Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin

1. Úvod

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických

oborů PřF JU

reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

Přehled témat

► Úvod (základní pojmy, typy markerů, variabilita, apod.)

► Isozymy

► Izolace DNA

► PCR

► Přímé sekvenování

► NGS (next generation sequencing)

► Metody s arbitrárními primery (RAPD, ISSR)

► Mikrosatelity (SSR)

► Restrikční metody (RFLP, PCR-RFLP, T-RFLP)

► AFLP

ke každé metodě technický princip, struktura a vyhodnocení dat, příklady použití v botanice

Úvod

Co jsou markery?

= znaky, v širším smyslu jsou markery např. morfologické, cytologické, chemické ...

Co jsou molekulární markery?

= ty, které odrážejí molekulární podstatu genetické informace; variabilita je generována mutacemi a přestavbami genomu:

►DNA metody – pracují s variabilitou na úrovní DNA» konkrétní sekvence

» délková variabilita fragmentů DNA (elektroforéza apod.)

►proteiny, isozymy – variabilita odvozená ze struktury DNA

►organizace DNA na cytogenetické úrovni (FISH, GISH,...)

►příp. další, jako charakteristiky biosyntetických drah apod.

Úvod

sekvence DNA ►

▲ nepřímá informace:variabilita ELFO mobility (= hlavně délky) molekul - fragmentů DNA

banding pattern

přepis do RNA a následně do proteinů

▲ nepřímá informace:variabilita ELFO mobility (délka, elektrický náboj) molekul proteinů

Aplikace molekulárních markerů

Taxonomie

vedle dalších znaků do datové matice také informace o vztazích mezi taxony, reprodukčních bariérách, genetické variabilitě taxonů...

Populační biologie studium genetické variability populací a faktorů ji ovlivňujících (inbreeding, gen. drift, migrace,…); podíl pohlavního / nepohlavního rozmnožování; identifikace klonů; v širším geografickém měřítku migrace a refugia (fylogeografie)

Ekologie společenstev od prosté základní identifikace organismů (barcoding) i z fragmentárních vzorků, až ke komplexní analýze složení daného společenstva – např. mikroorganismů nebo hub, které často nelze zkoumat pomocí klasické morfologické determinace

(+ aplikace v biotechnologiích, identifikace kultivarů v zemědělství apod.)

Výhody a omezení

Výhody molekulárních markerů

► nejsou ovlivněny vnějším prostředím (není fenotypová plasticita)

► teoreticky téměř neomezený počet znaků

► měly by být více variabilní než ostatní markery» velmi výhodný zdroj dat pro taxony s obtížně detekovatelnou morfologickou variabilitou (např. mikroorganismy)

» někdy velmi rychlá evoluce → možnost detekovat recentní procesy

Nevýhody molekulárních markerů:

► Mají stejnou hlavní nevýhodou jako kterýkoli jiný typ dat: homoplazie, i když obvykle v menší míře

homoplazie = stejný stav znaku, který u 2 nebo více studovaných jedinců vznikl nezávisle; zdánlivá podobnost, která ale neodráží příbuznost

AAGGTA (předek)

AAGATA AAGCTA

AAGTTA AAGTTA

Bird Bat

(morfologická homoplazie) (homoplazie na úrovni sekvence DNA) (homoplazie DNA fragmentu)

stejná ELFO mobilita, ale odlišná sekvence:

ATCTCATC CTTGATTA

Výhody a omezení

Nevýhody molekulárních markerů:

► pro některé typy markerů je nutná určitá předběžná znalost genomu studovaného organismu

» krajním případem jsou specifické markery, které fungují jenom na danou taxonomickou skupinu (např. rod)

» potřebné informace často nejsou k dispozici• drahé / pracné je získat de novo

► stále relativně vysoká cena molekulárních analýz

► potřeba speciálně vybavené laboratoře

Výhody a omezení

Variabilita

Jak variabilní marker potřebujeme?

► „tak akorát“ – pokud možno co nejvyšší variabilita odlišující studované skupiny (populace / taxony) nebo odhalující určitý jev + zároveň co nejnižší „nevysvětlená“ variabilita

» málo variabiliní marker nenese dost informace

» pozor na příliš variabilní markery (viz dále)

► marker vhodný pro jednu skupinu organismů na dané taxonomické úrovni může být zcela nevhodný pro jinou skupinu na téže úrovni

» ale může být výhodný na jiné úrovni

► genetická variabilita může souviset s typem rozmnožování (viz dále)

Variabilita

Příliš variabilní markery

► obvykle nelze použít totéž na různých taxonomických úrovních

» co dobře funguje mezi populacemi může být příliš variabilní mezi druhy / rody, a naopak

► zvýšené riziko homoplazií

» mutace se ”protočí” a stejný stav znaku vznikne nezávisle u nepříbuzných jedinců

» předpoklad homologie srovnávaných znaků je kritický, bez jeho splnění nemá většina analýz smysl

Variabilita

Příklady problémů u příliš variabilních markerů:

ISSR banding pattern dvou odlišných druhů r. Schoenoplectus:

- oba druhy značně odlišné

- málo sdílených lokusů

- i u několika málo potenciálně sdílených bandů (◄) není jistota homologie

◄

◄

◄

Nejistá homologie bází v evolučně příliš vzdálených sekvencích DNA:

(shoda bází může být čistě náhodná, nelze z ní odhadovat homologii)

Lokus, multilokusová dataLokus

► konkrétní místo v genomu (konkrétní gen / sekvence; určité místo na daném chromosomu;…)

► srovnáváme data v rámci 1 lokusu» jinak není homologie

► vždy je výhodné mít co nejvíc data z různých míst genomu (lokusů)

Multilokusová data► některé markery poskytují informace

z více lokusů najednou – většinaDNA metod vytvářejících tzv. banding pattern

» trochu definice kruhem: lokus = fragment dané délky

► u ostatních markerů (isozymy, sekvenování) je možné získat data z více lokusů, ale za cenu vyšších nákladů

▲ 8 lokusů, metoda ISSR

Dominantní data = jsme schopni rozlišit pouze přítomnost / nepřítomnost (dominantní homozygot a heterozygot vypadají stejně)

» kódování 0 / 1

» typicky ISSR, AFLP

» často multilokusová data

Kodominatní data = jsme schopni rozlišit i heterozygoty» allozymy, mikrosatelity,

PCR-RFLP, někdy sekvence

► pro populační genetiku výhodná kodominantní data

► často ale stačí i dominantní data (příbuznost / fylogeneze, míra genetické podobnosti, identifikace klonů, …)

Dominantní a kodominantní data

0 0 0 1 0 1 1 1 1 1

AB AA BB BB BC CC AB CC BC

Selekční neutralita

► úspěšnost (fitness) jedince není ovlivněna (ne)přítomností konkrétní alely pro daný lokus; frekvence alel v čase se mění náhodně

► nutná pro studium náhodných procesů v populační genetice

» genetický drift (včetně founder effect apod.)

» migrace (genový tok)

» mutační rychlost

► typicky nekódující úseky DNA, omezeně isozymy

Tři genomyjaderný genom:

biparentální přenos

+ rekombinace

možnost polyploidie

chloroplastový genom (cpDNA):

maternální přenos

(u nahosemenných paternální!)

v buňce velké množství kopií

mitochondriální genom (mtDNA):

maternální přenos

v buňce velké množství kopií

Tři genomy

► jaderný» biparentální přenos = semena + pyl

► chloroplastový» maternální přenos = pouze semena» pouze u nahosemenných paternální = pyl

► mitochondriální» maternální přenos» u rostlin obvykle ale nepoužitelný (malá variabilita,

někdy přestavby, výměna genů s jádrem,…)» výjimkou jsou nahosemenné

► výhodné kombinovat jádro + chloroplast (→ fylogeografie)

Specifita markerů

► nespecifické markery » do značné míry univerzální, lze je použít pro řadu taxonů

► specifické markery » fungují pouze na daný taxon (příp. blízké příbuzné)

» lze je použít, pouze pokud máme pro daný taxon informaci o genomu nutnou pro vlastní provedení metody

► v reálu použijeme markery, které pro daný taxon už někdo vyvinul a publikoval, příp. optimalizval nebo musíme vyvinout vlastní markery (časově a finančně náročnější)

Specifita markerů

► specifické markery je nutné použít, pokud pracujeme se vzorky obsahující tkáně dalších organismů, které potřebujeme z analýzy odfiltrovat (endosymbionti, paraziti apod.)

▲ hyfy mykorhizních hub (AMF) v kořenech ▲ fykobiont lišejníků

► … a nebo je naopak chceme selektivně zkoumat

Další pojmy

DNA fingerprinting (DNA typing, DNA profiling)► termín používaný spíše ve forenzní genetice► souhrnné označení metod vytvářejících „DNA profil“, podle

kterého lze identifikovat daného jedince► hypervariabilní markery

DNA barcoding► určování organismů podle sekvence DNA („čárový kód“)

» izoláty z půdy, hyfy hub z kořenů, pozůstatky potravy ve střevech / trusu zvířat,…» běžně neurčitelný materiál – larvy a jiní nedospělci, zbytky mrtvých jedinců, kořeny, morfologicky neodlišitelné druhy,…

► variabilní, snadno amplifikovatelné úseky DNA» mitochondriální gen pro cytochromoxidasu (cox) u zvířat» ITS úsek jaderné ribosomální DNA u rostlin

Ploidní stupeň

► Polyploidie častá u rostlin (vč. mechorostů), u některých řas» neopolyploidie vs. paleopolyploidie

► Stupeň ploidie = počet kopií chromosomů / genů v genomu

► Někdy celé komplexy cytotypů / taxonů různých stupňů, retikulátní evoluce

» příklad: Achillea millefolium agg. (2n = 2x, 4x, 6x, 8x)

► Zásadní informace při vyhodnocování dat!

► Jak se zjišťuje – viz samostatná přednáška

Co je dobré vědět dopředu

Ploidní stupeň

► Více typů heterozygotů (→ kodominantní markery)» AAAB, AABB, ABBB

» až x alel v jednom genomu (x = počet kopií)

► Odhad míry heterozygotnosti jiný než u diploidů» míry genetické vzdálenosti

» nesrovnatelné hodnoty mezi ploidiemi (platí i pro další parametry založené na míře heterozygotnosti)

► Některé výpočetní postupy předpokládají diploidy, resp. neumí pracovat s více ploidiemi zároveň

» populační genetika (F-statistiky, H-W rovnováha,…)» STRUCTURE

Co je dobré vědět dopředu

Vegetativní rozmnožování

► Co je jedinec?

► Pozor při sběru vzorků!

► a co teprve mikroorganismy …

Co je dobré vědět dopředu

http://alpandino.org/en/course/19/19e.htm

Co je dobré vědět dopředu

Reprodukční systémy

► 3 hlavní způsoby tvorby semen» sexualita – allogamie

» sexualita – autogamie

» apomixie

► zásadní vliv na očekávanou genetickou variabilitu(vnitro- i mezipopulační)

► nutno brát v úvahu již při sběru vzorků» smysluplný počet populací a počet jedinců na populaci je různý

► … nebo to naopak může být cílem studia (na základě pozorované variability v „náhodném“ vzorku)

Co je dobré vědět dopředu

vlastnost allogamie autogamie apomixie

meiosa, ano ano nerekombinace

identita s ne ne (ale homo- anorodiči zygotní linie)

vnitropopul. velká menší ± žádnávariabilita (homozyg. linie)

mezipopul. malá n. spíše velká velká (nebovariabilita velká někdy žádná)

heterozygo- různá malá často velkásita (hl. u diploidů) (allopolyploidi)

Reprodukční systémy

Co je dobré vědět dopředu

počet vzorků allogamie autogamie apomixie

populace méně více více

jedinci v více méně málopopulaci

► … a aby toho nebylo málo, spousta druhů má směs:» různý podíl auto- a allogamie

» fakultativní apomixie

» … a ke všemu vegetativní rozmnožování

Reprodukční systémy