mecanismo de toxicidade induzido pelo metilmercurio e...
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Universidade Federal do Pará
Centro de Ciências Biológicas
Departamento de Fisiologia
Laboratório de Neuroquímica Molecular e Celular
Mecanismo de Toxicidade Induzido pelo Metilmercurio e
Regulação do Sistema Nitrérgico em Culturas Celulares de
Retina
Anderson Manoel Herculano Oliveira da Silva
Belém/2006
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Universidade Federal do Pará
Centro de Ciências Biológicas
Departamento de Fisiologia
Laboratório de Neuroquímica Molecular e Celular
Mecanismo de Toxicidade Induzido pelo Metilmercurio e
Regulação do Sistema Nitrérgico em Culturas Celulares de
Retina
Tese de Doutorado Apresentada ao Programa de Pós Grauduação em Neurociências
E Biologia Celular da Universidade Federal do Pará para Obtenção do Título de
Doutor em Neurociências e Biologia Celular
Belém/2006
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REUMO O sistema visual representa um importante alvo da intoxicação mercurial. Neste
contexto, o presente trabalho objetivou avaliar o efeito do mercúrio no sistema de
neutransmissão glutamatérgica utilizando como modelo experimental culturas de retina
de embrião de galinha. Nossos resultados demonstraram que a exposição a diferentes
concentrações de MeHg induz uma diminuição da viabilidade celular de uma forma
dependente da concentração e de tempo de exposição. Nossos dados também
demonstraram que o MeHg promove diminuição da captação de [3H]-Glutamato e [3S]-
Cisteína nas culturas expostas, assim como, diminuição dos níveis intracelulares de
GSH. O bloqueio da toxicidade mercurial observado na presença de antagonistas
glutamatérgicos do tipo NMDA, inibidores da atividade da NOS e precursores da
síntese de GSH, demonstrou que a ativação via glutamato somado ao estresse oxidativo
representam o principal mecanismo de toxicidade induzida pelo MeHg nas células da
retina. Neste trabalho também avaliamos a regulação ad atividade da NOS ao longo do
desenvolvimento in vitro, nossos dados demonstraram que a atividade da NOS aumenta
gradativamente com evolução das culturas. Nossos dados demonstraram que no período
C2 glutamato e NGF, mas não seu substrato, L- arginina, são capazes de elevar
sigficativamente a atividade da NOS. Avaliamos a captação de L-arginina e observamos
uma baixa atividade em C2, o tratamento com NGF induziu um aumento da captação de
L-arginina, da mesma forma que o anti-NGF bloqueia esta captação em C2. Desta
forma nosso trabalho sugere que a homeostasia do sistema nitrergico é regulada por
NGF nos primeiros períodos do desenvolvimento retiniano.
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ABSTRACT
Methylmercury (MeHg) is a potent environmental pollutant that affects the central
nervous system and provokes serious damage in the visual system. The mechanisms of
citotoxicity induced by MeHg in the retinal cells still remains unclear. Thus, the aim of
this work was to evaluate the role of ionotropic glutamatergic receptors and nitrergic
activation on the neurotoxicity induced by MeHg in retinal cell cultures. Decrease of
viable cells in a time and concentration-dependent manner by MeHg exposure was
detected. NOS activity monitoring revealed an increase with 4 and 6 hours of MeHg
intoxication. NMDA-type receptor antagonist, MK-801, and the nitric oxide synthase
(NOS) inhibitor, L-nitro-arginine was able to prevent partially the cellular death
provoked by 4h of MeHg exposure. These results support that MeHg toxicity in retina is
mediated by NMDA-type glutamate receptor and NOS activation.
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INTRODUÇÃO:
Ao longo do processo evolutivo, o sistema visual apresentou-se como
uma das mais importantes aquisições adaptativas para a manutenção de uma espécie em
diferentes nichos ecológicos. Este sistema é responsável pela captação, transformação e
processamento dos estímulos luminosos provenientes do meio, sendo a retina o seu
primeiro nível de processamento. A retina caracteriza-se como uma fina camada de
tecido nervoso localizado no interior do globo ocular, a partir da qual a informação
visual é transmitida do nervo óptico para os núcleos mesencefálicos e talâmicos, cujos
neurônios transmitem a informação ao córtex visual, onde ocorre o último nível de
processamento desta informação (Ramón y Cajal, 1892).
Nos vertebrados em geral, a retina apresenta uma citoarquitetura laminar
formada por cinco camadas, três de corpos celulares e duas de neurópila ou conexões.
Nas camadas de corpos celulares, podemos destacar: a camada nuclear externa (CNE), a
qual contém os corpos celulares dos fotorreceptores (cones e bastonetes); a camada
nuclear interna (CNI), com os corpos celulares das células bipolares, horizontais,
amácrinas e a camada de células ganglionares (CCG), contendo os corpos celulares das
células ganglionares. As camadas de neurópila ou de conexões, são constituídas pelas
camadas plexiforme externa (CPE) e interna (CPI). Na primeira observamos conexões
entre os terminais sinápticos dos fotorreceptores e células bipolares e horizontais e na
segunda são formadas conexões entre as células bipolares, amácrinas e as células
ganglionares (Ramón y Cajal, 1892) (Figura 1).
Figura 1. Diagrama esquemático da retina de vertebrados, mostrando a estrutura
laminar da retina e seus elementos celulares. (CC) Camada Coroidal; (EP) Epitélio
Pigmentar; (SE) Camada de Segmentos Externos; (SI) Camada de Segmentos Internos;
(MLE) Membrana Limitante Externa; (CNE) Camada Nnuclear Externa; (CPE)
Camada Plexiforme Externa; (CNI) Camada Nuclear Interna; (CPI) Camada Plexiforme
Interna; (CCG) Camada de Células Ganglionares; (CF) Camada de Fibras do Nervo
Óptico; (MLI) Membrana Limitante Interna. (Modificado de Rodieck, 1998).
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A complexa organização celular da retina, assim como a suas conexões,
é resultante de refinados eventos moleculares e celulares que ocorrem no período
embrionário dos vertebrados, sendo por isso, de extrema relevância os estudos
direcionados aos eventos que ocorrem nos primeiros momentos de formação deste
tecido, assim como o mecanismo de ação de agentes capazes de alterar ou inibir os
mecanismos que regem a diferenciação retiniana (Kolb e cols, 2001).
Nos estudos relacionados à ontogenia ou toxicologia no tecido retiniano
diversos modelos animais são utilizados, dentre estes o modelo aviário destaca-se pela
facilidade de acompanhamento do desenvolvimento do animal, assim como pelo
tamanho da estrutura ocular, a capacidade de manutenção de células retinianas por
longo período em ambiente in vitro, além do baixo custo. Desta forma, neste trabalho
utilizamos este modelo para avaliar os fatores que regulam a diferenciação do sistema
nitrérgico durante o desenvolvimento embrionário e como a toxicidade de um
reconhecido poluente ambiental, metilmercurio, interfere na diferenciação deste tecido e
o papel do NO para o mecanismo de neurotoxicidade.
1.1. O DESENVOLVIMENTO DA RETINA DE AVES
Estudos sobre o desenvolvimento de aves demonstram que estes
organismos apresentam períodos embrionários bem caracterizados, que varia do
primeiro dia embrionário (E1) ao vigésimo primeiro dia (E21), sua organização celular
é bastante semelhante à observada nos outros vertebrados, o que valida a generalização
de inferências sobre os fenômenos embriogênicos que ocorrem nestes períodos
(Aristotle, 1942; Hamburguer & Hamilton, 1951).
Em aves, após a caracterização do eixo rostro - caudal, observa-se a
formação do tubo neural, o qual na porção anterior origina três vesículas cerebrais o
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prosencéfalo (forebrain), mesencéfalo (midbrain) e rombencéfalo (hindbrain) a partir
das quais desenvolver-se-ão diferentes componentes cerebrais, sendo o globo ocular
originado da parte posterior do prosencéfalo, o diencéfalo (Hamburguer & Hamilton,
1951).
Ao longo do desenvolvimento embrionário de aves (E3 a E7) ocorre a
invaginação da vesícula óptica primária, o que leva a formação de uma estrutura
bilaminar, a vesícula óptica secundária. A retina neural desenvolve-se a partir da
camada mais interna deste olho primordial, enquanto a camada mais externa que está
em contato com o mesênquima, formará a esclera e a coróide, originando também o
epitélio pigmentar retiniano (Hamburguer & Hamilton, 1951). Nas primeiras semanas
do desenvolvimento retiniano, observamos uma intensa atividade mitótica das células
tronco (stem cell) em toda a superfície retiniana, sendo esta atividade regulada por
fatores mitogênicos, como o fator de crescimento transformante alfa, beta 1 e beta 3
(TGF, TGF1 e TGF3) e o fator de crescimento de epiderme ( EGF) (Reh & Levine,
1998).
A atividade mitogênica na retina começa a sofrer um progressivo
processo de diminuição que se inicia na área central em E5, sendo esta diminuição
mitótica propagada para a periferia. Em E8, observamos eventos mitóticos restritos à
região marginal denominada ora serrata ( Kahn, 1973). Entre E7 e E8, a taxa de auto-
renovação as células tronco cai para menos que 50% (Dutting e cols, 1983) e
progressivamente as células deixam o período de proliferação passando à fase de
diferenciação e migração que se estende até a pós-eclosão (P) do animal.
As primeiras células a sofrerem diferenciação (E3), a partir dos
neuroblastos retinianos, são as células da camada ganglionar. As células neuroblásticas
migram para as porções mais internas da retina onde formarão a camada de células
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ganglionares já no período E7 (Meller, 1984). Os fotorreceptores começam a sofrer
diferenciação a partir de E9, tendo sua primeira resposta elétrica detectada em E13,
sendo seu desenvolvimento contínuo até o período pós-natal. A resposta elétrica a
estímulos luminosos ocorre entre E17 e P3 onde as células já se encontram na camada
nuclear externa e suas conexões na camada plexiforme externa. Depois dos
fotorreceptores iniciarem a sua diferenciação, observa-se a formação das células
amácrinas, horizontais e células bipolares respectivamente. Ao longo do período
compreendido entre E12 a P7, ocorre o completo estabelecimento do seu sistema de
neurotransmissão e posicionamento nas respectivas camadas que formam a retina (Mey
& Thanos, 2000).
Estes fenômenos celulares e histológicos são regidos por fatores de
crescimento, como o fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator neurotrófico
derivado de células ciliares (CNTF), fator de crescimento neuronal (NGF), fator
neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); ácido retinóico (RA); por elementos da
matriz extracelular (ECM) e moléculas de adesão celular conhecidas como N-CAM
(Mey & Thanos, 2000). Neurotransmissores como glutamato (Liets & Chalupa, 2001),
dopamina (Guimarães e cols, 2001) e o ácido gama aminobutírico (GABA) também
participam ativamente deste processo (Huang e cols 2000).
Dentro do conjunto de neurotransmissores que modulam o
desenvolvimento do sistema nervoso, o óxido nítrico (NO) tem mostrado um importante
papel nos processos de diferenciação celular e histológica ao longo do desenvolvimento
do sistema nervoso de vertebrados. Como no período de desenvolvimento retiniano as
sinalizações retrógradas e anterógradas desempenham um importante papel na
diferenciação do tecido adulto (Burek & Oppenheim, 1996), o NO por ser um gás
amplamente difusível, participa ativamente nestas duas vias de sinalização, podendo
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atuar como um neuromodulador ao longo do desenvolvimento do tecido (Bruning e
cols, 1994; Garthwaite, 1995).
O NO é uma molécula formada a partir do aminoácido L-arginina pela
ação da enzima óxido nítico sintase (NOS), sendo a atividade desta enzima dependente
dos níveis de NADPH. A NOS pode apresentar-se como três isoformas nos sistemas
biológicos, duas delas constitutivas e dependentes do complexo cálcio-calmodulina
(NOS-1 e NOS-3) e uma expressa somente quando induzida e independente de cálcio
(NOS-2) (Bredt & Snyder, 1994).
1.2. NEURÔNIOS QUE PRODUZEM NO AO LONGO DO
DESENVOLVIMENTO DA RETINA
Uma propriedade que permite a identificação de células NO-Sintase
positivas é a capacidade desta enzima de reduzir sais de tetrazoliuim a um composto de
cor azulada, o formazam, sendo por isso denominada genericamente de NADPH-
diaforase (Thomas & Pearse, 1964). A atividade da NO-Sintase pode ser inibida
utilizando análogos da L-arginina, como L-nitro-arginina (L-NARG) e L-nitro-arginina-
metil-éster (L-NAME) sendo estes compostos amplamente utilizados nas análises
bioquímicas e histoquímicas como controles negativos da atividade NO-Sintase
(Knowles e cols, 1989).
Paes de Carvalho e cols (1996) utilizaram este método histoquímico para
a identificação de neurônios NADPH-diaforase positivos e demonstraram que nos
primeiros períodos embrionários (E3- E8) é visualizada uma forte marcação da camada
de células ganglionares até a camada de neuroblastos retinianos. Em E12 e E14 a
marcação mostrou-se mais restrita à camada de células ganglionares e na recém formada
camada nuclear interna, principalmente as células amácrinas.
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Rios e cols (2000) demonstraram em E16 um aumento na marcação na
camada de células ganglionares, sendo neste período observada uma degeneração de
aproximadamente 20% das células presentes nesta camada (Hughes & McLoon, 1979).
A partir de E17 constatou-se uma forte marcação no segmento interno dos
fotorreceptores, em algumas células amácrinas e nas células ganglionares, sendo este
padrão mantido até o período de eclosão (Paes de Carvalho e cols, 1996).
É importante salientar que embora o óxido nítrico desempenhe um papel
significativo no desenvolvimento retiniano, diversos trabalhos demonstram que
elevadas concentrações deste composto podem desencadear processos de toxicidade no
sistema nervoso. Desta forma a ativação nitrérgica pode ser responsável como mediador
de eventos citotóxicos induzidos por agentes exógenos no tecido retiniano, o que
justifica a avaliação do comportamento daquele sistema frente à exposição a
xenobióticos que reconhecidamente afetam a fisiologia do sistema visual.
Dentre os compostos cuja principal ação biológica está relacionada a
alterações no sistema nervoso, principalmente nas funções visuais e motoras podemos
destacar o mercúrio (Hg), cujas propriedades ambientais e biológicas serão descritas a
seguir.
1.3. HISTÓRICO: MERCÚRIO E O HOMEM
Levantamentos históricos demonstram que o elemento químico mercúrio
(Hg) é utilizado pela espécie humana desde o ano 2.700 antes de Cristo. Neste período
já era conhecido sua capacidade de conjugação com o ouro, entretanto, somente após a
revolução industrial o mercúrio passou a ser utilizado como matéria prima para diversos
produtos industrializados, como na fabricação de celulose, lâmpadas e produtos
farmacêuticos. Esta utilização levou ao aumento gradativo do despejo deste metal nos
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diversos ecossistemas, sendo estimado que devido à atividade antropogênica é liberado
no ambiente cerca de 4.000 toneladas de Hg/ano (tn/ano), o que intensifica a sua
concentração nos diversos biomas (Lodenius & Malm, 1998).
O mercúrio do ambiente também pode ser de origem natural como
conseqüência de emissões do córtex terrestre (3.000tn/ano) e de eventuais erupções
vulcânicas (36.880tn/ano), sendo que este mercúrio, assim como o de origem
antropogênica, precipita-se nos ambientes de águas doces (200tn/ano) e de águas
oceânicas (1.000tn/ano), o que pode levar a contaminação da fauna e da flora (Lindströn
e cols, 1991).
Os problemas relacionados a ação antropogênica do mercúrio no meio
ambiente, assim como a sua interação com a espécie humana, se intensificaram a partir
das décadas de 50 e 60, quando foi relatada a morte de cerca de quarenta e oito pessoas
da cidade de Minamata no Japão, devido a ingestão de peixes intoxicados com
mercúrio. Estudos posteriores demonstraram que este metal apresenta uma intensa
capacidade de acúmulo biológico e nos ecossistemas marinhos peixes podem armazenar
grandes quantidades de mercúrio e promover fenômenos de intoxicação nos indivíduos
que os consomem (Cossa, 1996). A introdução do mercúrio no ambiente marinho,
promove o acúmulo deste metal nos diversos níveis tróficos da cadeia alimentar, onde
organismos que ocupam níveis mais elevados tendem a apresentar maior concentração
de mercúrio em sua constituição (Wren, 1986). No caso de Minamata, a quantidade de
mercúrio por unidade de peso dos peixes superava mil vezes a concentração de
mercúrio presente na água (Cossa, 1996).
Uma característica importante do mercúrio no ambiente é a capacidade
de apresentar-se em uma ampla variedade de formas químicas, podendo estas ser
inorgânicas ou organometálicas, sendo característico fenômenos de interconversão entre
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estas formas. Jansen & Jernelöv (1969) demonstraram que o mercúrio inorgânico pode
ser convertido a mercúrio orgânico pela ação de bactérias presentes no ambiente
aquático.
Estas observações foram importantes para a caracterização do ciclo do
mercúrio no ambiente (Figura 2). A origem antropogênica ou natural é emitido na forma
de vapor de mercúrio (Hg°) e posteriormente convertido para forma iônica de Hg+2
(solúvel em água). Essa forma é rapidamente arrastada pelo vento e pela chuva
chegando aos rios e oceanos. No ambiente aquático o mercúrio pode ser novamente
reduzido para a forma Hg° e ser devolvido a atmosfera, ou pode incorporar-se ao
sedimento aquático ficando na forma inativa de cinábrio (HgS).
Uma via alternativa no ciclo biogeoquímico do mercúrio no ambiente
ocorre quando a forma solúvel sofre um processo de metilação, tal processo é mediado
pela ação de bactérias anaeróbias sulforredutoras, culminando na formação de um
composto bastante estável denominado de metilmercúrio (Jansen & Jernelöv, 1969).
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Figura 2: Ciclo do mercúrio no meio ambiente (modificado de Wasserman, e cols
2002)
Sedimento
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O metilmercúrio (MeHg), assim como o dimetilmercúrio (Me2Hg),
correspondem as formas que predominantemente são incorporadas na cadeia alimentar,
principalmente devido a sua capacidade de penetração e acúmulo nos sistemas
biológicos (EPA, 1980). A meia vida biológica do MeHg é de aproximadamente dois a
três anos, esta propriedade é responsável pelos níveis elevados de MeHg observados em
peixes carnívoros que são consumidos continuamente pela população, o que amplia os
riscos de intoxicação por este metal pesado ( WHO, 1991).
A intoxicação pelo MeHg se dá predominantemente a partir da dieta e
dependendo dos níveis de contaminação do ambiente a exposição pode ocorrer pelas
vias aéreas ou pelo consumo de água. O consumo de peixes intoxicados representa a
principal fonte de entrada do MeHg nos seres humanos (WHO, 1990). A Organização
Mundial de Saúde (WHO, 1989) estabeleceu que o valor máximo de consumo humano
admissível é de 0,5g de mercúrio por grama de peixe por dia e para exposições a
vapores o limite é de 0,05mg de mercúrio/m3.
No que concerne à região amazônica, esta se tornou alvo de grandes
eventos de contaminação pelo mercúrio, principalmente a partir dos processos
desordenados de extrativismo mineral que se iniciaram nesta região nas décadas de 70 e
80.
O mercúrio foi amplamente utilizado nos processos de exploração e
aproveitamento do ouro (garimpagem), onde aquele foi comumente adicionado ao ouro
por processos gavimétricos para separá-lo dos outros minerais. O excesso de mercúrio
deste processamento é liberado por procedimentos de lavagens ou por evaporação,
fazendo que o mercúrio entre em contato direto com o ambiente, favorecendo o
fenômeno de biotransformação na água e a sua dispersão na atmosfera ( Fernandes,
1989).
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O mercúrio ao se estabelecer no ambiente aquático, principalmente na
forma de MeHg, passa a representar um grande risco para a população ribeirinha local,
visto que a principal fonte nutritiva protéica se dá pelo consumo de peixes presentes
neste ecossistema (Harada e cols, 2001; Pinheiro e cols, 2005)
Análises feitas em amostras de cabelo da população ribeirinha da região
amazônica têm demonstrado claras diferenças de concentrações entre os indivíduos
analisados, sendo maior os valores encontrados naqueles que se alimentam de peixes
carnívoros (Eve e cols, 1996). Outros resultados obtidos de pessoas expostas ao MeHg
que vivem a margem do Rio Negro-AM, não demonstraram diferença significativa na
quantidade de mercúrio presente no cabelo de crianças e adultos submetidos a mesma
dieta, no entanto, o fenômeno de exposição sazonal ao mercúrio nesta região mostrou
que homens apresentam sempre maiores concentrações que as mulheres (Barbosa e cols,
2001).
Em algumas áreas da região amazônica, estimou-se uma ingestão diária
na ordem de 100g de MeHg/dia, uma quantidade muito maior que o limite máximo
recomendado pela organização mundial de saúde (WHO, 1989). Apesar deste intenso
processo de ingestão, nenhum caso claro de sintomas semelhantes aos observados nos
indivíduos de Minamata foi descrito na região amazônica, contudo, Lebel e cols (1998),
demonstraram alterações neurológicas em indivíduos que foram intoxicados com MeHg
nesta região, sendo estas alterações proporcionais às concentrações de MeHg presentes
no cabelo dos indivíduos ( >50g/g ).
Todas estas observações justificam os estudos relacionados à intoxicação
mercurial em nossa região, visto que, devido o seu poder bioacumulativo e tóxico a
presença deste elemento nos ecossistemas amazônicos, em médio e longo prazo, pode
tornar-se um problema de saúde pública, fazendo-se importante as análises voltadas à
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elucidação dos mecanismos de toxicidade causada por este metal, assim como, aos
possíveis mecanismos de proteção contra sua ação tóxica.
1.4. METILMERCÚRIO E O SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1.4.1 Absorção e Incorporação
A intoxicação começa pela ingestão de peixes ou outros alimentos
contaminados com MeHg que penetra no trato gastrointestinal, onde é facilmente
absorvido devido a sua solubilidade em lipídeos. Na corrente sangüínea o mercúrio é
amplamente distribuído para os diversos tecidos, sendo que em humanos esta
distribuição ocorre após poucos dias de ingestão (WHO, 1990).
É bem descrito o poder de associação do MeHg a moléculas que contém
grupamentos sulfidrila (-SH), esta propriedade faz do MeHg um composto com alta
afinidade por proteínas, peptídeos e aminoácidos. Um fenômeno relacionado a esta
característica é a sua forte associação com a glutationa (GSH) e o aminoácido L-cisteína
presentes no sangue e em diversos outros tecidos, este processo intensifica o transporte
do MeHg através da barreira hemato-encefálica para o sistema nervoso central (SNC).
Uma vez no SNC, o mercúrio pode se dissociar destes compostos e ali se acumular em
grandes quantidades (Aschner e cols, 1990a; Aschner e cols 1990b). Mottet e cols
(1994) descreveram que o MeHg no SNC sofre um gradual processo de demetilação
transformando-se em mercúrio inorgânico (I-Hg) que é pouco solúvel, o que favorece o
seu acúmulo dentro das células do SNC. O mecanismo que promove este processo de
demetilação parece ser não enzimático e dependente de cádmio (Cd), sendo pouco
conhecidos os mecanismos moleculares que regem o regem. Animais tratados
previamente com as formas orgânicas do mercúrio (MeHg e Me2Hg) apresentam lesões
irreversíveis no SNC, estes efeitos foram observados poucos dias após a intoxicação
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(Chang, 1977). O grau de neurotoxicidade do MeHg depende da dose a qual o indivíduo
é exposto, assim como do tempo de exposição (Hewett & Atchison, 1991).
Análise em animais intoxicados com MeHg mostram que este composto
exerce maior neurotoxicidade nos sistemas motor e visual, sendo o cerebelo e a retina
alvos potenciais de ação de MeHg (Mottet e cols, 1994; Goto e cols, 2001). Os
mecanismos celulares relacionados a estes fenômenos neurotóxicos ainda não estão bem
esclarecidos, no entanto, vários eventos celulares e moleculares são descritos a partir de
modelos experimentais de intoxicação com MeHg.
1.4.2. O Mercúrio e o Sistema Visual
Como citado anteriormente, alterações motoras representam importantes
características em eventos de intoxicação com mercúrio, da mesma forma que estruturas
cerebrais envolvidas na atividade motora, como o cerebelo e o estriado acumulam
grandes quantidades de mercúrio em indivíduos intoxicados (Feng e cols, 2004). É
importante salientar que embora a toxicidade nestas estruturas neurais sejam bem
descritos, os mecanismos responsáveis por este acúmulo ainda não estão totalmente
elucidados.
Dentro deste contexto, uma série de trabalhos descreve que outras
regiões do sistema nervoso central, como a retina, têm a propriedade de acumular
mercúrio quando intoxicados (Warfvinge & Boom, 1996; 2000 ). Associado a estas
observações, Urban e cols (2003) demonstraram que indivíduos expostos a níveis
mercúrio, que estão abaixo do estipulado pela organização mundial de saúde,
apresentam significativos déficits no processo de discriminação de cor, sendo este
fenômeno diretamente proporcional à dose de mercúrio o qual foram expostos. A
ratificação destes achados foi observada a partir dos resultados produzidos por Ventura
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e cols (2004) que utilizaram análises por eletroretinografia multifocal. Neste trabalho os
autores demonstraram alterações visuais após fenômenos de exposição ocupacional ao
mercúrio, estas alterações sugerem que a retina representa um importante alvo da
toxicidade induzida pelo mercúrio no sistema nervoso central.
Uma outra importante característica da relação entre o mercúrio e o
sistema nervoso é a maior sensibilidade deste no período que compreende o seu
desenvolvimento (Sanfeliu e cols, 2003). No que concerne à retina, trabalhos anteriores
mostraram que alterações visuais em crianças poderiam estar associadas à intoxicação
pré-natal com mercúrio, entretanto estas alterações ainda são fruto de especulação
(Altmann e cols, 1998). Warfvinge & Bruun (2000) utilizaram primatas não humanos
como modelo experimental, para verificar um grande acúmulo de mercúrio no tecido
retiniano em indivíduos expostos durante o período pré-natal. Neste mesmo trabalho os
autores demonstraram que o processo de eliminação do mercúrio na retina em
desenvolvimento é maior do que o observado em retinas mais diferenciadas, entretanto
esta observação não descarta um possível efeito patológico deste metal na ontogênia do
tecido retiniano, como já demonstrado em outros trabalhos. De fato, se alterações
visuais estão associadas à exposição pré-natal ao mercúrio. Desta forma, é de grande
relevância que se orientem estudos voltados à caracterização dos mecanismos de ação
no tecido retiniano frente à exposição ao mercúrio, uma vez que na literatura poucos
trabalhos fazem alusão aos mecanismos moleculares que regem a toxicidade do
mercúrio neste tecido.
1.4.3. Ação nos Principais Sistemas de Neurotransmissão
Os fenômenos de biodistribuição e acúmulo do mercúrio no sistema
nervoso fazem com que este metal influencie na homeostasia de diversos sistemas de
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neurotransmissão, tal processo acentua significativamente os efeitos danosos induzidos
pelo mercúrio, justificando desta forma os estudos sobre o efeito do mercúrio no
sistema de neurotransmissão específico que gerencia as diferentes regiões do sistema
nervoso.
1.4.3.1. Sistema Colinérgico
Os efeitos do mercúrio no sistema colinérgico estão intimamente
relacionados a um dos principais sintomas observados em indivíduos intoxicados com
aquele metal, a perda do controle motor. De fato os estudos de Kobayashi e cols (1981)
demonstraram que camundongos intoxicados com diferentes concentrações de
metilmercúrio apresentavam diminuição significativa da atividade motora, sendo os
efeitos comportamentais semelhantes aqueles observados em camundongos tratados
com drogas que inibem a atividade da acetilcolinesterase, enzima responsável pela
síntese de acetilcolina. É importante salientar que este trabalho complementa outros
trabalhos realizados pelo mesmo grupo. Em modelos in vitro, estes autores
demonstraram que tratamento com metilmercúrio em células cerebelares promovia uma
diminuição significativa da captação de colina, um dos substratos para síntese da
acetilcolina (Kobayashi e cols, 1979).
De fato, estudos posteriores demonstraram que além do reconhecido
efeito do mercúrio na síntese de acetilcolina, este metal tem a propriedade de inibir a
atividade de receptores muscarínicos no sistema nervoso central e em linfócitos. Neste
mesmo trabalho também foi demonstrado que ocorria uma regulação positiva para a
expressão dos receptores muscarínicos. Coccini e cols, 2000, sugeriram que esta
regulação positiva poderia estar relacionada à depleção de acetilcolina como
demonstrado anteriormente nos trabalhos de Kobayashi.
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1.4.3.2. Sistema GABAérgico
O ácido gamaaminobutírico (GABA) representa no SNC um dos
principais neurotrasmissores inibitório, já que a estimulação dos receptores
GABAérgicos está associada ao influxo de íons cloreto (Cl-). Este processo promove
hiperpolarização da célula estimulada, dificultando assim o disparo do potencial de ação
(Mody e cols, 1994). Uma série de estudos descreve que alterações no sistema
GABAérgico pode está associada a quadros clínicos de epilepsia e esquizofrenia,
sugerindo que este neurotransmissor tem importante papel no controle das funções
cognitivas (Bausch, 2005).
Um dos estudos pioneiros sobre o efeito do mercúrio no funcionamento
da sinapse GABAérgica demonstrou que no córtex de ratos intoxicados ocorre uma
diminuição no sistema de captação de GABA (Araki e cols, 1981; O'Kusky and
McGeer, 1989). Yuan and Atchison (1997) relatam que a intoxicação com
metilmercúrio induz o bloqueio da estimulação por GABA no hipocampo de ratos,
favorecendo assim um hiper estímulo nestas regiões. Estes resultados forma
confirmados pelo trabalho de Fonfria e cols (2001), que utilizaram o modelo de cultura
de células para demonstrarem que o metilmercúrio pode interagir com grupamentos
sulfidrilas dos resíduos de cisteína presentes nos receptores GABAérgicos;
promovendo a alquilação destes últimos com conseqüente disfunção. Estes efeitos
induzidos pela intoxicação mercurial podem estar associados aos danos cognitivos
observados em indivíduos expostos ao mercúrio, embora estudos mais elaborados sejam
necessários para confirmar esta hipótese.
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1.4.3.3. Sistema Dopaminérgico
O sistema dopaminérgico de modo geral parece estar fundamentalmente
relacionado aos sistemas motor e cognitivo, esta observação é sustentada por trabalhos
que demonstram a relação entre a perda do controle motor e alterações de
comportamento, observadas em doenças neurodegerativas como a doença de Parkinson,
com a morte ou disfunção de neurônios dopaminérgicos no sistema nigro-estriatal
(Moore e cols, 2005). Em eventos de intoxicação com mercúrio a perda motora e
cognitiva são sintomas característicos. Trabalhos como de Cuomo e cols (1984) foram
os primeiros a associar estes déficits induzidos pela intoxicação mercurial com
alterações no sistema dopaminérgico. Posteriormente Rajanna e cols (1985)
demonstraram que a intoxicação mercurial promove diminuição da captação de
dopamina em ratos, este efeito parece relacionado à diminuição da atividade da Na+/K+
ATPase.
Assim como alterações no padrão normal de captação de dopamina,
outros trabalhos demonstraram in vitro que o mercúrio promove aumento da liberação
de dopamina no SNC (Kalisch e cols, 1996). Em modelo de intoxicação in vivo, Faro e
cols (1997) ratificaram estes resultados e demonstraram que além do aumento da
liberação de dopamina, em um fenômeno independente de Ca+, a exposição mercurial
também induz um aumento na fenda sináptica dos principais produtos do metabolismo
da dopamina o ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovalínico (HVA).
Este mesmo grupo propôs que alterações na atividade do transportador dopaminérgico,
induzidas pelo mercúrio e ativação de receptores glutamatérgicos, representam um
importante mecanismo de indução da liberação de dopamina nos animais intoxicados
(Faro e cols, 2000; 2002a, 2002b).
23
Na retina pouco é conhecido sobre a ação especifica da dopamina,
entretanto é sabido que ela exerce, assim como muitos neurotransmissores, um papel
importante na via de processamento da informação visual (Masson e cols, 1993).
Baseado nisso o trabalho eletrofisiológico de Herba e cols (2004) demonstraram que a
intoxicação mercurial alterava o papel da dopamina no controle das respostas celulares,
podendo este efeito estar relacionado a uma possível alteração dos receptores
dopaminérgicos presentes na retina.
1.4.3.4.Sistemas Glutamatérgico e Nitrérgico
O glutamato é o principal neurotransmissor no SNC e sua concentração
neste tecido é muito maior que a observada em outros tecidos. O glutamato é
encontrado em baixa concentração no meio extracelular em relação ao meio intracelular,
sendo este fenômeno mais evidente nos terminais nervosos (Danbolt, 2001).
Nas células do sistema nervoso, o glutamato provém principalmente da
glicose, do ciclo de Krebs ou da glutamina (ciclo glutamato-glutamina) uma vez que o
mesmo não apresenta a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica
(Westergaard et al., 1995). De modo semelhante a outros neurotransmissores, o
glutamato é armazenado em vesículas sinápticas e liberado por exocitose em um
processo dependente de Ca+2 (Augustine et al., 1996). Uma vez no meio extracelular,
este aminoácido pode ser captado pelos neurônios pré-sinápticos, pós-sinápticos e,
principalmente pelas células gliais.
Na célula da glia, o glutamato captado é convertido em glutamina pela
ação da enzima glutamina sintetase, e uma vez liberada no meio extracelular, a
glutamina é captada pelos neurônios, para ser então reconvertida a de glutamato,
24
sendo este fenômeno mediado pela ação enzimática da glutaminase (Ottersen, 1996)
(Figura 3).
O glutamato desempenha importante papel em diversos processos
fisiológicos, tais como, na transmissão sináptica e na plasticidade neuronal envolvida
em processos cognitivos relacionados à memória e aprendizado. O glutamato também
desempenha importante papel nos processos relacionados ao desenvolvimento do
sistema nervoso central, como na indução sináptica (Quinlan, 1999), migração (Rossi &
Slater, 1993), diferenciação e morte celular (Rabachi, 1992).
As principais vias eferentes e aferentes corticais utilizam o glutamato
como neurotransmissor, assim como os numerosos circuitos excitatórios locais no
córtex, hipocampo, cerebelo e retina (Miller & Slaughter, 1986; Salt & Herrling, 1991).
A ação glutamatérgica é atribuída a sua capacidade de ativar uma
variedade de proteínas receptoras localizadas na membrana plasmática dos neurônios
pós-sinápticos. Estas proteínas foram classificadas como receptores ionotrópicos e
metabotrópicos, sendo aqueles ionotrópicos passivos de ativação pelo N-metil-D-
aspartato denominados tipo NMDA. Os receptores ionotrópicos passivos de ativação
pelo ácido propiônico--amino-4-hidroxi-5-metil-4-isoxazol] (AMPA) ou ao ácido
caínico são denominados receptores tipo AMPA e Cainato respectivamente.
É importante salientar a existência de oito tipos de receptores
glutamatérgicos chamados metabotrópicos pois estão associados a proteína G, sendo
estes do tipo mGluR1 à mGluR8 (Conn & Pin, 1997; Ozawa et al., 1998; Yang,
2004).
25
Figura 3: Representação do ciclo glutamato-glutamina responsável pelo metabolismo
do neurotransmissor glutamato no sistema nervoso central. Fonte: Danbolt, 2001.
Glutamato
Glutamato
Glutamina
Glutamina sintetase
Glutamina
Glutamato Glutaminase
Glutamina
Célula Glial
Neurônio
26
No tecido retiniano o glutamato é armazenado e liberado pelas células
fotorreceptoras, bipolares, amácrinas e ganglionares, apresentando-se como o principal
neurotransmissor excitatório responsável pelo processo de fototransdução (Kalloniatis
& Napper, 1996). Na camada externa da retina, os fotorreceptores liberam
continuamente glutamato, sendo essa liberação modulada pela emissão de luz. No meio
extracelular, o glutamato ativa diferentes receptores glutamatérgicos expressos na
membrana das células bipolares e horizontais. Na camada plexiforme interna, o
glutamato é liberado por dois tipos de células bipolares: células bipolares-ON, que
liberam o neurotransmissor na presença de luminosidade e células bipolares-OFF, que
liberam o glutamato no escuro. As células amácrinas e ganglionares são alvos da
liberação de glutamato pela camada plexiforme interna (Copenhagen & Jahr, 1989;
Rauen et al., 1996) (Figura 1).
Na retina e nas demais regiões do SNC, os receptores glutamatérgicos
são responsáveis pela transmissão sináptica excitatória rápida, estando envolvidos em
eventos adaptativos e fisiopatológicos como plasticidade neuronal e excitotoxicidade
(Ozawa et al., 1998). De fato esta ultima propriedade da ação glutamatérgica está
fortemente associada à hiper-estimulação de receptores ionotrópicos de glutamato.
A excessiva ativação dos receptores de membrana levaria a
despolarização prolongada da célula neuronal, sendo este fenômeno relacionado ao
constante in fluxo de íons positivos como o Ca+2 e Na+. A despolarização se iniciaria
com a ativação de receptores AMPA com subseqüente ativação dos canais de sódio
dependentes de voltagem. No entanto, quando a célula torna-se permanentemente
despolarizada, os receptores NMDA são desbloqueados com a liberação do magnésio
27
(Mg+2), ficando, assim, disponíveis para ativação (Yang, 2004). Os receptores NMDA
apresentam-se como os principais responsáveis pela entrada de cálcio na célula.
O aumento da concentração interna de íons como o Ca+2 do neurônio
ativa permanentemente, uma cadeia de eventos bioquímicos potencialmente destrutivos
que poderiam resultar em morte neuronal. Os principais eventos envolvidos na
neurotoxicidade incluem: o aumento da liberação de glutamato; a ativação de proteases,
lipases e cinases que causam lesões na membrana; estimulação de cascatas
inflamatórias; ativação gênica e ativação da enzima óxido nítrico sintase (NOS)
responsável pela produção do radical livre óxido nítrico (NO) (Trotti, 1998) (Figura 4).
28
Figura 4: Efeitos excitotóxicos do glutamato no sistema nervoso central desencadeado
pelo aumento da concentração intracelular de cálcio (Ca++). Fonte: Doble, 1999.
cinas
Dano mitocondrial
Dano na membrana
Dano nuclear
Peroxidação lipídica
Radicais Livres
Perda de Energia
despolarização
Receptor NMDA
Receptor AMPA
Canal de Sódio dependente de
Voltagem
Canal de Cálcio dependente de
Voltagem
29
1.4.3.5.Sistema Nitrérgico
O mecanismo pelo qual o MeHg altera a atividade da NO-Sintase
provavelmente ocorre pela estimulação dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA,
o que elevaria os níveis intracelulares de cálcio, com a conseqüente estimulação da NO-
Sintase via o complexo Ca+2-calmodulina. Shinyashiki e cols (1998) demonstraram que
no cerebelo de ratos intoxicados com MeHg há um aumento na atividade da NO-
Sintase, assim como dos principais produtos do metabolismo do NO, nitrito e nitrato
(NO2-/NO3
-). Estes resultados sugerem que a neurotoxicidade causada pelo MeHg no
cerebelo pode estar relacionada com a produção de NO em virtude do aumento da
atividade da NO-Sintase no córtex e no cerebelo. A intoxicação com MeHg aumenta a
atividade da NO-Sintase sem alterar os mecanismos pré-transcripcionais de nenhuma
das suas isoformas (Himi, e cols 1996; Yamashita e cols 1997)..
Estes mecanismos de ação do MeHg sob a atividade da NO-Sintase são
bem esclarecidos nas regiões corticais e cerebelares, no entanto, não é bem claro se
estes eventos celulares, assim como os outros descritos anteriormente ocorrem em
outras regiões do sistema nervoso como na retina.
Como descrito acima a excitoxicidade induzida pelo excessivo estímulo
de receptores glutamatérgicos pode estar associada à ativação de diferentes vias, desta
forma o mercúrio pode induzir indiretamente diferentes mecanismos de
excitotoxicidade nas diferentes regiões do SNC. Em cada caso, é importante a
caracterização do mecanismo de toxicidade do mercúrio. Estudos na retina são de
grande importância e podem servir de subsídios para prevenção e tratamento, tendo em
vista que alterações visuais são comuns em indivíduos expostos ao mercúrio em
períodos pré ou pós-natais. Como o sistema nitrérgico apresenta-se como um
protagonista, tantos em eventos relacionados ao desenvolvimento retinianao, quanto em
30
mecanismos de toxicidade, torna-se interessante avaliar a relação entre a toxicidade
induzida pelo mercúrio com a ativação nitrérgica nas células retinianas.
1.5. RESISTÊNCIA CELULAR AO MeHg
Os processos patológicos e bioquímicos causados pelo MeHg são
amplamente estudados a partir do momento que este composto apresentou-se como um
importante agente neurotóxico. Outro importante ponto a ser abordado são os
mecanismos de defesa que a maquinaria celular apresenta contra o estresse causado pelo
mercúrio. Estas estratégias podem ser agrupadas dentro de três categorias gerais: (1)
modificações químicas do mercúrio para neutralizar sua toxicidade, (2) excreção por um
transporte ativo minimizando sua concentração ou (3) modificação ou expressão de
proteínas que minimizem o estresse oxidativo causado por este metal.
Uma forma elegante de proteção é adotada por bactérias que vivem em
ambientes com grandes concentrações de mercúrio. Estes organismos são dotados de
famílias gênicas organizadas em operons, ou seja, genes codificam proteínas que atuam
em uma mesma via metabólica (Figura 5).
Quando o mercúrio penetra nestas células ele é rapidamente conjugado a
uma proteína denominada de merR, sendo que esta proteína, associada com o mercúrio,
ativa a região promotora de outros cincos genes que se encontram lado a lado no
cromossomo bacteriano ( merP, merT, merA, merD e merB). A partir de sua expressão,
a proteína merP é transportada para o espaço periplasmático e conjuga-se ao mercúrio
presente neste local; uma vez conjugada, esta proteína transfere este mercúrio para uma
31
proteína transportadora (merT) que transporta o mercúrio para o citoplasma da célula.
No citoplasma, este mercúrio sofre a ação da proteína merB, que retira grupamentos
alkil (metil, etil), promovendo a formação da forma inorgânica de mercúrio (Hg+2),
sendo este utilizado pela proteína mercúrio redutase (merA) que reduz a forma
inorgânica para forma de Hg°. Esta forma caracteriza-se por ser extremamente volátil, o
que promove sua saída da célula (Sarafian e cols, 1996). A introdução deste conjunto de
genes em algas é bastante utilizado em processos de descontaminação de ambientes cuja
concentração de mercúrio é elevada. (Bizily e cols, 1999).
32
Figura 5: Ativação e regulação do operon Mer em bactérias ( Modificado de Serafian e
cols, 1996).
MeHg
Mer R Mer T Mer P Mer A Mer D Mer B RP
MER R
MeH MER B
MeH
Hg+2
MER A
Hg0
MER T
MeHg MeHg
MeHg MER P
DNA
Citoplasma
MP
Periplasma
Extracelular
33
Organismos eucariotos não dispõem deste coordenado mecanismo de
proteção contra o mercúrio, com isso, uma estratégia alternativa é a utilização das
chamadas metalotioneínas (Figura 6A) que correspondem a proteínas de baixo peso
molecular e ricas em grupamentos de cisteína (Hemer, 1986). Estas proteínas ligam-se
fortemente a metais pesados e a radicais livres, equilibrando com isso o ambiente
celular e diminuindo os efeitos neurotóxicos destes compostos. Rising e cols (1995)
demonstraram que astrócitos em cultura expressam metalotioneínas após intoxicação
com mercúrio e cádmio, sendo que esta expressão diminui a ação tóxica causada por
estes metais. Existem três isoformas conhecidas de metalotioneínas, sendo todas elas
expressas no SNC (Bauman & Klassen, 1993, Stankovic e cols, 2003). Apesar das
metalotioneínas representarem um importante mecanismo de defesa celular contra a
ação de metais pesados, o principal mecanismo que a célula eucariótica utiliza para este
fim é a glutationa (Meister, 1994).
1.6. O SISTEMA GSH
A Glutationa é um tripeptídeo (-glutamicilcisteinilglicina) que é
sintetizado em dois passos bioquímicos, o primeiro pela ação da -glutamicilcisteína
sintetase, que promove a ligação entre cisteína e glutamato, formando -
glutamicilcisteína (-GluCys), e um segundo que é catalisado pela ação da glutationa
sintetase, que une a este dipeptídeo o aminoácido glicina formando a glutationa (-
glutamicilcisteínaglicina) (Figura 6B).
34
No SNC, a síntese de glutationa é dependente dos níveis de cisteína
presentes no meio (Figura 7). Outros estudos também demonstraram que a síntese de
glutationa em neurônios é em sua grande maioria dependente da síntese do precursor -
glutamicilcisteína por astócitos, sendo este captado pelo neurônio onde ocorre o passo
final para formação do tripeptídeo (-glutamicilcisteínaglicina) (Bannai e cols, 1984,
Patrick, 2002). A partir de sua síntese podemos encontrar a glutationa no meio
intracelular na sua forma oxidada (GSSG) ou na sua forma reduzida (GSH) como
mostrado na figura 3B e 3C, sendo a conversão de GSSG a GSH catalisada pela enzima
glutationa redutase (GR). Uma outra enzima relacionada com a formação de glutationa,
a glutationa peroxidase (GPx), atua no SNC como o principal agente de transformação
do superóxido de hidrogênio (H2O2) em água, sendo esta atividade depende da
quantidade de GSH no meio. Neste processo a forma GSH é transformada em GSSG.
35
Figura 6: Representação da metalotioneína em A, sendo mostrado no centro colorido a
região rica em grupamentos cisteína. Em B e C temos representado a forma de
Glutationa reduzida e glutationa oxidada respectivamente.
C
A B
36
Figura 7: Participação das células neuronais e gliais no metabolismo da glutationa
(GSH). Fonte: Dringen, 2000.
Célula da Glia Neurônio
37
Todas estas considerações sobre sistema GSH demonstram que seu
funcionamento é fundamental para a manutenção da homeostasia celular, desta forma é
importante o conhecimento do papel dos principais transportadores em células
neuronais e gliais que promovem a síntese de GSH assim como sua relação com o
sistema glutamatérgico.
No SNC, o transporte de glutamato é realizado, principalmente, pelos
transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs), no entanto, outros mecanismos
pelos quais pode ocorrer a entrada de glutamato na célula já estão sendo descritos. Uma
grande variedade de transportadores transmembrana foram identificados e
caracterizados pelos diferentes sistemas que os mesmos utilizam para realizar o
transporte de diversos aminoácidos. Esses sistemas, por sua vez diferenciam-se pela
dependência ou não a determinados íons.
Todos os cincos transportadores de glutamato citados anteriormente são
conhecidos como transportadores sódio-dependente de alta-afinidade (Bridges et al.,
2005). Essas proteínas transmembrana realizam a captação de aminoácidos
dicarboxilados, como glutamato e aspartato por um sistema denominado de XAG-,
caracterizado como o principal responsável pelo transporte de glutamato no sistema
nervoso central (Danbolt, 2001). Por esse sistema também são transportados
aminoácidos como a cisteína e cistina (Bukowski et al., 1995; Knickelbein et al., 1997).
Um outro mecanismo para transporte de aminoácidos neutros foi descrito
e apresenta-se, também, como um transportador dependente de Na+. Por esse sistema,
conhecido como ASC (ASCT1 e ASCT2), são transportados, preferencialmente,
aminoácidos como a serina, alanina, treonina e cisteína. Esse transportador pode realizar
a captação de glutamato na sua forma neutra, apesar de apresentar baixa afinidade por
esse substrato (Utsunomiya-Tate et al., 1996). Bannai (1986) descreveu um mecanismo
38
de transporte do aminoácido cistina, em fibroblastos humanos que é feito independente
de íons, apenas com a atividade de um canal de cloreto. Por esse sistema, o transporte
de cistina é acoplado a saída de uma molécula de glutamato, e devido a esta
característica, alguns autores o denominam de “trocador glutamato-cistina”. Esse
transportador apresenta afinidade por substratos como L-homocisteato, L--
aminoadípico e quisqualato (McBean, 2002).
Esse modelo de transporte, denominado de sistema XCG-, também, foi
descrito em hepatócitos, células alveolares do tipo II, macrófagos peritoniais e células
endoteliais humanas (Ishii et al., 1992). No SNC, o sistema XCG- foi identificado em
culturas primárias de neurônios (Sagara et al., 1993) e astrócitos (Allen et al., 2001;
Gochenauer & Robinson, 2001), células de glioma C6 (Cho & Bannai, 1990), gliomas
humanos (Ye et al., 1999) e microglia (Piani & Fontana, 1994).
O transporte de cistina para dentro da célula, tanto pelo mecanismo
dependente de sódio como pelo independente de sódio é, particularmente importante,
uma vez que a cistina captada é convertida em duas moléculas de cisteína, o principal
aminoácido precursor da molécula de glutationa (Bender et al., 2000).
Estudos in vivo e in vitro demonstraram que os níveis de glutationa são
maiores nos astrócitos que nos neurônios, variando, ainda, em função da região do
sistema nervoso a ser estudada (Langeveld et al., 1996; Cooper et al., 1997).
Normalmente, a taxa de liberação da glutationa pelas células gliais depende da sua
concentração intracelular e segue, aparentemente, a cinética de Michaelis-Menten
(Dringen et al., 2000). Simultaneamente a sua liberação, a glutationa é resintetizada na
tentativa de compensar a quantidade liberada e de manter constante a sua concentração
intracelular. Cho & Bannai (1990) mostraram que em células de glioma C6, a cistina
utilizada para a formação de glutationa é obtida, principalmente, a partir de seu
39
transporte pelo sistema XCG-. No entanto, ainda não está claro qual dos sistemas, XAG
-
ou XCG-, é o principal responsável pelos níveis de glutationa no SNC (McBean, 2002).
Os severos danos resultantes do intenso processo de estresse oxidativo
acometem diversas regiões do SNC, entre elas, o tecido retiniano, um dos constituintes
do sistema visual. A retina apresenta uma série de características que a torna,
especialmente, vulnerável a essa condição, como: a elevada taxa de consumo de
oxigênio, alta concentração de ácidos graxos poliinsaturados na camada de células
fotorreceptoras e constante exposição à luminosidade responsável pela peroxidação
lipídica. Processos isquêmicos, muito comuns nesse tecido, podem ainda contribuir para
condições de estresse oxidativo (Huster et al., 2000).
O sistema GSH constitui o principal mecanismo de defesa celular da
retina frente a processos oxidativos, portanto, defeitos no metabolismo desse
antioxidante podem ser prejudiciais para o tecido retiniano (Schütte & Werner, 1998;
Drigen et al., 1999). No entanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos responsáveis
pela síntese e liberação de GSH pelas células gliais de Müller na retina; e do possível
envolvimento dos sistemas XCG- e XAG
- nesses processos, assim como se eventos de
intoxicação mercurial afetam o funcionamento destes sistemas.
Todos estes fenômenos bioquímicos que envolvem a GSH são
importantes na prevenção contra processos de estresse oxidativo que geralmente são
produzidos frente à intoxicação com metais pesados (Sarafian e cols, 1996).
Fisiologicamente quando há intoxicação por metais pesados, como MeHg, a glutationa
na sua forma reduzida atua inicialmente conjugando-se com este metal, por meio do seu
resíduo de cisteína, facilitando o transporte do mercúrio para fora da célula. A GSH
também tem a propriedade de ligar-se a radicais livres e promover a manutenção dos
grupamentos - SH das proteínas. Este tripeptídeo representa um importante marcador de
40
eventos de estresse oxidativo, assim como de intoxicação por metais pesados, sendo que
a debilitação deste sistema implica em uma maior predisposição a fenômenos de
neurotoxicidade, com isso, torna-se importante nos estudos relacionados à intoxicação
com MeHg a avaliação dos níveis de glutationa presentes antes e depois do evento
tóxico (Dringen, 2000).
A toxicidade causada pelo MeHg no SNC, principalmente durante o
período de desenvolvimento, justifica os estudos relacionados aos mecanismos celulares
que regem sua ação em sítios nervosos como a retina (Clarkson, e cols, 1997). Um dos
principais alvos da neurotoxicidade causada pelo mercúrio, como citado anteriormente,
é o sistema visual e apesar da variedade de estudos relacionados à toxicidade deste
elemento em outras regiões do sistema nervoso, pouco é conhecido sobre a ação do
mercúrio nas células que compõem a retina.
Dentro deste contexto, utilizaremos um modelo de estudo in vitro para
avaliar alguns fenômenos celulares e moleculares, como alterações nos sistemas
nitrérgico, glutamatérgico e de GSH, que podem estar envolvidos na neurotoxicidade
causada pelo MeHg nas células de retina, já que culturas celulares de retina nos
possibilitam visualizar com bastante clareza as respostas celulares frente a intoxicação
sem que haja a interferência de outros fatores externos presentes nos modelos in vivo.
É importante salientar que para relacionar a ativação nitrérgica com a
toxicologia do mercúrio nas células de retina em cultura, é necessário caracterizar
inicialmente em que momento do desenvolvimento in vitro este sistema apresenta-se
estabelecido, pois como citado anterirmente o sistema nitrérgico tem diferente padrão de
expresão em diferentes períodos do desenvolvimento.
41
1.7. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi estudar o mecanismo de toxicidade
induzido pelo MeHg na retina, assim como a diferenciação do sistema nitrérgico
durante o desenvolvimento embrionário utilizando como modelo experimental cultura
de células retinianas de embrião de galinha. Verificou-se também o papel do sistema
anti-oxidante como possível proteção à intoxicação mercurial.
Os objetivos específicos:
1- Avaliar o padrão de atividade e expressão da NOS em diferentes períodos do
desenvolvimento em culturas de células de retina.
2- Avaliar o papel do NGF na ativação da NOS em períodos precoces do
desenvolvimento de células retinianas mantidas in vitro.
3- Avaliar o curso temporal de captação de L-Arginina ao longo do desenvolvimento
de células retinianas mantidas in vitro
4- Avaliar a ação do NGF e anti-NGF no transporte de L-arginina ao longo do
desenvolvimento retiniano in vitro
5- Avaliar a viabilidade das culturas celulares de retina de embrião de galinha após a
intoxicação com diferentes concentrações de MeHg por diferentes intervalos de tempo
6- Avaliar o efeito da exposição ao MeHg na captação de 3H-glutamato em culturas
celulares de retina de embrião de galinha.
7- Determinar o padrão de atividade da NO-Sintase em culturas celulares de retina de
embrião de galinha intoxicadas com diferentes concentrações de MeHg por diferentes
intervalos de tempo.
42
8- Avaliar o efeito da exposição ao MeHg na captação de 3H-cisteína em culturas
celulares de retina de embrião de galinha.
9- Determinar os níveis totais de GSH em culturas celulares de retina de embrião de
galinha intoxicadas com diferentes concentrações de MeHg por diferentes intervalos de
tempo.
10- Estudar o possível efeito protetor de substâncias antioxidantes (GSH e Cisteína),
meio condicionado por células gliais nas culturas celulares de retina intoxicadas com
diferentes concentrações de MeHg
43
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. CULTURAS PRIMÁRIAS DE RETINA DE EMBRIÕES DE GALINHA
Os ovos Leghorn fertilizados foram gentilmente cedidos pela empresa
MAKARÚ LTDA, localizada na estrada da providência s/n- Ananindeua-PA. Os ovos
foram retirados da incubadora, banhados em etanol absoluto e posteriormente levados
para câmara de fluxo laminar onde foram abertos sob condições assépticas. Os embriões
com oito ou nove dias de desenvolvimento, datados segundo os critérios descritos por
Hamburguer e Hamilton (1951), foram colocados em placa de petri contendo meio livre
de cálcio e magnésio (CMF- calcium media free) sendo decaptados e enucleados. Os
globos oculares foram abertos em sua região anterior, de forma que possibilitou a
retirada do cristalino, juntamente com o humor vítreo. A retina foi cirurgicamente
retirada e passada para uma placa de petri contendo CMF gelado. O tecido retiniano foi
transferido para tubos de ensaio de 15ml contendo uma solução de meio DMEM
(Dulbeco’s modified Eagles’s medium) e tripsina 0,05%, sendo posteriormente
incubado por cerca de 5 minutos a 37°C. Os experimentos relacionados ao estudo do
sistema nitrérgico, o tecido retiniano não foi submetido a dissociação química com
tripsina. O período de incubação foi sucedido pela dissociação mecânica do tecido, que
consistiu de sucessivas aspirações com auxílio de uma pipeta de vidro. A suspensão
celular foi centrifugada a 500g por 1 minuto e ressuspendida em meio DMEM com 10%
de soro fetal bovino (SFB). As células foram colocadas em placas de petri de 33mm e
diluídas em DMEM com 10%SBF. A diluição foi feita para que se obtivesse cerca de 2-
3 106 células/placa. Após o plaqueamento as culturas foram mantidas em estufa a
37°C, com atmosfera constituída de 95% de ar e 5% de CO2.
44
2.2. CULTURAS PRIMÁRIAS DE CÉLULAS GLIAIS DE MÜLLER DE RETINA
DE EMBRIÃO DE GALINHA.
As culturas de glia de embrião de galinha foram obtidas de ovos
fertilizados com 10-11 dias de desenvolvimento. Os ovos foram banhados em etanol
absoluto e posteriormente transferidos para uma câmara de fluxo laminar. Os olhos dos
embriões foram retirados e colocados em uma placa de petri contendo meio DMEM
sem soro. As retinas foram cirurgicamente retiradas e colocadas em tubos de 15ml
contendo 2ml de uma solução de tripsina 0,05%, sendo posteriormente incubadas em
banho-maria a 37oC por 5 minutos. Após este processo, foi feita a dissociação mecânica
do tecido, sendo as células mantidas em placas de petri de 35mm previamente tratadas
com poli-L-ornitina. As culturas foram mantidas em estufa de CO2 a 37oC por um
período de 10 dias. Neste intervalo de tempo, observou-se uma confluência celular
formada por 90% de células gliais e 10% de neurônios.
Para os experimentos de proteção, as células gliais com 15 dias de
desenvolvimento in vitro, foram tratadas com 1mM de L-cisteína diluída em DMEM
sem soro por 2h, após este período o meio foi retirado e adicionado 2ml de DMEM sem
soro sendo este meio coletado 4h depois e utilizado como meio condicionado nos
experimentos de proteção celular.
2.3. CAPTAÇÃO DE L-[H3]-ARGININA
Para avaliar o tranporte de L-arginina utilizaremos culturas com 2, 4,6 e
8 dias de desenvolvimento. Estas serão incubadas independentemente em solução
contendo L-[H3]-arginina (2,65Ci/ml),, NaCl 140 mM, KCl , 5 mM, HEPES 20 mM,
glucose 4 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM. Após este processo, as culturas foram
45
lavadas e as células rompidas com TCA 5%, sendo o conteúdo interno de radiação
determinado por cintilação líquida. Para se verificar o efeito do NGF as culturas foram
previamente tratadas por 24h com 100ng/ml, sendo este processo seguido pela
exposição das células à L-[H3]-arginina como descrito anteriomente.
2.4. INTOXICAÇÃO DAS CULTURAS DE CÉLULAS DE RETINA COM MeHg
O metil-mercúrio foi diluído em meio DMEM sem SBF para que se
evitasse eventuais conjugações deste elemento com as proteínas presentes no soro. As
culturas retinianas com oito dias de desenvolvimento in vitro foram expostas a
diferentes concentrações de MeHg (1M, 10M, 100M e 1mM) por intervalos de 2h,
4h e 6h. O controle dos experimentos foi feito com culturas no mesmo estágio de
desenvolvimento, sendo estas expostas a meio DMEM sem SBF por intervalos de 2h,
4h e 6h. Utilizamos também culturas controles com DMEM e 10% de SBF, no entanto,
não foi observada diferença bioquímica no comportamento destas células em relação
àquelas tratadas com meio sem SBF (dados não mostrados).
2.5. MEDIDA DA VIABILIDADE CELULAR PELO MÉTODO MTT
Para avaliar a viabilidade e a neurotoxicidade celular nas culturas de
células de retina após a intoxicação com diferentes concentrações de MeHg, foi
utilizada a análise colorimétrica com o corante MTT (thiazolil blue). O princípio da
técnica baseia-se na capacidade que células viáveis apresentam de reduzir a forma
oxidada do MTT a um composto de cor azulada, sendo o monitoramento desta redução
feito por espectrofotometria como descrito por Mosman (1983).
Em placas controles e tratadas com MeHg, após a remoção do meio, foi
feita uma lavagem com PBS estéril e posteriormente adicionado 550µl de PBS e 55μl
46
de MTT . As amostras foram incubadas por 4 horas, a partir das quais, foram
homogeneizadas no mesmo meio para posterior leituras da absorvância em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 570 nm. O branco da reação foi feito
com a solução de PBS e MTT.
2.6. AVALIAÇÃO DO TRANSPORTE DE 3H-GLUTAMATO e 3H-CISTEÍNA EM
CULTURAS RETINIANAS
Para avaliar a captação de 3H-glutamato e 3H-cisteína, as culturas mistas
de células da retina controles e expostas ao MeHg serão lavadas com solução de Hank
contendo 128mM de NaCl, 4mM de KCl, 1mM de MgCl2, 2mM de CaCl2, 12mM de
glicose e 20mM de HEPES, e posteriormente, incubadas durante 5 minutos com 3H-
glutamato ou 3H-cisteína (1Ci/mL 0.2µCi/mL) e solução de Hank, de acordo com o
método descrito por do Nascimento et al. (1998). Após os cinco minutos de incubação,
as culturas serão lavadas com solução de Hank para retirada do excesso de 3H-
glutamato presente no meio. Em seguida as células serão rompidas com TCA (ácido
tricloroacético) 5%. A quantidade de 3H-glutamato presente no interior da célula será
determinada por cintilação líquida, sendo os valores expressos em percentagem da
captação do controle.
2.7. HISTOQUÍMICA PARA NADPH-DIAFORASE
Culturas de retina controles e tratadas foram feitas em lamínulas
previamente tratadas com poli-L-ornitina e fixadas com paraformadeído 5% por 30
minutos. Nos experimentos no qual utilizamos 10µM, 100µM e 1mM de MeHg por 4
horas o processo de fixação foi realizado após a intoxicação com MeHg. Após a fixação
as culturas foram mantidas em geladeira a –20oC. Durante este período foram
47
preparadas duas soluções, sendo a primeira constituída de 300mg de ácido málico em
tampão TRIS pH 8.0 NaOH 5M e a segunda com 15mg de nitro blue tetrazolium
(NBT) diluído em 0,5ml de dimetil-sulfóxido (DMSO). Ambas as soluções foram
misturadas, sendo nestas adicionadas posteriormente 50mg de -NADP, 20mg de
cloreto de manganês (Mn2Cl) e 15ml de triton X-100 e o recipiente protegido da luz.
As culturas previamente fixadas, foram retiradas da geladeira e após 10
minutos incubadas por 3-4 horas a 37oC com a solução acima descrita. Após o
aparecimento da coloração nas células, a reação foi interrompida com 3 lavagens com
TRIS-HCl pH 8.0. As lamínulas foram montadas em lâminas e fotografadas
posteriormente em microscópio de luz comum.
2.8. MEDIDA DA ATIVIDADE DA NOS EM CULTURAS DE RETINA
A atividade da NOS foi medida de acordo com o método descrito por
Bredt e Snyder (1990) com pequenas modificações. O princípio do ensaio baseia-se na
capacidade da NOS de catalisar a formação equimolar de óxido nítrico e L-[H3]-
citrulina a partir da L-[H3]-arginina, em um processo dependente de NADPH e cálcio-
calmodulina.
Culturas com dois, quatro, seis e oito dias de desenvolvimento, assim
como culturas controles e intoxicadas com 10M, 100M e 1mM de MeHg por
intervalos de 2h, 4h e 6h, foram independentemente homogenadas em 1ml de tampão da
NOS ( HEPES 50mM, Valina 1mM, DTT 0,1mM e CaCl2 2mM). Foram adicionados
50l deste homogenado em tubos de ensaio bioquímico contendo: 15l de calmodulina,
10l de NADPH 1mM e 25l de L-[H3]- arginina 5.8Ci/ml. O controle negativo da
reação foi feito utilizando 15l de L-nitroarginina, que corresponde a um inibidor
irreversível da NOS. A reação foi paralisada após 30 minutos com 2ml de ácido
48
triclórico (TCA 5%), sendo este processo sucedido por três lavagens consecutivas com
2ml de éter etílico absoluto. Para separação da L-[H3]-citrulina formada e a eventual L-
[H3]-arginina não convertida pela NOS, as amostras foram eluídas através de colunas
cromatográficas de trocas iônicas. Estas colunas consistem de um cilindro de vidro
contendo a resina AG50-WX8 (SIGMA) que foram previamente ativadas com NaOH
1N. Esta ativação favorece a retenção da L-[H3]-arginina e a passagem da L-[H3]-
citrulina formada pela NOS. Após a eluição, cerca de 200l das amostras individuais
foram adicionadas em filtros de cintilação os quais foram secos a 100°C por 30 minutos.
O nível de radioatividade presente em cada experimento foi determinado utilizando
espectrofotometria por cintilação líquida e os resultados expressos em fmoles de L-[H3]-
citrulina/mg de proteína/minuto.
2.9. MEDIDA DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA EM CULTURAS DE CÉLULAS DE
RETINA INTOXICADAS COM MeHg
A determinação dos níveis intracelulares da forma reduzida de glutationa
(GSH) foi feita baseada no método descrito por Anderson (1969) com pequenas
modificações. O princípio desta técnica baseia-se na capacidade da GSH em reduzir o
ácido-5,5-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) para ácido nitrobenzóico (TNB), o qual
pode ser medido por espectrofotometria.
Inicialmente foi produzida uma curva de sensibilidade do DTNB para
concentrações conhecidas de GSH (0 a 15g/ml), sendo que a linearidade observada
neste intervalo de concentração nos permitiu determinar a função para o cálculo dos
níveis de GSH presente nas amostras.
As culturas controles e intoxicadas com MeHg (1M, 10M, 50M,
100M e 1mM) foram homogeneizadas em 2ml de PBS 0,1M, e colocadas em tubos de
49
ensaio, sendo 1ml deste volume separado para dosagem dos níveis totais de proteínas.
No volume restante foi adicionado 1ml de TCA 10%. As amostras foram centrifugadas
a 5000rpm (rotações por minuto) por 10 minutos a 4°C, sendo o sobrenadante retirado
para outro tubo e neste adicionado 2ml de éter etílico absoluto. O éter foi
posteriormente retirado e cerca de 300l do volume restante foi adicionado em um tubo
de ensaio contendo: 600l de PBS/EDTA 1mM, 100l de GSH redutase 100u/ml e 50l
de NADPH 4mM. Após 15 minutos de reação, foi adicionado 50l de DTNB e a
formação do TNB monitorada por espectrofotometria (comprimento de onda 412nm).
Os resultados foram expressos em mol de GSH/mg de proteína por minuto.
2.10. DOSAGEM DE PROTEÍNA
Para dosagem da proteína foram utilizados 200µl da amostra diluída 10X
em NaOH 0,1N, foi adicionada em 2ml do reativo cupro-alcalino (RCA) (NaOH 0,1N;
carbonato de sódio 2%; sulfato de cobre 0,1%; e tartarato duplo de sódio e potássio
0,2%). Após 10 minutos foi adicionado o reativo fenólico Folin 2N, realizando-se a
leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda de 750nm após 30 minutos,
como descrito por Lowry (1951).
2.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes e cada grupo
experimental foi formado por n=4-6. Para comparação entre os grupos adotamos
Análise de Variância (ANOVA) utilizando o teste TUKEY post hoc do programa
INSTAT3.0
50
3. RESULTADOS
3.1. ATIVIDADE DA NOS AO LONGO DO DESENVOLVIMENTO DAS
CULTURAS RETINIANAS.
Nossos resultados mostram que a atividade catalítica da NO-Sintase e a
citoquímica para NAPH-diaforase nos diferentes períodos de desenvolvimento das
culturas de retina (C2, C4, C6 e C8) apresenta um padrão de elevação gradativa e
temporal. Em C2 a atividade na NO-sintase apresentou-se baixa (11,2 fmol/mg
ptn/min), com uma pequena quantidade de L-[3H]-citrulina formada. Já em C4
observamos um aumento da formação de L-[3H]-citrulina (20,5 fmol/mg ptn/min) o que
sugere um aumento da atividade da NO-sintase neste período em relação a C2. O
aumento da atividade da NO-Sintase é gradativo e atinge o seu pico em C6 (27,6
fmol/mg ptn/min), a partir do qual não observamos mais um aumento significativo.
(Figura 8).
Estes resultados são interessantes e diferentes daqueles observados no
tecido retiniano, pois no período de C2 a atividade da enzima está baixa quando
comparada com a alta atividade da NO sintase no tecido correspondente ao mesmo
período embrionário (E8). Testamos duas possiibilidades para averiguar essas
diferenças. Uma poderia ser a disponibilidade do substrato L-arginina e a outra a
liberação de fatores tróficos para o meio extracelular induzida por despolarização. Os
resultados também demonstram que o pré-tratamento das culturas com 1mM de L-
arginina no período C2, não promove mudança significativa na atividade da NO-
Sintase, entretanto, o pré- tratamento das culturas com 500M de L-glutamato, neste
mesmo período de desenvolvimento, promove a elevação da atividade da enzima até os
níveis observados em C8. O mesmo padrão de elevação da atividade da NO-Sintase em
51
C2 foi observado quando estas culturas foram pré-tratadas com potássio e 100ng de
NGF (Figura 9).
Figura 8: Curso temporal da atividade da NO-Sintase em culturas de retina de embrião
de galinha. A atividade enzimática em função dos dias 2, 4, 6 e 8 in vitro, representados
por C2, C4, C6 e C8 respectivamente. * p 0,05 em relação a C2 (ANOVA, teste
Turkey).
0
5
10
15
20
25
30
35
C2 C4 C6 C8
Ativ
idad
e da
NO
S (fm
ol L
-[H3]
citr
ulin
e/m
g pt
n/m
in.) *
* *
Dias in Vitro
53
Figura 9: Fotomicrografias do Padrão histoquímico da atividade de NADPH-diaforase
em culturas celulares de retina de embrião de galinha. Em A, culturas com 2 dias de
desenvolvimento, em B com 4 dias, C com 6 dias e em D com 8 dias de
desenvolvimento. Escala 50µm.
55
Figura 10: Atividade da NO-Sintase em culturas celulares de retina de embrião de
galinha no período de 2 e 8 dias de desenvolvimento in vitro. Tratamento das culturas
com diferentes agentes no segundo dia de desenvolvimento (C2) como descrito nos
métodos. * p 0,05 em relação ao controle de 2 dias não tratado (ANOVA, Turkey).
3.2. CURSO TEMPORAL DA CAPTAÇÃO DE L-ARGININA
0
5
10
15
20
25
30
35
40
C2dias C8dias Arginina Glutamato KCL NGF
Ativ
idad
e (F
mol
es [H
3]ci
trul
ina/
mg
ptn/
min
.)
* *
*
C2dias
56
Uma vez que o tratamento com L-arginina não promoveu aumento
significativo da atividade da NOS, fomos observar o comportamento da captação de
L[3H]-arginina. nos diferentes períodos de desenvolvimento in vitro (2 dias, 4 dias, 6
dias e 8 dias) Nossos resultados mostram que culturas celulares de retina com dois dias
de desenvolvimento (C2) apresenta um baixo padrão de captação de L[3H]-arginina. Em
C4 observamos um aumento desta captação em relação a C2, sendo o mesmo padrão de
elevação observado em culturas com seis e oito dias de desenvolvimento (C6 e C8)
(Figura 10).
3.3. EFEITO DO NGF NA CAPTAÇÃO DE L-ARGININA
Como não houve aumento na atividade da enzima em função da
disponibilidade de L-arginina e ao mesmo tempo ocorreu um aumento gradativo no
sistema de transporte de arginina coincidente com aumento da atividade da NO-sintase
em cultura, poderia ser que algum fator trófico estivesse sendo liberado no meio. Em
células PC12, NGF promove sua diferenciação celular através da indução de NO-
sintase. É provável que NGF estivesse modulando a expressão do sistema de transporte
de arginina e o aumento desta captação estivesse aumentando a atividade da NO-sintase.
O tratamento das culturas em C2 com 100ng/ml de NGF por 24h
promoveu um aumento de aproximadamente três vezes na captação de L[3H]-arginina
em relação ao controle não tratado (Figura11).
Para ratificar o possível papel desta neurotrofina na regulação da
captação de L[3H]-arginina em culturas de retina, promovemos o tratamento das células
com 100ng/ml de anti-NGF por 24 nos diferentes períodos de desenvolvimento in vitro
57
(C2, C4, C6 e C8). A figura 12, mostra que culturas tratadas com anti-NGF, ocorre
apenas um pequeno aumento na captação de L[3H]-arginina quando comparado ao
grupo controle não tratado em todos os periodos de diferenciação da cultura.
58
Figura 11: Captação de L-[3H]-Aginina ao longo do desenvolvimento células de retina.
Os valores de captação estão expressos em contagens por minuto por miligrama de
proteína no período de 2 e 8 dias de desenvolvimento in vitro (* p< 0,05 em relação a 2
dias - ANOVA Turkey).
0
5000
10000
15000
20000
25000
2 dias 4 dias 6 dias 8dias
Cap
taçã
o de
L-[
H3]
-Arg
inin
a (C
PM/m
g pt
n)
*
*
*
59
Figura 12: Efeito do NGF na captação de L-[3H]-Aginina em culturas de retina com
dois dias de desenvolvimento in vitro. Os valores da captação estão expressos em
contagens por minuto por miligrama de proteína (* p< 0,05 ANOVA Turkey).
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
Controle NGF
Cap
taçã
o de
L-[
H3]
-Arg
inin
a (C
PM/m
g de
ptn
) *
60
Figura 13: Efeito do Anti-NGF no curso temporal de captação de L-[3H]-Aginina em
culturas celulares de retina em diferentes períodos de desenvolvimento. As culturas
foram pré-tratadas por 12h com 100ng/ml de anti-NGF, sendo os valores de captação
expressos em contagem por minuto por miligrama de proteína (**p<0,05; # p<0,05-
ANOVA-Turkey)
0
5000
10000
15000
20000
25000
2 dias 4 dias 6 dias 8dias
Cap
taçã
o de
L-[
H3]
-Arg
inin
a (C
PM/m
g de
ptn
)
ControleAnti-NGF
**
**
** #
#
61
3.4. TOXICIDADE DO MeHg EM CULTURAS CELULARES DE RETINA DE
EMBRIÕES DE GALINHA
A viabilidade das células de retina em cultura foi medida após a
exposição destas células a diferentes concentrações de MeHg (1M, 10µM e 100µM)
por diferentes intervalos de tempo (2h, 4h e 6h) e comparadas com a viabilidade de
culturas controles não intoxicadas. Nossos resultados mostram que a toxicidade causada
pelo MeHg nas culturas ocorre dependente de concentração e tempo de exposição
(figura 13). Quando as células foram expostas por 2h a 1µM de MeHg, observamos que
a viabilidade celular diminuía sensivelmente em relação ao controle. Aumentando o
tempo de exposição para 4 e 6 horas, observamos uma diminuição gradativa da
viabilidade nas culturas quando expostas a esta mesma concentração de MeHg (85% e
80% respectivamente). A toxicidade do MeHg nas culturas intensificou-se quando
utilizamos 10µM, sendo que em 2h de intoxicação, a viabilidade celular atinge 90%, em
4h temos 70% de células viáveis e em 6h apenas 51%. Em concentrações mais altas
como 100µM, o efeito tóxico do MeHg apresenta-se mais evidente, nesta concentração
com 2h de intoxicação a viabilidade das células atinge entre 80 e 90%, diminuindo para
40% em 4h e 34 % em 6h. A concentração de 1mM mostrou-se extremamente letal
para as células de retina em cultura, visto que, nas primeiras 2h de intoxicação a
viabilidade caia para 28% e em 4h e 6h para 12% e 10% respectivamente.
62
Figura 14: Viabilidade Celular das culturas retinianas intoxicadas com diferentes
concentrações de MeHg por 2h, 4h e 6h como descrito em métodos. No eixo das
ordenadas está representada a viabilidade celular em porcentagem do controle e nas
abscissas o tempo de exposição ao MeHg.
0102030405060708090
100110120
2h 4h 6hTempo
Viab
ilida
de C
elul
ar (%
Con
trol
e)
01µM10µM100µM1mM
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
63
3.5. EFEITO DO MeHg NA CAPTAÇÃO DE GLUTAMATO EM CULTURAS
CELULARES DE RETINA
Culturas retinianas expostas a 10µM de MeHg por uma hora apresentam
um sensível aumento da captação glutamato, sendo esta captação cerca de 20% maior
que a observada nas culturas controles (Figura 5), entretanto, aumentando o tempo de
exposição com esta mesma concentração, podemos observar que o MeHg induz a uma
diminuição de cerca de 50% na captação de glutamato (Figura 14 e 15).
64
Figura 15: Captação de 3H-glutamato em culturas de retinas controles e expostas a
10µM de MeHg durante o intervalo 1H. Os resultados estão expressos em percentagem
da captação em relação ao controle (ANOVA-Turkey *p<0,05).
*
010
203040
50607080
90100110
120130
Controle MeHg (10µM)
Cap
taçã
o 3H
-Glu
tam
ato
(% d
o co
ntro
le)
65
Figura 16: Captação de 3H-glutamato em culturas de retinas controles e expostas a
10µM de MeHg durante o intervalo 2H. Os resultados estão expressos em percentagem
da captação em relação ao controle. (ANOVA-Turkey *p<0,01).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
Controle MeHg (10µM)
Cap
taçã
o 3H
-Glu
tam
ato
(% d
o C
ontr
ole)
66
3.6. ATIVIDADE DA NO-SINTASE NAS CULTURAS DE RETINA
INTOXICADAS COM MeHg.
Para avaliar a produção de NO nas células de retina intoxicadas com
MeHg, medimos a atividade da NO-Sintase nos diferentes períodos de intoxicação
como descrito nos métodos. Nossos resultados mostram que com 2h de intoxicação não
houve mudança significativa na atividade da NO-sintase nas culturas intoxicadas com
10µM e 100µM de MeHg, entretanto, com 4h de intoxicação utilizando estas mesmas
concentrações de MeHg, a atividade enzimática da NO-Sintase apresentou-se
significativamente elevada em relação ao controle (Figura 10).
Para saber se o padrão histoquímico aprsentava-se de acordo com o
padrão bioquímico avaliamos a atividade histoquímica da NADPH-diaforase nas
culturas de retina intoxicadas com 10µM, 100µM e 1mM por 4h
Podemos observar um padrão histoquímico aumentado com 10µM
100µM em relação ao controle não intoxicado. Não foi observada atividade de NADPH-
diaforase nas culturas intoxicadas com 1mM neste mesmo intervalo de tempo (Figura
16).
No período de 6h, as culturas intoxicadas com 10µM e 100µM apresentam
atividade da NO-sintase elevada, sendo observado, uma sensível diminuição em relação
às culturas intoxicadas por 4h com estas mesmas concentrações. Não observamos
diferença significativa na atividade da enzima quando comparamos as culturas
intoxicadas com 10µM ou 100µM em nenhum intervalo de intoxicação. Para
concentração de 1mM de MeHg não foi detectada atividade da NO-Sintase em nenhum
intervalo de intoxicação analisado (Figura 17).
67
Figura 17: Histoquímica para NADPH-diaforase em culturas de retina intoxicadas com
MeHg por 4h. Em A temos o controle não intoxicado, B culturas intoxicadas com
10µM, em C intoxicadas com 100µM e em D com 1mM. Escala 50µm.
A B
C D
68
Figura 18: Atividade da NO-Sintase nas culturas não intoxicadas e intoxicadas com
10µM e 100µM de MeHg por 2h, 4h e 6h. No eixo das ordenadas observamos a
atividade da NO-Sintase expressa em fmol de L-[3H]-citrulina formada por mg de
proteína por minuto e no eixo das abscissas o tempo de intoxicação das culturas de
retina (ANOVA-Turkey *p<0,01).
0
20
40
60
80
2h 4h 6h
Tempo
* * * *
Controle
10µM
100µM
Ativ
idad
e de
NO
S
(fmol
L-[
3 H]-c
itrul
ina/
mg
ptn/
min
uto)
69
3.7. NÍVEIS DE GSH EM CULTURAS DE RETINA INTOXICADAS COM MeHg
A concentração intracelular de GSH expressa em µmol por miligrama de
proteína por minuto, foi medida nas culturas de retina intoxicadas com diferentes
concentrações de MeHg, por diferentes intervalos de tempo. Os níveis de GSH
permanecem constantes nos experimentos controles, no entanto, com 1µM de MeHg em
2h de intoxicação, ocorre uma diminuição significativa da concentração intracelular de
GSH em relação ao controle. Com 4h e 6h de intoxicação, com 1µM, estes níveis
sofrem uma diminuição, apresentando uma queda de aproximadamente 50% em relação
ao controle (Figura 18).
A intoxicação das culturas celulares de retina com 10µM e 100µM de
MeHg promove uma queda acentuada dos níveis intracelulares de GSH, sendo este
fenômeno observado desde as primeiras 2h de intoxicação. Em 4h e 6h utilizando estas
maiores concentrações de MeHg, quase não se detecta os níveis de GSH nas culturas de
retina intoxicadas, estes resultados são apresentados na figura 18.
70
Figura 19: Concentração de GSH em culturas de retina intoxicadas com MeHg por
diferentes intervalos de tempo. A concentração de GSH está representada em função do
tempo de exposição das células a diferentes concentrações de MeHg (Controle, 1µM,
10µM e 100µM- ANOVA-Turkey *p<0,05).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
2h 4h 6h
Nív
eis d
e G
SH
(µm
ol/m
g de
ptn
/min
.)
Tempo
0
1µM
10µM
100µM
*
**
*
* *
*
**
71
3.8. EFEITO DO MeHg NA CAPTAÇÃO DE CISTEÍNA EM CULTURAS
CELULARES DE RETINA.
Para avaliar se a diminuição dos níveis de GSH induzida pelo tratamento
com MeHg está associada com alterações no processo de captação de L-[35S]- cisteína,
culturas celulares de retina foram expostas por 1h e 2h com 10µM e 100µM de MeHg.
Nossos resultados mostram que na primeira hora de exposição às concentrações de
10µM e 100µM ocorre aumento e diminuição, significativa na captação de L-[35S]-
cisteína respectivamente. Entretanto nossos dados demonstram que aumentando o
tempo de exposição para 2h, ambas as concentrações de MeHg promoveram uma
intensa diminuição na captação deste aminoácido em relação ao controle (Figura 19 A e
19 B).
72
Figura 20: Efeito do tratamento com diferentes concentrações de MeHg na captação de
L-[35S]- cisteína em culturas celulares de retina. No gráfico A as culturas foram
expostas por 1h ao MeHg e no gráfico B por um período de 2h. Os valores estão
expressos em percentagem do controle (*p<0,05 em relação ao controle)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Controle 10µM MeHg 100µM MeHg
Cap
taçã
o de
L-[3
5S]-C
iste
ína
(% C
ontr
ole)
*
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Controle 10µM 100µM
Cap
taçã
o de
L-[3
5S]-
Cis
teín
a (%
Con
trol
e)
*
*
73
3.9. AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DE TOXICIDADE DO MeHg NAS
CULTURAS DE RETINA
Antagonistas de receptores glutamatérgicos, um inibidor da atividade da
NOS e agentes antioxidantes foram utilizados para caracterizar o possível mecanismo
neurotóxico do MeHg em culturas celulares de retina. Nas primeiras 4h de intoxicação
com 10µM de mercúrio, observamos que aproximadamente 60% das células
permaneciam vivas. O pré-tratamento das culturas com L-NARG elevou a viabilidade
celular para cerca de 90%, resultados semelhantes foram observados com o pré-
tratamento das culturas com MK-801. O tratamento com CNQX e NBQX não
promoveu proteção contra a ação neurotóxica do MeHg em 4h de intoxicação (Figura
20). Avaliamos também a ação de antioxidantes nas culturas celulares de retina frente a
aintoxicação com 10µM de MeHg e observamos que o tratamento prévio com GSH
elevou a viabilidade nas culturas para aproximadamente 90%, este fenômeno de
proteção também foi observado após o tratamento das células com L-cisteína. O
tratamento das culturas com meio condicionado retirado de culturas de glia, que como
citado em métodos foram tratadas previamente com L-cisteína o que levaria a liberação
no meio do precursor de GSH o CysGly, promoveu uma proteção semelhante a
observada com GSH e L-cisteína, já a L-metionina não mostrou ação protetora contra o
mercúrio como mostrado na figura 21.
Ao utilizarmos 100µM de MeHg nas culturas por 4h a viabilidade celular
atingiu 41% e o pré-tratamento destas culturas com L-NARG elevou sua viabilidade,
após a intoxicação, para 71 %. MK-801 também promoveu proteção contra a ação do
mercúrio (65%), assim como observamos uma ação sinérgica de proteção quando se
utilizou MK-801+ NARG (90%) nas culturas de retina. Assim como para intoxicação
por 4h com 10µM de mercúrio NBQX e CNQX não promoveram proteção nas culturas
74
de retina (Figura 22). Nossos resultados demonstraram também que L-cisteína (70%) e
o meio condicionado glial (60%) exerceram proteção nas culturas intoxicadas com
100µM por 4h, no entanto, o tratamento com GSH, para esta concentração de MeHg,
não exerceu atividade protetora nas células intoxicadas (Figura 23).
Procuramos avaliar também a ação das substâncias citadas anteriormente
em culturas intoxicadas por 6h com 10µM e 100µM de mercúrio. Nas culturas
intoxicadas com 10µM o pré-tratamento com L-NARG e MK-801 não se mostrou
eficiente para proteger as células contra a ação tóxica do MeHg nas culturas analisadas,
todavia, quando utilizamos o pré-tratamento com L-NARG+MK-801 a viabilidade das
culturas atinge 79,29% após a intoxicação com mercúrio (Figura 24). Também
observamos que o pré-tratamento com GSH, não protegeu as células da intoxicação
mercurial, sendo que apenas L-cisteína e meio condicionado de glia, exerceram alguma
atividade contra a intoxicação do MeHg (71% e 65% respectivamente) como mostrado
na figura 25.
Nas culturas de retina intoxicadas com 100µM de MeHg por 6h também
não se observou proteção significativa frente ao tratamento com L-NARG e MK-801,
no entanto como na intoxicação com 10µM por 6h, a combinação destes dois agentes
mostrou alguma ação de proteção nas culturas intoxicadas (Figura 26). Para esta
concentração de mercúrio, GSH também não se mostrou eficiente para proteger as
células, sendo que a viabilidade celular só foi elevada frente a utilização de L-cisteína
(60%) e meio condicionado de glia (50%) como ilustrado na figura 27.
75
Figura 21: Ação do L-NARG e de antagonistas de receptores glutamatérgicos na
viabilidade de culturas de retina de embrião de galinha após 4h de intoxicação com
10µM e 100µ de MeHg. Os resultados estão expressos em porcentagem de células
viáveis, em relação ao controle não intoxicado, em função do tratamentos com os
diferentes antagonistas.. (* p0,05 em relação à 10µM; + p, 0,05 em relação a 100µM
de MeHg; p0,05 em relação ao controle ANOVA-Turkey).
0
20
40
60
80
100
120Con
trole
10µM
MeHg
100µ
M MeH
g
NARG+10µ
MMeHg
MK+10µ
MMeHg
CNQX+10µMMeH
g
NBQX+1
0µMMeH
g
NARG+100
µM M
eHg
MK+100
µM M
eHg
CNQX+100µ
M MeH
g
NBQX+1
00µM
MeH
g
Viab
ilida
de C
elul
ar (%
Con
trole
)
* *
+ +
#
# # #
# #
76
Figura 22: Ação de agentes antioxidantes e de meio condicionado de glia (MCG) na
viabilidade celular de culturas de retina de embrião de galinha após 4h de intoxicação
com 10µM e 100µM de MeHg. Os resultados estão expressos em porcentagem de
células viáveis, em relação ao controle não intoxicado, em função do tratamentos com
os diferentes agentes e com o meio condicionado glial (* p0,05 em relação a 10µM de
MeHg; + p<0,05 em relação a 100µM; p0,05 em relação ao controle ANOVA-
Turkey).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Contro
le
MeHg 10
µM
MeHg 10
0µM
GSH 500µ
M+ 10µM
MeH
g
Cist 50
0µM+1
0µM M
eHg
MCG+10µM M
eHg
GSH 500µ
M+ 100µ
M MeH
g
Cist 50
0µM+1
00µM
MeH
g
MCG+100µ
M MeH
g Via
bilid
ade
Cel
ular
(% d
o C
ontro
le)
* * *
+ + #
# #
# #
77
Figura 23: Ação do L-NARG e de antagonistas de receptores glutamatérgicos na
viabilidade de culturas de retina de embrião de galinha após 6h de intoxicação com
10µM e 100µM de MeHg. Os resultados estão expressos em porcentagem de células
viáveis, em relação ao controle não intoxicado, em função do tratamentos com os
diferentes antagonistas. (* p0,05 em relação a 10µM de MeHg; + p<0,05 em relação a
100µM p0,05 em relação ao controle ANOVA, Turkey test).
#
0
20
40
60
80
100
120
Contro
le
10µM
MeHg
100µ
M MeH
g
NARG+10µ
MMeHg
MK+10µ
MMeHg
MK+NARG++1
0µMMeH
g
NARG+100
µM M
eHg
MK+100
µM M
eHg
MK+NARG+10
0µM M
eHg
Via
bilid
ade
Cel
ular
(% C
ontr
ole) *
# #
#
# #
# #
+
78
Figura 24: Ação de agentes antioxidantes e de meio condicionado de glia na viabilidade
de culturas de retina de embrião de galinha após 6h de intoxicação com 10µM e 100µM
de MeHg. Os resultados estão expressos em porcentagem de células viáveis, em relação
ao controle não intoxicado, em função do tratamentos com os diferentes agentes e com
o meio condicionado glial (* p0,05 em relação a 10µM de MeHg; + p<0,05 em relação
a 100µM p0,05 em relação ao controle (ANOVA, Turkey test).
0102030405060708090
100110120
Contro
leMeH
g 10µM
MeHg 10
0µM
GSH 500µ
M+ 10µM
MeH
g
Cist 50
0µM+1
0µM M
eHg
MCG+10µM M
eHg
GSH 500µ
M+ 100µ
M MeH
g
Cist 50
0µM+1
00µM
MeH
g MCG+10
0µM M
eHg
Viab
ilida
de C
elul
ar (%
do
cont
role
)
* *
#
# #
# #
* #
# #
+ +
79
4. DISCUSSÃO
Hoje se sabe que NO parece participar de inúmeros eventos no SNC.
Pode ser considerado um mensageiro químico que em concentrações aumentadas parece
estar envolvido na neurotoxicidade. Participa também dos fenômenos relacionados a
diferenciação e maturação do SNC. Para esclarecer a presença de NO durante o
desenvolvimento da retina e relacionar aos eventos de toxicidade induzidos pelo MeHg
utilizamos neste trabalho um modelo de cultura de células de retina de embrião de
galinha. Podemos dizer que existe uma estreita correlação entre NO, estresse oxidativo,
neurotoxicidade induzida por MeHg.
Nos estudos da ontogênese do sistema nitrégico nestas culturas,
demonstramos que nos primeiros dias de desenvolvimento in vitro (C2) a atividade
bioquímica da NO-Sintase, bem como a histoquímica para NADPH-diaforase,
apresentam-se significativamente reduzidas, estes resultados são bastante interessantes,
visto que, no oitavo dia de desenvolvimento embrionário (E8), período que nossas
culturas são produzidas, Ientile e cols (1996) e Paes de Carvalho e cols (1996 e 1997)
independentemente demonstraram um pico de atividade da NO-Sintase na retina de
galinha. Estes trabalhos se propunham a estudar a diferenciação do sistema nitrergico
durante o desenvolvimento retiniano. Foi observado que a atividade da NO-Sintase e o
padrão histoqímico de NADPH-diaforase apresentavam-se diminuídos em E3, atingiam
um pico em E8 a partir do qual diminuíam progressivamente até o período pós-eclosão
(P1), resultados semelhantes em cultura de neurônios mesencefálicos de ratos foram
descritos por Hilbig e cols (2001). Nossos resultados demonstraram que tanto a
atividade bioquímica da NO-Sintase quanto a histoquímica para NADPH-diaforase, a
partir de C2, aumentavam progressivamente até o período C6 e aparentemente se
mantinham constantes até C8.
80
A partir destes resultados demonstramos que culturas celulares de retina,
reproduzem os primeiros momentos do comportamento do tecido retiniano in vivo
quando focalizamos a atividade da enzima NO-Sintase. Essas observações ratificam a
importância deste modelo experimental para o estudo de diferenciação do sistema
nitrérgico durante a ontogênese da retina, bem como das demais regiões sistema
nervoso central.
O curso temporal do desenvolvimento do sistema nitrérgico na retina é
bem descrito em modelos in vivo (Ientile e cols ,1996 ; Pas de Carvalho e cols, 1997),
entretanto, os mecanismos celulares que controlam este padrão de desenvolvimento
ainda não são bem esclarecidos, com base nestas observações procuraremos avaliar o
curso temporal do desenvolvimento do sistema nitrérgico in vitro bem como alguns
possíveis mecanismos que o regulam.
Apesar da quantidade de trabalhos produzidos sobre o desenvolvimento
do sistema NO-Sintase, muito pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam este
sistema ao longo do desenvolvimento da retina. Como em nossas culturas reproduzimos
o comportamento do tecido in vivo, procuramos testar em primeira instância se algum
fator interno, no momento da dissociação do tecido foi perdido, ocasionando assim a
diminuição da atividade NO-Sintase e de NADPH-diaforase. Para isso procuramos
testar a via clássica de ativação da NO-Sintase tratando as células de retina com L-
glutamato no período C2.
Interessantemente este aminoácido elevou a atividade da NO-Sintase
para um padrão semelhante ao observado no oitavo dia in vitro (C8) demonstrando que
toda via celular de ativação desta enzima apresenta-se íntegra nas culturas no período de
desenvolvimento in vitro correspondente a C2. Estes resultados sugerem que algum
fator presente no ambiente in vivo foi perdido no momento do preparo das culturas e
81
que este fator ao ser progressivamente produzido nas culturas, promove elevação do
padrão de atividade até os períodos de C6 e C8.
Dentro deste contexto, procuramos evidências sobre a possibilidade de
este fator ser produzido no ambiente intracelular nas culturas de retina. Testamos esta
hipótese induzindo uma despolarização das células com potássio. Este íon em altas
concentrações produz uma despolarização nas células em culturas e um concomitante
aumento na atividade da NO-Sintase de forma semelhante aquela observada para o
glutamato. A hipótese sugerida é que a despolarização induzida por potássio ou
glutamato pudesse estar liberando algum fator trófico no meio extracelular. Taylor e
cols (2003) mostraram que a ativação glutamatérgica promovia a expressão e liberação
de fatores neurotóficos por células gliais de Muller em cultura. Em outro trabalho
Sheehy e cols (1997) demonstraram que o fator de crescimento do nervo (NGF) induzia
a expressão e ativação da NO-Sintase em linhagens de feocromocitoma de ratos (PC12).
Com base nestes estudos, procuramos testar o possível efeito do pré-tratamento das
culturas de retina com NGF e observamos que a atividade da NO-Sintase eleva-se
significativamente, de forma semelhante ao aumento induzido por glutamato e o
potássio. Este resultado favorece a hipótese que NGF tem um importante papel na
regulação do sistema NO-Sintase ao longo do desenvolvimento da retina. É importante
ressaltar que existe uma estreita associação entre o pico da atividade nitrérgica com a
expressão de neurotrofinas e de seus receptores (TrK A, TrK B, TrK C e p75). Este
período coincide com o intenso período apoptose que ocorre no tecido retiniano ao
longo do seu desenvolvimento (Vecino e cols, 2004).
Outro dado importante é que NGF pode atuar como um fator na
regulação de morte celular em períodos específicos do desenvolvimento retiniano e este
fenômeno parece ser regulado por ativação nitrérgica. Estudos prévios demonstram que
82
a indução de morte celular no sistema nervoso central, induzida pelo NGF, está
relacionada à ativação de receptores p75 de baixa afinidade (Frade e cols, 1996), na
retina estes resultados são reforçados por um estudo recente que demonstra a expressão
de receptores p75 somente em células ganglionares alojadas em sua camada, não sendo
observada esta expressão em células que se apresentam em processos migratórios
(Harada e cols, 2006).
Uma outra possibilidade para o aumento da atividade da NO-sintase em
nossas culturas é a disponibilidade do substrato L-arginina. Quando fazíamos
tratamento prévio das culturas com L-arginina, este substrato não promoveu mudança
significativa na atividade da NOS em culturas em C2. Cossenza e Paes-de-Carvalho
(2000) demonstraram que neurônios utilizam L-arginina liberada por células gliais
como substrato para atividade da NOS, entretanto não está esclarecido se esta relação
glia-neurônio ou se o sistema de captação de L-arginina estão estabelecidos em todos
os períodos do desenvolvimento da retina. Ao avaliarmos o curso temporal de captação
deste aminoácido ao longo do desenvolvimento das culturas, nossos resultados
demonstraram pela primeira vez que a captação de L-arginina segue um padrão
semelhante ao observado pela atividade da NOS, ou seja, uma baixa atividade nos
primeiros períodos do desenvolvimeto (C2), atingindo altos níveis de captação em
culturas mais desenvolvidas (C6 e C8).
Demonstramos também que o tratamento com NGF aumenta
significativamente a captação de arginina em C2, da mesma forma que o tratamento
com anti-NGF diminui captação ao longo do desenvolvimento das culturas. Portanto,
parece que o NGF tem um papel importante tanto na ativação da NOS quanto na
disponibilidade do seu substrato em cultura de células de retina. De fato o trabalho de
Carmo e cols (1999) demonstra que em retinas de ratos com quadro clínicos de diabetes
83
a atividade nitrérgica esta associada ao aumento da captação de L-arginina na retina,
podendo ser estes fenômenos importantes no mecanismo de morte celular por estresse
oxidativo. Com base nestes dados torna-se possível inferir que NGF pode regular e
controlar os fenômenos de morte celular em períodos específicos do desenvolvimento
retiniano, através da regulação da entrada de L-arginina na célula e aumento na síntese
de NO. Entretanto estudos mais detalhados devem ser realizados para confirmar essses
achados.
Este trabalho não caracteriza qual isoforma da NO-Sintase apresenta
regulação da atividade ao longo do desenvolvimento das culturas, contudo De Faria e
cols (1995) demonstraram a existência tanto das formas dependes quanto das
independentes de cálcio na retina de aves, Paes de Carvalho e cols (1996) reproduziram
os mesmos resultados demonstrando que as formas independentes de cálcio não sofriam
alteração na sua atividade ao longo do desenvolvimento da retina de embriões de
galinha, tendo apenas um pequeno aumento no período pós-eclosão. Entretanto em
nosso trabalho não descartamos a possibilidade do efeito regulador do NGF sobre as
isoformas constitutivas e induzidas da NO-Sintase, uma vez que a atividade da NO-
Sintase induzida, está intimamente relacionada a eventos citotóxicos.
Uma vez caracterizado que o sistema nitrérgico apresenta-se bem
estabelecido no período C8 de desenvolvimento, utilizamos culturas neste estágio para
verificar a relação daquele sistema com o mecanismo de toxicidade induzida pelo
mercúrio na retina.
Os resultados observados neste trabalho demonstram que o MeHg exerce
toxicidade nas células de retina mantidas em cultura, esta toxicidade mostrou-se
dependente tanto da concentração e do tempo de exposição ao mercúrio. Estes
resultados estão de acordo com os observados in vivo, em que foi demonstrado que a
84
neurotoxicidade promovida pelo MeHg é dependente da dose que o indivíduo é
exposto, bem como do tempo de exposição (Hewwett & Atchison, 1991).
Sorg e cols (1998) demonstraram que o MeHg promove uma elevação
de radicais de oxigênio reativos (ROS) no SNC, dentre os quais está incluído o óxido
nítrico (NO). Os sub-produtos do metabolismo deste gás, nitrito e nitrato, em grandes
quantidades podem promover citotoxicidade por apresentarem-se como radicais livres.
Nossos dados demonstram que nas duas primeiras horas de intoxicação com MeHg não
há mudanças significativas na atividade da NO-Sintase, da mesma forma que a
viabilidade celular também manteve-se semelhante a do controle não intoxicado,
contudo, em quatro e seis horas de intoxicação houve um aumento da atividade da NO-
Sintase, bem como no padrão histoquímico para NADPH-diaforase, sendo estes
acompanhados pela diminuição da viabilidade celular. Resultados semelhantes foram
observados no cerebelo de ratos após a intoxicação com MeHg, onde a toxicidade neste
tecido foi creditada a elevada concentração do NO (Himi e cols 1996; Yamashita e cols
1997).
Analisando córtex e cerebelo de ratos Shiniashiki e cols (1998)
mostraram que a elevação da atividade da NO-Sintase nestes tecidos não era
acompanhada da elevação da expressão protéica de suas isoformas, posteriormente
Aschner e cols (2000) demonstraram que o MeHg altera o transporte de glutamato em
astrócitos o que promoveria o aumento deste neurotransmissor na fenda sináptica,
desencadeando citotoxicidade no tecido nervoso. Com isso o MeHg indiretamente
aumentaria a atividade da NO-Sintase via ativação do complexo cálcio-calmodulina,
sendo a entrada de cálcio induzida pelo estímulo dos receptores glutamatérgicos do tipo
NMDA. Um mecanismo semelhante foi observado em nossas culturas, uma vez que
85
após duas horas de intoxicação houve uma diminuição significativa na captação de
glutamato.
Nossos resultados sugerem que as células NO-Sintase positivas na retina
estão participando diretamente da toxicidade causada pelo MeHg, visto que tanto a
atividade bioquímica da NO-Sintase, quanto histoquímica para NADPH-diaforase, estão
elevadas durante a intoxicação. Como as células NADPH diaforase são mais resistentes
a injúrias no sistema nervoso (Thomas and Pearse, 1964), estas células possivelmente
atuam como protagonistas do fenômeno neurotóxico induzido pelo MeHg na retina. O
excesso de glutamato, devido a diminuição do sistema de captação nas culturas, pode
estimular os neurônios NOS positivos uma vez que reconhecidamente o aumento de
glutamato na fenda sináptica leva a estimulação dos receptores NMDAs a ativação da
via cálcio-calmoduluna-NO-Sintase (Bredt & Snyder, 1990).
Confirmamos esta hipótese após a intoxicação com MeHg observando a
elevação da viabilidade nas culturas frente ao pré-tratamento com L-NARG, ratificando
que a ativação do sistema nitrérgico pelo MeHg, tem um importante papel na
citotoxicidade produzida por este metal.
Em nosso modelo experimental pudemos observar também que o
bloqueio dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA com MK-801, exerceu
proteção contra a ação tóxica do MeHg. Resultados semelhantes foram observados em
culturas de células corticais por Park e cols (1996), onde tanto o bloqueio dos receptores
NMDAs e não NMDAs (AMPA/Cainato) diminuíam a citotoxicidade mediada pelo
MeHg, interessantemente quando utilizamos inibidores de receptores não NMDAs não
conseguimos proteger as células de retina, mostrando que diferentemente do córtex na
retina o mercúrio age preferencialmente em uma via de ativação de citotoxidade pela
estimulação dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA.
86
Recentemente Sanfeliu e cols (2001) demonstraram que astrócitos
humanos em cultura são mais resistentes que neurônios a toxicidade mediada pelo
MeHg. No mesmo trabalho foi demonstrado que 10µM de MeHg é letal para 50%
destas células após 24h de exposição. Em nossos experimentos, utilizando esta mesma
concentração, observamos que a mortalidade de 50% das células de retina foi atingida
logo nas seis primeiras horas de intoxicação sugerindo uma maior sensibilidade destas
células ao efeito tóxico do MeHg (Figura 6). Este fenômeno pode subsidiar estudos
comparativos que enfatizem o comportamento das respostas corticais e retinianas frente
a intoxicação com mercúrio, como por exemplo estudos relacionados a expressão de
metalotioneínas, visto que estas apresentam-se intensamente expressas em células
corticais de vertebrados, principalmente em astrócitos (Nishimura, 1991), enquanto na
retina a expressão destas proteínas é restrita a camada de células pigmentares e a
camada plexiforme interna (Hidalgo, 2001). Como as metalotioneínas atuam
diretamente no estoque e transporte de metais pesados, sua maior concentração na
região cortical pode ser um dos fatores responsáveis pela maior resistência destas
células a intoxicação por MeHg.
Além das metalotioneínas, a glutationa (GSH) representa o principal
agente de defesa celular contra a intoxicação por metais pesados no SNC (Meister,
1994), ao avaliarmos as concentrações intracelulares deste tripeptídeo em nossas
culturas após a intoxicação, observamos que as células de retina demonstraram uma
redução dos níveis de GSH dependente do tempo e da concentração de MeHg utilizada.
Nossos resultados também demonstram que a intoxicação mercurial
promove diminuição significativa na captação de cisteína em tempos e concentrações
elevadas de MeHg, estes resultados estão de acordo com os observados por Allen e cols
(2001) que demonstraram que MeHg diminui os níveis de GSH pelo bloqueio da
87
captação de seus precursores em astrócitos, principalmente pelo bloqueio do sistema
XAG- . Nas culturas de retina pudemos observar também que o comportamento da
captação de cisteína foi semelhante ao observado para captação de glutamato frente a
exposição ao mercúrio, demonstrando que o mercúrio simultaneamente induz e favorece
fenômenos de estresse oxidativo, uma vez que observamos a ativação nitrérgica pelo
excesso de glutamato na fenda e inibição da captação do precursor da síntese de GSH.
Embora a diminuição da captação de cisteína no ambiente celular
diminua os níveis de GSH, não descartamos a possibilidade desta redução estar
associada à conjugação do MeHg com GSH, visto que o MeHg tem alta afinidade pelo
grupamento sulfidrila (-SH) presente no resíduo de cisteína que compõe a GSH (Hughes
e cols 1957; Simpson e cols 1961). Quando nossas culturas foram tratadas com L-
metionina, que apresenta o grupamento sulfídrico(–S) no lugar do sulfidril (-SH), não
observamos ação protetora frente a intoxicação com MeHg, ratificando a importância
dos radicais –SH contra a ação tóxica promovida por este metal.
Estudos prévios têm demonstrado que a diminuição dos níveis
intracelulares de GSH diminui a viabilidade celular em culturas primárias (Shang e cols
2000). Em nossos experimentos, nas primeiras duas horas de intoxicação, observamos
que os níveis de GSH diminuem em função do aumento da concentração de MeHg, sem
que ocorra modificação significativa da viabilidade celular, o que parece demonstrar
que a diminuição dos níveis de GSH somada a ação direta do MeHg só influenciará na
viabilidade celular após o período de duas horas de intoxicação, o que justifica o
interesse de nossos estudos somente nos intervalos de intoxicação posteriores a este
período. Tal observação é confirmada posteriormente, visto que a exposição das células
ao MeHg, por quatro e seis horas, promoveu diminuição da GSH acompanhada da
diminuição significativa da viabilidade celular.
88
Nossa tentativa de proteger as células com GSH demonstrou que este
composto só preveniu contra ação tóxica do MeHg em quatro horas de exposição com
10µM. Em concentrações e tempos mais elevados, somente o tratamento com os
precursores de GSH, L-cisteína e meio condicionado, promoveu proteção celular em
nossos experimentos.
Nossos resultados estão de acordo com estudos recentes que
demonstram, em culturas corticais de neurônios e células da glia, um maior efeito
protetor da acetil-cisteína em relação ao tratamento com GSH contra a toxicidade
induzida pelo metilmercúrio (James e cols, 2005).
O fenômeno pelo qual a GSH não exerceu proteção nas células de retina
em longos intervalos de intoxicação e em altas concentrações de MeHg não é totalmente
esclarecido, entretanto este fenômeno pode estar relacionado ao fato da incorporação de
GSH, tanto por glias quanto por neurônios, necessitar inicialmente de uma quebra no
meio extracelular para o posterior transporte para o interior destas células, onde
finalmente será transformada em GSH pela glutationa sintetase (Dringen, 2000). Em
duas horas de pré-incubação com GSH possivelmente apenas parte deste processo
ocorre e a exposição às altas concentrações de MeHg e por longos intervalos de tempo,
este pode afetar as proteínas envolvidas na síntese de GSH, o que promove a diminuição
da nova síntese deste último fazendo com os níveis de GSH produzidos não sejam
suficientes para proteger contra o evento tóxico. A pré-incubação com os precursores de
GSH, faz com que as células rapidamente captem estas substâncias sem a necessidade
de um passo a mais de quebra como ocorre com a GSH, com isso ao intoxicarmos estas
células com MeHg, possivelmente as enzimas de síntese de GSH já tiveram tempo para
atuar e assim produzir GSH o que promoveria um efeito de proteção mais eficiente que
a doação da própria GSH. Entretanto o aumento da concentração de MeHg no meio,
89
bem como o tempo de exposição das células, diminui a capacidade de proteção dos
precursores de GSH, sugerindo que outras vias de morte celular, induzida pelo MeHg,
possivelmente estão atuando nas culturas.
A partir dos resultados observados neste trabalho, podemos descrever
que o NGF representa um importante fator na regulação da atividade nitrérgica e na
captação de L-arginina e que o sistema nitrégico participa diretamente no mecanismo de
ação do MeHg nas células de retina nos diferentes intervalos de intoxicação.
Nas primeiras horas, observamos que o MeHg induz o aumento do
glutamato na fenda sináptica com consequente ativação dos receptores NMDAs que
promoverão a entrada de cálcio nas células, uma vez aumentada a concentração do
cálcio intracelular, este pode desencadear diversas vias de citotoxicidade. O efeito
protetor do NARG, nas primeiras quatro horas, sugere que após o aumento do cálcio
intracelular a principal via de citotoxicidade nas culturas é mediada pela ativação do
sistema nitrérgico.
Quando aumentamos a concentração e/ou o tempo de exposição ao
MeHg observamos que outras vias de morte celular estão sendo ativadas, já que o
bloqueio dos receptores NMDAs e o tratamento com NARG independentemente
promovem pouca ou nenhuma proteção contra a ação neurotóxica do MeHg. Neste caso,
devido a alta concentração e o tempo de exposição, o MeHg pode estar se conjugando e
inativando proteínas importantes para manutenção da viabilidade celular, bem como
estar promovendo o aumento do cálcio intracelular por outras vias que não a de ativação
de NMDA, como pela liberação do cálcio presente em vesículas citoplasmáticas
(Atchison & Hare, 1994). Contudo o efeito sinérgico na proteção das células de retina
pela combinação MK-801 e NARG, demonstra que o aumento do cálcio intracelular e a
90
ativação do sistema nitrérgico apresentam um importante papel na neurotoxicidade
induzida por MeHg nas células de retina em cultura.
Paralelamente a este fenômeno a entrada do MeHg nas células de retina
diminui os níveis de GSH, fazendo com que as células tornem-se ainda mais sensíveis
ao estresse oxidativo produzido por este metal via produção de NO, pois a GSH além da
sua capacidade de conjugação com metais pesados, tem um importante papel na
inativação de ROS (Sarafian e cols, 1996). Altas concentrações de MeHg possivelmente
inativam as proteínas envolvidas na síntese de GSH nas primeiras quatro horas de
intoxicação, visto que nestas condições experimentais o tratamento com os precursores
de GSH exercem pouca proteção contra a ação tóxica do MeHg, sendo que esta
proteção possivelmente pode estar envolvida à conjugação direta do MeHg com estes
precursores que apresentam em sua constituição grupamentos sulfidrila (-SH).
91
5. CONCLUSÕES
Em culturas celulares de retina a atividade bioquímica da NO-Sintase,
bem como o padrão histoquímico para NADPH-diaforase, apresentam-se baixos nos
primeiros momentos do desenvolvimento in vitro, este padrão de atividade aumenta
conforme o aumento do tempo das células em cultura, sendo um padrão similar
observado no fenômeno de captação de L-arginina ao longo do tempo.
A ativação do sistema nitrérgico in vitro parece estar relacionada à
liberação de fatores no meio de cultura. O NGF representa um destes fatores uma vez
que o mesmo regula tanto o aumento da atividade da NOS quanto a captação do
principal substrato da NOS a L-arginina.
No oitavo dia de desenvolvimento in vitro o sistema nitrérgico parece
estar bem estabelecido em culturas celulares de retina de embrião de galinha, sendo este
um importante momento para analisar fatores ou drogas que podem influenciar no
funcionamento deste sistema.
O MeHg promove neurotoxicidade em culturas de células de retina com
oito dias de desenvolvimento, esta toxicidade mostrou-se dependente do tempo e da
concentração a qual as células são expostas. A ativação nitrérgica representa uma via de
ativação da neurotoxicidade induzida pelo mercúrio nas células de retina. O sistema
nitrérgico possivelmente foi ativado via NMDA por uma possível estimulação
glutamatérgica em virtude da diminuição da captação deste neurotransmissor induzida
pelo.
Um outro efeito do mercúrio nas células de retina é a diminuição dos
níveis intracelulares de GSH total ou pela diminuição da captação de cisteína ou pela
conjugação direta com os grupamentos –SH, sendo que ambos os fenômenos
contribuem para a diminuição da viabilidade celular.
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