mekanisme transfer & isolasi dna

MEKANISME TRANSFER &

ISOLASI DNA

Fita Fatimah (4001410001)

Rahmawati (4001410002)

M. Irsyad (4001410016)

Inna Latifa R. (4001410036)

Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.

Outline

DNA sebagai Materi

Genetik

Mekanisme

Transfer DNA,

Transposons,

Mutasi

Isolasi DNA

Jurnal


DNA sebagai Materi Genetik

Konsep HereditasGenom

Elemen Genetik yang BergerakPercobaan Griffith, Avery et al,

Hershey & ChaseKelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012.

Mikrobiologi Terapan.

Konsep Hereditas• Ada dua fenomena biologi

pada konsep hereditas, yaitu:

1). Hereditas yang bersifat stabil : dimana generasi berikut yang terbentuk dari pembelahan satu sel mempunyai sifat yang identik dengan induknya

2). Variasi genetik yang mengakibatkan adanya perbedaan sifat dari sel induknya akibat peristiwa genetik tertentu, misal: mutasi.

Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan

21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.

1. Unit Herediter Bakteri (Genom)

1. Kromosom

Gen prokariota ada dalam kromosom.

Gen bakteri terdapat dalam molekul DNA tunggal (haploid). Berbentuk sirkuler, panjangnya ± 1mm, beratnya 2-3% dari berat kering satu sel, disusun sekitar 4 juta kbp DNA, makromolekul yang sangat banyak ini dikemas agar tidak berubah dalam bentuk superkoil (± 70-130 superkoil domain)


…Unit Herediter Bakteri (Genom)

2. Plasmid

adalah material turun temurun yang bukan bagian dari kromosom, dapat memperbanyak diri sendiri, biasanya bulat, kecil, dan relatif sederhana Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik.



3 Macam Plasmid1. F dan F’ plasmid, factor fertilitas konjugasi

2. R plasmid disebut juga RTF atau Resisten Transfer Factor plasmid membawa beberapa gen untuk resistensi terhadap antibiotic atau obat antibiotic yg lain.3. Col plasmid disebut juga colicinogenic, plasmid yang mengkode untuk colisin, protein yang membunuh secara sensitive sel E. Coli (Gardner, 1991).

Plasmid F Terdiri dari sekitar 25 gen, sebagian besar diperlukan untuk memproduksi

pili seks. Ahli-ahli genetika menggunakan simbol F+ untuk menyatakan sel yang mengandung plasmid F (sel "jantan"). Kondisi F+ dapat diwariskan: plasmid F bereplikasi secara sinkron dengan DNA kromosom, dan pembelahan satu sel F+ biasanya menghasilkan dua keturunan yang semuanya merupakan F+. Sel-sel yang tidak memiliki faktor F diberi simbol F- , dan mereka berfungsi sebagai resipien DNA ("betina")

selama konjugasi. Kondisi F+ adalah kondisi yang "menular' dalam artian sel F+ dapat

mengubah sel F- menjadi F+ ketika kedua sel tersebut berkonjugasi. (Campbell, 2002).



Plasmid RFaktor R pertama kali ditemukan di Jepang pada strain bakteri enterik yang mengalami resistensi terhadap sejumlah antibiotik (multipel resisten). Plasmid R100 disusun oleh 90 kbp yang membawa gen resisten untuk sulfonamid, streptomisin/spektinomisin, asam fusidat, kloramfenikol, tetrasiklin dan pembawa gen resisten terhadap merkuri.


2. Elemen Genetik yang Bergerak

Berdasarkan analisis genetik terhadap organisasi kromosom diungkapkan bahwa penyusunan kembali DNA dapat membawa elemen genetik yang bergerak.

Terdiri dari 2 Jenis :1. IS2. Transposon

Insertion Sequences (IS)

• adalah elemen urutan sisipan

yang merupakan unsur genetik yang mampu menyisip ke

tempat baru pada *replikon yang sama maupun berbeda. IS tidak dapat mereplikasi dirinya sendiri. Urutan dari kelompok IS sederhana biasanya hanya mengandung gen tunggal yang mengkode satu enzim, transposase, yang penting untuk transposisi elemen IS.

* Replikon : infomasi genetik yang diperlukan untuk replikasi dirinya sendiri.



Transposon• adalah unsur genetik yang

mengandung beberapa kbp DNA, termasuk informasi yang diperlukan untuk migrasi dari satu lokus genetik ke lokus genetik lain, terutama untuk fungsi khusus misalnya resistensi terhadap antibiotik.

Percobaan Frederick Griffith (1928)


Simpulan Percobaan Griffith

terdapat bahan yang utama untuk terjadinya proses transformasi (transforming principle) yang berperan dalam konversi tersebut yang mungkin merupakan beberapa bagian dari kapsul polisakarida atau beberapa senyawa yang dibutuhkan untuk sintesis kapsul meskipun kapsul itu sendiri tidak dapat menyebabkan pnemonia.


Percobaan Avery


Percobaan Avery et al• Filtrat dari sel IIIS yang telah dimatikan diperlakukan dengan protease

(suatu enzim yang dapat menghancurkan protein), dan RNase (suatu enzim yang dapat menghancurkan molekul RNA) secara terpisah, kemudian dicampur dengan sel galur IIR. Pencampuran ini masih menghasilkan bakteri galur IIIS, yang berarti bahwa protein dan RNA

bukan merupakan bahan untuk transformasi (transforming

principle). Percobaan lainnya adalah dengan menambahkan DNase (suatu enzim yang dapat menghancurkan enzim) pada filtrat dari sel IIIS. Filtrat yang telah dicampur dengan DNase ini ternyata

tidak mampu menghasilkan sel IIIS bila dicampur dengan sel

IIR, yang berarti tidak mampu menginduksi transformasi.

• Dari hasil percobaan ini, Avery, MacLeod, dan McCarty menyatakan bahwa DNA adalah bahan utama untuk transformasi.


Harshey & Chase


Simpulan• percobaan yang dilakukan oleh Hershey dan Chase membuktikan

bahwa DNA virus masuk ke dalam tubuh bakteri E. Coli, sedangkan sebagian besar protein virus tetap berada di luar. Masuknya materi genetik ke dalam tubuh bakteri akan menyebabkan terjadinya kerusakan program genetik bakteri karena diambil alih oleh DNA virus. Hal ini menyebabkan virus dapat dengan mudah memperbanyak diri selama di dalam tubuh bakteri. Percobaan Hershey dan Chase memberikan bukti kuat bahwa asam nukleat (bukan protein) merupakan materi hereditas.


TransduksiTransformasi

Konjugasi

Mekanisme Transfer Materi Genetik



ISOLASI DNA

Prinsip-prinsip Isolasi DNA

1. Sentrifugasi

2. Presipitasi

1. Sentrifugasi

• memisahkan substansi

berdasarkan berat jenis

molekul dengan cara

memberikan gaya

sentrifugal sehingga

substansi yang lebih berat

akan berada di dasar,

sedangkan substansi yang

lebih ringan akan terletak di

atas.

• Memakai mesin sentrifugasi.

2. Presipitasi

• Presipitasi merupakan

langkah yang dilakukan

untuk mengendapkan suatu

komponen dari campuran

(Alberts dkk. 1994: 254).

ALAT SENTRIFUGASI

Tahap-tahap isolasi DNA

1. Isolasi Jaringan2. Dinding sel dan membran dilisiskan3. Diekstraksi dalam larutan4. Dipurifikasi5. Dipresipitasi

1. Isolasi Jaringan

• Tahap pertama yaitu

mengisolasi jaringan

yang akan digunakan,

yaitu darah.

Menggunakan larutan

hipotanis yang terdiri

atas EDTA

(ethylenediamine

tetraacetic acid).

2. Dinding sel dan membran sel dilisiskan

• Melisiskan dinding sel

dan membran sel

dengan menggunakan

larutan pelisis sel darah

merah.

• Diinkubasi

• Disentrifugasi selama

10 menit dengan

kecepatan 2500 rpm.

3. Diekstraksi dalam larutan

• Ekstraksi

• Hal ini dilakukan

dengan tujuan agar

didapat ekstrak

nukleus sel darah

putih.

4. Purifikasi

• Purifikasi bertujuan

untuk membersihkan sel

darah putih dari zat-zat

lainnya; Ke dalam

larutan tadi kemudian

diberikan RNAse dan

diinkubasi selama 15

menit pada suhu 37°C.

Hal tersebut bertujuan

untuk mengoptimalkan

kerja enzim yang sangat

dipengaruhi oleh

temperatur.

5. Presipitasi

• Tahap presipitasi dilakukan

dengan cara meneteskan

larutan presipitasi protein dan

kemudian divortex yang

bertujuan untuk

menghomogenkan larutan.

• Larutan tersebut kemudian

disentrifugasi kembali selama

15 menit dengan kecepatan

3000 rpm.

• Menambahan isopropanol

untuk memvisualisasikan DNA

Lanjutan tahap 5 • Disentrifugasi

(hasil=terdapatnya pelet DNA pada dasar tabun)

• ditambahkan etanol 70% untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya dan dibolak-balik kembali..

• Disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm.

• Hasil = DNA yang berada pada tepi dasar tabung.

• Menambahkan Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi

JURNAL“Transfer Plasmid Bakteri Metanogenetik Asal

Tanah Tempat Pembuangan Air Kelapa ke Dalam E coli C 600 untuk Produksi Biogas”

Tujuan dan Kegunaan • Mengisolasi dan karakterisasi bakteri metanogenik

dalam limbah air kelapa• Mengisolasi dan mengidentififikasi DNA bakteri

metanogenik dari dalam kotoran sapi• Mentransformasi plasmid bakteri metanogenik ke

dalam E. coli C600• Mengidentifikasi produk metan dari E. coli

transforman

Bakteri Metanogenik• Bakteri yang memproduksi metan• 16S rRNA termasuk kedalam archaebacteria• Bulat, batang, spiral• Motil atau tidak motil• Tidak membunyai klorofil• Aseksual : pembelahan biner

Prospek air kelapa

Penentuan Jenis Bakteri Metanogenik dalam limbah air kelapa

Penentuan Jenis Bakteri Metanogenik dalam limbah air kelapa

Di dalam media I dan III terjadi proses metabolisme yang meningkat,

Waktu yang tepat untuk mengidolasi bakteri metanogenik dan ditanam dalam media Ros bengal, kemudian di inkubasi dalam suasana

anaerob.

Penentuan Jenis Bakteri Metanogenik dalam Limbah

Air Kelapa

Karakteristik isolat bakteri Metanogenik

• Batang• Mesofil• Dapat memproduksi enzim katalase• Dapat mereduksi nitrat• Berperan dalam fermentasi gula• Dapat menghidrolisis gelatin, casein,

dan pati• Hidup pH 5,7 - 8,8

Bakteri termasuk ke dalam golongan gram positif, mempunyai endospora, berbentuk batang, dan bulat

Amphibacillus, Bacillus, Clostridium, Sporolactibacillus, Sporosarcina, Sulfobacillus, dan

Syntrophosphora.

Identifikasi Isolat Bakteri Metanogenikberdasarkan 16S rRNA

Isolasi DNA total

Ampifikasi Gen 16S rRNA

Perunutan Nukleotida

Penelusuran Produk metan dari E. coli C600 Transforman

Mengevaluasi pelet bakteri transforman

Fermentasi air kelapa steril dengan E.coli transforman

Kontrol positif : inokulan bakteri

metan putihKontrol

negatif :inokulan E. coli C600

Bertujuan untuk melihat apakah sudah terjadi ekspresi gen [enghasil metan oleh plasmid

bakteri metanogenik yang telah ditransformasikan dalam E.coli C600

KesimpulanTransformasi plasmid isolat P

kedalam E.coli C600 menghasilkan E.coli

transforman yang dapat memproduksi gas metan

setelah 3 hari fermentasi, lebih cepat 5 hari dari isolat P.


Pertanyaan

1. Sujarwanto : Jelaskan kembali bagaimana mekanisme transfer genetik.

2. Dwi Lestari : Apakah replikasi virus bisa dilaksanakan tanpa adanya bakteri?

mekanisme transfer & isolasi dna

Education