CUANTIFICACIN DE FENOLES TOTALESLos fenoles totales se determinarn de acuerdo a la metodologa descrita por Brat et al. (2005), con el reactivo de Folin-Ciocalteu y usando cido glico como estndar.

Preparacin de la curva de calibracinSe utilizar una solucin estndar de cido glico (0.1 mg/mL) de la cual se tomarn volmenes de 0 L a 640 L y se completar el volumen de cada uno a 1000 L con agua destilada. Los volmenes y concentraciones se describen en la siguiente tabla.

Volumen a tomar de la solucin madre (L)Volumen de agua destilada (L)Concentracin de cido glico (g/mL)

010000

160840160

320680320

400600400

560440560

640360640

Determinacin de fenoles en una muestra o estndarA 250 L de extracto (o estndar de la curva de calibracin) se le agregarn 1250 L de reactivo de Folin-Ciocalteu (diluido 1:10 en agua destilada), se agitar por 30 s con vortex y se dejar reposar 2 min a temperatura ambiente. A continuacin se agregarn 400 L de Na2CO3 (75 mg/L), se incubar durante 15 min a 50 C y finalmente se dejar enfriar a temperatura ambiente. La absorbancia de las muestras y estndares se determinar a una longitud de onda de 760 nm. Empleando la ecuacin de la curva de calibrado se calcular el contenido de fenoles totales de las muestras. Los resultados se expresarn en g de cido glico por mL de extracto (g equivalentes de cido glico/mL extracto).

ReferenciasBrat, G. S. P., Alter, B. P., Amiot, M. J. (2005). Rapid determination of polyphenols and vitamin C in plant-derived products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 1370-1373.

CUANTIFICACIN DE FLAVONOIDES TOTALESLos flavonoides totales se determinarn de acuerdo a la metodologa descrita por Lee et al. (2003), usando catequina como estndar.

Preparacin de la curva de calibracinSe pesar 10 mg de catequina y se transferirn a un matraz volumtrico de 10 mL y se aforar con agua destilada. De la solucin madre se tomarn volmenes de 0 L a 640 L y se completar el volumen de cada uno a 1000 L con metanol. Los volmenes y concentraciones se describen en la siguiente tabla.

Volumen a tomar de la solucin madre (L)Volumen de MeOH (L)Concentracin de catequina (g/mL)

010000

160840160

320680320

400600400

560440560

640360640

Determinacin de flavonoides totales en una muestra o estndarA 250 L de extracto o de estndar se adicionarn 250 L de una solucin de NaNO2 (5% p/v). Transcurridos 5 min, se adicionarn 125 L de una solucin acuosa de AlCl36H2O (10% p/v). Despus de 6 min, se adicionarn 124 L de NaOH 1.0 M. Se determinar la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm. Empleando la ecuacin de la curva de calibrado se calcular el contenido de flavonoides totales de las muestras. Los resultados se expresarn en g de catequina por mL de extracto (g equivalentes de catequina/mL extracto).

ReferenciaLee, K. W., Kim, Y. J., Lee, H. J., Lee, C. Y. (2003). Cocoa has more phenolic phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and red wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51:7292-7295.

CUANTIFICACIN DE FLAVANONAS Y DIHIDROFLAVONOLESEl contenido total de compuestos flavonones y dihidroflavonoles se efectuar empleando el mtodo reportado por Popova et al. (2004).

Preparacin de la curva de calibracinSe pesar 10 mg de naringenina y se transferirn a un matraz volumtrico de 10 mL y se aforar con metanol. De la solucin madre se tomarn volmenes de 0 L a 640 L y se completar el volumen de cada uno a 1000 L con metanol. Los volmenes y concentraciones se describen en la siguiente tabla.

Volumen a tomar de la solucin madre (L)Volumen de MeOH (L)Concentracin de naringenina (g/mL)

010000

160840160

320680320

400600400

560440560

640360640

Determinacin de flavonones y dehidroflavonoles en una muestra o estndarA 250 L de extracto o de estndar se adicionarn 500 L de una solucin de 2,4-dinitrofenil hidracina (1 g de 2,4-dinitrofenil hidracina en 2 mL de cido sulfrico al 96%, llevados a un volumen final de 100 mL de metanol). La mezcla se calentar a 50 C durante 50 min. Las muestras o estndares se dejarn enfriar a temperatura ambiente durante 10 min y se diluirn a un volumen final de 2.5 mL con hidrxido de potasio en metanol al 10% (p/v). De la solucin anterior se toman 200 L y se le adicionan 1.0 mL de metanol, centrifugar a 2500 rpm por 10 min. La absorbancia del sobrenadante se determinar a una longitud de onda de 486 o 495 nm.

ReferenciaPopova, M., Silici, S., Kaftanoglu, O., Bankova, V. (2005). Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical composition. Phytomedicine 12:221-228.

CAPTACIN DE RADICALES LIBRES DPPHSolucin de DPPH 0.1 mM.Pesar 4 mg de DPPH y disolver en 100 mL de etanol.

Procedimiento1. Alcuotas de 100 L de muestra se aaden a un microtubo de 2 mL, despus se aaden 1000 L de la solucin 0.1 mM de DPPH en etanol. 2. Se utiliza como control una mezcla que cosiste en 100 L de agua destilada y 1000 L de la solucin 0.1 mM de DPPH en etanol.3. La muestra y el control se agitan en vortex y se dejan reaccionar por 30 min. 4. La absorbancia de la muestra y el control se determina a una longitud de onda de 517 nm.5. El porcentaje de captacin de radicales se calcula empleando la siguiente formula:(AC - AM/AC) x 100Donde AC es la absorbancia del control y AM es la absorbancia de la muestra.

ReferenciaShimada, K., Fujikawa, K., Yahara, K., Nakamura, T. (1992). Antioxidative properties of xanthan on the autioxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40: 945-948.

PODER REDUCTOR DE Fe(III)Solucin amortiguadora de fosfatos 0.2 M, pH 6.6.A: solucin 0.2 M monobsica de fosfato de sodio (2.76 g en 100 mL)B: solucin 0.2 M dibsica de fosfato de sodio (5.365 g de Na2HPO47H2O o 7.17 g de Na2HPO412H2O en 100 mL). Mezclar 81.2 mL de la solucin A + 23.6 mL de solucin B, aforar a 200 mL con agua destilada.Ferricianuro de potasio al 1%. Disolver 500 mg de K3Fe(CN)6 en 50 mL de agua destilada.cido tricloroactico al 10%. Disolver 5 g de C2HCI3O2 en 50 mL de agua destilada.Cloruro frrico al 0.1%. Disolver 50 mg de FeCl3 en 50 mL de agua destilada.

Procedimiento1. A 250 L de muestra o estndar aadir 250 L de buffer fosfato (0.2M, pH 6.6) y 250 L de ferrocianuro de potasio (1%). Mezclar vigorosamente e incubar a 50 C durante 20 min.2. Concluida la incubacin, adicionar 250 L de cido tricloroactico (10%) y centrifugar a 3000 rpm por 10 min. Tomar 500 L de sobrenadante y agregar 400 L de agua destilada y 100 L de cloruro frrico (0.1%). Mezclar vigorosamente e incubar a 50 C por 10 min. Finalmente se deja reposar por 10 min y se determina la absorbancia a una longitud de onda de 700 nm. 3. Se calcula el porcentaje de poder reductor de la forma siguiente: PR = (AM-AB/AM) (100) Dnde: AM = absorbancia en presencia de muestra o control y AB = absorbancia del blanco.4. Obteniendo los porcentajes de poder reductor a diferentes concentraciones de una misma muestra es posible relacionar ambas variables y obtener una ecuacin para determinar el IC50, que se define como la concentracin de muestra necesaria para reducir el 50% del Fe oxidado presente en la solucin.

ReferenciaOyaizu, M. (1996). Studies on products of browning reactions: antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine. Japanesse Journal of Nutrition, 44: 307-315.

CAPACIDAD QUELANTE DE Cu (II)Solucin reguladora de pH de acetato de sodio 50 mM (pH 6.0). Aadir 143 L de cido actico glacial a un matraz volumtrico de 500 mL, ajustar el pH a un valor de 6.0 con hidrxido de sodio al 40%, aforar a 500 mL con agua destilada. Solucin de violeta de pirocatecol 0.1%.Pesar 1.0 mg de violeta de pirocatecol y disolver en 10 mL de tampn de acetato de sodio (50 mM, pH 6.0) para obtener una solucin de 1.0%. Tomar una alcuota de 1.0 mL y disolver hasta un volumen final de 10 mL para obtener una solucin de 0.1%.Solucin patrn de sulfato de cobre (CuSO45 H2O) 20 mM.Pesar 156.2 mg de sulfato de cobre y disolver en 20 mL de tampn de acetato de sodio (50 mM, pH 6.0).

ProcedimientoBlanco: mezclar 250 L de solucin reguladora de pH de acetato de sodio + 250 L de solucin patrn de Cu (II) + 25 L de violeta de pirocatecol 0.1% + 250 L de agua destilada. Dejar reaccionar 10 min a temperatura ambiente y leer la absorbancia a 632 nm. El complejo formado es estable por 30 min. Muestra: mezclar 250 L de tampn de acetato de sodio + 250 L de solucin patrn de Cu (II) + 25 L de pirocatecol 0.1%, dejar reaccionar 5 min a temperatura ambiente y luego aadir 250 L de muestra.

Calculo de la capacidad quelante.Se calcula la capacidad quelante de la forma siguiente: %CQ = (AbsM - AbsB/AbsM) (100). Dnde:AbsM = absorbancia del complejo de violeta de pirocatecol-Cu(II) + muestra.AbsB = absorbancia del complejo de violeta de pirocatecol-Cu(II).

ReferenciaDinis, T.C.P., Madeira, V.M.C., Almeida, L.M. (1994). Action of phenolic derivatives (acetaminophen, salicylate, and 5-amino salicylate) as inhibitors of membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical scavengers. Arch Biochem Biophys, 315: 161-169.6