2015).
Biljni materijal vrste M. juliana korišćen u ovom radu je uzet iz kulture koja je rasla in vitro na
MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja. Biljni materijal je bio vitalan i zdrav. Korišćeni su
nodalni eksplantati veličine 5mm, koji su postavljani na MS (Murashige i Skoog, 1962) podlogu
sa različitim koncentracijama fitohormona auksina i citokinina.
3.2 MS hranljiva podloga
U ovom radu je korišćena standardna MS podloga. Hranljiva podloga predstavlja smešu
agara, šećera, mineralnih soli, vitamina, inozitola, aminokiselina, kofaktora i hormona
(Murashige i Skoog, 1962). Sastav standardne MS podloge je prikazan u tabelama 1 i 2. Podaci u
tabeli su namenjeni za pripremanje 1000ml MS podloge.
Tabela 1. Sastav makro i mikro mineralnih soli MS podloge
Makro mineralne soli mg/l
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2 x 2H2O 440
MgSO4 x 7H2O 370
KH2PO4 170
Mikro mineralne soli mg/l
MnSO 444 H2O 22,3
ZnSO4 x 7H2O 8,6
H3BO3 6,2
KJ 0,83
25
Na2MoO 44 2H2O 0,25
CuSO4 x 5H2O 0,025
CoCl2 x 6H2O 0,025
Na2EDTA x 2H2O 37,2
FeSO4 x 7H2O 27,8
Tabela 2. Organska jedinjenja koja ulaze u sastav standardne MS podloge
Organska jedinjenja mg/l
vitamin B1 (Tiamin) 0,ح
vitamin B3 (Nikotinska kiselina) 0,5
vitamin B6 (Piridoksin) 0,5
Glicin 2
g/l
Mioinozitol 0,1
Saharoza 30
Agar 7
Podloga koja se priprema u laboratoriji mora biti sterilna. To se postiže sterilizacijom
podloge na visokoj temperaturi i pritisku - autoklaviranjem. pH vrednost podloge, prilikom
njenog spremanja iznosi od 5,2-5,8, a nakon autoklaviranja opada za 0,5 pH jedinica.
Doterivanje pH se vrši sa 1,0 N NaOH, ili HCl. pH podloge je bitan jer omogućuje dostupnost
mineralnih soli u podlozi biljkama koje na njoj rastu, a takođe utiče i na čvrstinu same podloge.
3.3 Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka vrste M. juliana (MS podloga
sa kinetinom i 0,57µM IAA)
U ovom istraživanju je ispitivan uticaj kinetina i indol-3-sirćetne kiseline (IAA) na indukciju
aksilarnih pupoljaka M. juliana. Postavljeno je 8 grupa eksplantata. Prva je kontrolna grupa, bez
biljnih hormona, a ostalih 7 grupa je gajeno na podlozi sa različitom koncentracijom kinetina,
dok je koncentracija IAA bila uvek ista. Prikaz sastava hranljivih podloga je dat u tabeli 3.
26
Tabela 3. Sastav hranljivih podloga
MS
podloga
1 2 3 4 5 6 7 8
Kinetin
(µM)
0 0 0,1 0,3 1 3 10 30
IAA
(µM)
0 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57
Svaki tretman je sadržavao po 30 eksplantata, po 10 eksplantata je postavljeno u jednu
teglu. Tegle su zatvorene i obeležene nazivom vrste i odgovarajućim koncentracijama
fitohormona u podlogama.Tegle sa hranljivim podlogama su autoklavirane, pa ostvljene na 24h
da se podloga stegne.
Eksplantati su gajeni 28 dana, na temperaturi od 21 ± 2 °C i fotoperiodu od 16 sati
svetlosti i 8 sati mraka. Nakon četiri nedelje evidentiran je broj pupoljaka, zatim je merena
dužina pupoljaka. Na analitičkoj vagi merena je sveža masa biljaka. Nakon sušenja u trajanju od
nedelju dana na sobnoj tempetraturi, merena je njihova suva masa. Dobijeni podaci su statistički
obrađeni.
3.4 Sterilizacija
Sterilizacija je postupak kojim se kompletno odstranjuju, ili uništavaju svi oblici
mikroorganizama. U zavisnosti od načina i sredstava koja se koriste u svrhu sterilizacije postoje
različite metode za njeno izvođenje. Metode sterilizacije se dele na fizičke i hemijske. Fizičke
metode sterilizacije obuhvataju: sterilizaciju toplotom, zračenjem i mehaničku sterilizaciju
(filtriranje). Hemijske metode podrazumevaju korišćenje hemijskih sredstava, koja se ipak
koriste uglavnom samo za dezinfekciju. Od hemijskih sredstava za sterilizaciju se aktivno koristi
etilen-oksid.
27
3.4.1. Sterilizacija biljnog materijala
Ovaj postupak odgovara 0 fazi miropropagacije, u smislu pravilne pripreme biljnog
materijala koji će se uvesti u kulturu. Postupak je veoma važan, jer ukoliko ne bude izveden
pravilno može doći do kontaminacije kulture.
Površinska sterilizacija se pre samog početka pospešuje tako što se eksplantati M. juliana
tretiraju 96% alkoholom u trajanju od 60 sekundi. Nakon toga je materijal ispran destilovanom
vodom i sterilisan 10% varikinom (natrijum hipohlorit - NaOCl sa 60 g aktivnog hlora/l). U
erlenmajeru u kome su eksplantati sa varikinom, dodata je i kap deterdženta, sve to je zatvoreno
aluminijumskom folijom. Sadržaj je promućkan svakih 1-2 minuta, a ceo postupak sterilizacije je
trajao oko 25 minuta. Nakon ovoga odlivena je varikina iz erlenmajera i eksplantati su tri puta
isprani sterilnom destilovanom vodom.
3.4.2. Sterilizacija hranljivih podloga
Autoklav je aparat koji radi na principu stvaranja vodene pare pod pritiskom na visokoj
temperaturi i uništvanja mikroorganizama na taj način. Za sterilizaciju hranljive podloge
autoklaviranje je na temperaturi od 114 - 120 °C i pritisku od 1 atmosfere. Postupak sterilizacije
podloga u ovom eksperimentu je trajao 30 minuta na temperaturi od 120˚C.
3.4.3. Sterilizacija instrumenata i prostora
Instrumenti (pincete i skalpeli), kao i petri kutije i ostalo posuđe i pribor su pakovani u
aluminijumske folije i sterilisani suvom sterilizacijom u trajanju od 1-2 sata na temperaturi od
160-180 °C. Radni prostor (laboratorija) je sterilisana UV lampom 24h pre početka rada i u toku
celokupnog rada na postavljanju eksperimenta. Radna površina je pre i u toku rada stalno
dezinfikovana 96% alkoholom. U toku rada je goreo plamenik radi dodatne sterilizacije
28
instrumenata i vazduha. Svaki od instrumenata prilikom rada je korišćen samo jednom, a zatim
stavljan u alkohol i paljen na plamenu pre ponovnog korišćenja, radi smanjenja mogućnosti od
kontaminacije.
3.5 Merenje sveže i suve mase biljaka
Merenje sveže i suve mase biljaka je vršeno na analitičkoj vagi, sa preciznošću od 0,1 mg.
Nakon nedelju dana sušenja biljnog materijala, merena je i suva masa svakog pupoljka na
anlitičkoj vagi. Podaci su unošeni u tabelu, a zatim i statistički obrađeni.
3.6 Statistička analiza podataka
Obrada podataka je urađena statističko – grafičkim paketom Statgraphics, procedura
ANOVA i test LCD na nivou značajnosti p<0,05. Statistička analiza je urađena za svaki
parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene su
različitim slovima, dok ista slova označavaju da tih razlika nije bilo.
29
4. REZULTATI
4.1 Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana
Od biljaka M. juliana gajenih in vitro skalpelom su isečeni nodalni eksplantati. Svaki
eksplantat je deo stabla sa nodusom i parom listova u čijem pazuhu se nalaze aksilarni pupoljci.
Bazalnim delom nodalni eksplantati su uronjeni u hranljivu podlogu. Nodalni eksplantati su
gajeni na MS hranljivoj podlozi: a) bez regulatora rastenja (kontrola), b) sa 0,57µM auksina
indol-3-sirćetne kiseline (IAA), c) sa kombinacijom auksina IAA (0,57 µM) i različitih
koncentracija citokinina kinetina (0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 i 30 µM).
Aksilarni pupoljci su gajeni na navedenim podlogama 4 nedelje, i za to vreme došlo je do
formiranja aksilarnih pupoljaka na svim eksplantatima bez obzira na kojoj podlozi su gajeni.
Nakon tog perioda vršeno je evidentiranje broja, merenje držine pupoljaka, sveže i suve mase
pupoljaka. Meren je samo materijal koji nije bio zaražen.
Prve promene na eksplantatima su uočene u trećoj nedelji gajenja na hranljivoj podlozi.
Aksilarni pupoljci su se izduživali na gotovo svim nodalnim eksplantatima bez obzira na
koncentraciju korišćenih biljnih hormona. U tabeli 4 prikazani su rezultati gajenja eksplantata na
8 različitih hranljivih podloga.
Tabela 4. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana
Hranljiva podloga Prosečan broj pupoljaka po
eksplantatu
Prosečna dužina pupoljaka
(mm)
1 MS 1,92 ± 0,13ab
10,44 ± 0,88d
2 MS + IAA 1,69 ± 0,12a 10,07 ± 0,92
cd
3 MS + IAA + 0,1 kin 1,88 ± 0,13ab
7,24 ± 0,56ab
MS + IAA + 0,3 kin 2,00 ± 0,18 حab
8,30 ± 0,86c
5 MS + IAA + 1 kin 1,76 ± 0,13a 8,25 ± 0,63
bc
6 MS + IAA + 3 kin 2,18 ± 0,16b 8,52 ± 0,77
bcd
7 MS + IAA + 10 kin 1,94 ± 0,11ab
7,77 ± 0,67abc
8 MS + IAA + 30 kin 2,00 ± 0,20ab
5,00 ± 0,74a
Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p0.05
30
Na hranljivoj podlozi MS bez regulatora rastenja (kontrola) svi postavljeni eksplantati su
bili dobro razvijeni, vitalni, izduženih internodija, zelene boje (Sl. 3). Na ovoj podlozi prosečno
je formirano 1,92 pupoljaka po eksplantatu. Prosečna dužina pupoljaka bila je 10,44 mm. Na
pojedinim eksplantatima pojavila se nekroza na listovima koji su bili u dodiru sa hranljivom
podlogom (Sl. 4).
Slika 3. Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi bez fitohormona
Slika 4. Pojedinačni eksplantat M. juliana na MS hranljivoj podlozi bez fitohormona
31
Kada su eksplantati gajeni na podlozi sa indol-3-sirćetnom kiselinomu koncentraciji
0,57µM prosečan broj aksilarnih pupoljaka je bio 1,69. Iz tabele 4 može se videti da je prisustvo
indol-3-sirćetne kiseline u MS podlozi dovelo do formiranja manjeg broja pupoljaka po
eksplantatu u poređenju sa kontrolom. Na ovoj podlozi većina eksplantata bila je dobro
razvijena, međutim nekoliko eksplantata nije reagovalo na tretman, ovi eksplantati se nisu
razvijali, i do kraja četvrte nedelje su ostali iste veličine kao na početku ekperimenta. Pod
uticajem IAA u podlozi došlo je do formiranja adventivnih korenova na bazalnom delu većine
eksplantata (Sl. 6).
Slika 5. Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA
Slika 6. Adventivni korenovi na eksplantatu Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi sa
0,57µM IAA
32
Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 0,57µM indol-3-sirćetne kiseline i 0,1µM
kinetina su bili svetlo zelene boje, sa nekrozom na listovima koji su bili u kontaktu sa hranljivom
podlogom (Sl. 7). U odnosu na kontrolnu podlogu broj formiranih pupoljaka po eksplantatu bio
je manji, njihov prosečan broj bio 1,88. Zabeležena je i niža vrednost prosečne dužine pupoljaka
koja je u ovom slučaju iznosila 7,24 mm (Tab. 4). Na bazalnom kraju pojedinih eksplantata
formirano je kalusno tkivo (Sl. 8).
Slika 7. Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 0,1µM kinetina
Slika 8. Pojednični eksplantat M. juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 0,1µM
kinetina
33
Na eksplantatima gajenim na hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 0,3µM kinetina
prosečan broj pupoljaka bio je veći u odnosu na kontrolu, i iznosio je 2,00. Eksplantati su bili
vitalni, zelene boje, bez hloroze i nekrotičnog tkiva na listovima (Sl. 9). Odnos fitohormona u
podlozi doveo je do pojave adventivnih korenova na bazalnom delu većine eksplantata M.
juliana, što se vidi na slikama 9 i 10.
Slika 9. Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 0,3µM kinetina
Slika 10. Adventivni koren na eksplantatu M. juliana gajenom na MS podlozi sa 0,57µM IAA i
0,3µM kinetina
34
Prosečan broj razvijenih pupoljaka po eksplantatu na MS podlozi sa 0,57µM IAA i 1µM
kinetina iznosio je 1,76. Prosečna dužina pupoljaka bila je 8,25 mm (Tab. 4). Eksplantati su bili
ili kratkih internodija, žbunaste forme, ili pojedinačni izdanci izduženih internodija (Sl. 11, 12).
Na bazalnom kraju eksplantata formirano je kalusno tkivo, ređe koren.
Slika 11.Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 1µM kinetina
Slika 12. Pojedinačni eksplantat M.juliana na MS podlozi sa 0,57µM IAA i 1µM kinetina
35
Na eksplantatima gajenim na MS podlozi sa 0,57µM IAA i 3µM kinetina došlo je do
formiranja najvećeg broja pupoljaka, prosečno 2,18. Bez obzira na isti sastav podloge u
pojedinim teglama biljni materijal bio je veoma heterogen. Na slici 13 mogu se videti zdrave
biljke u svim teglama, ali sa značajnom razlikom u produkciji biomase. Na ovoj podlozi,
formiranje adventivnih korenova na bazalnom kraju eksplantata nije zabeleženo. Prosečna
dužina pupoljaka bila je 8,52 mm, pojedinačni eksplantati dostizali su dužinu i preko 20 mm (Sl.
14).
Slika 13. Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 3µM kinetina
Slika 14. Pojedinačni eksplantat M. juliana na MS podlozi sa 0,57µM IAA i 3µM kinetina
36
Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu, kada su eksplantati gajeni na podlozi sa 0,57µM
IAA i 10µM kinetina, je iznosio 1,94 i bio je gotovo isti kao i kod kontrolne grupe. Prosečna
dužina pupoljaka bila je 7,77mm, značajno manja od dužine pupoljaka kontrolne grupe (Tab. 4).
Na ovoj podlozi pojedini eksplantati bili su izrazito skraćenih internodija, žbunaste forme, dok su
drugi imali izdužene internodije i dostizali dužinu i preko 15 mm (Sl. 15, 16).
Slika 15. Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 10µM kinetina
Slika 16. Pojedinačni eksplantati M. juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 10µM
kinetina
37
Na podlozi sa IAA i 30µM kinetina prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 2,00.
Međutim, ovi pupoljci su imali najmanju prosečnu dužinu, 5,00 mm (Tab. 4). Na slici 17 uočava
se heterogenost eksplantata, više od polovine postavljenih eksplantata bilo je inhibirano
najvećom koncentracijom kinetina u podlozi. Nekroza tkiva se nekada javlja samo na listovima
koji su najbliži podlozi (Sl. 18), nekada na celom eksplantatu.
Slika 17. Micromeria juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 30µM kinetina
Slika 18. Pojedinačni eksplantat M. juliana na MS hranljivoj podlozi sa 0,57µM IAA i 30µM
kinetina
38
Rezultati indukcije aksilarnih pupoljaka na eksplantatima M. juliana su predstavljeni i u
histogramu 1. Najveći prosečan broj pupoljaka po eksplantatu indukovala je podloga sa IAA i
kinetinom u koncentraciji 3 µM, najveću dužinu imali su pupoljci na eksplantatima gajenim na
podlozi bez regulatora rastenja.
Histogram 1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana
39
4.2 Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana
Nakon 4 nedelje gajenja na različitim hranljivim podlogama eksplantati su skinuti sa
podloga, i odmah je merena njihova sveža masa. Biljni material je zatim 7 dana sušen na
vazduhu, nakon čega je merena njegova suva masa. Podaci dobijeni merenjem ova dva
parametra predstavljeni su u tabeli 5.
Najbolja produkcija sveže biomase M. juliana je izmerena na MS hranljivoj podlozi bez
prisustva fitohormona i iznosila je 16,94mg. U tabeli 5 se može videti da je prisustvo biljnih
regulatora rastenja uticalo da sveža masa bude manja u odnosu na kontrolnu hranljivu podlogu.
Najmanje vrednosti prosečne sveže biomase M. juliana su bile pri najvećim koncentracija
fitohormona kinetina (Tab. 5).
Micromeria juliana najveću prosečnu suvu biomasu takođe je imala na podlozi bez
fitohormona (Tab. 5). Najveća prosečna suva masa je iznosila 2,22mg, dok je najmanja vrednost
bila na podlozi sa 0,57µM IAA i 0,1µM kinetina. Najmanja prosečna vrednost prosečne suve
mase iznosila je 1,28mg.
Tabela 5. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana
Hranljiva podloga Prosečna sveža masa
(mg)
Prosečna suva masa
(mg)
1 MS 16,94 ± 1,17b 2,22 ± 0,16
d
2 MS + IAA 14,31 ± 1,16ab
1,88 ± 0,18bcd
3 MS + IAA + 0,1 kin 12,88 ± 0,98ab
1,28 ± 0,11a
MS + IAA + 0,3 kin 14,42 ± 1,14 حab
1,71 ± 0,14bc
5 MS + IAA + 1 kin 12,73 ± 0,99ab
1,62 ± 0,12ab
6 MS + IAA + 3 kin 15,62 ± 1,37ab
2,01 ± 0,15cd
7 MS + IAA + 10 kin 12,55 ± 1,09a 1,59 ± 0,17
ab
8 MS + IAA + 30 kin 12,70 ± 1,87ab
1,44 ± 0,32ab
Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p0.05
40
5. DISKUSIJA
Micromeria juliana je uvedena u kulturu od strane autora Tošić i sar. (2015).
Mikropropagacija ove vrste se pokazala uspešnom i od tada se istražuje uticaj različitih
koncentracija biljnih hormona na njeno rastenje i razviće.
U ovom radu je izvršeno istraživanje uticaja fitohormona auksina (u koncentraciji od
0,57µM) i citokinina kinetina (u koncentracijama od 0,1-30µM) na indukciju aksilarnih
pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana. Rastenje je upoređivano sa
kontrolnom grupom, koja nije bila pod delovanjem fitohormona.
Na eksplantatima, koji su rasli na MS podlozi bez regulatora rastenja, razvijali su se
aksilarni pupoljci. Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu na ovoj podlozi bio je 1,92. Uspešna
indukcija pupoljaka na podlogama bez hormona publikovana je na vrstama Micromeria juliana
(Tošic i sar., 2015), M. pulegium (Tošić i sar., 2016), M. croatica (Tošić, 2015), Salvia
brachyodon (Misić i sar. 2006).
MS podloga koja je sadžala samo 0,57µM IAA je rezultirala najmanjim prosečnim
brojem pupoljaka po eksplantatu. Vrednost je iznosila 1,69 i bila statistički značajno različita od
prosečnih vrednosti dobijenih kada su eksplantati gajeni na podlozi bez hormona. U prilog
ovome idu i rezultati rada na M. juliana (Tošić i sar. 2015). Suprotni rezultati dobijeni su nakon
ispitivanja na vrstama Mentha arvensis i Mentha piperita (Sujana i Naidu, 2011).
Stimulativni efekat niske koncentracije auksina i različitih koncentracija citokinina na
indukciju aksilarnih pupoljaka je pokazan kod različitih biljnih vrsta, u različitim istraživanjima:
na rodu Salvia (Cuenca i sar. 2000), kod Calendula officinalis (Çöçü i sar. 2004), kod Ocimum
sanctum (Singh i Sehgal 1999) i kod Catharanthus roseus (Yuan i sar. 1994). Kinetin u
kombinaciji sa auksinom je pozitivno delovao na indukciju pupoljaka kod Mentha piperita
(Venkatramalingam i Ebbie, 2011). Inhibitoran uticaj citokinina na indukciju i razviće aksilarnih
pupoljaka zabeležen je kod Mentha arvensis (Akram i sar. 2007), Coleus barbatus (Gupta i sar.
2010) i Ocimum kilimandscharicum (Saha i sar. 2010).
41
Najveći prosečan broj pupoljaka po eksplantatu (2,18) zabeležen je na podlozi sa 0,57µM
IAA i 3µM kin. Slični rezultati su dobijeni u istraživanjima M. juliana (Tošić i sar. 2015) sa
sličnim sastavom fitohormona.
Najveća prosečna dužina pupoljaka izmerena je kod eksplanata koji su gajeni na MS
hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja (kontrola). Prosečna dužina pupoljaka na ovoj podlozi
je iznosila 10,44mm. Rezultati eksperimenta na Ocimum sanctum (Singh i Sehgal 1999) i Nepeta
rtanjensis (Mišić i sar. 2005) kod kojih su pupoljci eksplantata gajenih na podlozi bez regulatora
rastenja bili najduži idu u prilog prethodno navedenim rezultatima. Inhibitorni efekat visokih
koncentracija citokinina na izduživanje pupoljaka zabeležen je u eksperimentu sa Mentha
piperita (Ghanti i sar. 2004) i Melissa officinalis (Tavares i sar. 1996). Najmanja prosečna
dužina pupoljaka se upravo javila na podlozi sa 0,57µM IAA+30µM kin (5mm).
U ovom istraživanju je merena i prosečna sveža i suva masa M. juliana. Najveća
produkcija biomase je izmerena na podlozi bez fitohormona. Najveća sveža masa je iznosila
16,94mg, dok je najmanja iznosila 12,55mg (0,57µM IAA+10µM kin). Najveća suva masa je
vrednosti 2,22mg, dok je najmanja 1,28mg (0,57µM IAA+0,1µM kin).
42
6. ZAKLJUČAK
Micromeria juliana (L.) Benth.ex Rchb. je uspešno gajena u kulturi in vitro. Nodalni
eksplantanti su u zavisnosti od sastava fitohormona manje ili više uspešno rasli na podlogama.
To je utvrđeno merenjem sledećih parametara: prosečnog broja pupoljaka po eksplantantu,
prosečne dužine pupoljaka, kao i prosečne sveže i suve mase.
Najveći prosečan broj pupoljaka po eksplantatu zabeležen je na podlozi sa 0,57µM
IAA+3µM kin i iznosio je 2,18, dok je najmanji prosečan broj pupoljaka bio na podlozi sa
0,57µM IAA (1,69). Najveća prosečna dužina pupoljaka je bila na podlozi bez fitohormona i
iznosila je 10,44mm, dok je najmanja iznosila 5,00mm i izmerena je na podlozi sa 0,57µM
IAA+30µM kin.
Na MS podlozi bez fitohormona je izmerena najveća prosečna sveža i suva masa.
Najveća prosečna sveža masa je iznosila 16,94mg, dok je najveća prosečna suva masa iznosila
2,22mg. Na podlozi sa 0,57µM IAA+10µM kin, izmerena je najmanja prosečna sveža masa
(12,55mg), dok je na podlozi sa 0,57µM IAA+0,1µM kin izmerena najmanja prosečna suva
masa u vrednosi od 1,28mg.
Ovim istraživanjem je utvrđeno da se iz male količine početnog materijala M. juliana i
pravilnim izborom koncentracija fitohormona auksina i citokina, mikropropagacijom može dobiti
velika količina materijala za dalji istraživački rad. Na taj način se znatno smanjuje pritisak na
prirodne populacije ove vrste, jer je njen farmakološki značaj veliki. Moguće je, takođe i
reintrodukovati i zaštititi ovu endemičnu vrstu od potpunog izčezavanja u prirodi.
43
7. LITERATURA
1) Akram. M., Afrasiab, H., Mahmood, S., Aftab, F. (2007): Monoterpene contents in in
vitro cultures and field-grown plants of Japanes mint (Mentha arvensis L.). Department
of Botany, University of the Punjab, Quaid-e-Azam campus, Lahore-54590, Applied
Chemistry Research Centre, PCSIR Laboratories Complex, Lahore-54600, PAKISTAN.
2) Bräuchler, C., Ryding, O. and Heubl, G. (2008): The genus Micromeria (Lamiaceae), a
synoptical update. Willdenowia 38: 363-410.
3) Chater, A.O., Guinea, E. (1972): Micromeria bentham. u: Tutin T.G., Heywood V.H.,
Burges N.A, Moore D.M., Valentine D.H, Walters S.M, Webb D.A., Valentine D.H,
Walters S. M, Webb D. A. (ur.). Flora Europaea, Cambridge: Cambridge University press,
III: 167-170.
4) Çöçü, S., Uranbey, S., İpek, A., Khawar, K.M., Sarihan, E.O., Kaya, M.D., Parmaksiz, İ.,
Özcan, S. (2004): Adventitious shoot regeneration and micropropagation in Calendulla
officinalis L. - Biol. Plant. 48: 449-451.
5) Cuenca, S., Amo-Marco, J.B. (2000): In vitro propagation of two Spanish endemic
species of Salvia through bud proliferation. - In Vitro cell. dev. Biol. Plant 36: 225-229.
6) Debergh, P., Maene, L., 1981: A scheme for commercial propagation of ornamental
plants by tissue culture, Sci. Hort., 14: 335 – 345.
7) Ghanti, K., Kaviraj, C. P., Venugopal, R. B., Jabeen, F. T. Z., Rao, S., (2004): Rapid
regeneration of Mentha piperita L. from shoot tip and nodal explants. Indian Journal of
Biotechnology, 3: 594 – 598.
8) Gupta et al., (2010): Variations in growth of tubers of field grown Coleus barbatus as
affected by different hormonal treatments. African Journal of Plant Science Vol. 4(12),
pp. 467-473.
9) Martin, E., Cetin, O., Dırmenci, T., Ay, H., (2011): Karyological studies of Clinopodium
L. (Sect. Pseudomelissa) and Micromeria Benth. s. str. (Lamiaceae) from Turkey.
Caryologia, 64: 398 – 404
10) Marić M., (1995): Kultura biljnih tkiva. ‘Dragančić’, Beograd (20-66).
11) Meimberg, H., Abele, T, Bräuchler, C., McKay, JK., Perez de Paz PL., Heubl, G. (2006):
Molecular evidence for adaptive radiation of Micromeria Benth.(Lamiaceae) on the
Canary Islands as inferred from chloroplast and nuclear DNA sequences and ISSR
fingerprint data. Molecular Phytogenesis and Evolution, volume 41, issue 3, pages 566-
578.
12) Misic, D.; Grubisic, D.; Konjevic, R. (2006): Micropropagation of Salvia brachyodon
through nodal explants. Volume 50, Number 3, pp. 473-476(4).
13) Mišić, D., Ghalawenji, N.A., Grubišić, D., Konjević, R. (2005): Micropropagation and
reintroduction of Nepeta rtanjensis, Diklić i Milojević, an endemic and critically
endangered perennial of Serbia. - Phyton 45: 9-20.
44
14) Murashige, T., Skoog, F., (1962): A Revised Medium for Rapid Growth and Bio
Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473 – 497.
15) Parić. A., Pustahija. F., Karalija. E. (2011): Propagacija biljaka kulturom in vitro.
Prirodno-matematički fakultet, Sarajevo.
16) Saha et al.(2010):Micropropagation of Ocimum kilimandscharicum guerke(Labiatae).
Acta biologica cracoviensia Series Botanica 52/2 50–58.
17) Singh, N.K., Sehgal, C.B.(1999): Micropropagation of ‘Holy Basil’ (Ocimum sanctum
Linn.) from young inflorescences of mature plants. Plant Growth Regul. 29: 161-166.
18) Stojičić, D., Tošić, S., Slavkovska V., Zlatković B., Budimir, S., Janošević, D., Uzelac,
B. (2016): Glandular trichomes and essential oil characteristics of in vitro propagated
Micromeria pulegium (Rochel) Benth. (Lamiaceae). Planta DOI 10.1007/s00425-016-
2513-7.
19) Sujana, P., Naidu, C.V., (2011): Impact of Different Carbohydrates on High
Frequency Plant Regeneration from Axillary Buds of Mentha piperita (L.) – An
Important Multipurpose Medicinal Plant. Journal of Phytology 2011, 3(5): 14-18.
20) Šarić-Kundalić. B., Dobeš. C., Klatte-Asslmeyer. V., Saukel. J.,(2011): Ethnobotanical
survey of traditionally used plants in human therapy of east, northand north-east
Bosnia and Herzegovina.Journal of Ethnopharmacology, volume 133, issue 3, pages
1051-107.
21) Tatić, B., Blečić, V., (2002): Sistematika i filogenija viših biljaka. Zavod za udžbenike
i nastavna sredstva, Beograd.
22) Tavares, A.C., Pimenta, M.C., Goncalves, M.T.(1996): Micropropagaton of Melissa
officinalis L. through proliferation of axillary shoots. Plant Cell Reports ,volume 15,
issue 6, pp 441-444.
23) Tošić, S., Nikolić, S., Jovanović, M., Zlatković, B., Stojičić D. (2015):
Micropropagation of Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb. (Lamiaceae). Biologica
Nyssana 6(1), September 2015: 17-23.
24) Tošić. S. (2015): FIZIOLOŠKI I BIOHEMIJSKI ASPEKTI PROPAGACIJE
ENDEMIČNIH VRSTA Micromeria pulegium (Rochel) Benth. i Micromeria croatica
(Pers.) Schott in vitro (Doktorska disertacija). Univerzitet u Beogradu, Biološki fakultet.
25) Venkatramalingam, K., Ebbie, M.G., (2011): An Efficient in vitro Culture Method of
Shoot Regeneration for a Medicinaly Important Plant Mentha Piperita. Journal of
Plant Sciences, 6: 108-112.
26) Vinterhalter. D., Vinterhalter B. (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka.
Institut za istraživanja u poljoprivredi „Srbija“, Beograd.
27) Yuan, Y.J., Hu, T.T., Yang, Y.M.(1994): Effects of auxins and cytokinins on
formation of Cataranthus roseus G. Don multiple shoots. Plant Cell Tissue Organ Cult.
37: 193- 196.
45
Biografija kandidata
Mitić Marija, rođena je u Leskovcu 25. aprila 1992. godine. Završila je osnovnu školu
“Siniša Janić” u Vlasotincu. Srednju medicinsku školu “Medicinska škola Leskovac” završila je
2011.god.
2012. godine upisala je osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu
Univerziteta u Nišu, na departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne studije je završila 2015.
godine i stekla zvanje “Biolog”. Iste godine upisuje master akademske studije na Departmanu za
biologiju i ekologiju, Prirodno matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu, odsek Biologija.
46
Прилог 5/1
ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редниброј, РБР:
Идентификациониброј, ИБР:
Типдокументације, ТД: монографска
Типзаписа, ТЗ: текстуални / графички
Врстарада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Марија Митић
Ментор, МН: Драгана Стојичиић
Насловрада, НР: „Утицај ауксина и цитокинина на индукцију аксиларних пупољака на нодалним експлантатима Micromeria juliana (L.) Benth.
Језикпубликације, ЈП: српски
Језикизвода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2017.
Издавач, ИЗ: aуторскирепринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
44стр. ; 18 слика ; 5 табела ; 1 хистограма. Научнаобласт, НО: Биологија
Научнадисциплина, НД: Биологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria juliana, mikropropagacija, aksilarni pupoljci, kin, IAA
УДК 577.175.1:581.44+582.929.4
Чувасе, ЧУ: библиотека
Важнанапомена, ВН: Извод, ИЗ: Micromeria juliana је ендемит Балкана и угрожена је врста. Припада
фам.Lamiaceae и продукује етерична уља. У овом истраживању je
испитиван утицај фитохормона кинетина(0,1-30µM) i 0,57µM индол-3-сирћетнекиселине на индукцију аксиларних пупољака M. juliana. Експериментом је утврђено да се највећипросечанброј пупољака по експлантату развио на подлози са 0,57µM ИAA и 3µM kин, а најмањи на 0,57µM ИAA.највећа просечна дужина пупољакабила је наMСподлози, док је најмања на подлози са 0,57µM ИAA и 30µM kин. Мерена је и просечна свежа и сува маса M. juliana. Највећа свежа и сува маса је измерена код експлантата гајених на подлогама без фитохормона .
Датумприхватања теме, ДП: 12/10/17
Датумодбране, ДО:
Члановикомисије, КО: Председник: Др Татјана Михаилов-Крстев
Члан: Др Бојан Златковић
Члан, ментор: Др Драгана Стојичић
47
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: mаster thesis
Author, AU: Marija Mitić
Mentor, MN: Dragana Stojičić
Title, TI: The influence of auxin and cytokinin on axillary buds induction on
nodal explants Micromeria juliana (L.) Benth.
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2017
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
44 p. ; 18 pictures ; 5 tab. ; 1 chart.
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: Biology
Subject/Key words, S/KW: Micromeria juliana, micropropagation, axillary buds, kin, IAA.
UC 577.175.1:581.44+582.929.4
Holding data, HD: Library
Note, N: Abstract, AB: Micromeria julaiana is endemic specie of the Balkan and it belongs to endangered
species. Belongs to the Lamiaceae family and produce essential oils. In this study,
the influence of phytohormones kinetine (0.1-30μM) and 0.57μM indole-3-acetic
acid on the induction of axillary buds of M. juliana was investigated. The experiment
found that the highest average number of buds per explant was developed on the
substrate with 0.57μM IAA and 3μM kin, and the smallest on the substrate with
0.57μM IAA, without the presence of kin. The highest average length of buds is on
the MS substrate without phytohormones, while the smallest is on the substrate with
0.57μM IAA and 30μM Kin. The average fresh and dry mass of M. juliana is also
measured. The largest fresh and dry mass was measured on explants grown on
substrates without phytohormones.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 12/10/17
Defended on, DE: 27/12/17
Defended Board, DB: President: Dr Tatjana Mihailov-Krstev
Member: Dr Bojan Zlatković
Member, Mentor: Dr Dragana Stojičić
48