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58 Serie Actas INIA Nº 49

Seminario: Avances y Desafios para la Agroindustria Hortícola de Exportación Chilena

CAPÍT UL O 8

METABOLITOS SECUNDARIOS Y GENÓMICAFUNCIONAL EN ESPECIES Capsicum

María Teresa Pino Q.Ingeniero Agrónomo. Ph.D.

[email protected] - La Platina

Durante el transcurso de la última década,las exportaciones hortofrutícolas en Chilehan experimentado un fuerte aumento. La

Industria de alimentos procesados, constituye unaeminente estrategia para consolidar al país comopotencia Agroalimentaria líder en el HemisferioSur. En el año 2000 se exportaba alrededor de 750millones de dólares de procesados hortofrutícolas yen el 2010 los retornos superaron los $ 1.244 millones(Pro Chile, 2012). En la actualidad, se apuesta tam-bién al aprovechamiento de hortalizas para la agro-industria, con propiedades organolépticas, agronó-micas, nutricionales y comerciales según estándaresinternacionales. El pimiento y el ají son parte de es-te desafío, al ser altamente cotizados por su sabor,pungencia, composición bioquímica y acciónnutracéutica, además de su legendaria particulari-dad como colorante natural y especia (Lightbourn etal., 2008).

En las especies Capsicum, el único órgano de im-portancia económica es el fruto, y en los últimosaños ha recibido particular atención por su contenidode moléculas funcionales, entre las cuales se inclu-yen carotenoides, flavonoides, ácido ascórbico,compuestos fenólicos y capsicinoides responsablesde la pungencia (Wall, Waddell and Bosland,2001). Las condiciones ambientales y factoresfisiológicos pueden intervenir en la presencia deestos metabolitos, pero es la genética molecular eldeterminante en su disponibilidad cualitativa ycuantitativa dentro de la planta (Schreiner, 2005).A través de la biología molecular ha sido posibleana lizar directamente genes implicados encaracterísticas agroindustriales. Así por ejemplo,el color del fruto, atributo sensorial, producto demetabolitos secundarios de naturaleza antioxidanteconocidos como carotenoides (Thorup et al., 2000).

FENÓMENO CROMÁTICO DE LAMADURACIÓN DEL FRUTO

Los colores en los frutos se deben a varios pigmentos,incluyendo clorofilas, carotenoides, flavonoides ybetalaínas (Thorup et al., 2000). En frutos de especiesCapsicum, la madurez o senescencia, es un estadode transición fundamental, donde diferenciacionestitulares generan fenómenos fisico-químicos comotransformación de almidón en glucosa, degradaciónde pectina y biosíntesis de pigmentos encabezadapor la transformación de cloroplastos a cromoplastosy con ello la desintegración del aparato fotosintético(Brummell, 2006). La conversión de cloroplastos acromoplastos en frutos se identifica por la descom-posición del almidón, acumulación de carotenoides,lípidos poli insaturados y considerables cambiosestructurales que parten de la zona interna (Martí etal., 2008). Aquí desaparece la clorofila tras la desin-tegración de sacos tilacoides y estructuras grana,seguido del incremento en número y tamaño deplastoglóbulos, que son estructuras lipoproteicas,donde se concentran los pigmentos en forma decristales, y alteran críticamente el sistema de mem-brana interna, además de la extensión de filamentosen la superficie responsables del intercambio demetabolitos entre la red de plastos y el citosol (Bianet al., 2011).

La secuencia de reacciones bioquímicas que en-vuelven la síntesis de carotenoides ha sido exten-samente estudiada y elucidada entre los años de1950 y 1960 (Cunningham and Gantt, 1998). La víainicial se conserva en la mayoría de las especies deplantas, aunque algunas acumulan carotenoidesúnicos (Cazzonelli and Pogson, 2010), como lasespecies de Capsicum en cuyo fruto maduro se hanidentificado ceto carotenoides responsables del color

Darío Estay U.Licenciado en Biotecnología

INIA - La Platina

Carolina Pabón Q.Ingeniero en Biotecnología

Universidad de ESPE,Quito, Ecuador

mailto:[email protected]

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rojo (Davies, Matthews and Kirk, 1970). En frutos deCapsicum, la ruta biosintética de carotenoides seextiende para convertir anteraxantina y violaxantinaen ceto carotenoides rojos, capsantina y capsorubinarespectivamente (Figura 1), a través de Capsantina-Capsorubina-Sintasa CCS (Bouvier et al., 1994).Estos pigmentos no están presentes en tejidos quecontienen clorofila, son propios del fruto maduro. Secaracterizan por tener un inusual anillo ciclopentano(-) que se forma de la estructura 3-hidroxi-5,6-epoxi(Fraser and Bramley, 2004). La secuencia del genCCS posee un grupo amino terminal dinucleótido(FAD/NADP), motivo de unión y de elevada similitudcon -LCY (Bouvier et al., 1994); que ha conducidoa demostrar que la enzima CCS tiene una activadciclasa (Hugueney et al., 1995).

Considerables avances se han alcanzado respecto ala caracterización de genes involucrados en la acu-

mulación de carotenoides, en particular genes quecodifican enzimas principales como la capsantina-capsorubinasintasa CCS, una ciclasa modificadaque cataliza la formación de pigmentos rojos (Bouvieret al., 1994; Hugueney et al., 1995), y que funcio-naría como marcador molecular durante la madura-ción de frutos no climatéricos (Kuntz et al., 1998).Aunque la capsantina y capsorubina son los princi-pales componentes responsables del color rojo, seacumulan también otro tipo de carotenoides en lamaduración, que convierte al fruto en un buen mo-delo para estudiar los mecanismos de regulaciónsubyacente a la síntesis de pigmentos (Deli et al.,2001). Durante la maduración de Capsicum, segeneran isoprenoides C40 con nueve dobles enlacesconjugados en la cadena poliénica central y diferentesgrupos terminales que al alterar sus propiedadescromóforas, los clasifica en dos familias isocromá-ticas: Rojos (Capsantina, Capsorubina, Capsantina -5,6 - epóxido) y Amarillos (zeaxantina, violaxantina,anteraxantina, -criptoxantina, -caroteno, y cucur-bitaxantina A) (Hornero-Méndez, Gómez, & Mín-guez-Mosquera, 2000).

Figura 1. Ruta biosintética de carotenos en plantas superiores. Representación abreviada de los genesde importancia. GGPS, geranilgeranildifosfatosintasa; PSY, fitoenosintasa; PDS, fitoenodesaturasa; ZDS,

-caroteno desaturasa; -LCY, licopeno--ciclasa; -LCY, licopeno--ciclasa; -CH, -caroteno-hidroxilasa; -CH, -caroteno-hidroxilasa; ZEP,zeaxantinaepoxidasa; NXS, neoxantinasintasa; VDE, violaxantinaepoxidasa;

CCS, capsantina-capsorubinasintasa (específico en C. annuum). Modificado de (Rodriguez et al., 2012).



ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE LOSGENES CAROTENOGÉNICOS CCS

Y -LCY EN 7 GENOTIPOS DECapsicum spp PERTENECIENTES

A UN PROGRAMA DEMEJORAMIENTO GENÉTICO

PARA LA AGROINDUSTRIA DEEXPORTACIÓN EN CHILE

En un total de siete genotipos de Capsicum spp.,pertenecientes al programa de MejoramientoGenético de INIA La Platina para la agroindustria,se estudió la expresión de los genes CCS y -LCY enfunción de la síntesis de carotenoides totales (Figura2). El muestreo del fruto se realizó durante el perío-

do de cosecha (marzo - mayo del 2011), cuando elfruto presentó pericarpio liso, brillante y alcanzócoloración completa.

El análisis de carotenoides y clorofilas en los sietegenotipos evaluados mostró diferencias altamentesignificativas en el contenido de clorofila-a, cloro-fila-b y carotenos totales entre los frutos por efectodel factor genotipo (Figura 3). Los genotipos de co-lor marrón, presentaron valores de clorofilas entredos y cinco veces superiores respecto a los genotiposrojos y amarillos. Destacó el genotipo A-658 con(132,62±12,1 µg.mL -1 gDW-1) Chl a, (80,91±10,5µg.mL -1 gDW-1) Chl b, en contraste con el amarilloA-580 (0,45± 0,27 µg.mL-1 gDW-1) Chl a, (1,25± 0,3µg.mL -1 gDW-1) Chl b. En cuanto al contenido decarotenos totales, se observó una mayor acumu-

Figura 2. Frutos de genotipos de Capsicum spp utilizados en esta investigación. INIA - La Platina, Chile.Códigos de genotipos: A. A-571; B. A-1777; C. A-580; D. A-583; E. A-612; F. A-658; G. A-664.

Figura 3. Contenido de clorofila-a (Chl a), clorofila-b (Chl b), y carotenostotales en fruto de siete genotipos de Capsicum spp. Valores de (±SD) para n=3.

Letras mayúsculas distintas indican diferencias significativas en el contenido de carotenos totales. Minúsculas implicandistintas diferencias significativas en el contenido de clorofila-a y cursivas, distintas diferencias significativas en el contenido

de clorofila-b, entre los genotipos evaluados según Prueba de separación de medias de Duncan (p<0,05).



lación en los genotipos de color rojo A-571(375,79±5,8 µg.mL -1 gDW-1); A-1777 (395,73± 12, µg.mL -1

gDW-1) a diferencia del genotipo marrón A-612(111,68± 21,1 µg.mL -1 gDW-1). Estos resultadospermitieron inferir que la relación entre la presenciade carotenos totales es inversamente proporcionala la disponibilidad de clorofilas. Y por tanto, podríaconsiderarse al color final de madurez comoindicador potencial del contenido de pigmentos.Sin embargo, es importante enfatizar al genotipoA-664; que con niveles considerables de clorofilasa y b en su composición, exhibe también la con-centración más alta de carotenos totales (435,92±12,55 µg.mL-1 gDW-1).

Para el seguimiento de la expresión de genes aso-ciados a la síntesis de compuestos funcionales deltipo carotenoides, se logró secuenciar, clonar yestudiar la expresión de los genes -LCY (X86221.1)y CCS (X76165.1). A partir de estos resultados seasociaron las secuencias obtenidas con proteínasfuncionalmente similares previamente descritasen especies como naranja (AAF18389.1), tomate(Q43503), kiwi (ACJ66629.1), Arabidopsis (Q38933)y otros Capsicum, alcanzando porcentajes de iden-tidad superiores al 80%. En las secuencias amino-

acídicas tanto de CCS como de -LCY, se identificóun sitio de unión a dinucleótido (NAD/NADPH)parcialmente conservado, que parece estar impli-cado en la catálisis enzimática (Cunningham etal., 1996).

Durante el estudio cuantitativo de la expresión deestos genes en los diferentes genotipos, se observódiferencias altamente significativas en los nivelesde expresión génica relativa entre todas las acce-siones, para el gen -LCY y el gen CCS (Figura 4).Para los genotipos rojos, los coeficientes de deter-minación describen una influencia de la expresióngénica sobre el 70% de pigmentos totales. Además,presentaron un grado de correlación positivo (0.6 r 1) y estadísticamente significativo particularmen-te para el gen CCS (p<0.01), cuyos resultados sonlos esperados para frutos donde la coloración estádirectamente marcada por la presencia de capsan-tina y capsorubina (Figura 5). Este gen tiene uncomportamiento dominante localizado en el locusY, que posteriormente se traduce en la enzima bi-funcional capsantina-capsorubina sintasa, que pro-duce moléculas isocromáticas de color rojo (Horne-ro-Méndez et al., 2000). Los pimientos color marrón(Figura 6), tienen una compleja relación entre su

Figura 4. Expresión de genes carotenogénicos en fruto de siete genotipos de Capsicum spp. (a) GenCCS capsantinacapsorubinasintasa.(b) Gen -LCY licopeno beta ciclasa. (c) Gen 18S Control interno.

RT-PCR establecido para 109 ng RNA. (C+) Controles positivos. Geles de agarosa 2.5%, 70V.



disponibilidad de carotenos y el nivel de expresiónde los genes -LCY y CCS. Según lo observado, el70% del contenido total de carotenos es influen-ciado por el gen CCS, mientras que con respecto algen -LCY, no existe una correlación significativa(p 0.05) entre carotenos totales y los niveles deexpresión génica. Este fenómeno se identifica en lagran diversidad cromática que presentan los frutoscolor marrón, como efecto de la persistencia declorofila en sus tejidos durante todo el proceso demaduración (Rodriguez-Concepción and Boronat,2002).

Figura 5. Relación entre el contenido de carotenos totales y la expresión relativade los genes carotenogénicos CCS y -LCY en genotipos de Capsicum spp

de color rojo. (a) Carotenos totales vs expresión génica de CCS.(b) Carotenos totales vs expresión génica de -LCY.


de color marrón. (a) Carotenos totales vs expresión génica de CCS.(b) Carotenos totales vs expresión génica de -LCY.

En los genotipos amarillos (Figura 7), el gen -LCYposee mayor influencia en el contenido de carotenostotales. Es decir, su manipulación tendría resultadoscríticos porque el producto de -LCY, la enzima (li-copeno beta ciclasa), que dirige el flujo de precur-sores monocíclicos y carotenos, son transformadosen una extensión de la ruta biosintética de pigmentosen moléculas altamente antioxidantes capsantina ycapsorubina (Fraser and Bramley, 2004). Probable-mente, la acción catalítica de la enzima licopenobeta ciclasa es de mayor implicancia debido a quese ubica antes de la enzima CCS dentro de la ruta debiogénesis de pigmentos (Pecker et al., 1996).




de color amarillo. (a) Carotenos totales vs expresión génica de CCS.(b) Carotenos totales vs expresión génica de -LCY.

A partir de estos resultados se puede asegurar quelas herramientas moleculares como el aislamientode genes y el análisis de sus niveles de expresiónson muy útiles y eficientes dentro del proceso deselección de variedades para el mejoramientoagrícola. La presencia de genes responsables decaracterísticas como el color del fruto en especiesde Capsicum, permite relacionar directamente elmaterial genético con la disponibilidad de molé-culas antioxidantes como carotenoides. Sin embar-go, es necesario extender el estudio hacia otrasenzimas carotenogénicas, principalmente las quese ubican en la parte inicial de la ruta. Ello porqueproporcionan los sustratos necesarios para activarlos genes que están por debajo de la misma duranteel proceso de maduración que proporciona unaextensa diversidad cromática impactando en lacalidad externa del fruto y la cantidad de compues-tos nutricionales.

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