Instituto Politécnico NacionalEscuela Nacional de Ciencias Biológicas

Ingeniería Bioquímica

Profesora: Larios Serrato Violeta

Autor: Alonso Ruíz Carlos Alberto

Colaboración: Estrada Buendía Víctor Jesús

Laboratorio de Métodos de Análisis

Práctica: Determinación de proteínas por método de “Lowry”

Grupo: 4IV1

Fecha: 22/04/2015

Introducción

Este es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de proteínas. Se añade a la muestra un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer. Este método consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+¿ ¿, en medio alcalino se unen a las proteínas formando complejos con los

átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Los complejos Cu2+¿−¿¿proteína tienen un color azul claro. Esto provoca el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que participan en la segunda etapa. El Cu2+¿ ¿

se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato

2) La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau (en medio básico), por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

}

Albúmina: Es una proteína compuesta de 610 aminoácidos organizados en una cadena péptida simple, doblada sobre sí misma en varias capas y con un peso molecular de 66.248. La albumina provee presión osmótica, sirve de transporte a los nutrientes y protege al medio interno de sustancias toxica.

Objetivos

Conocer y comprender el método de Lowry para valoración de proteínas. Construir curva de calibración con solución de Albúmina por método de Lowry. Comprender el manejo del espectrofotómetro.

Resultados

1) CURVA DE CALIBRACIÓN DE ALBÚMINA .

Tabla 1. Curva de Calibración de AlbúminaTubo No.

Cantidad de Proteína (ϻg/mL)

A595 Promedio A595

1 25 0.057 0.049 0.0532 50 0.093 0.085 0.0893 75 0.15 0.146 0.1484 100 0.2 0.182 0.1915 125 0.222 0.22 0.221

Ejemplo de conversión de solución de Albúmina de ml a ϻg

Para 0.1 mL de Albúmina

Si 1ml--------------0.25 mg/ml

0.1ml--------------- x = (0.025 mg/mL) (1000) = 25 ϻg/mL

Construcción de curva de calibración:

Gráfica 1 Curva de calibración graficando en “Y” promedio de A595 y en “X” datos de cantidad de cantidad de Proteína (ϻg/mL).

20 40 60 80 100 120 1400

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Curva de calibración de albúmina por método de Lowry

ϻg/mL de proteína

A595

Gráfica 2 Curva de calibración con regresión lineal.

20 40 60 80 100 120 1400

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

f(x) = 0.001752 x + 0.00900000000000001R² = 0.989131331463455

Curva de calibración de albúmina por método de Lowry

ϻg/mL de proteína

A595

a) Ecuación de la curva de calibración: y=0.0018x+0.009

Dónde:

X: Cantidad de proteína en ϻg 0.0018: La pendiente (Sensibilidad del método)

Y: La A595 (absorbancia)

0.009: La ordenada al origen (Absorbancia con una concentración de 0 de proteína “absorbancia del blanco”)

b) La curva de calibración cumple con la Ley de Bouger-Beer en un rango de 50 – 100 ϻg, visto en la gráfica no. 1

c) Expresión matemática para calcular cantidad de proteína, a partir de la ecuación de la curva.

x= y−0.0090.0018

2) ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Tabla 2. Réplicas para análisis estadístico.Tubo No.

Cantidad de Proteína (ϻg/mL)

1 0.123 63.3332 0.142 73.8883 0.130 67.2224 0.145 75.5555 0.128 66.1116 0.118 60.5557 0.134 69.4448 0.138 71.6669 0.124 63.888

10 0.145 75.555

Ejemplo de cálculo de cantidad de proteína:

Empleando la ecuación: x=( y−0.009)/(0.0018)

Sustituyendo valores de en y, se obtiene para el tubo 1 lo siguiente: y=0.1213

x=(0.123−0.009) /(0.0018) x=63.333

Cálculo de la media: x ‾=

∑i=1

n

X i

n

En Excel x ‾=68.722

Cálculo de desviación: S=√∑i=1

n

(X ¿¿ i−x ‾ )

n−1¿

Sumatoria de (X ¿¿i−x ‾ )² ¿=

∑ ¿257.438

S=√ 257.43810−1

S=5.348

Cálculo de varianza: S2= (S )2 S2= (5.348 )2 S2=¿28.6011

Cálculo de coeficiente de variación: C . V= Sx ‾

x 100 %C.V= 5.34868.722

x 100 %C .V =7.78%

Cálculo de límites de confianza de media poblacional: ϻ=x ‾ ±t vNC∗S

√n

Valor de t student con n = 10 y (n – 1) = 9 con 95% de confiabilidad = 2.262

ϻ=68.722±(2.262)(5.348)

√10 ϻ=68.722±3.825

ϻ=(64.897−72.547)

Tabla 3. Resultados de análisis estadísticox ‾ S S ² %C.V ϻ

68.722 5.348 28.6011 7.78% 64.897−72.547

3) INTERFERENCIAS.

Tabla 4. Efecto de sustancias no proteínicas

-5.388 29.0415.166 26.694-1.5 2.25

6.833 46.694-2.611 6.817-8.166 66.6940.722 0.5212.944 8.669-4.833 23.3616.833 46.694

Tubo No.

SustanciaCantidad de

Proteína (ϻg/mL)

Tipo de interferencia

generada

1 Tris 1M, pH 7.0 0.137 71.111 No interfiere

2 Glicerol al 1% (v/v) 0.179 94.444 positiva3 Detergente comercial al 1% 0.154 80.555 positiva

4 Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1%

0.232 123.888 positiva

5 Ácido triclocoacético (TCA) al 5% 0.153 80 positiva6 Fenol al 1% 1.951 1078.888 positiva7 Mercaptoetanol al 0.1% 0.138 71.666 No interfiere8 Tris 1M, pH 10 0.130 67.222 No interfiere9 Urea al 5% 0.112 57.222 negativa

10 ¿al 3% 0.142 73.888 positiva

4) COMPARCION ENTRE MÉTODO DE LOWRY Y BRADFORD.

Diferencias de exactitud Bradford (referencia) y Lowry (prueba). Prueba de la t

Ɖ=∑ Di

n Donde Di=X prueba−X referencia

Tabla 5. Cálculo de Di

Cantidad de Proteína (ϻg/mL) Lowry

X prueba

Cantidad de Proteína (ϻg/mL) Bradford

X referencia

Di

63.333 73.621 -10.28873.888 56.594 17.29367.222 89.567 -22.34575.555 85.243 -9.68866.111 66.324 -0.21360.555 65.243 -4.68869.444 64.702 4.74171.666 73.891 -2.22563.888 86.324 -22.43675.555 77.945 -2.390

∑ ¿−52.242

Valor de la media de Di : Dmedia=−52.24210

=−5.2242

Valor de SD SD=√1283.741√10−1

SD=√∑i−1

n

¿¿¿¿¿

SD=11.943

Se calcula el valor de t: t calculada=Dmedia × √nS D

t calculada=−5.2242× √1011.943

t calculada=−1.398

Al tener la t de student en tablas con un nivel de probabilidad de 95% se obtiene t v , NC=2.262

t calculada<t v ,NC −1.398<2.262

No existe diferencia significativa en exactitud

Diferencias de exactitud Lowry (referencia) y Bradford (prueba). Prueba “F” de Fisher

F calculada=Sb2

Sa2 ; Donde Sb

2>Sa2

La varianza en el método de Lowry fue de 28.6011

La varianza en el método de Bradford fue de 117.917 117.917 > 28.6011

F calculada=117.91728.6011

Fcalculada=4.122

Di Di−Dmedia ¿¿ -10.288 -5.064 25.64717.293 22.517 507.044-22.345 -17.121 293.139-9.688 -4.463 19.927-0.213 5.010 25.109-4.688 0.536 0.2874.741 9.965 99.312-2.225 2.998 8.990

-22.436 -17.212 296.255-2.390 2.833 8.027

∑ ¿1283.741

De tablas de obtiene F crítica=4.03 con 9 grados de libertad en numerador y denominador

F calculada> Fcrítica 4.122>4.03

Existe diferencia significativa en precisión

Comparación entre diversos métodos de determinación de proteínas.

Método Ventaja Desventaja

Kjeldahl

*Aplicable a todo tipo de alimentos*Barato*Método oficial para medir el contenido de proteína cruda

*Mide el nitrógeno orgánico total, no sólo el nitrógeno proteico*Consume mucho tiempo (al menos 2 horas para completarse)*Usa reactivos corrosivos

Biuret

*Rápido (se puede completar en menos de 30 minutos)*Método más simple de análisis de proteínas*Pocas sustancias no proteicas interfieren con la reacción Biuret

*Requiere de 2 – 4 mg de proteínas por prueba*Las concentraciones altas de sales de amonio interfieren con la reacción *Debe estandarizarse el color mediante cantidades de proteínas conocidas

Lowry *Muy sensible*Menos afectado por la turbidez de la muestra*Más específico que la mayoría de

*El color varias con diferentes proteínas (mas que Biuret)*Sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y hexoaminas interfieren

otros métodos

con la reacción*Altas concentraciones de azúcares reductores, sulfato de amonio y compuestos con sulfhidrilo interfieren con lareacción

Biuret

*Método rápido (la reacción se puede completar en 2 minutos) *Reproducible *No existe interferencia de cationes como K + , Na +, y Mg

*El complejo proteína-colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo*El color varía con diferentes tipos de proteínas.*La proteína estándar debe seleccionarse con mucho cuidado• interferencia con detergentes

Ácidobicinconínico

(bca)

*Reactivo más estable que el de Lowry*Sales de buffer y detergente no iónico no interfieren con la reacción*Concentraciones del medio de reactivos desnaturalizantes no interfieren (guanidina 4m-hcl o urea 3m)

*El color no es estable con el tiempo, Se necesita controlar cuidadosamente el tiempo entre el análisis y la lectura en absorbancia.*Los azúcares reductores interfieren con la reacción.*Altas concentraciones de sulfato de amonioInterfieren con la reacción.

Ultravioleta 280nm

*No existe interferencia del sulfato de amonio y otras sales buffer*Método no destructivo*Utilizado en detección post-columna de las proteínas

*Los ácidos nucléicos también absorben en la región de 280nm*El contenido de aminoácidos aromáticos difiere considerablemente en varias proteínas.*La solución debe ser clara e incolora. laturbidez puede producir resultados erráticos

Discusión

En este método en base a su fundamento, se observa que a mayor concentración en la proteína de aminoácidos como tirosina (aminoácido fenólico) aumenta la coloración azul con la reacción de Folin-Ciocalteau. Por lo que a mayor cantidad de proteína se lee una mayor absorbancia. En cuanto a la curva de calibración se observó en la gráfica 1, se cumple con la Ley de Bouguer-Beer en el intervalo de (50 – 100) ϻg donde se observa que la cantidad de proteína es directamente proporcional a la absorbancia, los valores que quedaron fuera en la regresión lineal se deben a errores de medición del laboratorista que llevo a cabo el ensayo. La media estadística obtenida fue de 68.75 ϻg que es baja a comparación de los 75 ϻg esperados. En cuanto a las interferencias se obtuvieron 6 interferencias positivas, 1 negativa y 3 que no interfieren, a lo cual se puede decir que aquellas que dieron interferencia positiva son soluciones que favorecen la reacción, llevando acabo una mayor reducción con el reactivo de Folin-Ciocalteau obteniendo una mayor coloración.

En las pruebas “t” de Student y “F” de Fisher se observó que en cuanto a precisión el método de Bradford es mejor, en cuanto a precisión al no existir diferencia estadística, la exactitud es la misma para ambos métodos.

Conclusión

El método de Lowry es un método fotométrico muy sensible que obedece la “Ley de Bouguer-Beer”, se caracteriza por medir en el espectrofotómetro una absorbancia a 595nm y 100%T, es un método altamente sensible en cuanto a precisión en comparación con Bradford el segundo en es mejor.

Bibliografía

Córdoba, I. A. (22 de Abril de 2015). http://analisisinstrumentalmeh.wordpress.com. Obtenido de https://analisisinstrumentalmeh.files.wordpress.com/2011/04/anc3a1lisis-de-las-protec3adnas.pdf

Desconocido. (22 de Abril de 2015). http://catedras.quimica.unlp.edu.ar. Obtenido de http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Proteinas.pdf

Rojas, A. L. (22 de Abril de 2015). http://revistas.um.es/. Obtenido de http://revistas.um.es/analesumciencias/article/viewFile/100481/95851