microbiologia manual

5/14/2018 Microbiologia Manual - slidepdf.com

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

INSTITUTO TECNOLÓGICO

DE ORIZABA

Laboratorio deIngeniería Ambiental

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIOMICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

Miguel Ángel Rendón Sagardi

Ingeniería Química



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MANUAL DE PRÁCTICAS ELABORADO Y REVISADO POR:

M.C. GUSTAVO ADOLFO MIRANDA ROSAS

M.C. RAÚL PÉREZ ÁVILA

PERTENECIENTES AL DEPARTAMENTO DE

INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA DEL INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA



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DATOS GENERALES

NOMBRE DE LA MATERIA:

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

SEMESTRE:

SEXTO

NOMBRE DEL MAESTRO TITULAR:

M.C. RAÚL RÉREZ ÁVILA

NOMBRE DEL ALUMNO:

MIGUEL ÁNGEL RENDÓN SAGARDI

NO. DE CONTROL:

07010179

EQUIPO:

2

CALIFICACIÓN FINAL:

_____________________________________



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ÍNDICE DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

1. CONTINGENCIA AMBIETAL

2. MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO

3. MORFOLOGÍA COLONIAL Y TINCIÓN DE GRAM

4. MEDIOS DE CULTIVO

5. CULTIVO DE BACTERIAS Y DILUCIONES

6. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

7. DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL AGUA USANDO EL MÉTODO DELNÚMERO MÁS PROBABLE

8. AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MÉTODOSDIRECTOS

9. CINÉTICA DE FERMENTACIÓN

10. FLUCTUACIÓN DE MICROORGANISMOS EN LA ATMÓSFERA



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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ASISTENCIA AL LABORATORIO

La asistencia al laboratorio será de acuerdo al horario y calendario deprácticas programadas.

Se considerará retardo si el alumno se presenta a realizar su práctica de 10a 15 minutos después de la hora establecida. Pasado ese tiempo no se admitirá a

ningún alumno dándose por vista la práctica.

No se podrá abandonar el laboratorio sin la autorización del maestro,mientras dure la práctica.

Es obligatorio el uso de bata blanca en el laboratorio y los implementosnecesarios de protección personal.

Cuando por mala fe, negligencia o descuido, desperdicien sustancias,destruyan o maltraten material, instrumentos, equipo o instalaciones; losresponsables deberán pagar por el daño ocasionado o reponer los aparatos o

equipo dañado.

REPORTE DE PRÁCTICAS

Cada alumno debe tener una libreta (engrapada o cosida, no de espiral)tamaño esquela (de 10 por 15 cm.) en donde hará sus anotaciones personales de“recorrido de campo” y dentro del laboratorio.

El recorrido de campo lo avalará el profesor que hizo el recorrido anotandofecha y firma.

El alumno una vez concluidos los análisis de cada práctica anotará en lahoja del formato oficial, únicamente resultados y observaciones personales.

Si el trabajo fue en equipo (o personal en equipo) se reportarán losresultados del equipo y cada uno anotará los resultados obtenidospersonalmente.



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Al final del periodo el alumno entregará su libreta y sus hojas de reportepara evaluar su desempeño y acreditar la calificación del laboratorio que seráreportada al maestro de teoría.

La calificación del laboratorio se acreditará cuando el alumno no tengaadeudos de material, libros, revistas, tesis, reportes (de equipo y personales)

Mantener limpia y ordenada El área de trabajo permanentemente.

No arrojar residuos sólidos a los lavabos, tarjas o sumideros.

Estrictamente prohibido ingerir alimentos dentro del laboratorio.

No se permiten bromas, peleas o juegos, así como vocabulario soez dentrodel laboratorio. Al o los alumnos que se les sorprenda realizando lo anterior se lesretirará de la práctica y cuando el caso lo amerite podrá cancelarse su derechode asistencia al laboratorio.

Al terminar el experimento limpie muy bien el material del equipo y mesade trabajo. Entregue al maestro las sustancias sobrantes, no las tire.

Toda el agua que se genere al realizar la práctica será depositada en unlugar especial (cubeta de residuos) para su tratamiento y disposición final, así como los medios de cultivo.

El alumno se enterará de los dispositivos de seguridad del laboratorio y en

caso de contingencia dará la voz de aviso inmediatamente.

En caso de siniestro siga las instrucciones del encargado del laboratorio,guarde la calma. Ayude a sus compañeros de ser necesario y siga la ruta deevacuación.

LABORATORIO DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ENERO 1998



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PRÓLOGO

Integrar en un solo manual de prácticas de laboratorio los conocimientosbásicos de la microbiología general y de la microbiología ambiental supone sermuy ambicioso, sin embargo, se ha querido dar al estudiante en éste manual deprácticas un compendio de instrucciones claras y precisas que le permitanintroducirse en los aspectos completamente básicos de la microbiología, hasta lamicrobiología aplicada, con la finalidad de entender algunos procesosambientales como las relaciones de los microorganismos con el ambiente en elque se desarrollan o la biodegradación de contaminantes.

En particular, se pretende que quien termina este curso con éxito (teórico-práctico), tenga los elementos necesarios de los procedimientos y habilidadesque les permitan manipular los materiales y microorganismos con rapidez,seguridad, precisión y limpieza. Todo esto, con objeto de poderlos encontrar,observar, describir, distinguir y caracterizar en su ambiente, con lo cual se estaráen condiciones de controlarlos, estudiarlos y, hasta cierto punto, utilizarlos para unproceso de interés.

Es importante tener en cuenta que dada la amplitud de actividades que se

abarcan en algunas prácticas, no todos los ejercicios aquí planteados se puedenrealizar dentro del tiempo normalmente disponible por sesión, es decir, algunos delos ejercicios requieren de más tiempo que el asignado en cada sesión. Por loanterior, algunas experiencias se realizarán en tiempos extras y nonecesariamente cuando lo indique el calendario.

El orden en que se presentan las prácticas no necesariamente será el quese siga durante el desarrollo del curso. Los cultivos microbianos señalados en cadapráctica pueden ser sustituidos según el criterio del profesor y la disponibilidad delas cepas que en algunos casos no es posible conservar y se deben obtener

directamente del suelo, agua, clínicas u hospitales, instituciones de investigación,etc. De tal manera que muchos de los experimentos que se creen que seobtendrán resultados aparentemente obvios no necesariamente corresponderáncon el resultado deseado. Se puede concluir de lo anterior que el trabajar conseres vivos, es trabajar con entidades variables.

Al final se incluye un apéndice con algunas técnicas, fórmulas de algunosmedios de cultivos, reactivos y colorantes empleados en las prácticas.



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REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DEINGENIERÍA AMBIENTAL

Tomando en consideración que se trabaja básicamente conmicroorganismos y estos pueden ser patógenos reconocidos o potenciales, sedeberán seguir estrictamente las indicaciones de este reglamento. No se debemenospreciar el riesgo a la salud que representan muchas de las sustancias quese emplean ni las preocupaciones en el uso de mecheros de gas debiendo daraviso de inmediato en el caso de fugas o derrames.

1. La hora de entrada debe cumplirse puntualmente. No se permitirá el accesoal laboratorio a quien llegue con retraso.

2. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Solo podrá quitársela alsalir de éste.

3. No se permitirá la entrada a personas ajenas al laboratorio.4. Recogerse el cabello antes de entrar al laboratorio.5. La puerta del laboratorio deberá mantenerse en lo posible siempre cerrada.6. Limpiar la mesa de trabajo con una solución germicida antes de empezar y al

terminar el trabajo.7. Colocar todos los objetos personales en los lugares asignados para ello. Dejar

fuera solamente el material que se va a utilizar.8. Abstenerse de comer, fumar, beber, aplicarse maquillaje e introducirse objetos

a la boca.9. No se debe pasear entre las mesas de laboratorio. Si fuera posible, el trabajodebe realizarse sentado.

10. Hablar solo lo necesario.11. Leer cuidadosamente el instructivo antes de empezar la práctica y seguir las

instrucciones del profesor. Si no entiende, pregunte. 12. Informar al profesor sobre cualquier accidente que ocurra.13. Depositar en los botes de basura todo el material de desecho no

contaminado, como papel, algodón, cerillos, etc.14. No debe lavarse material de ningún tipo durante la sesión práctica.15. Al finalizar cada sesión, colocar el material debidamente separado en los

lugares asignados para ello: material contaminado para esterilizar, sinetiquetas; material sucio para lavar; material para incubar; y reactivosdebidamente cerrados y ordenados.

16. El material para incubar debe llevar la siguiente identificación: grupo, equipo,nombre del alumno, fecha y nombre del microorganismo o experimento.

17. Lavarse meticulosamente las manos antes de salir del laboratorio.18. En caso de emergencia, inmediatamente cerrar la llave de gas ya apagar

cualquier aparato con el que se esté trabajando. De manera ordenada yrápida salir del laboratorio. RECUERDE: NO CORRO, NO GRITO, NO EMPUJO.



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OBJETIVOS GENERALES DEL LABORATORIO DEMICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

1. Aprender el vocabulario y los conceptos teóricos y experimentales quepermitan conocer la naturaleza y diversidad de los microorganismos y ellugar que ocupan entre los seres vivos.

2. Reconocer las interrelaciones que se presentan entre los microorganismos y

el ambiente.

3. Reconocer la importancia de los microorganismos como modelos deinvestigación científica.

4. Utilizar adecuadamente las técnicas microbiológicas que permitanmanipular los microorganismos para su aislamiento, estudio de lascaracterísticas fisiológicas de cultivo, identificación y clasificación,selección, modificación, propagación, utilización y control.

5.

Integrar las funciones generales de los microorganismos en los diferentesecosistemas.



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Practica No. 1


M.C. Raúl Pérez Ávila



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CONTINGENCIA AMBIETAL

PRÁCTICA No. 1 FECHA DE REALIZACIÓN: 01 de septiembre de 2009

OBJETIVO:

Contribuir a la instrumentación de una tarea eficiente y segura en elámbito del Laboratorio de Microbiología Ambiental, mediante procedimientosque prevengan, protejan y/o eliminen los riesgos físicos, químicos y biológicos.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS:

RIESGOS QUIMICOS

• Todo producto químico es un contaminante tóxico potencial que puedecomportar riesgos por sí mismo o producir reacciones más peligrosas encontacto con otros.

• Todos los docentes involucrados en el dictado de los trabajos prácticos dematerias que utilicen productos químicos deben conocer sus propiedadesfísico-químicas, los efectos que producen sobre la salud y la forma dedisminuir su incidencia nociva.

Envases

• Los reactivos deberán estar contenidos en recipientes de tamañoadecuado para facilitar su uso, evitar el trasvase y traslado de un lugar alotro del laboratorio. El envase deberá ser acorde al producto a contener ya las cantidades que se deben dispensar.

• Deberá tenerse en cuenta el posible efecto corrosivo que las sustanciasquímicas y agentes físicos (temperatura, radiación solar) puedan tenersobre el material del envase. Los envases plásticos deben ser revisados confrecuencia.

• Los recipientes de pequeña capacidad que contengan sustanciascorrosivas (ácidos y álcalis) deberán ubicarse separados entre sí y sobrebandejas de polietileno de alta densidad o policarbonato según sucompatibilidad para retener derrames (rotura, volcado).

• Los recipientes de vidrio se utilizarán sólo para guardar pequeñascantidades de productos. Los envases de vidrio deben transportarseprotegidos (ver transporte) y las botellas de dos litros deben disponer de unasa que facilite su manejo.



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• Cada reactivo debe estar identificado correctamente mediante etiquetasnormalizadas. Las sustancias químicas se catalogarán y reconocerán pormedio de colores de acuerdo a su peligrosidad.

Desechos generados

• En el laboratorio debe existir un contenedor especial para vidrios rotos,material para adsorber derrames (tierra de diatomeas, arena, etc.) eimplementos de limpieza para recolectar desperdicios en caso de roturade material.

• Los residuos deberán ser separados y envasados en recipientes adecuadosde vidrio, plástico o bolsas plásticas, perfectamente identificados yrotulados.

RIESGOS BIOLOGICOS

Los agentes biológicos son todos aquellos microorganismos, con inclusiónde los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos,susceptibles de originar algún tipo de infección, alergia o intoxicación, con lo cualtodo material de origen biológico es un contaminante tóxico potencial quepuede comportar riesgos por sí mismo.

El laboratorio de Microbiología Ambiental se encuentra ligado a estosriesgos, y es por esto que:

• Todo el personal docente debe conocer el nivel de riesgo que implica lamanipulación de microorganismos, vectores, hongos, parásitos, animales,sangre, suero, plasma, antisueros, etc. o cualquier agente modificadogenéticamente o proveniente de seres vivos, así como las posibles rutas depenetración, infección o transmisión.

• El docente a cargo de los turnos de trabajos prácticos debe restringir elingreso al laboratorio sólo a aquellas personas cuyas tareas lo justifiquen,quienes deberán estar informadas y capacitadas convenientemente.

• Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona esresponsable directa de la zona de trabajo que le ha sido asignada y detodos los lugares comunes.

TRABAJOS PRÁCTICOS CON MATERIALES BIOLÓGICOS

En la entrada de todos los laboratorios debe existir información sobre elnivel de seguridad con el que se trabaja.

• Nivel de Seguridad I: Agente no patógeno. Utilizable para prácticasmicrobiológicas estándar. Sólo este nivel de riesgo está permitido para loslaboratorios de enseñanza de grado.



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• Nivel de Seguridad II: Agente patógeno que puede provocarenfermedades en humanos o animales pero tiene pocas probabilidades

de producir riesgo grave para el personal o su entorno. Riesgo individualmoderado y comunitario limitado.

• Nivel de Seguridad III: Agente patógeno que suele ocasionarenfermedades humanas graves pero no se propaga de una persona aotra. Riesgo individual elevado o comunitario escaso (por ejemplo,aerosoles o transmisión por aire).

• Nivel de Seguridad IV: Riesgo individual y comunitario elevados. Agentespatógenos que suelen ocasionar enfermedades graves o mortales y quepuede propagarse fácilmente (epidemias).

En aquellos laboratorios en que se desarrollen actividades conmicroorganismos que no pertenezcan al Grupo I, se debe exponer en la puerta elsímbolo de Riesgo Biológico durante el tiempo en que se realicen las tareas,informar la especie con la que se trabaja, el nombre y forma de ubicar alprofesional responsable en caso de accidente y los requerimientos que debencumplir las personas que ingresen al laboratorio.

Las siguientes medidas de contención primaria son necesarias paraprevenir el escape de agentes infecciosos en el ambiente del laboratorio yproteger a las personas.

Barrera 1: está dispuesta alrededor del microorganismo e incluye las buenasprácticas microbiológicas, así como cualquier equipo diseñado para prevenir ladiseminación de los agentes infectivos por aerosol o aire. Por ejemplo, para elNivel de Seguridad I puede alcanzar con un mechero; para los otros niveles esnecesario una cabina.

Barrera 2: está dispuesta alrededor del trabajador e incluye ropa protectora(delantales, guantes, barbijos, zapatos cerrados, etc.) así como medidas dehigiene y supervisión médica.

• El uso de máscaras protectoras para ojos, nariz o boca está recomendadopara el manejo de microorganismos peligrosos o manipulaciones de otrosagentes biológicos que puedan conducir a la formación de aerosoles yespecialmente en caso de trabajar con hongos.

• El derrame o caída de muestras contaminadas, diluciones y mediossembrados o inoculados será informada al docente de inmediato. Seprocederá a tratar el área afectada con solución desinfectante quecorresponda, la cual se dejará actuar y se recogerá con papel absorbenteque será luego autoclavado. Se tomarán las precauciones debidas paracada desinfectante. Una vez limpia, la zona será tratada nuevamente condesinfectante.



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• En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos,proceder de igual forma pero no tocar los residuos antes de que el

desinfectante hubiera actuado.

• El almacenamiento de recipientes con cualquier material biológico debeefectuarse en cuartos, heladeras, congeladoras, etc., perfectamenteidentificados y etiquetados y bajo la responsabilidad del docente a cargodel laboratorio.

• Los docentes deberán estar entrenados en el manejo correcto de cadainstrumento: fuentes de poder, autoclaves, centrífugas refrigeradas,espectrofotómetros, estufas, microscopios, baños termostatizados,termocicladores, hornos de hibridación, etc.

• El área de trabajo debe estar limpia, ordenada sin libros, abrigos o bolsassobre las mesadas trabajo.

a) Siempre desinfectar y ordenar la zona de trabajo antes decomenzar, al terminar o si se hace un intervalo.

• Lavarse las manos meticulosamente cada vez que deje de trabajar ysecarse con papel descartable.

• Los jefes de trabajos prácticos y coordinadores deberán implementar quelas manipulaciones más riesgosas, como el trasvasamiento de cultivos, sean

realizados por los docentes en zonas aptas para esa tarea.Tratamiento y disposición de los desechos generados

• Todos los cultivos se autoclavarán antes de su disposición final y los residuosgenerados se tratarán como residuos domiciliarios. Se tomarán losrecaudos necesarios para que los recipientes individuales estén contenidosen otros de mayor capacidad para prevenir la diseminación de materialorgánico dentro del autoclave en situaciones de daño o derrame.

• En caso de trabajar con hongos toxicogénicos, los cultivos se inactivarán yse procederá como en el punto anterior.

• Las pipetas usadas, portaobjetos y otros elementos abiertos deberáncolocarse en un recipiente con solución desinfectante para su posteriordescontaminación y lavado o descarte.

• Está terminantemente prohibido verter muestras o cultivos en las piletas.

• Todos los elementos corto punzantes utilizados serán desechados endescartadores apropiados (recipientes rígidos que no permitan suapertura).



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• No está permitido encapuchar las agujas antes de ser desechadas.

• Los restos recipientes de vidrio rotos, una vez desinfectados, deberán ser

envueltos en papel grueso, cuádruplo y colocado en caja de cartón,asegurándose de que no queden bordes y aristas potencialmentecortantes.

• En el laboratorio debe existir un contenedor especial para vidrios rotos,material para recoger derrames (tierra de diatomeas, arena, etc.) eimplementos de limpieza para recolectar desperdicios en caso de roturade material.

BUENAS PRÁCTICAS

• Las buenas prácticas incluyen reglas, recomendaciones o prohibicionesrelacionadas con el conocimiento, el sentido común y la solidaridad en elambiente de trabajo.

• No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio.

• Se deberá usar vestimenta adecuada (guardapolvos que cubran la ropade calle, preferentemente de algodón y mangas largas que no seráutilizado fuera del laboratorio, zapatos cerrados).

• No está permitido pipetear con la boca.

CONTINGENCIA O EMERGENCIAS

• Los planes de contingencia que permitan contener derrames o fugas,sismos, incendios, accidentes, deben ser conocidos por todo el personaldocente, comunicados a los alumnos al inicio del ciclo lectivo y cumplidoestrictamente.

• Los alumnos y docentes deben estar familiarizados con los elementos deseguridad disponibles, salidas, extintores, duchas, lavaojos; además decontar el equipo de protección personal.

• El área de trabajo debe estar limpia y ordenada. No deben colocarselibros, abrigos o bolsas sobre las mesadas de trabajo.

• Toda herida o abrasión, aún los pequeños cortes que puedan producirsedurante el trabajo práctico deben ser informados obligatoriamente aldocente.



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Practica No. 2





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MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO


OBJETIVO:

El alumno conocerá las partes del microscopio de campo luminoso, sufuncionamiento y cuidados para conservarlo en las mejores condiciones detrabajo y así lograr buenas observaciones utilizando los diferentes objetivos.


Una de las herramientas más útiles e importantes en microbiología es elmicroscopio. Todas las formas vivientes con las que se experimentan enMicrobiología son prácticamente invisibles a simple vista y es esencial estarplenamente familiarizado con el Microscopio al empezar cualquier curso deMicrobiología. Desde el punto de vista óptico, se reconocen dos tipos demicroscopios: el que solamente usa una lente, también llamada lupa, que es elmicroscopio simple y el que se usa por lo menos dos lentes, microscopiocompuesto, en el cual la imagen producida por la primera lente o sistema delentes (objetivo) es ampliada por la segunda lente o sistema de lente (ocular)

TIPO DE MICROSCOPIOAUMENTO

MAXIMO UTIL(x)

LIMITE DERESOLUCIO

N (nm)APLICACIÓN EN MICROBIOLOGÍA

Campo luminoso 1500 100-200 Muy usado con objetos teñidos.

Campo oscuro 1500 100-200Para microorganismos vivos o

difíciles de teñir.

Ultravioleta 2500 100Para obtener mayor aumento y

resolución que en campoluminoso.

Fluorescencia 1500 100-200

Para objetos con fluorescencia

natural o por tinción; muy útil enidentificación.

Contraste defases

1500 100-200Para ver estructuras de

microorganismos vicos, sin teñir.

LUZ

Con focal 1500 100-200Permite estructuras superficialescon una imagen tridimensional.

Barrido 15000-100000 1 a 10Permite ver imágenes en dos y

tres dimensiones.ELECTRONICO

Transmisión 6000-400000 1Para observar organelos y ultra

estructuras de microorganismos.

EFECTO TUNEL1000000-

100000000<0.1 a 1

Observación de macromoléculaso átomos.



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Partes de un microscopio compuesto de campo brillante:

Sistema Parte Función

Lámpara Fuente de luzFiltro Selecciona la longitud de onda de la luz.

CondensadorRecoge la luz de la lámpara y la concentra en

el objeto.

Diafragma de campoRegula la cantidad de luz que sale de la

lámpara.

Iluminación

Diafragma decondensador

Regula la luz del condensador y permitecontrastar el objeto.

Objetivos Sistema de lentes de aumento. Pueden sersecos o de inmersión en aceite.

ÓpticaOcular

Conjunto de lentes de aumento quecolectan, enfocan y envían la luz al ojo

donde se forma la imagen virtual.

Ajuste Tornillos micrométricosy macrométricos

Acerca o aleja rápidamente o lentamente elobjeto y el sistema óptico.

Revolver Sostiene y permite el cambio de los objetivos.Platina Sostiene la preparación o portaobjetos.Soporte

Pie y brazo Sostiene la parte óptica.

CUIDADOS DEL MICROSCOPIO:

1. Transportar el microscopio en forma vertical, tomándolo del brazo con lamano y de la base con la otra.

2. Colocar cuidadosamente microscopio en la mesa. Es convenienteasegurar que no exista vibraciones o aparatos que la provoquen (vórtex,agitadoras, etc.) en la mesa donde se coloquen.

3. Limpiar el soporte metálico del microscopio con una tela que no dejepelusa y la parte exterior del sistema óptico con papel seda. Si las lentes seencuentran demasiado sucias pueden limpiarse con un hisopo de algodónimpregnado con agua. En caso extremo acudir a un experto. JAMASLIMPIAR LAS LENTES CON SOLVENTES ORGÁNICOS.

4. Evitar arrastrar, golpear o inclinar el microscopio.

5. NUNCA DEBE LIMPIARSE CON EL DEDO EL ACEITE DEL OBJETO DE INMERSIÓN.



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MANEJO DEL MICROSCOPIO:

1.

Iluminación del campo visual:

• Conectar y prender la lámpara.• Acercar el objeto a la preparación.• Subir el condensador hasta el tope.• Abrir o cerrar el diafragma del condensador hasta tener un campo

adecuadamente iluminado y con el mayor contraste posible. Recuerdeque los campos excesivamente iluminados disminuye el contraste de laestructura del objeto que se observa y que los campos poco iluminados nopermiten distinguir los colores.

2. Colocar la preparación en la platina y sujetarla con las pinzas.3. Enfoque la preparación.

• Cuando sea necesario, colocar el cubre objetos en la preparación.• Enfocar la preparación con el objeto seco débil (10x) usando primero el

tomillo macrométrico y después el tornillo micrométrico hasta obtener unaimagen clara.

• Sin mover los tornillos, cambiar el objeto seco fuerte (40x) y mover el tornillosmicrométrico hasta enfocar de nuevo.

• Para observar con el objeto de inmersión ponga el cubre objetos sobre lamuestra.

• Dejar caer una pequeña gota de aceite de inmersión sobre lapreparación, con cuidado cambiar el objeto de inmersión e intentarenfocar la preparación en el tornillo micrométrico. Cuando se estáenfocando una preparación que se desea observar con el objeto deinmersión nunca se debe mover el tornillo macrométrico. Es importantetener cuidado al estar buscando el enfoque correcto ya que a veces pordescuidado se presiona demasiado el porta objeto hasta que se rompe. Alterminar de hacer las observaciones, limpiar el microscopio como se indico

anteriormente y entregarlo:

a) Con la lámpara apagada, el cable enrollado y sujeto con una liga.b) Con la platina hasta el tope inferior.c) Con el revólver colocado en el objeto de menor aumento a donde no

lo tiene.

Colocar en el lugar asignado y cubrirlo con la funda.Avise a los profesores de cualquier irregularidad que note en el microscopio.



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ACTIVIDADES

MATERIAL:

1. Microscopio de campo brillante.2. Pipetas Pasteur o asa bacteriológica.3. Tela suave.4. Hisopos de algodón.5. Portaobjetos y cubreobjetos.6. Azul de metileno.

MATERIAL BIOLÓGICO:

1. Epidermis de cebolla.2. Cultivo mixto de protozoarios (agua estancada)

TÉCNICA:

Preparación húmeda (montaje húmedo):

a) Limpie perfectamente los portaobjetos y coloque con cuidado unapequeña gota del cultivo protista o cualquier otra muestra. Ayúdese con

una pipeta Pasteur o con varias asadas.b) Con cuidado cubra la gota con un cubreobjetos perfectamente limpio.c) Para observarse, siga los pasos que se indican en el manejo del

microscopio hasta tener una imagen nítida.

Preparación seca (frotis):

a) Si la muestra es líquida, en zona estéril y siguiendo la técnica aséptica tomeuna muestra con la pipeta Pasteur o con el asa, y extiéndala sobre elportaobjetos, deje secar al aire.

b) Si la muestra es cultivo sólido, coloque una gota pequeña de aguadestilada sobre el portaobjetos y mézclela con una muestra del sólido quele interese, para que pueda ser disuelto en el agua. Deje secar al aire.

REPORTE DE LA PRÁCTICA:

1. Resumir en un cuadro sinóptico las principales partes del microscopiocompuesto.

2. Presente imágenes ante los diferentes objetivos: seco (10x), seco fuerte(40x), e inmersión (100x).



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ESQUEMAS Y OBSERVACIONES:

Realizamos un frotis húmedo con el agua estancada y observamos con diferentesobjetivos:

Seco (10x) Seco fuerte (40x)

Colocamos una porción de epidermis en el portaobjetos y observamos condiferentes objetivos:

Seco (10x) Seco fuerte (40x)



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Agregamos colorante a la muestra, retiramos el exceso y montamos lapreparación para proceder a observar:

No realizamos observaciones con el objetivo de inmersión (100x), pues lasmuestras que teníamos eran húmedas, y el contacto del cubreobjetos con ellente podría haberlo dañado.



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Partes del microscopio:

Mapa conceptual de las partes del microscopio:



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Esquemas de las observaciones del agua estancada, observada con losdiferentes objetivos:

Seco (10x)El panorama con el objetivo seco, no

permite observar a detalle, aunque nosproporciona un gran campo visual.

Seco fuerte (40x)Con este objetivo se logra apreciar el aguacon más detalle, aunque el campo visual

se reduce.

CUESTIONARIO:

¿Cuáles son las diferencias bajo el microscopio más obvias entre losmicroorganismos observados?R= La forma, pues pudimos apreciar diferentes morfologías; en el caso de lacebolla logramos apreciar la forma de las células en su epidermis.

¿Qué partes de la ultraestructura de una bacteria solamente se puede observarpor microscopía electrónica?R= Gracias al microscopio electrónico se hizo posible observar con detalle laestructura interna de las bacterias. Todavía se trabaja en el perfeccionamiento deestas técnicas, por lo cual, la anatomía está en una fase de desarrollo acelerado.

CONCLUSION:

Durante esta práctica, conocimos las partes del microscopio compuesto ypudimos apreciar diferentes morfologías mediante su uso.



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Practica No. 3





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MORFOLOGÍA COLONIAL Y TINCIÓN DE GRAM


OBJETIVO:

El alumno describirá y reconocerá la morfología colonial así como larealización de la técnica de coloración de Gram con especies bacterianasconocidas.


Morfología colonial:

Cuando se examinan los microorganismos asociados o presentes en unanimal, planta, suelo, agua o alimento, se encuentra una gran variedad. Sóloraramente se encontrará un solo tipo de microorganismo. Si se quiere trabajar conun cultivo puro, se deben obtener colonias separadas o aisladas. La observacióncuidadosa de las colonias muestra que éstas varían en apariencias. Una colonia microbiana está constituida por individuos de la misma especie provenientes deuna célula o de un grupo de ellas. Por definición un buen aislamiento en placas esaquel que nos da colonias aisladas, con una distancia que permita distinguir ydescribir la morfología colonial que incluye:

a) Tamaño: se describe en milímetros y puede variar desde coloniasextremadamente pequeñas que miden apenas una fracción de milímetrohasta aquellas que llegan a medir 10mm o más. Algunas especiesbacterianas pueden extenderse en toda la superficie de la caja.

b) Color: las colonias pueden tener varios colores, debido a pigmentos propiosa absorción de algunas sustancias del medio.

c) Forma: pueden ser puntiformes, circulares o irregulares. Las coloniaspuntiformes son tan pequeñas que no se pueden distinguir el resto de suscaracterísticas.

d) Bordes: pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lóbulos,filamentos, proyecciones como dientes de sierra enrollados.

e) Elevación: la colonia puede ser plana o elevada, esta última a su vezpuede ser convexa, pulvinada, embonada, crateriforme o umbilicada.

f) Superficie: puede ser lisa, rugosa o granularg) Aspecto: puede ser húmedo o secoh) Luz reflejada: puede ser brillante o mate.



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i) Luz transmitida: puede ser transparente, translúcida u opaca. j) Producción de pigmentos: algunas bacterias producen pigmentos solubles

en agua, que puede difundir al medio ambiente.k) Consistencia: dura o suave, esta última puede ser butirosa, o friable. Estacaracterística se determina tocando la colonia con el asa y por lo tantopuede ser la última en describirse.

l) Otras: en ciertos medios de cultivos el crecimiento bacteriano ocasionacambios visibles alrededor de la colonia, como la hemolisis en gelosasangre, acidificación que de manifiesta con un indicador pH incorporadoal medio de cultivo, y otros efectos similares.

Con la experiencia en la observación de cultivos, las características de

morfología colonial viene a constituir una guía muy útil en el reconocimiento delos principales grupos de microorganismos, y también permite en muchos casoscorroborar la pureza de un cultivo o alertar sobre una posible contaminación. Lacerteza de tener un cultivo puro así como el reconocimiento de un cultivo mixto oimpuro permite la caracterización correcta de un microorganismo.

Tinción de Gram:

La observación microscópica de las bacterias es más fácil cuando se tiñe.Sin embargo, es fácil confundir un punto o bastón sobre un fondo de un mismo

color con algún artefacto. Este problema apareció cuando las muestras detejidos infectados se tifien con azul de metileno buscando a las bacteriasincluidas. El primer intento para resolver el problema fue decolorar los cortesdespués de la coloración. En los tejidos que tenían bacilos tuberculosos, esto fueefectivo pero en otras bacterias se decoloraba igual que los tejidos y no seganaba nada. El problema fue resuelto por Hans Christian Gram, patólogo danésque en 1884 introdujo un colorante de contraste después de la decoloración. Enesta tinción diferencial las bacterias se teñían de color púrpura oscuro usando lallamada solución Ehrlich, violeta de genciana con anilina y los tejidos circulantescon café de Bismark o vesubiano. Originalmente la coloración de Gram. se

desarrollo para visualizar las bacterias en los tejidos animales pero pronto seadvirtió que era útil para la diferenciación de bacterias. Las bacterias teñidas poresta coloración se dividen en dos grupos: las que retienen el violeta de gencianao cristal violeta o Gram positiva y las que se decoloran con el decolorante y setiñen con el colorante de contraste (generalmente de color rojo como lasafranina o la fucsina básica aunque puede usarse verde de malaquita para losobservadores daltónicos) o Gram negativas.

La afinidad tintorial seguramente se debe a numerosas diferencias en laestructura y composición química de muchos componentes celulares entre los



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que destaca la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una paredcompuesta principalmente de una capa de peptidoglicana relativamente gruesa

(20-80nm). En cambio, las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicanadelgada (5-10nm) además de una membrana externa constituida de fosfolípidosy lipolisacáridos.

En general, las bacterias Gram positivas son susceptibles a la penicilina yvarios agentes químicos y son más resistentes a la desintegración por tratamientomecánico que las Gram negativas, que como grupo, son más susceptibles a otrosantibióticos como la estreptomicina. Las diferencias básicas en la estructurasuperficial de las bacterias Gram positivas y negativas contribuyen a aclarar ladiferencia en la respuesta a la coloración Gram. Durante la tinción de Gram,

ambos grupos de bacterias se tiñen con el colorante primario (cristal violeta) ymordente (yodo). El complejo colorante-mordente, es decir atrapado dentro dela célula Gram positiva por la deshidratación y la porosidad reducida de la gruesapared celular que ocurre durante de la etapa del lavado diferencial con etanolal 95%. En cambio, las Gram negativas la delgada capa de peptidoglicana noimpide la extracción del complejo colorante-mordente en la decoloración. Elcolorante secundario o de contraste tifie fácilmente a las células decoloradas.Gram negativas. El rompimiento mecánico o disgregación enzimática de la paredcelular de los Gram positivos los hace teñirse como Gram negativos.

GRAM POSITIVO GRAM NEGATIVO

Fijación

Cristal violeta

Lugol

DecoloraciónAlcohol-cetona

Safranina



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ACTIVIDADES

MORFOLOGÍA COLONIAL:


Cultivos de 24-48 hrs. de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Saccharomycescerevisiae, Bacillus megaterium.

MATERIAL:

1. Asa bacteriológica

2. Puente de tinción3. Portaobjetos4. Cubreobjetos5. Mechero

EQUIPO:

1. Microscopio

REACTIVOS:

1. Safranina2. Cristal violeta3. Azul de metileno

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE UN FROTIS Y TINCIÓN

Primer caso

1. Si se tiene un cultivo líquido, tome una muestra con el asa y extendiéndolasobre un portaobjetos perfectamente limpio y deje secar al aire.

2. Después añada cuidadosamente un colorante y déjelo por espacio de unminuto.

3. Suavemente lave el frotis con agua, deje secar al aire.4. Observe cada uno de los objetos.5. Anote las observaciones.

Segundo caso



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1. Si se tiene una placa con cultivo, primero coloque una pequeña gota deagua destilada sobre un portaobjetos perfectamente limpio.

2.

Flamee el asa con el mechero y deje enfriar al aire cerca de la llama.3. Tome con el asa una pequeña colonia de la palca y haga una pequeñasuspensión bacteriana con la gota que está en el portaobjetos.

4. Extienda ésta suspensión hasta hacer un frotis.

Continué con el proceso descrito anteriormente.

PRECAUCIONES:

Al realizar esta técnica se puede cometer errores que son comunes y que

entorpecen una buena interpretación al hacer la observación, por lo que sedebe considerar las siguientes recomendaciones.

1. AI ocupar los portaobjetos deberán estar limpios de cualquier materialextraño

2. Evitar los frotis que se vean espesos, de otra manera no podrá apreciar conexactitud al microscopio

3. Evitar que el colorante actué por tiempos muy prolongados o muy cortos.4. Sujetar por los lados al portaobjetos. Evitar hacerlo por donde están los

frotis, puede arriesgar a contaminarse con el microorganismo.

5. Secar cerca del mechero puede deshidratar o quemar los frotis.

TINCIÓN DE GRAML:


Cultivos de 24-48 hrs. de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Saccharomycescerevisiae, Bacillus megaterium, Proteus sp., Enterobacter aerogenes,Saccharomyces cerevisiae.

MATERIAL:

6. Asa bacteriológica7. Puente de tinción8. Portaobjetos9. Cubreobjetos10. Mechero

EQUIPO:



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2. Microscopio

REACTIVOS:

4. Safranina5. Cristal violeta6. Bicarbonato de sodio al 5%7. Lugol8. Alcohol – cetona9. Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO:

1. Hacer frotis con una de las bacterias y fijarla con calor.2. Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir

el colorante y lavar con un chorro suave de agua.3. Cubrir los frotis con solución de Lugol y dejarlo actuar durante un minuto.

Escurrir el reactivo y lavar con un chorro suave de agua.4. Colocar el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco, decolorar

añadiendo gota a gota al alcohol-cetona durante 5 a 15 segundos. El

momento exacto para terminar la coloración con agua es cuando dejande fluir "hilos colorantes" por el frotis. Este es el paso crítico de la tinción.Lavar inmediatamente con un chorro de agua suave.

5. Cubrir los frotis con safranina y dejar actuar durante un minuto. Escurrir elcolorante y lavar con un chorro suave de agua. Dejar secar al aire.

PRECAUCIONES:

La tinción de Gram en general es muy sencilla de hacer, sin embargo, sepueden cometer errores que hacen variar el resultado y consecuentemente la

interpretación. Los errores detectados frecuentemente son:

1. Un frotis mal fijado al portaobjetos puede ocasionar durante los lavadosarrastre a las bacterias.

2. Lavar vigorosamente y con exceso de agua, elimina el frotis, colorante ocomplejo frotis-colorante del portaobjetos.

3. Dejar actuar por más tiempo el decolorante arrojará resultados falsamentenegativos.

4. Un cultivo viejo influye en los resultados obtenidos durante la tinción deGram.



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Morfología colonial:

Tomamos el asa bacteriológica y la pusimos a la flama del mechero Bunsen hastaque se pusiera al rojo vivo, con el fin de esterilizar y posteriormente dejamosenfriar:

Colocamos la bacteria E. coli sobre el portaobjetos esparciéndola levemente yposteriormente pasándola por la flama del mechero una tres veces procurandoque no se quemara:

Colocamos el portaobjetos en el puente y aplicamos safranina y dejamos reposarde 1 minuto a minuto y medio y posteriormente lavamos con agua destilada:



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Colocamos el portaobjetos de nuevo en el puente y dejamos secar hasta que elagua sobrante se evapore y no se vea rastro alguno. Posteriormente llevamos al

microscopio pero sin colocar el cubreobjetos:

En las siguientes fotos se muestra la bacteria Escherichia coli aglomeradas comocadenas.En el seco débil 10x pudimos distinguir la bacteria pero en forma de pequeñísimoscírculos.

En el seco fuerte 40x no se tomo fotografía. En el de Inmersión 100x ya se observacon mucho más nitidez las cadenas aglomeradas de la bacteria la machanaranja es el tinte rojo, hay que recordar la bacteria es un bacillo en forma debastón.



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Tinción Gram:

En cuatro portaobjetos identificados con un plumín permanente (del 1 al 4)colocamos, con la ayuda del asa, una muestra de E. coli:

Hicimos el frotis seco la bacteria en cada portaobjetos y fijamos con calor.(Recordad que no hay que poner directamente el frotis en la llama y hacerlo porlapsos de tiempo):

Una vez seco el frotis, colocamos una pequeña cantidad de colorante cristalvioleta a cada uno de los frotis y dejamos reposar de medio minuto a 1 minuto yposteriormente escurrimos el colorante y lavamos con la piseta:



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Posteriormente cubrimos los frotis con una pequeña cantidad de solución deLugol (NOTA: omitimos el portaobjetos numero 1, y lo hicimos del 2 al 4). Dejamos

actuar de medio minuto a 1 minuto y posteriormente escurrir el reactivo y lavamoscon un chorro suave de agua.

Luego colocamos el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco,decoloramos añadiendo gota a gota alcohol-cetona (NOTA: omitimos elportaobjetos número 1 y 2, y lo hicimos con el 3 y 4). Dejamos actuar durante 15segundos. El momento exacto para terminar la coloración con agua es cuandodeja de fluir “hilos colorantes” por el frotis. Este es el paso crítico de la tinción.Lavamos inmediatamente con un chorro suave de agua.

Posteriormente colocamos en pequeña gota de colorante de safraninaúnicamente al portaobjetos 4, y dejamos actuar durante medio minuto a 1 minutoy posteriormente escurrimos el reactivo y lavamos con un chorro suave de agua.Dejamos secar y observamos cada portaobjetos, del 1 al 4:



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G

G

Esquemas de las fotos obtenidas en cada porta objetos

Forma Forma de Identificación Agrupación

Frotis con Cristal Violeta

En elPaso 1

Todas las células se tiñen aazul violeta

Frotis con Cristal Violeta yLugol

En el

Paso 2

Todas las células siguendel mismo color azul

violeta

Frotis con Cristal Violeta,Lugol y Alcohol-Cetona

En elPaso 3

Las células Gram Positivassiguen de color azul-

violeta mientras que las deGram negativa se

decoloran

Frotis con Cristal Violeta,Lugol y Alcohol-Cetona y

Safranina

En elPaso 3

Las células Gram Positivas(G+) se ven azul-violeta ylas Gram Negativas (G-)

rosas o rojas

Escherichia coli, bacteria con forma de

bastón (bacilo), quepertenece a la familia

de lasEnterobacteriáceas;

está considerada comoel material biológico

más utilizado en

experimentación. Estabacteria se encuentra

en el tracto intestinal delos mamíferos. La

especie comprendevarios grupos que seestablecen según su

actividad. Las especiesde Escherichia coli

oportunistas producen

infecciones sólo siabandonan el colon.

La Escherichia coli es unorganismo adecuado

para la investigación porsu crecimiento rápido y

porque su cultivo essencillo.

En las fotografías sepuede notar como los

bacillos en forma debastones se aglomeran

como si estuvieranformando cadenas otiras, y de cómo se va

siguiendo cada paso enla tinción de Gram hasta

concluir en GramNegativa



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LA BACTERIA E. COLI ES GRAM NEGATIVA

Cada uno de los integrantes del equipo llevo acabo el mismo procedimiento enun solo portaobjetos y llegamos a la misma conclusión.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué importancia tiene la técnica de coloración de Gram en laidentificación de las bacterias?

R=Por medio de esta tinción se puede diferenciar las bacterias y se puedendividir en dos grupo: las que retienen el violeta de genciana o cristal-violetaque son las Gram Positivas, y las que se decoloran con el alcohol-cetona y setiñe por contraste de rosa o rojo.

2. ¿Cuál es el paso crítico en la técnica de la coloración de Gram?R= Es cuando se le agrega el alcohol-cetona pues cuando dejan de fluir hiloscolorantes por el frotis

3. Diga el nombre de tres bacterias (género y especie) Gram positivas y tresGram negativas diferente citadas en la práctica.

R= Gram Negativas: Escherichia coli , S. dysenteriae y H. influenzae.Gram Positivas: Saccharomyces , C. diphtheriae y M. tuberculosis.

BIBLIOGRAFIA

Brock Biología de los Microorganismos, 10ma. Edición, Editorial PEARSON PrenticeHall, Autores: Michael T. Madigan, John M. Martinko y Jack Parker.

CONCLUSIÓN

Durante esta práctica, reconocimos la morfología colonial y aprendimos latécnica de tinción diferencial de Gram con especies bacterianas conocidas.



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Practica No. 4





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MEDIOS DE CULTIVO


OBJETIVO:

El alumno preparará diversos medios de cultivo utilizando agar y fuentesfuente de carbono y sales minerales.


Para diseñar un medio de cultivo se debe tener en cuenta no sólo losnutrientes requeridos por el microorganismo que se desea estudiar, sino tambiénlas condiciones físicas que le permitan crecer, los cuales son:

• Nutrientes: La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio decultivo viene determinada por el rendimiento de un productodeterminado, además de los requerimientos nutricionales delmicroorganismo.

• pH: Un microorganismo puede alterarse o alterar el pH del medio de cultivo

como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo.Estos cambios pueden llegar a inhibir el crecimiento del microorganismo.Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemastampón, el más utilizado en microbiología es la combinación de KH2PO4 yK2HPO4.

• Necesidades de gases: los principales gases que afectan al desarrollomicrobiano son el O2 y CO2. Las bacterias presentan una respuesta ampliay variable al O2 libre clasificándose en 4 grupos:

• Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de O2 libre.• Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de O2 libre.• Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan en

presencia o ausencia de O2 libre.• Micro-aerobias: bacterias que crecen en presencia de pequeñas

cantidades de O2 libre.

• Suministro de luz: Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a unafuente de iluminación, la cual no debe plantear problemas de variación de



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temperatura, por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con undesprendimiento mínimo de calor.

• Control de temperatura: El desarrollo de las bacterias depende dereacciones químicas y la velocidad con que se efectúan, las cuales estáninfluidas por la temperatura, por lo cual la temperatura puede, en parte,determinar el crecimiento de los microorganismos en estudio. Cadaespecie microbiana posee una temperatura óptima de crecimientoclasificándose según esto en:

• Psicrófilas (psicrofílicas): capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Sutemperatura óptima es alrededor de los 15° C.

• Mesófilas (mesofílica): crecen mejor entre 25 y 40° C.• Termófilas (termofílicas): crecen mejor entre 45 y 60° C.

• Grado de humedad

• Presión osmótica: generalmente se trabaja en condiciones de isotonía (300miliosmoles), aunque existen bacterias que pueden crecer enconcentraciones hipotónicas e hipertónicas.

• Esterilidad

• Protección: El medio de cultivo debe estar protegido de la contaminaciónmicrobiana ambiental.

Agar

El agar (llamado antiguamente agar-agar) es un gel coloidal formado porhidratos de carbono, de extendido uso comercial, y que proviene de las paredescelulares de varias especies de algas rojas, en concreto de miembros orientalesdel género Gelidium. Es un excelente medio de cultivo de bacterias, ya que no se

disuelve por el efecto de las sales, ni se consume por la acción de la mayoría delos microorganismos.

Químicamente, el agar es una mezcla compleja de sales de polisacáridos,fundamentalmente, galactósidos. Las grandes moléculas que lo constituyendeterminan sus cualidades sobresalientes, como coloides y espesantes, que lohan hecho hasta ahora insustituible.

Además de los polisacáridos, el agar contiene numerosos cationesasociados, tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, etc. De los cuales no



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está, claramente, establecida su influencia sobre las propiedades de esteproducto.

Referente a las propiedades y contenidos del agar, básicamente,dependen de la materia prima empleada, procedencia geográfica, época decosecha y madurez del alga.

A continuación, se caracterizarán los tipos de medios de cultivo según suestado y composición.

Estado:

1. Medios sólidos: Su proporción de agar es siempre por encima del 15%.

2. Medios semisólidos: Son medios intermedios entre los medios líquidos ysólidos, su proporción de agar suele ser suele ser inferior al 5%, pero siempresuele presentar cierta cantidad que le proporcione una consistenciasemisólida.

3. Medios líquidos o caldos: No contiene agar y su composición (además deagua) suele contener al menos una fuente de carbono, sales minerales, y aveces según las características de medio, factores de crecimiento,vitaminas, peptonas, aminoácidos, entre otros.

Composición:

1. Medios sintéticos o químicamente definidos: Llevan fuentes de carbono,nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca, etc.), otros elementoscomo estimuladores de crecimiento pero siempre a concentracionesconocidas.

2. Medios complejos o de composición indefinida: Estos medios llevaningredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro,extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sinsaber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estosnutrientes.

3. Medios de enriquecimiento: Son medios complejos, normalmente, conaditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinadosmicroorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Tales como:adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

4. Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimientoespecífico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos.Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de unapoblación microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono esselectivo para autótrofos, adicionando cristal violeta se inhibe el



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crecimiento de los Gram Positivos (G+), utilizando maltosa como únicafuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

5.

Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminaciónde microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales decrecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticosde no hemolíticos;

6. McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).7. Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo

ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápidade las células. Por ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismosproducen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible noutilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

Medio de cultivo de uso común:

Agar Nutriente: Medio para fines generales que promueve el crecimiento de lamayoría de los microorganismos poco exigentes.

Agar Papa Dextrosa: Medio para el cultivo y enumeración de levaduras y mohosa partir de alimentos y otros materiales. Los hidratos de carbono y la infusión depapa favorecen el crecimiento de levaduras y hongos, en tanto que por el bajorango de pH, la flora acompañante se reduce significativamente.

Agar Salmonella-Shigella: Medio para el aislamiento de salmonelas y de Shigellade heces, de comestibles y de otros materiales.

Agar Sabouraud: Medio para la detección y aislamiento de hongos en muestrasmediante técnica de filtración por membrana. Para que ocurra el crecimientoselectivo de hongos sobre bacterias en la muestra depende tan solo de lareacción ácida (pH 5.6).

Caldo Nutritivo: Medio de uso general, utilizado para el crecimiento de

microorganismos exigentes así como para los no exigentes. Clostridios yanaerobios pueden crecer también cuando se incuban bajo condiciones deanaerobiosis.

Agar McConkey: Medio diferencial para la detección, aislamiento y enumeraciónde bacterias coniformes y patógenas intestinales en aguas, productos lácteos ymuestras biológicas. Su acción diferencial está basada en que losmicroorganismos capaces de fermentar lactosa producen una caída de pH, juntocon una absorción del colorante, apareciendo en la colonia el color rojo, lascolonias de microorganismos que no fermentan la lactosa permanecen incoloras.



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Agar Levine: Medio para el aislamiento y la diferenciación de los Escherichia coli yenterobacterias, fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa y para

la identificación rápida de los albicans.

Agar Chapman: Medio para la detección de Staphylococcus patógenos enmuestras de alimentos y otros materiales mediante la técnica de filtración pormembrana.

Cuadro de Crecimiento:

Agarnutriente

AgarMcConkey

AgarLevine

AgarChapman

AgarPapa

dextrosa

AgarSalmonella-

Shigella

AgarSabouraud

AgarSangre

CaldoNutritivo

Staphylococcusaureus NO NO NO SI NO NO SI NO SI

Escherichia coli SI SI SI NO NO NO SI SI SI

MATERIAL:

a. Algodónb. Matraces elenmeyerc. Cajas de Petri

d. Espátulae. Mecherof. Mortero con Pistilog. Tubos de ensayo

EQUIPO:

a) Balanza granatariab) Olla exprés

REACTIVOS:

a) Agaresg) Caldo Nutritivo

PROCEDIMIENTO:

Cada equipo preparó dos medios de cultivo diferentes, en nuestro caso, al ser elequipo número dos nos tocó preparar:



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Caldo nutritivo:

Medio de uso general, utilizado para el crecimiento de microorganismos exigentesasí como para los no exigentes. Clostridios y anaerobios pueden crecer tambiéncuando se incuban bajo condiciones de anaerobiosis.

Fórmula para 1000ml de agua destilada:Peptona de gelatina 5.0 g.Extracto de carne de res 3.0 g.pH final 6.9±0.2

Disolver 8 gramos en un l itro de agua destilada.

Agar Czapek-dox:

Medio de cultivo para hongos saprófitos, bacterias del suelo y otrosmicroorganismos. En este medio la única fuente de carbono es la sacarosa y elnitrato aporta nitrógeno.

Se recomienda para el aislamiento de Aspergillus y Penicillium. De la florabacteriana del suelo solo pueden desarrollar las bacterias no exigentes.

Fórmula para 1000ml de agua destilada:Sacarosa 30.0 g.Nitrato de sodio 3.0 g.Sulfato de magnesio 0 .5 g.Fosfato dipotásico 1.0 g.Cloruro de potasio 0.5 g.Sulfato ferroso 0.01 g.Agar 0.01 g.pH final 7.3±0.2

Disolver 5 gramos en un l itro de agua destilada.

1. Utilizando la balanza granataria, pese la porción correspondiente de polvopara preparar el medio de cultivo.

2. Deposite en el matraz y llena afora con agua destilada y posteriormentehomogeniza dando círculos en la punta de la llama del mechero debunsen.

3. Posteriormente poner algodón y tapar con papel aluminio la boca (casoagar).



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.g28.1x

x.ml160

.g0.8.ml1000

=

→

→

4. Depositar en tubos de ensayo (caso caldo)5. Llevar a la olla exprés con poca agua y colocar los matraces.

6.

Llevar a la estufa hasta que llegue a los 300 °C; mantener 15min y luegoesperar a que baje la temperatura.7. Posteriormente llevar al refrigerador y dejar reposar durante 24 hrs.8. Después sacar y meter al microondas para que cambie a estado liquido.9. Colocar el agar en las cajas Petri cerca de la flama del mechero de

bunsen y esperar a que se solidifiquen.10. Posteriormente sellar con un pedazo de masking-tape y un sello de

identificación de agar.11. Meter al refrigerador para conservar.

PRECAUCIONES:

• El procedimiento para la preparación de cualquier medio de cultivo deberealizarse rigurosamente para no contaminar el medio.

• Los medios de cultivo en ocasiones vienen muy duros (como piedra) así quehay que utilizar una espátula para picar y una mortero con pistilo parapulverizar.


Para preparar el caldo nutritivo, basta disolver 8 gramos delpolvo en un litro de agua; y ya que deseamos preparar 160ml, se tiene:

Se pesó. Se midió el volumen de agua. Se disolvió.



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.g05.1x

x.ml210

.g0.5.ml1000

=

→

→

Se llenaron los tubos de ensayo para introducir en la olla exprés.

Para preparar el agar Czapek-dox, basta disolver 5 gramosdel polvo en un litro de agua; y ya que deseamos preparar210 ml, se tiene:

Se pesó. Se midió el volumen de agua. Se disolvió.

Se le colocó el sello de algodón y papelaluminio; y se introdujo a la olla exprés.



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Se saca de la olla y se llenan las cajas de Petri.

BIBLIOGRAFIA

Collins C.H, Lyne Patricia, Métodos Microbiológicos Edición Acribia, S.A, Zaragoza,España, quinta edición.

CONCLUSIÓN

Durante esta práctica, aprendimos a preparar los medios de cultivos, loscuales permiten el crecimiento y desarrollo de microorganismos gracias a que

proporcionan sustancias nutritivas.



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Practica No. 5





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CULTIVO DE BACTERIAS Y DILUCIONES


OBJETIVOS:

El alumno inoculará diversas bacterias con el fin de observar lascaracterísticas de las mismas.

El alumno realizará diluciones con el fin de observar la proliferación debacterias en un medio determinado.


El cultivo es un método para la multiplicación de células omicroorganismos, o para el crecimiento de tejidos en el que se prepara un medioóptimo para favorecer el proceso deseado; es empleado como un métodofundamental para el estudio de las bacterias.

Esto se lleva a cabo al cultivarlas en un medio líquido o en la superficie deun medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes quevan, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o elextracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partirde una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un mediode cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización;tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisiónbinaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones decélulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en unnuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que esimposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, paraidentificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicassembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un

producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas,pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. Otras veces elmedio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo puedenutilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH quecambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y segeneran catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producirfermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo serealiza en un tubo cerrado.



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Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratoriode microbiología, pues sirven para identificar las bacterias causantes deenfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.

MATERIAL:

• Olla exprés• Asa bacteriológica• Mechero• Crayón• Balanza granataria• 6 Tubos de ensayo• 6 Cajas de Petri• 1 matraz

REACTIVOS:

• 2 medios de Czapek-dox• 2 medios de Agar Nutritivo• 2 medios de Agar dextrosa y papa• 2 medio de Agar azul de metileno y eosina• Agua destilada• Agar nutritivo• Bacterias (indicadas en la técnica)

PROCEDIMIENTO:

Cultivo

Se utilizarán los siguientes medios, preparados en la práctica anterior:

• 2 medios de Czapek-dox (elaborado por nuestro equipo)

•

2 medios de Agar Nutritivo (elaborado por el equipo 5)• 2 medios de Agar dextrosa y papa (elaborado por el equipo 4)• 2 medio de Agar azul de metileno y eosina (elaborado por el equipo 3)

Cultivo en tres zonas:

1. Tomar las cajas de los medios con Agar Czapek-dox, dextrosa-papa y azulde metileno-eosina ya esterilizados; y con una crayola dividir en tres partespor la parte inferior de la caja.

2. Enumerar para saber que bacteria se sembrará en cada zona.



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Zona 1 sembrar Staphylococcus aureus.Zona 2 sembrar E. coli.

Zona 3 será el blanco.3. La técnica de siembra (inoculación) será la siguiente:Con el asa esterilizada tomamos una muestra de la bacteria.La pasamos por la zona correspondiente en el medio haciendo una estría.

4. Lo anterior se repetirá en dos cajas de los 3 medios seleccionados.5. Posteriormente llevar a incubación para su crecimiento.

Cultivo en siete zonas:

1. Se utilizarán dos cajas con agar nutritivo.

2. Dividir la caja en siete partes por la parte inferior utilizando el crayón.3. En cada zona se sembrará lo siguiente:Zona 1: Muestra de cabello.Zona 2: Saliva.Zona 3: Piel.Zona 4: Muestra de piso.Zona 5: Muestra de agua de llave.Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato.Zona 7: Blanco.

4. La técnica de siembra (inolulación) será la siguiente:

Con el asa esterilizada tomamos la muestra correspondiente.La pasamos por la zona correspondiente en el medio haciendo una estría.

5. Posteriormente llevar a incubación para su crecimiento.

Diluciones

1. Preparar medio de agar nutritivo siguiendo la metodología vista en lapráctica anterior.

2. Esterilizar con la olla exprés en 6 tubos de ensayo.3. Sacar los tubos de ensayo de la olla y templar sin llegar a la solidificación

del medio; pues se llevarán a cabo las diluciones.4. En una serie de tres tubos realizar la dilución de la bacteria Bacilo subtilis y

en otra serie de tres tubos la de la bacteria Proteus vulgaris.

PRECAUCIONES:

• El procedimiento para la preparación del medio de cultivo debe realizarserigurosamente para no contaminar el medio.

• La temperatura del agar donde se realizará la dilución será tal que alcontacto con el brazo sea tolerable sin llegar a la solidificación del medio.



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• Al finalizar la práctica las cajas se desecharán colocándolas en una bolsa ysometiéndolas a esterilización.


Cultivo en tres zonas:

En cada una de las 6 cajas de cultivo:• 2 de Agar Czapek-dox• 2 de Agar dextrosa y papa• 2 de Agar azul de metileno y eosina

Se realizó lo siguiente

División en 3 zonas Esterilización de asa

Toma de muestra bacteriana Siembra

Zona 1: Staphylococcus aureus.Zona 2: Escherechia coli.Zona 3: Blanco.

Staphylococcus aureus:

• Es una especie bacteriana integrada por formas cocaceas, que se dividenen más de un plano, por lo que se agrupan regularmente en racimos.

• Son inmóviles y carecen de esporas.• Son grampositivas.



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• Agente patógeno que actúa como un microorganismo saprófito, seencuentra en la piel del individuo sano pero en ocasiones en que las

defensas de la piel caen puede causar enfermedad.

Escherichia coli:

• Es quizás el organismo procarionte más estudiado por el ser humano, setrata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinosanimales y por ende en las aguas negras. Ésta y otras bacterias sonnecesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo.

• Son gramnegativo.• Anaeróbico facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su

cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa.

Medio de azul de metileno-eosina:

En caja que se aprecia en la fotografía a la izquierda se puede apreciar de mejormanera el crecimiento de las bacterias. La bacteria Staphylococcus aureus,presenta un color morado-grisáceo mientras que la E. coli presenta un colornegruzco.

Medio de dextrosa-papa:

No se aprecia crecimiento aparente, solo un pequeño brillo en un lugar donde secolocó la estría.



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Medio de Czapek-dox:

No se aprecia crecimiento aparente, solo un pequeño brillo en un lugar donde secolocó la estría.

Observaciones hechas después de 48 hr. de incubación.

Cultivo en siete zonas:

En las dos cajas de agar nutritivo se realizó lo siguiente:

División en 7 zonas Esterilización de asa

Toma de muestras SiembraZona 1: Muestra de cabello.Zona 2: Saliva.Zona 3: Piel.Zona 4: Muestra de piso.Zona 5: Muestra de agua de llave.Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato.Zona 7: Blanco.



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Solo en la caja de la imagen izquierda no se mezclaron los crecimientos de laszonas, pues como se puede apreciar en la caja de la derecha, todo se mezcló.

De la caja de la imagen izquierda se ve que:

Zona 1: Muestra de cabello: No hubo crecimiento de microorganismos,únicamente se aprecia el brillo donde se realizo la estría.Zona 2: Saliva: Se aprecia crecimiento de microorganismos en una coloniaesférica.Zona 3: Piel: No hubo crecimiento de microorganismos.



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Zona 4: Muestra de piso: Se poco crecimiento en una mancha amarillenta.Zona 5: Muestra de agua de llave: Se aprecia crecimiento en una mancha

opaca.Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato: Se aprecia crecimiento en unamancha grande.Zona 7: Blanco.

Observaciones hechas después de 48 hr. de incubación.

Diluciones:

Preparación de agar nutritivo:

Tomamos 6 tubos de ensaye con Agar Nutritivo ya esterilizados y en estado líquido

(dado que la práctica la continuamos el día jueves 1 de octubre, se realizó bañomaría para disolver)

Posteriormente en la primera serie de tres tubos se colocó una muestra de Bacilosubtilis y en la segunda serie Proteus vulgaris.



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En cada caso:

Del tubo de ensaye (1) se toma una muestra y se coloca en otro tubo de ensaye(2); posteriormente se toma la muestra del tubo de ensaye (2) y se coloca en eltubo de ensaye (3)

Se colocó en tres cajas de Petri el contenido de los 3 tubos de ensaye (1), (2) y (3)por separado y se etiquetaron para su identificación.

Se llevó a incubación al refrigerador, durante parte del jueves, viernes, sábado,domingo y parte del lunes; pues debido a limpieza de la escuela porcontingencia sanitaria no pudo colocarse en la estufa.

Se observa que en cada caja de Petri el crecimiento de las bacterias fue deforma proporcional ya que en el tubo de ensaye (1) había más población y en eltubo de ensaye (2) disminuía, y por ultimo en el tubo de ensaye (3) disminuía aúnmás. Es decir no hubo crecimiento proporcional.

Bacillus subtilis:

Es una bacteria grampositiva, Catalasa-positiva,aerobio facultativo1 comúnmente encontrada en el

suelo. Tiene la habilidad para formar una resistenteendospora protectora, permitendo al organismo tolerarcondiciones ambientalmente extremas.

Proteus vulgaris:

Es una bacteria gramnegativa, facultativamente anaeróbico en forma de baciloque habita en el tracto intestinal del hombre y varios animales. Puede también seraislado de la tierra, agua y materia fecal. Se agrupa con las enterobacteriaceae



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y es un patógeno oportunista en humanos, causando infecciones urinarias, deheridas y en abscesos hepáticos.

Desecho de cajas de Petri:

Se esterilizaron en la olla exprés, se colocaron en una bolsa negra y se depositaronen el bote correspondiente.

BIBLIOGRAFIA

Cultivo (microbiología), Wikipedia, Enciclopedia en Líneahttp://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_(microbiolog%C3%ADa)

CONCLUSIÓN

Durante esta práctica, comprobamos que cada bacteria tiene ciertaafinidad por un medio de cultivo específico, el cual le brinda los nutrientesnecesarios para su crecimiento. También observación los crecimientosproporcionales de acuerdo a la cantidad de muestra.



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Practica No. 6





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MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

PRÁCTICA No. 6 FECHA DE REALIZACIÓN: 6 de octubre de 2009

OBJETIVOS:

Preparar para esterilizar el material de vidrio más usado en el laboratorio demicrobiología.

Conocer el material y equipo más común para la esterilización y el trabajoen condiciones de esterilidad.


La esterilización es un proceso mediante el cual se elimina por remoción omuerte todos los organismos viables de un objeto, superficie o medio. Un objetolibre de cualquier forma de vida se dice que está estéril. El concepto deesterilización absoluto, es decir no existe un material casi, más o menos, o 99%estéril.

En el trabajo de un laboratorio de microbiología es necesario que todo el

material como pipetas, tubos de ensaye, cajas de Petri de vidrio o de plástico,medios de cultivo y soluciones estén estériles. Debe cuidarse que el materialesterilizado se conserve estéril. Así, antes de esterilizarse, a los matraces, tubos ydemás recipientes se les pone un tapón de algodón que evitará el acceso demicroorganismos del ambiente al interior. También es necesario proteger estetapón con papel para tratar que no se humedezca con agua de condensacióndespués de esterilizar con calor húmedo. Algunos laboratorios utilizan tapones deplástico o metálicos en lugar de algodón con la misma finalidad.

Existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, la selección de

uno o de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar. Porejemplo, la esterilización con calor húmedo, generalmente se realiza en unautoclave a 121ºC durante 15 minutos, la temperatura se alcanza utilizando vaporde agua a una presión de 15 psi (2 atm). Estas condiciones de esterilización concalor húmedo pueden variar de acuerdo con el volumen, tipo de autoclave ynaturaleza del material por esterilizar. LOS RECIPIENTES QUE SE ESTERILIZAN ENAUTOCLAVE NO DEBEN ESTAR HERMÉTICAMENTE CERRADOS.



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La muerte de los organismos contaminantes ocurre principalmente pordesnaturalización de las macromoléculas (proteínas, RNA y DNA) y coagulación

de proteínas.

La esterilización con calor seco se usa principalmente para material devidrio y materiales sólidos estables al calor, la cual requiere de mayor duración eintensidad porque la conducción del calor es menos rápida que un ambientehúmedo. La temperatura que se utiliza es generalmente entre 160 y 180ºC durante1.5 horas. Las cajas de Petri de vidrio y las pipetas se colocan en cilindros de demetal con aberturas que permiten el paso del aire caliente. La inactivación de loscontaminantes ocurre por pérdida de agua y oxidación de todos suscomponentes esenciales.

La filtración a través de membranas se usa para esterilizar soluciones desustancias termolábiles en donde los microorganismos son detenidos en el filtro. Elfiltrado estéril debe recibirse en un recipiente también estéril. Los virus y algunostipos de bacterias muy pequeñas como Bdellovidrio, rickettsias, clamidias yalgunas espiroquetas atraviesan esos filtros de membrana.

VAPOR A PRESIÓN (AUTOCLAVE)HUMEDO

AIRE CALIENTE (HORNO)

FLAMEADOCALOR

SECO INCINERACIÓNFILTRACIÓN DISCO DE MEMBRANAS

RAYOS UVNO IONIZANTE

RAYOS IR

RAYOS X

MÉTODOS FÍSICOS

RADIACIONES

IONIZANTERAYOS γ (COBALTO-60)

GASES OXIDO DE ETILENO

FORMALDEHÍDOMETODOS QUÍMICOSLÍQUIDOS

BETA-PROPIOLACTONA

En las campanas de flujo laminar que se usan como áreas estériles en eltrabajo microbiológico, el aire se esteriliza por filtración a través de mallas defibras de diversos materiales (filtros absolutos). Para el control de la contaminaciónproveniente del aire en especies limitadas, se ha usado la esterilización UV, perosu escaso poder de penetración solo se le ha usado para esterilización desuperficies y láminas muy delgadas de agua transparente, incolora y sin excesode sales de fierro. El gas de óxido de etileno y las radiaciones ionizantes sonutilizados para esterilizar material de plástico sensible al calor, porque este gas



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difunde fácilmente a través de polietileno, papel y cartón. Por esta razón se hanusado radiaciones ionizantes como las del cobalto-60 para esterilizar artículos de

plástico ya envueltos, como las jeringas hipodérmicas. Estos agentes no serecomiendan para esterilizar soluciones o medios de cultivo.

Para determinar la eficiencia del proceso de esterilización se emplean losindicadores biológicos de esterilización. Específicamente, cuando se esteriliza concalor húmedo se utilizan, junto al material que se esteriliza, ampolletas quecontienen esporas viables de Bacillus stearothermophilus que son inactivadas a121ºC durante 12 minutos. Después de la esterilización se incuban las esporas y seanalizan si éstas sobrevivieron o no al proceso de esterilización. También existencintas que con el cambio de un indicador químico muestran si se alcanzaron las

condiciones de la esterilización por calor o por óxido de etileno.

MATERIAL

Pipetas para esterilizar.Pipeta de 10 ml.18 tubos de ensayo.18 campanas.AlgodónPapel aluminio. PROCEDIMIENTO

Preparación de tubos de vidrio para esterilizar en olla exprés (sustituyendoautoclave)

1. Prepara Caldo lactosado como medio de cultivo.2. Colocar con una pipeta de 10ml de capacidad, 5ml del caldo en los 18

tubos, cada uno de los cuales debe contener una campana.3. Colocar los tubos en la rejilla e introducir en la olla exprés.

4. Cerrar la olla esperar que aumente la presión y con ello la temperatura,mantener por 15 min. la temperatura de 121ºC.

5. Anotar en los tubos su respectivo rótulo de identificación.

Preparación de pipetas para esterilizar en autoclave.

Colocar en la boca de la pipeta un filtro de algodón con la ayuda de un clipdesdoblado. EL ALGODÓN NO DEBE QUEDAR NI MUY APRETADO NI MUY FLOJO,DEBE PERMITIR EL PASO DEL AIRE PERO SIN MOVERSE.Flamear con el mechero el algodón que sobresale de la boquilla de la pipeta.



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Envolver con papel aluminio cada pipeta siguiendo las instrucciones del profesor.Marcar en la envoltura el volumen, valor de las subdivisiones menores y si es

terminal o no.

ESQUEMAS Y OBSERVACIONES

Preparación de tubos de vidrio para esterilizar en olla exprés (sustituyendoautoclave)

Preparación del caldo lactosado:

Llenado de tubos, con su respectiva campana.

Llevados a la olla exprés, hasta alcanzar 121ºC, y manteniendo en estatemperatura por 15 minutos:



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Preparación de pipetas para esterilizar en autoclave.

Envoltura de pipetas en papel alumnio:

Llevadas a la estufa:

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el método más apropiado para esterilizar en siguiente material?

MATERIAL MÉTODO

Solución de vitaminas RadiaciónCajas de Petri de plástico dedesecho

Gases

Aceite mineral Químico

Sangre para transfusión QuímicoRopa contaminada Calor Seco

Cajas de Petri de plásticolimpias

Calor Húmedo

Talco Radiación



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Instrumental de cirugía Radiación

Sangre de desecho Filtración

Cadáveres de animales deexperimentación de laboratorio Radiación

2. ¿Con qué finalidad se le pone a las pipetas un filtro de algodón?R= Para evitar el acceso de microorganismos del ambiente al interior.

3. ¿Con qué deben obtenerse los líquidos biológicos (por ejemplo sangre)para preparar un medio de cultivo?R= Por medio de radiaciones iónicas como las del cobalto-60 paraesterilizar artículos de plástico ya envueltas, como jeringas hipodérmicas.

4. ¿Cuál es el diámetros del poro en los filtros de esteres de celulosa utilizadospara esterilizar por filtración?R= Son delgadas películas que derivados de celulósicos plásticas o aunmetal con orificios uniformemente situados del mismo diámetro.

5. ¿Cuánto mide una bacteria de las pequeñas que se conocen?R= Las bacterias miden de 0.2 a 1.5 micrómetros de diámetro.

CONCLUSION

Durante esta práctica aprendimos que la esterilización es muy importanteen la microbiología, ya que el material con el que se trabaja debe estar libre decualquier forma de vida. Conocimos métodos tanto físicos como químicos deesterilización, aunque solo utilizamos en esta práctica métodos físicos deesterilización seca y húmeda.

BIBLIOGRAFIA

Brock Biología de los Microorganismos, 10ma. Edición, Editorial PEARSON PrenticeHall, Autores: Michael T. Madigan, John M. Martinko y Jack Parker.



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Práctica No. 7





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DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL AGUAUSANDO EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE


OBJETIVO:

Determinar la calidad de una muestra de agua, mediante ladeterminación de coliformes, empleando el método del número más probable.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS:La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante

en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienenuna variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos,involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la saludpública al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de aguapara determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme quehabitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangrecaliente, da una indicación. Dada la limitada capacidad de algunos miembros

del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números tambiénpueden emplearse para estimar el grado de contaminación fecal.

Una de las Normas Mexicana establece un método para la detección yenumeración en agua de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes)y Escherichia coli presuntiva mediante el cultivo en un medio liquido en tubosmúltiples y él cálculo de sus números más probables (NMP) en la muestra.

Este método es aplicable para todo tipo de agua, incluyendo aquellos quecontienen una cantidad apreciable de materia en suspensión.

La selección de las pruebas usadas en la detección y confirmación delgrupo de organismos coliformes, incluyendo E. coli, puede verse como parte deuna secuencia continua. El grado de confirmación con una muestra en particulardepende parcialmente de la naturaleza del agua y parcialmente de las razonespara realizar el examen.

En la práctica, la detección de E. coli presuntiva da usualmente unaindicación satisfactoria de contaminación fecal.



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El método NMP se basa en la inoculación de alicuotas de la muestra,diluida o sin diluir, en una serie de tubos de un medio de cultivo líquido

conteniendo lactosa. Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubación yasea a 308 o 310K (35 o 37°C).

Mediante tablas estadísticas se lleva acabo él cálculo del numero másprobable (NMP) de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantesy E. coli que pueda estar presente en 100 ml. de muestra, a partir de los númerosde los tubos que dan resultados confirmativos positivos.

NO. DE TUBOS CON REACCIONESPOSITIVAS

LÍMITE CONFIABLE DE95%

CALIDAD 3 TUBOSCON 10ml.

3 TUBOSCON 1ml.

3 TUBOSCON 0.1ml.

INDICE DEL

NMP POR100ml. INFERIOR SUPERIOR

CRITERIO DEACEPTACIÓN

0 0 0 <3

0 0 1 3 <0.5 9EXCELENTE

0 1 0 3 <0.5 13

1 0 0 4 <0.5 20

1 0 1 7 1 21

1 1 0 7 1 23

1 1 1 11 3 36

MUYBUENA

1 2 0 11 3 36

RECOMENDABLE

2 0 0 9 1 36

2 0 1 14 3 37

2 1 0 15 3 44

2 1 1 20 7 89

2 2 0 21 4 47

BUENA

2 2 1 28 10 150

ACEPTABLE

3 0 0 23 4 120

3 0 1 39 7 130

3 0 2 64 15 280

3 1 0 43 7 210

3 1 1 75 14 230

REGULAR

3 1 2 120 30 380

DUDOSA

3 2 0 93 15 380

3 2 1 150 30 440

3 2 2 210 35 470

3 3 0 240 36 1300

3 3 1 460 71 2400

3 3 2 1100 150 4800

MALA

3 3 3 >2400

NO ACEPTABLE



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En la anterior tabla se muestra el índice del NMP y límite confiable de 95%para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan

tres tubos con porciones de 10 ml., tres tubos con porciones de 1 ml. y tres conporciones de 0.1 ml.

Resultados positivos indican que existe presencia de:

• Organismos coliformes: son aquellos capaces de crecer de maneraaeróbico ya sea 308±1K (35±1°C) o 310±1K (37±1°C) en un medio de cultivolíquido lactosado con producción de ácido y gas dentro de un periodo de48 horas.

• Organismos coliformes fecales (termotolerantes): son en primer términoorganismos coliformes que tienen las mismas propiedades fermentativas a317±0.5K (44±0.5°C).

MATERIAL

1. Pipetas estériles2. 18 tubos de ensayo con caldo lactosado y tubos Durham (preparados la

práctica anterior)3. Muestras de agua

4. Purpura de bromocresol5. Perilla

PROCEDIMIENTO

Se utilizaran los 18 tubos preparados con caldo lactosado en la práctica anterior.• 9 tubos servirán para determinar la calidad de una muestra de agua del

grifo.• 9 tubos servirán para determinar la calidad de una muestra de agua de

marca comercial (purificada)

1. Toma tres tubos de la primera serie y, con ayuda de una pipeta y perilla,coloca 10 ml. de la muestra de agua en cada uno.

2. Toma otros tres tubos de la primera serie y coloca 1 ml. de la muestra deagua en cada uno.

3. Toma los últimos tres tubos de la primera serie y coloca 0.1 ml. de la muestrade agua en cada uno.

4. Repite este procedimiento con la segunda serie y la segunda muestra.5. Coloca los 18 tubos en la estufa con el fin de incubar por 24 hr.



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6. Cumplido el plazo, saca los tubos de la estufa y coloca 2 o 3 gotas depúrpura de bromocresol a cada tubo.

7.

Registra los resultados que muestra el vire o no vire del indicador.


Nota: Debido a que agregamos las gotas de púrpura de bromocresol antes de lasiembra e incubación, tuvimos que esterilizar los tubos en la olla exprés.

Imágenes después de la incubación:

Serie 1: Agua de grifo.

3 tubos con 10ml. de muestra 3 tubos con 1ml. de muestra

3 tubos con 0.1ml. de muestra



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Serie 2: Agua purificada marca Santorini.



En todos los tubos de la primera serie hubo presencia de microorganismos, ya que

se pudo apreciar sedimentación. También se notó la presencia de gas dentro delos tubos Durham en 5 de los 9 tubos de la primera serie, lo que indica lageneración de CO2, y con ello la presencia de coliformes (E. coli)

Diferente al caso de la serie 2, donde los tubos no presentaron cambios de color,ni presencia de sedimentos o gas:



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Tablas de resultados:

PRIMERA SERIE = MUESTRA DE AGUA DE GRIFONUMERODE TUBO

10ml. 1ml. 0.1ml.

1 █ █ █ █ █ █ █ 2 █ █ █ █ █ █ █ 3 █ █ █ █ █

NUMERODE

POSITIVOS2 2 1

SEGUNDA SERIE = MUESTRA DEAGUA MARCA SANTORINI

NUMERODE TUBO

10ml. 1ml. 0.1ml.

1 █ █ █ 2 █ █ █ 3 █ █ █

NUMERODEPOSITIVOS

0 0 0

█ Producción de gas █ Producción de acidez (verificado por el vire de azul a amarillo) █ Presencia de precipitado (crecimiento de microorganismos) █ Ningún cambio.

La muestra de agua de grifo, según el NMP, presenta 28 NMP por cada 100ml.Calidad: BuenaCriterio de aceptación: Aceptable

La muestra de agua purificada Santorini, según el NMP, presenta menos de 3 NMPpor cada 100ml.Calidad: ExcelenteCriterio de aceptación: Recomendable



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CONCLUSIÓN

Mediante la realización de esta práctica de conoció el método paracalcular la presencia de microorganismos presentes en una muestra de agua,utilizando el método del número más probable.

BIBLIOGRAFÍA

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-127-SSA1-1994Salud ambiental, agua para uso y consumo humano-límites permisibles de calidady tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización.



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Práctica No. 8





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AISLAMIENTO Y RECUENTODE MICROORGANISMOS POR MÉTODOS DIRECTOS


OBJETIVO:

Aprender y practicar las técnicas de aislamiento por medio de la estríacruzada y el método de las diluciones.

Aplicar técnicas de cuantificación por observación microscópica directapara determinar la abundancia relativa de microorganismos en muestras de sueloy agua.


Aislamiento de microorganismos

Los microorganismos generalmente se encuentran en la naturaleza comopoblaciones mixtas y para poder caracterizar e identificar un tipo particular de

microorganismos, este debe ser aislado y conservado como un cultivo puro oaxénico, que significa que esta formado por microorganismos de la mismaespecie. Para el aislamiento de microorganismos se cuentan con varios métodos,los más usados son: el método de la estría cruzada y el método de las diluciones.

El método de la estría cruzada consiste en depositar en un área de laplaca de medio de cultivo sólido una asada de la muestra o cultivo mixto quesirve de inóculo, se extiende el inóculo con el asa haciendo varios trazos en formade secante cada vez mayor de la orilla hacia el centro, pero solamente a unadistancia de 1 a 2 centímetros de la orilla. Se esteriliza el asa, se deja enfriar o se

introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes estrías. Segira la caja de Petri 1/5 de la vuelta y con el asa esterilizada se hace una nuevaserie de estrías que deben extender una pequeña porción de la pequeña serie enforma similar con trazos que vayan de la orilla hacia el centro. La operación serepite dos veces más y en la quinta se hace una serie de estrías abiertas quetermine en o cerca de centro, cuidando que no se toque las estrías anteriores.

El método de las diluciones consiste en hacer una serie de diluciones,generalmente decimales, de las cuales se toman alícuotas que se siembran enmedios de cultivos sólidos ya sea depositando la alícuota en la superficie y



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dispersándola uniformemente con una varilla de vidrio; o bien mezclando laalícuota con un medio de cultivo fundido en un tubo y enfriado a 450 C y

vaciando inmediatamente en una caja de Petri estéril.

Las colonias aisladas presentan características morfológicas diferentesdebido a que cada grupo filogenético de microorganismos tienen, característicaspeculiares que se ven influidas por las condiciones del medio. Una colonia sedesarrolla en un medio sólido y procede de una sola bacteria, espora oagrupación de microorganismos de la misma especie, a los que se les denominaunidades formadoras de colonias (UFC). Para determinar el número de UFC enuna muestra procesada por el método de las diluciones se cuenta el número decolonias formadas en las placas, de preferencia aquellas que tengan entre 30 y

300. Se calcula el número de UFC contenidas en un mililitro de la dilución usadapara inocular cada placa y se multiplica por la inversa de la dilucióncorrespondiente.

No todas las bacterias viables presentes en una muestra pueden cultivarsein Vitro; dependiendo de la muestra, se estima que solamente crecen en losdiferentes medios de cultivo entre un 20 y 50% de las especies presentes. Esto esdebido a que algunas de ellas viven en simbiosis obligada, o son inhibidas porotros microorganismos presentes, o en los medios usados crecen muy lentamente,o son inhibidas por los componentes de los medios de cultivo, o tienen

requerimientos nutricionales que el medio de cultivo no les proporciona, etc.

También para el éxito del aislamiento de microorganismos a partir demuestras de ambientes naturales se pueden requerir de medios de transporteespeciales o de técnicas de enriquecimiento previas, y cultivo en medios ricos,selectivos o diferenciales.

El oxígeno puede ser esencial para algunos microorganismos, pero tóxicopara otros. La capacidad de los microorganismos para crecer en presencia oausencia de oxígeno, está directamente relacionada con su metabolismo y con

la presencia o ausencia de enzimas que los protegen del efecto tóxico de losproductos del oxígeno (por ejemplo, superóxido dismutasa y catalasa). Con baseen los requerimientos de oxigeno, los microorganismos se han agrupado en:aerobios estrictos, anaerobios facultativos, anaerobios estrictos, anaerobiosaerotolerantes y microaerofílicos.

Los microorganismos aerobios estrictos respiran usando el oxígeno comoaceptor final de electrones en su cadena respiratoria; los anaerobios facultativospueden obtener su energía tanto por procesos respiratorios como fermentativos,es decir, tener como aceptores finales de electrones al oxígeno o compuestos



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orgánicos. Los microorganismos microaerofílicos requieren oxígeno pero atensiones menores de 15%.

Cuantificación de microorganismos

La estimación de la población microbiana por métodos directos, se haempleado en forma usual por diferentes investigadores. Los métodos que se handescrito se pueden adaptar a diversos tipos de hábitat. Por otro lado, laobservación directa de microorganismo en muestras de suelo y agua, permitenconocer el tipo, la forma y las posibles agrupaciones de los diferentesmicroorganismos de la comunidad.

Las cuantificaciones de microorganismos realizadas por métodos directos,en general permiten obtener valores más elevados con respectos a lasdeterminaciones de cuenta viable, Esto es debido a que se incluyen células noviables y aún aquellas que no pueden crecer en los medios de cultivos usualesempleados en le laboratorio.

Los métodos directos para cuenta de microorganismos empleados enestudios preliminares resultan complementarios a los métodos indirectos,lográndose así obtener resultados de mayor confiabilidad.

REINO PROTISTA

Dinoflagelados:

Los dinoflagelados son el segundo grupo más importante del fitoplancton,que es el responsable de la producción de energía en la cadena tróficaoceánica. Tienen una estructura semejante a un látigo llamada flagelo, queactúa como órgano de locomoción y muestran características tanto devegetales como de animales. Los dinoflagelados pueden reproducirse conrapidez, produciendo grandes poblaciones de forma inmediata; ciertas especies,

mediante este tipo de crecimiento, forman las mareas rojas tóxicas que matan alos peces y contaminan los mariscos.



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Ciliados:

Los protozoos ciliados son organismos unicelulares que se impulsan mediante unasdiminutas proyecciones, a modo de pelos, llamadas cilios. Además de servir parala locomoción, los cilios también tienen la función de crear corrientes que ayudana arrastrar pequeñas partículas alimenticias hacia el interior de una depresiónpequeña de la superficie del cuerpo, a través de la cual se ingiere el alimento. Losprotozoos ciliados viven en el agua o el suelo, o establecen relaciones comoparásitos o simbiontes de otros organismos, En los suelos, los ciliados actúan en ladescomposición de los organismos, disgregando la materia orgánica ensustancias que pueden ser utilizadas por otros seres vivos.

Ameba engullendo a un paramecio:

Aquí se muestra a una ameba o amiba, un organismo unicelular carentede órganos internos, que atrapa a un paramecio y comienza a engullirlo,rodeándolo con dos grandes proyecciones de su citoplasma, llamadasseudópodos. Cuando el paramecio es engullido por completo, se formaalrededor de él una primitiva cavidad digestiva, llamada vacuola. En ésta, losácidos descomponen el paramecio en nutrientes, que pueden difundirse por elcitoplasma de la ameba.



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Anatomía de un protozoo (Paramecio):

MATERIAL

Biológico:

a) Muestras de suelob) Muestras de agua

Medios de cultivo, soluciones y reactivos:

a) 18 tubos con caldo lactosado.b) 5 tubos con caldo nutrido y una correspondiente azúcar.c) Tubos para realizar pruebas IMViC (Pruebas bioquímicas)d) Púrpura de bromocresol.e) Agua estéril.

Vidriera y diversos:

a) Pipetas estériles.b) Campanas de fermentación.c) Asa bacteriológica.

Vacuolallenándose

de agua

Vacuola pulsátilllena de agua,la cual se abre yla libera al exterior.

Estructurade la membrana



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d) Matraz volumétrico de 100ml.e) Mecheros.f) Balanza granataria.

g) Estufa.

PROCEDIMIENTO

Primera parte:

Cuantificación de microorganismos por métodos directos:

1. Con las muestras de suelo se realiza una dilución de 1 gramo en un matrazvolumétrico de 100 ml.

2. Con una pipeta estéril, depositar en la primera serie de 9 tubos con caldonutritivo, 10ml de la suspensión en tres tubos, 1ml en otros tres y 0.1ml en losúltimos tres.

3. Repetir el paso anterior con la segunda muestra de suelo.

4. Incubar por 48 horas y aplicar dos gotas de púrpura de bromocresol paraobservar el cambio.

Pruebas bioquímica y de azucares:

1. Utilizando una muestra de agua, que haya dado positivo en la prácticaanterior, se realizarán las pruebas IMViC.

2. Se realizarán las pruebas de azucares.


Dilución de tierra:

Se disolvió un gramo de cada muestra de tierra en unvolumen de mezcla total de 100 ml.



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Imágenes después de la incubación:

Serie 1: Tierra de tomada de área verde en la escuela.





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Serie 2: Arena.





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Tablas de resultados:

PRIMERA SERIE = TIERRANUMERODE TUBO

10ml. 1ml. 0.1ml.

1 █ █ █ █ █ █ █ █ █ 2 █ █ █ █ █ █ █ █ █ 3 █ █ █ █ █ █ █ █ █

NUMERODE

POSITIVOS2 2 1

SEGUNDA SERIE = ARENA

NUMERODE TUBO

10ml. 1ml. 0.1ml.

1 █ █ █ █ █ █ █ █ 2 █ █ █ █ █ █ █ █ 3 █ █ █ █ █ █ █ █ █

NUMERO

DEPOSITIVOS

0 0 0

█ Producción de gas █ Producción de acidez (verificado por el vire de azul a amarillo) █ Presencia de precipitado (crecimiento de microorganismos) █ Ningún cambio.

La muestra de tierra de la primera serie, según el NMP, presenta más de 2,400 NMPpor cada 100ml. de solución formada con agua estéril.Calidad: MalaCriterio de aceptación: No aceptable

La muestra de arena en la segunda serie, según el NMP, presenta igualmente másde 2,400 NMP por cada 100ml. de solución formada con agua estéril.Calidad: MalaCriterio de aceptación: No aceptable



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Pruebas bioquímicas:

Trabajamos con uno de los tubos que dieron positivo (producción de gas) en lapráctica anterior (muestra de agua del grifo):

Prueba IMViC:

Indol MV Agar Citrato

Positivo

Se cometió un error al aplicar el indicador, pues en la prueba de indol, rojode metilo y Voges-Proskauer se aplico purpura de bromocresol y no los correctosreactivos:

Indol: Reactivo de Erhlich-éterRojo de metilo: Rojo de metiloVoges-Proskauer: Hidróxido de potasio-naftol

Pruebas de azucares:

Caseína Dextrosa Fructuosa Sacarosa

Negativo Ácido y gas Ácido y gas Ácido y gas



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Se realizo tinción de Gram y se obtuvo positivo.

Entonces la bacteria es:

Gram: +Citratos: +Dextrosa: Ácido y gasFructuosa: Ácido y gasSacarosa: Ácido y gasCaseína: –

CONCLUSION

Mediante la realización de esta práctica realizamos diluciones de suelo enagua y determinamos la cantidad de organismos por el método de número másprobable; además aplicamos técnicas que en prácticas posteriores realizaremosde manera más exacta.

BIBLIOGRAFÍA

Multimedia de diferencias bioquímicashttp://nhscience.lonestar.edu/biol/wellmeyer/media/media.htm



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Práctica No. 9





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CINÉTICA DE FERMENTACIÓN

PRÁCTICA No. 9 FECHA DE REALIZACIÓN: 10 de noviembre de 2009

OBJETIVO:

Llevar a cabo una fermentación alcohólica utilizando levadura(Saccharomyces cerevisae), con el fin de determinar la cinética de la reacción alcuantificar el sustrato y la población microbiana en la cámara de Neubauer.


La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por laslevaduras y algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman elazúcar en alcohol etílico y dióxido de carbono. La fermentación alcohólica,comienza después de que la glucosa entra en la célula. La glucosa se degradaen un ácido pirúvico. Este ácido se convierte luego en dióxido de carbono yetanol. La levadura más común para llevar a cabo la fermentación es laSaccharomyces cerevisae.

La reacción que se lleva a cabo es:

PRODUCTOCELULASMASCELULASSUSTRATO

CARBONODEDIOXIDOETANOLCELULASMASCELULASHEXOSA

+→+

++→+

O de una manera más correcta:

PCSPRODUCTOCELULAS

CELULAS

SUSTRATO

+ →

En un medio de azucarado el desarrollo de un microorganismo vieneacompañado de la degradación o consumo de nutrientes y de la formación deproductos. El estudio de los cambios de concentración con respecto al tiempo,en estos tres tipos de elementos (células, sustrato y producto) se les denominacinética de fermentación. Si se dispone de una técnica efectiva de evaluación



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cualitativa y cuantitativa de la concentración de una población microbiana ytécnicas analíticas para determinar sustrato y producto, es posible seguir y

estudiar la cinética de una fermentación, el estudio consiste en seguir en funcióndel tiempo (t) la concentración celular (CC), del nutriente limitante (sustrato) (S) ydel producto formado (P).

Las consideraciones de ingeniería son tan importantes como los factoresquímicos y biológicos involucrados. La cinética del proceso necesita serexactamente determinada y modelada:

Cg Cr µ=

Donde:

[ ].h,específicoocrecimientdevelocidad

.dm

g,célulasdeiónconcentracC

.hdm

g,celularocrecimientdevelocidadr

1

3C

3g

−=µ

=

⋅=

De acuerdo al modelo de Monod:

SS

CSmaxg

c

CKCC

rdt

dC+

µ==

En reactores intermitentes donde ha se lleva a cabo fermentaciónalcohólica con Saccharomyces cerevisae, se ha determinado para este modelo:

3S

1max

dmg694347.1K

h3284383.0

=

=µ−

MATERIAL

1. Levadura2. Jugo de fruta o solución azucarada.3. 1 recipiente de cristal con un volumen efectivo de 1L=1dm3 con tapón

horadado.4. Tubo de ensaye.



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5. Manguera de hule.6. Microscopio.

7.

Cámara de Neubauer.8. Oxigenador.9. Brixómetro.

PROCEDIMIENTO

1. Vierte el jugo de frutas o la solución azucarada en el recipiente de vidrio(previamente esterilizado en seco)

2. Normaliza para iniciar la fermentación a 25 grados Brix (para fines de esta

práctica la sacarosa será equivalente a la hexosa –sustrato-)

3. Pesa un gramo de levadura y añade al reactor.

4. Oxigena la mezcla y cuantifica la cantidad de UFC con la cámara deNeubauer. Esta determinación es importante para conocer los gramossubsecuentes por regla de tres.

5. Coloca el tapón horadado y la manguera de hule; el extremo opuesto deesta deberá ser introducido en el tubo de ensaye con agua (permitirá

observar la producción de dióxido de carbono que no se cuantificará)

6. Determina las UFC y los grados Brix cada 24 horas (hasta completar 72)

7. Elabora una tabla de la cinética y modela el sistema.

ooo

SoluciónAzucarada

+Levadura

EtanolCO2

R E A C T O R

I N T E R M I T E N T E




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Preparamos una solución azucarada de panela; a los 20°C deteminamos los

grados Brix, y diluimos con agua destilada y esterilizada hasta obtener 25°Brix.

(1°Brix=10g de sacarosa/ml de solución)Recordemos que para fines prácticos la concentración de sacarosa será igual ala de la glucosa.Por lo tanto al tiempo cero, la concentración del sustrato es de 250 g/dm3.

Tabla de observaciones:

t (h) °Brix

3S dmgC

0 25 250

24 24 240

48 20 200

72 18 180

Oxigenamos la mezcla y determinamos las UFC al inicio (t=0)



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t (h)Observación en

Cámara de

Neubauer

UFC/dm3

3C dmgC

0 36 4.5x1010 1

24 40 5x1010 1.11

48 74 9.25x1010 2.05

72 92 1.15x1011 2.55

La CC se obtiene al deducir que en el tiempo inicial se agregó 1 g en un litro

de solución, y ese gramo representó 4.5x1010 UFC/dm3, por lo tanto las UFC/dm3 calculadas en los siguientes tiempos sirven para determinar la concentración enesos tiempos.

TABLA CINÉTICA:

t (h)

3C dmgC

3S dmgC

0 1 250

1.11 24024

48 2.05 200

72 2.55 180

La velocidad promedio de crecimiento de la levadura, tomando el modelo deMonod, fue de:

hdmg3.0r 3g⋅

=

CONCLUSION

En esta práctica pudimos aplicar las técnicas de conteo en la cámara deNeubauer y la cuantificación de azucares con el brixómetro, observamos elproceso de la fermentación y determinamos la velocidad con que crece lalevadura.



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BIBLIOGRAFÍA

Welch, C.A., Fishleder, J., Ciencias biológicas de las moléculas al hombre,CECSA,1979.

Fogler, H.S., Elementos de ingeniería de las reacciones químicas, Pesarson-Prentice Hall, 2008.



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Práctica No. 10





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FLUCTUACIÓN DE MICROORGANISMOS EN LA ATMÓSFERA

PRÁCTICA No. 9 FECHA DE REALIZACIÓN: 17 de noviembre de 2009

OBJETIVO:

Identificar la manera en que influyen los factores ambientales ygeográficos, en relación al crecimiento microbiano, en un área geográficadeterminada.


Se entiende por crecimiento microbiano al incremento en forma ordenadade los componentes moleculares y el consecuente incremento del número deindividuos.

El crecimiento de los microorganismos en los medios de cultivo sólido seevidencia por la formación de colonias (conjunto de individuos originados a partirde un solo individuo), o por la formación de turbidez, película o sedimento en los

medios líquidos. Como todo ser vivo, los microorganismos necesitan de nutrientesy determinadas condiciones para poder crecer y desarrollar sus diversas funcionesvitales.

Factores ambientales

• Temperatura: Dependiendo de su procedencia requerirá una temperaturaóptima determinada para su crecimiento. Existen tres grupos; psicrófilo (15a 20 °C), mesófilo (25 a 40 °C) o termófilo (45 a 60 °C).

• Oxígeno: El microorganismos será aerobio si requiere de oxígeno para sucrecimiento; anaerobio si requiere de un ambiente carente de oxígenopues este elemento le es tóxico; microaerofílico, si la atmósfera en la quetiene que crecer no excede el 5% de oxígeno; o anaerobio facultativo, sipuede crecer indistintamente en presencia o ausencia de oxígeno.

• pH: Un medio ligeramente neutro es el adecuado para la gran mayoría delos microorganismos. Sin embargo, existen microorganismos concapacidad de crecer en ambientes tan ácidos como los Thiobacillusihioxidans que crece en medios con pH de hasta 1.0 (óptimo 2.0 a 2.8),



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pues esta bacteria es capaz de producir ácido sulfúrico. Otras en cambiopueden crecer en ambientes alcalinos como las Nitrosomonas que crecen

en medios muy alcalinos con pH 10 (óptimo 8.0 a 8.8).

• Humedad y actividad del agua: Los microorganismos requieren de aguapara su crecimiento y reproducción. La disponibilidad de agua en elambiente es muy variable; por ejemplo en suelos desérticos el agua es unfactor que limita el crecimiento microbiano, mientras que en los lagos elagua no es un factor que limite la actividad microbiana.

• Presión: En el nivel del mar la presión atmosférica es una atmósfera (1 atm =760 mm Hg). En los cuerpos de agua, por cada 10 m de profundidad se

incrementa aproximadamente 1 atm más. Las Spirillum son bacteriascapaces de crecer 15 veces más rápido en presiones entre 300 a 600 atmque a 1 atm. Las presiones hidrostáticas elevadas parecen inhibir la síntesisde ADN, ARN y proteínas; el transporte a través de la membrana celular; yla actividad de muchas enzimas por la modificación de su estructuraterciana.

• Radiación: La entrada constante de la luz a los ambientes, permite laformación de un espectro variado de longitudes de onda de los rayos UV,visibles, infra-rojos, rayos X, gamma, etc. Estas radiaciones se hacen

ionizantes cuando interactúan con la materia produciendo iones inestablesy radicales libres que pueden provocar destrucción, mutación o muerte delos microorganismos al incidir sobre ellos. La misma radiación ultravioletapuede ser germicida a longitudes de onda de 260 nm que coincide con lamáxima absorción del ADN, lo que sugiere que el daño del ADN es elprincipal mecanismo del efecto germicida.

• Movimiento: El movimiento del aire y del agua favorece la dispersión pasivade los microorganismos. De manera similar el movimiento es importante enla introducción y distribución de los nutrientes en el medio para el

crecimiento microbiano, además de la remoción de los productosmetabólicos que ocasionalmente puedan ser tóxicos. La introducción demateriales y el movimiento de estos dentro del ecosistema estáncontrolados por diversos factores tales como la solubilidad, difusión,viscosidad, gravedad específica, porosidad y las características delecosistema.

• Espacio: En condiciones de laboratorio, un espacio determinado, como uncaldo de cultivo, puede no ser un factor importante para el crecimientoinicial de los microorganismos; sin embargo cuando se incrementa la



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densidad poblacional, se reduce la disponibilidad de nutrientes y oxígeno yse incrementan los productos de desecho que puede limitar el

crecimiento. En la naturaleza no es así porque el microorganismo restringesu crecimiento a superficies o medios favorables. En ecosistemas terrestres,la textura del suelo se usa como un índice del área disponible para losmicroorganismos

MATERIAL

1. Cajas de Petri con agar nutritivo.2. Termómetro3. Reloj.

PROCEDIMIENTO

1. Acudir al cerro del borrego situado en la ciudad de Orizaba Veracruz.

2. Los equipos se dividirán para posicionarse en diferentes alturas del cerro delborrego para abrir las cajas.

3. Sincronizar relojes con el resto del grupo a fin de que la toma de la muestrase realice al mismo tiempo sin importar la distancia recorrida.

4. Una vez situados, abrir las cajas de Petri durante 15 minutos; tomar latemperatura y anotar cuantas personas o animales pasan alrededor de lacaja.

5. Llevar a incubación durante 24 horas.


A mí me tocó subir hasta la cima del cerro.

Pasaron 36 personas y 3 perros.La temperatura inicial fue de 20°C y disminuyo a los 15 minutos hasta 19°C.



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Caja de Petri Observaciones

En la fotografía se muestrala muestra tomada en el

cerro del borrego yacultivada.

Frotis Húmedo

Fotografía tomada con el objetivo 10X Fotografía tomada con el objetivo 40X

En el frotis húmedo se puede observar la presencia de muchos microorganismos ysu las morfologías que predomina son cocos.

CONCLUSION

Con esta práctica nos fue posible apreciar la rapidez con que las esporasde microorganismos pueden viajar en la atmósfera y desarrollarse en el momentoen que encuentran las condiciones óptimas. Pudimos hacer una comparacióncon las cajas de los demás compañeros y notar las diferencias de acuerdo a lazona de muestreo.

microbiologia manual

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