Meios microbiologia 2 Micronutrientes – Pequena quantidade mas funcionalmente importantes.

Manganês

Cobalto

Cobre

Molibdénio

Zinco

Macronutrientes – Grandes quantidades e desempenham papeis fundamentais na estrutura e metabolismo da célula.

Carbono

Oxigénio

Hidrogénio

Azoto

Enxofre

Magnésio

Fósforo

Fatores de Crescimento – São nutrientes acessórios, que fazem parte da célula mas eu não podem ser sintetizados pelo microrganismo.

Microrganismos heterotróficos - São organismos que usam carbono orgânico como principal fonte de carbono.

Autotróficos – São organismos que usam CO2 como principal fonte de carbono.

Cultura pura ou axénia – Tem apenas um tipo de microrganismo.

Cultura Mista – Tem vários tipos de microrganismos (muitos microrganismos diferentes).

Os meios devem conter – Nutrientes indispensáveis ao organismo em causa sob a forma assimilável.

O meio deve ser – Estéril e efetuado com técnicas de assepsia.

Fatores de crescimento

PH de 2 – 10

Tensão de oxigénio

Atividade da água Nota: A temperatura não é um fator de crescimento que possa ser posto no meio de cultura, tem a ver sim com as condições ótimas para a incubação da bactéria. Cultura – Crescimento de uma população microbiana em meios laboratoriais. Isolamento - Separação de um microrganismo a partir de uma população mista. Cultura de enriquecimento- Permite o crescimento de uma espécie microbiana em detrimento de outras. Ex.: Gelose de sangue; chocolate; coração. Meios enriquecidos – Permitem o crescimento de microrganismos fastidiosos, devido ao seu alto teor nutritivo.

Estado Físico

Líquido

Caldos

Nutrientes dissolvidos em água

desionizada

Semi - sólido

Agar na concentração

0,3 - 0,5 %

3g Agas/L

Sólido

Agar na concentração

1 - 1,5 %

15 - 20 g Agar/ L

Tipos de “culturas”

Placas de Petri

Tubos de ensaio - Rampa - A direito

Distinção de colónias numa Placa

Cor

Aspeto

Brilho

Tipo de colónias

Classificação dos meios de cultura

Composição Química

Quimicamente Definido

Consoante o grau de exigência do microrganismo

Conhecemos o que é lá posto

Conhecemos a quantidade

exacta.

Quimicamente Complexos

Não se conhece a composição quimica

exacta.

Utiliza nutrientes complexos

Permitem o crescimento de muitos

microrganismos diferentes.

Objectivos Funcionais

Simples Selectivos

São formulados para suprimir o crescimento de organismos que não interessam, permitindo

o crescimento dos microrgaismos que desejamos isolar.

Diferenciais

Podem crecer vários tipos de

microrganismos, mas devido ao diferente aspecto que tomam

no meio podem distinguir-se as

colónias.

Complexos

Microrganismos

Heterotróficos

Fotoheterotróficos

Compostos orgânicos

Luz

Químiolitoheterotróficos

Compostos Orgânicos

Inorgânico

Quimiorganoheterotróficos Compostos orgânicos

Orgânica

Autotróficos

Fotoautotróficos

CO2

Luz

Químioautotróficos CO2

Inorgânico

Químiorganoautotróficos

CO2 Orgânica

Meios de Cultura

Caldo de açúcar – Para determinar se as bactérias fermentam a glucose. Resultados:

Glucose + - Cor amarela – Com gás – hidrogenoliase fórmica reage com o ácido fórmico

- Sem gás

Glucose (-) – cor vermelha Kligler - meio diferencial para a capacidade fermentativa da glucose e lactose e produção de sulfito de hidrogênio.

- Fermentação da lactose na rampa - Fermentação da glucose no fundo do tubo [Fermentação]> 10 xs na rampa do que a [glucose].

Resultados:

Amarelo na rampa e no fundo – fermentação da lactose e glucose

Amarelo só no fundo – fermentador da glucose

Amarelo só na rampa – fermentador da lactose

Vermelho – Não fermentou – Na rampa – Não fermenta a lactose - No fundo – Não fermenta a glucose - Na rampa e no fundo – Não fermenta nada

Se existir – deslocamento no fundo do tubo – formação de CO2 + H2 - Formação de precipitado negro – formação de H2S

Nota: Semeia-se em profundidade e na rampa em esteria.

Meio MacConkey - Fermentação da Lactose. Não permite o crescimento de bactérias Gram + e fungos Resultados Bactérias Gram (-) e fermentadoras da lactose – Colónias vermelhas Bactérias Gram (-) e não fermentadoras da lactose – Colónias amarelas.

Manitol Salt Agar – Permite saber se as bactérias fermentam ou não o manitol. Não permite o crescimento de bactérias Gram (-) por causa da grande concentração de NaCl. Resultados Meio de cor amarela – bactérias fermentadoras de manitol. Meio de cor rosa – bactérias não fermentadoras de manitol.

CLED - permite distinguir bactérias fermentadoras da lactose e não fermentadoras de lactose. Resultados Cor inicial do meio – verde Se meio de cor verde => Lac (-) – Bactérias não fermentadoras da Lactose Se meio de cor amarelo => Lac + - Bactérias fermentadoras da Lactose

ONPG – Permite saber se a bactéria possui ou não permease. Resultados Cor inicial do meio – incolor Se meio incolor – Não possui β-galactosidade Se meio amarelo – Tem β-galactosidade – que a bactéria fermenta a lactose na presença de permeases.

OF – Serve para ver se a bactérias fermentam ou oxidam a glucose. Resultados Cor original do meio - verde

Se cor amarela( microrganismo anaeróbio facultativo) (é porque ocorre acidificação em todo o tubo) – tubo fechado Usa a glicose por

via fermentativa - tubo aberto

Se cor verde (microrganismo aeróbio estrito) – Tubo fechado

- Tubo aberto Usa a glicose por via oxidativa (ocorre acidificação no topo do tubo)

MR-VP

+ vermelho de metilo

Se vermelho

MR+

Se incolor

MR-

Acetoína

KOH + α naftol

Anel Púrpura

VP+

Incolor

VP -

MR – VP – Indica se a bactéria produz ácidos fortes a partir do piuvato

Ocorre baixa de Ph no meio quando o teste dá MR+

As reações são mutuamente exclusivas

MR+ - Produz ácidos fortes a partir do piruvato VP+ - Produz acetoína

Cor Original do meio

Verde

Azul - houve subida de Ph

Citrato +

Verde

Citrato -

Citratos - Uso de citrato como fonte de carbono

APP – Serve para saber se o microrganismo possui fenilalanina

desaminase

APP+ Cor verde na rampa – Tem fenilalanina desaminase

Por causa da formação de um complexo com ferro APP - Cor amarela na rampa – Não tem fenilalanina desaminase Indica a presença de ácidos provenientes da degradação da glicose

Púrpura

Púrpura

LDC +

Com

parafina

Púrpura

LDC+

Amarelo

Preença de ácidos provenientes da

degradação da glicose

Ausência de decarboxilases

LDC -

LDC/ODC - Serve para verificar a existência de descarboxilases de aminoácidos

- O microrganismo começa por degradar a glucose acidificando o meio. Quando esta tiver sido completamente utilizada, os microrganismos que possuem a descarboxilase vão utilizar o aminoácido presente no meio tornando-o alcalino. -É necessário cobrir com parafina líquida. - Os falsos positivos acontecem quando não usamos a parafina e há uma falsa alcalinização na superfície do meio. SIM – Produção de Indol a partir do Triptofano - Mobilidade - Formação de H2S Indol + - Fromação de anel Púrpura (vermelho) no tubo + Reagente de Erlich – Kovac’s Possui Triptofanases H2S – Formação de composto de cor preta Nota: Este meio e semeado em profundidade.

Nitratos – Redução de Nitratos NO3

- NO2- N2

NO3

- NO2- + Reagente A e B Vermelho – Bactéria tem nitrato redutases

NO3- NO2

- N2 + Reagente Incolor + Zinco Incolor Bactéria tem Nitrato Redutases NO3

-+ Reagente Incolor+Zinco Vermelho – Bactéria não tem Nitrato Redutases

Nitrato Redutases Nitrato Redutases

NaCl 6,5% ou PYR - determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase Teste positivo – Há turvação no meio – há crescimento bacteriano Teste negativo – Não há turvação do meio – não há crescimento bacteriano

Hidrólise da Esculina – meio contém Bílis e Esulina - Não crescem bactérias Gram neg. e também muitas de Gram positivo. - Crescem bem o Enterococcus e estes vão hidrolisar a esculina – Na presença de sais férricos presentes no meio este fica preto - A exceção neste meio é o S. bovis Resultados: Teste positivo – meio de cor preta Teste negativo – meio de cor amarela (cor original)

XLD – Xylose Desoxychocolate (xilose lisina deoxicolato) É usado para isolar enterobactérias patogénicas - Cor original do meio – vermelho

Microrganismo Crescimento Cor da Colónia

Proteus vulgaris Bom - Abundante Amarela

Proteus mirabilis Bom – Abundante Amarela

S. Thyphi Bom – Abundante Vermelha com pontos pretos

S. Typhimurium Bom – Abundante Vermelha com pontos pretos

Sigella dysenteriae Bom – Abundante Vermelha

Enterobater aerogenes Pobre Amarela

E.Coli Pobre Amarela

Staphylococcus Aureus Inibido -

SS –Destinado a isolar Salmonella e Sigella - Contém sais biliares e verde brilhante Cor original do meio – Rosa Alaranjado

Oraganismo Cor das colónias

Sigella Transparentes

Salmonella Transparentes com centro negro

MacConkey Sorbito Agar - A E. coli O157: H7 difere da maioria das outras estirpes de E. coli por ser incapaz de fermentar sorbitol. - No meio MacConkey sorbitol, a lactose é substituída por sorbitol. - A maioria das estirpes de E. coli fermentar sorbitol para produzir ácido, a E. coli O157: H7 não pode fermentar sorbitol, de modo que esta estirpe utiliza a peptona par a crescer. Isto eleva o pH do meio, permitindo que a estirpe O157: H7 possa ser distinguida de outras estirpes de E. coli.

Resultado: Positivo – Crescimento de colónias vermelhas

Ctalase Enzima intracelular que decompões o peróxido de hidrogénio encontrado no citoplasma de procariotas. 2H2O2 2H2O + O2

Teste Positivo – formação de bolhas Teste negativo – Não formação de bolhas Oxidase - Ultimo aceitador de eletrões no citocromo C - Encontrado em proteínas transmembranares de bactérias e mitocôndrias - Coverte O2 em H2O DNAse Enzima responsável pela quebra das ligações no DNA durante a apoptose. Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o ácido nucléico (DNA). Resultados:

Formação de halo transparente, identifica Staphylococcus aureus; Ausência de formação de halo transparente, identifica Staphylococcus coagulase

negativa.

Coagulase É uma adesina produzida pelo staphylococcus aureus e staphylococcus intermedius. - No laboratório é usado para distinguir os diferentes tipos de staphylococcus. - Teste negativo exclui a presença de S. aureus. - A coagulase não é uma enzima. - Reage com a protrombina no sangue. Factor de coagulação Teste positivo – no eppendorf a solução fica colada ao fundo. Teste negativo - no eppendorf a solção escorre dentro do tubo. Adesina – complexo proteico que reconhece e se liga a recetores também proteicos na superfície das células do hospedeiro. Pili