mb 6 2012library.nuft.edu.ua/ebook/file/mb_6_2012.pdf2 issn 0201-8462. Ì³êðîá³îë....

© ²íñòèòóò ì³êðîá³îëîã³¿ ³ â³ðóñîëîã³¿ ÍÀÍ Óêðà¿íè ³ì. Ä.Ê. Çàáîëîòíîãî, 2012

ÍÀÖ²ÎÍÀËÜÍÀ ÀÊÀÄÅÌ²ß ÍÀÓÊ ÓÊÐÀ¯ÍÈ

²ÍÑÒÈÒÓÒ Ì²ÊÐÎÁ²ÎËÎÃ²¯ ² Â²ÐÓÑÎËÎÃ²¯ ³ì. Ä.Ê. ÇÀÁÎËÎÒÍÎÃÎ

ÍÀÖ²ÎÍÀËÜÍÈÉ ÓÍ²ÂÅÐÑÈÒÅÒ Á²ÎÐÅÑÓÐÑ²Â ² ÏÐÈÐÎÄÎÊÎÐÈÑÒÓÂÀÍÍß ÓÊÐÀ¯ÍÈ

Ç Ì ² Ñ ÒÅêñïåðèìåíòàëüí³ ïðàö³

ÍÀÓÊÎÂÈÉ ÆÓÐÍÀË

ÇÀÑÍÎÂÀÍÈÉ Ó 1934 ð.

ÂÈÕÎÄÈÒÜ ÎÄÈÍ ÐÀÇ ÍÀ ÄÂÀ Ì²ÑßÖ²

MICROBIOLOGICHNY ZHURNAL

Òîì 74, ¹ 6, ëèñòîïàä–ãðóäåíü, 2012

ÊÈ¯Â

Адамчук-Чалая Н.И. Морфо-функциональные изменения растений пшеницы яровой при взаимодействии с азоспирилламиТитова Л.В., Бровко И.С., Леонова Н.О., Воцелко С.К., Иутинская Г.А., Патыка В.Ф. Роль липкогенных компонентов в повышении физиологической активности ризобий и продуктивности соево-ризобиального симбиоза Гудзенко Е.В., Варбанец Л.Д. Очистка и физико-химические свойства α-L-рамнозидазы Сryptococcus albidus 1001 Шепелевич В.В., Киприанова Е.А., Ярошенко Л.В., Авдеева Л.В. Чувствительность Pseudomonas chlororaphis к антибіотикам и химическим средствам защиты растенийНогина Т.М., Думанская Т.У., Хоменко Л.А., Подгорский В.С. Эффективность препарата «Эколан-М» для очистки нефтяных загрязнений почвы Циганкова В.А., Андрусевич Я.В., Білявська Л.О., Козирицька В.Є., Іутинська Г.О., Галкін А.П., Галаган Т.О., Болтовська О.В. Pістстимулюючі, фунгіцидні і нематицидні властивості нових субстанцій мікробного походження та їх вплив на синтез малих si/mi РНК в клітинах рослинЗахарова О.М., Мельничук М.Д., Данкевич Л.А., Патика В.П. Бактеріальні хвороби ріпаку

Mudryk M.R. Plant-Isolated Pantoea agglomerans – New Look into Potential PathogenicityПритула И.Р., Таширев А.Б. Усовершенствование метода выделения водородобразующих бактерий рода СlostridiumЯнева О.Д., Сичкарь С.В., Воронина А.А., Подгорский В.С. Отбор термофильных штаммов дрожжей, активно сбраживающих лактозуКириченко А.М., Щербатенко І.С. Спонтанні заміни нуклеотидів у генах Х-вірусу картоплі Babenko L.P., Lazarenko L.M., Shynkarenko L.M., Mokrozub V.V., Pidgorskyi V.S., Spivak M.Y.

The Effect of Lacto- and Bifi dobacteria in Monoculture on the Vaginal Microfl ora in Norm and in Cases of Intravaginal StaphylococcosisMokrozub V.V., Lazarenko L.M., Babenko L.P., Shynkarenko-Sichel L.M., Olevinska Z.M., Timoshok N.O., Pidgorskyi V.S., Spivak N.Ya. Effect of Probiotic Strains of Lacto- and Bifi dobacteria on the Activity of Macrophages and Other Parameters of Immunity in Cases of Staphylococcosis

Îãëÿä ë³òåðàòóðèБалко А.Б. Характеристика, свойства, перспектива применения бактериоцинов

Þâ³ëå¿ ³ äàòèКатерина Іванівна Андреюк. До 85-річчя від дня народження

3

9

16

24

29

36

46

53

58

65

71

80

99

107

90

ISSN 0201-8462. Ì³êðîá³îë. æóðí., 2012, Ò. 74, ¹ 62

CONTENTS

Experimental Works

Adamchuk-Chala N.I.Morpho-Functional Changes of Spring Wheat Plants under Interrelation with Azospirillas Tytova L.V., Brovko І.S., Leonova N.O., Votselko S.K., Іutynska G.O., Patyka V.P. Role of Sticky-Gene Components in the Increase of Rhizobia Physiological Activity and Productivity of Soybean-rhizobia Symbiosis Gudzenko O. V., Varbanets L.D. Purifi cation and Physico-Chemical Properties of Cryptococcus albidus 1001 α-L- Rhamnosidase Shepelevich V.V., Kiprianova E.A., Yaroshenko L.V., Avdeyeva L.V. Sensitivity of Pseudomonas chlororaphis to Antibiotics and Chemical Means of Plant ProtectionNogina T.M., Dumanskaya T.U., Khomenko L.A., Pidgorskyi V.S. Effi ciency of the Preparation “Ekolan-M” for Purifi cation of Oil Polluted Soil Tsygankova V.A., Andrusevich Ya.V., Biljavska L.A., Kozyritska V. Е., Iutinska H.O., Galkin A.P., Galagan T.O., Boltovska O .V. Growth Stimulating, Fungicidal and Nematicidal Properties of New Microbial Substances and Their Impact on si/miRNA Synthesis in Plant Cells Zakharova O.M., Melnichuk M.D., Dankevich L.A., Patyka V.F. Bacterial Diseases f Rape

Mudryk M.R.Plant-Isolated Pantoea agglomerans – New Look into Potential PathogenicityPrytula I.R., Tashyrev O.B. Optimization of Bacteria Genus Clostridium Isolation MethodIanieva O.D., Sichkar S.V., Voronina A.A., Pidgorskyi V.S. Selection of Thermophilic Lactose-Fermenting Yeast StrainsKyrychenko A.N., Shcherbatenko I.S. Spontaneous Nucleotide Substitution in Potato Virus X GenesBabenko L.P., Lazarenko L.M., Shynkarenko L.M., Mokrozub V.V., Pidgorskyi V.S., Spivak M.Ya. The Effect of Lacto- and Bifi dobacteria in Monoculture on the Vaginal Microfl ora in Norm and in Cases of Intravaginal StaphylococcosisMokrozub V.V., Lazarenko L.M., Babenko L.P., Shynkarenko-Sichel L.M., Olevinska Z.M., Timoshok N.O., Pidgorskyi V.S., Spivak M.Ya. Effect of Probiotic Strains of Lacto- and Bifi dobacteria on the Activity of Macrophages and Other Parameters of Immunity in Cases of Staphylococcosis

Surveys of Literature Balko A.B. Characteristic, Properties, Prospect of Application of Bacteriocins

Jubilees and Dates Kateryna Ivanivna Andreyuk. On Her 85th Birthday

3

9

16

24

29

36

46

53

58

65

71

80

99

107

90

3ISSN 0201-8462. Ì³êðîá³îë. æóðí., 2012, Ò. 74, ¹ 6

Åêñïåðèìåíòàëüí³ ïðàö³

УДК 576.31.579.23.581.4+57.016.581.123

Н.И. Адамчук-Чалая

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, ул. Академика Заболотного, 154, Киев, ГСП, Д03680, Украины

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ЯРОВОЙ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ

С АЗОСПИРИЛЛАМИИзучены морфо-функциональные изменения фотосинтетического аппарата пшеницы яровой при

инокуляции активными штаммами диазотрофов рода Azospirillum. Инокуляция приводила к увеличению размеров клеток мезофилла 3-х листьев пшеницы яровой и количества хлоропластов в них. Максималь-ное число гран и объём фотомембран был в хлоропластах растений, инокулированных A. brasilense 77, что соответствовало увеличению содержания хлорофилла b. В клетках мезофилла растений, иноку-лированных A. brasilense 102, выявлено большее количество хлоропластов, митохондрий и пероксисом, сравнительно с другими вариантами. Растения пшеницы яровой, инокулированные штаммами, содер-жали значительное количество каротиноидов.

Ключевые слова: Azospirillum brasilense, ризосферная микроассоциация, пшеница яровая, фотосин-тетический аппарат.

Ассимилированные в процессе фотосинтеза продукты углеводного метаболизма в агроце-нозах расходуются в трофических цепях при участии многочисленных почвенных микроорга-низмов. Благодаря жизнедеятельности растительно-микробных микроценозов почва пополня-ется большим количеством метаболитов.

Среди почвенных диазотрофов, способных к фиксации молекулярного азота из атмосферы, особое внимание привлекают ризосферные бактерии рода Azospirillum [5, 8]. В ризосфере зер-новых культур азоспириллы формируют высокоэффективные микроассоциации, оказывающие стимулирующий эффект на рост и развитие растений [7], в частности пшеницы яровой [8].

Методами световой и электронной микроскопий с использованием флуоресцентных анти-тел и нуклеотидных зондов было установлено, что азоспириллы располагаются в муцигеле на поверхности корней растений, а также способны проникать во внутренние слои паренхимы, стимулируя рост и развитие растений [7, 8]. Однако, на сегодняшний день недостаточно изу-ченными остаются аспекты ответа растительного организма на действие азоспирилл, в част-ности зависимость ростовых и ассимиляционных процессов растений от инокуляции штамма-ми азоспирилл разной активности.

Материалы и методы. Изучение формирования микроассоциации Azospirillum brasilense с растениями пшеницы яровой (Triticum aestivum L.) сорта Ранняя 93 проводили в лаборатор-ных исследованиях в асептических условиях на базе Института сельскохозяйственной микро-биологии и агропромышленного производства НААНУ. Для этого зерновки растений стерили-зовали 0,1 % раствором AgNO3 в течении трех минут, промывали стерильной водопроводной водой, помещали в колбы Эрленмеера ёмкостью 50 мл с 200 г речного песка. Для проведения опытов песок сначала промывали водопроводной водой и высушивали при температуре 50-60 °С. Высушенный песок промывали концентрированной соляной кислотой, затем стериль-ной водой и снова высушивали. Промытый сухой песок помещали в колбы Эрленмеера, ув-лажняя питательным раствором Кнопа (60 % от полной влагоемкости песка) и стерилизовали в режиме 1 атм, 20 мин. Инокуляцию зерновок пшеницы яровой сорта Краса Полесья проводили трехсуточной культурой Azospirillum brasilense (штаммы 77, 102 и sp7 коллекции Института сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААНУ), которую выращивали на картофельном агаре с малатом. Инокуляционная нагрузка составляла 200 тыс. бактериальных клеток на одну зерновку. В контрольном варианте зерновки обрабатывали эк-вивалентным количеством стерильной водопроводной воды.

© Í.È. Àäàì÷óê-×àëàÿ, 2012


Приживаемость азоспирилл и локализацию в ризосфере и ризоплане пшеницы яровой оценивали с помощью методики анализа полимерных поверхностей обрастания, описанных в работе [8].

Серединные высечки 3-го листа растений фиксировали 3 часа в 3 %-м растворе глютараль-дегида на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,2). После промывки идентичным буфером материал фиксировали в растворе 1 %-го тетроксида осмия в течении 3-х часов, промывали буфером и дегидратировали в растворе этилового спирта восходящей концентрации от 30 % до 100 % и ацетоне. Для исследования образцов в трансмиссионном электронном микроскопе Jeol 1200-EX (Япония) образцы помещали в молды, заливали смесью эпоксидных смол и полимеризовали при температуре 37°С первые сутки и двое суток при 65°С. Состав смол: Еpon 812 – 3 мл, Araldit M – 2 мл, Epon DDSA – 5 мл, DMP – 6 капель. Нарезанные на микротоме LKB (Швеция) препараты контрастировали цитратом свинца по Рейнольду [4].

Морфометрию проводили по 50-ти медианным срезам клеток мезофилла для каждого из вариантов [4]. Статистическую обработку данных проводили по программе STAT.

Содержание хлорофиллов a, b и каротиноидов определяли спектрофотометрическим ме-тодом [6]. Каждый образец анализировали в пятикратной повторности.

Результаты и их обсуждение. Микротестирование пленок обрастания в корневой сис-теме пшеницы подтвердило наличие палочек азоспирилл в муцигеле на поверхности корней растений и в ризосфере. При анализе панорамных снимков архитектоники микроассоциаций пшеницы яровой с активными штаммами азоспирилл (рис. 1) просчитывали число бактерий (среднее из 50-ти) в поле зрения (табл. 1) в ризоплане растений на поверхности корней (рис. 1, фрагмент 1), в ризосфере пшеницы яровой в прикорневой области – до 2 мм от корня (рис. 1, фрагмент 2) и более 2 мм от корня (рис. 1, фрагмент 3).

Таблица 1Численность азоспирилл в корневой зоне пшеницы яровой

Локализация бактерий Количество клеток азоспирилл на 104 мкм2

A. brasilense 77 A. brasilense 102 Azospirillum Sp7на поверхности корней 24,14±3,89 28,49±8,85 20,36±3,92в прикорневой области 52,19±11,78 97,29±10,59 48,64±8,52в ризосфере 47,90±2,10 44,23±0,72 44,48±4,02

Примечание: уровень значимости p≤0.05

1 2 3

2

5 5 5

Рис. 1. Фрагмент корневой зоны пшеницы яровой: в ризоплане растений на поверхности корней (фрагмент 1), в ризосфере пшеницы яровой в прикорневой области – до 2 мм от корня (фрагмент 2) и более 2 мм от корня (фрагмент 3), стрелками указаны бактерии.


Достоверного отличия локализации азоспирилл исследованных штаммов на поверхнос-ти корней пшеницы яровой не обнаружено, но они существенно отличались от значительно больших показателей в прикорневой области и в ризосфере (табл. 2). Во всех вариантах ино-куляции количество клеток азоспирилл в ризосфере вдвое превышало их число на поверх-ности корней. Однако наибольшая плотность расположения бактерий во всех трех вариантах инокуляции наблюдалась в прикорневой области. При инокуляции зерновок пшеницы яровой A. brasilense 102 число бактерий в поле зрения в прикорневой области значительно возраста-ло в сравнении с обработкой A. brasilense 77 и Azospirillum Sp7. Причем количество клеток азоспирилл A. brasilense 102 в прикорневой области почти вдвое превышало их число в ри-зосфере.

На поперечных срезах пластинки листьев пшеницы яровой между одноклеточными сло-ями адаксиальной и абаксиальной эпидерм располагались округленные клетки мезофилла, содержащие многочисленные эллипсовидные хлоропласты по периферии клеток. Толщина мезофилла во всех вариантах была одинаковой. Изменения структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата пшеницы яровой при бактеризации разными штаммами азоспирилл по сравнению с вариантами без инокуляции (табл. 2, 3) проявились в достоверном увеличении размеров клеток и количества цитоплазматических органелл, воз-растании объёма фотомембран в хлоропластах и содержания основных пигментов листьев. Объём клеток мезофилла у бактеризованных растений был в 1,4-1,8 раз выше в сравнении с контролем (табл. 2).

Таблица 2

Морфометрия клеток мезофилла растений пшеницы яровой, инокулированной азоспириллами

Параметры клеток Контроль без инокуляции

Штаммы азоспириллA. brasilense 77 A. brasilense 102 Azospirillum Sp7

Толщина мезофилла, мкм 144,33±0,75 146,09±1,01 147,45±0,57 146,09±0,67Объём клеток, мкм3 1879±79 3445±128 2630±98 2690±128Количество в клетке: Хлоропластов 15,75±1.44 26,06±1.94 41,81±1,28 36,63±1,61Митохондрий 15,00±0,28 25,00±0,42 35,00±0,85 30,00±0,37Пероксисом 9,00±1,68 13,00±3,47 21,00±2,18 10,00±2,25Число гран в хлоропласте 12,00±0,32 17,00±0,98 15,00±0,27 14,00±1,23Объём фотомембран, мкм3 165,50±12.26 310,50±32.63 238,70±32,81 302,90±24,05


На усиление клеточного метаболизма, пластических и энергетических процессов в мезо-филле листьев бактеризованных растений указывало возрастание числа цитоплазматических органелл: увеличение в 1,6-2,6 раза количества хлоропластов и в 1,6-2,3 раза митохондрий в мезофилле инокулированых растений. Количество пероксисом при действии штаммов 77 и 102 увеличивалось в 1,4-2,3 раза. Возрастание по сравнению с контролем в трёх экспери-ментальных вариантах таких ультраструктурных показателей хлоропластов как числа гран в 1,1-1,4 раза и объёма фотомембран в 1,4-1,8 раза соответствует увеличению содержания хлорофиллов и каротиноидов в листьях инокулированных растений пшеницы яровой.

В ходе наших исследований при инокуляции зерновок пшеницы яровой бактериями рода Azospirillum отмечалось достоверное увеличение содержания хлорофилла а и суммы хлоро-филлов у инокулированых растений по сравнению с контролем (табл. 4). Это соответствует возрастанию объёма фотомембран и количества гран хлоропластов в клетках мезофилла со-ответствующих вариантов (табл. 3). Однако достоверное увеличение содержания хлорофилла b, который преимущественно сосредоточен в тилакоидах гран и состоит из пигмент-белковых комплексов фотосистемы 2 [11, 13], было отмечено только для варианта с обработкой штам-мом A. brasilense 77, где в хлоропластах при увеличении количества гран, возрастало и число тилакодов в гранах доходя до 25-ти в отдельных гранах. В двух других вариантах инокуля-ции содержание хлорофилла b было меньше контрольного значения, а именно в вариантах A. brasilense 102 и Azospirillum Sp7.


Таблица 3 Содержание хлорофиллов и каротиноидов растений пшеницы яровой,

инокулированной азоспириллами, мг/100 г листьев

Параметры клеток Контроль без инокуляции

Штаммы азоспириллA. brasilense 77 A. brasilense 102 Azospirillum Sp7

Хлорофилл a 122,57±3,32 228,26±3,88 137,86±3,49 165,27±3,58Хлорофилл b 44,93±0,60 54,97±0,72 43,42±0,57 39,70±0,51Сумма хлорофиллов a+b 167,50±5.90 232,14±15,24 181,28±6,39 204,97±6,78Каротиноиды 45,00±1,61 76,05±2,95 60,30±2,78 66,70±2,79


Микроорганизмы ризосферы, стимулирующие рост растений, формируют популяции высокой плотности в прикорневой области, как это было показано в опытах с пшеницей яро-вой, сахарной свёклой, картофелем, томатами, горохом [17]. От азотфиксирующих бактерий в надземную часть растений поступают продукты жизнедеятельности, способствующие уве-личению интенсивности фотосинтеза в растении-хозяине за счет накопления хлорофиллов в листьях и развития листовой массы [10].

Мы же предполагаем возможность коррелятивных связей увеличения числа бактерий A. brasilense 102 в корневой зоне пшеницы и количественных морфометрических показателей фотосинтетического аппарата пшеницы яровой при обработке зерновок данным штаммом.

Фотосинтетический аппарат растений является первичным продуцентом органических веществ, поступающих в почву. По мнению авторов [14] выделения корневых экссудатов со-ставляют около 20 % общего объёма продуктов фотосинтеза. При этом органическими вещес-твами интенсивно обогащается область ризосферы до 2 мм от поверхности корня.

Именно в прикорневой области пшеницы яровой нами выявлено увеличение числа бакте-рий A. brasilense 102 по сравнению с другими вариантами.

Поскольку для активации нитрогеназы необходимо присутствие АТФ, то в качестве до-полнительного фактора регуляции процесса азотфиксации у диазотрофов, авторы [16, 15] рас-сматривают путь поставки бактериям молекул АТФ из растений. Клеточными органеллами, запасающими энергию в мактоэргических связях АТФ в мезофилле растений, являются хло-ропласты, митохондрии, количество которых в клетках мезофилла инокулированных растений значительно возрастало. Кроме того, под действием инокулянтов одновременно усиливалось развитие фотомембран в хлоропластах клеток мезофилла.

При обработке семян пшеницы суспензией азоспирилл увеличивается прорастание ино-кулированных зерновок, активизируется хлоропластогенез [3], увеличивается вегетативная масса за счет возрастания как общей листовой поверхности, так и усиления процесса форми-рования корневой системы [2].

Полученные нами результаты согласуются с литературными данными о стимулирующем влиянии азоспирилл на растения в эффективных микроассоциациях стабильной популяциии диазотрофов [5, 8], использующей для питания синтезированные растением органические ве-щества.

В наших исследованиях инокуляция зерновок пшеницы яровой диазотрофами рода Azospirillum приводила к увеличению размеров клеток мезофилла 3-х листьев пшеницы яро-вой и количества хлоропластов в них. Наибольшее число гран и объём фотомембран был в хлоропластах растений, инокулированных A. brasilense 77, что соответствовало увеличению содержания хлорофилла b.

Известно, что изменение содержания хлорофилла в листьях бобовых растений влияет на динамику нитрогеназной активности клубеньков [3]. Антипчук с соавторами (1990) на приме-ре сортов разных бобовых культур показали положительную корреляцию между интенсивнос-тью азотфиксации в клубеньках и содержанием хлорофилла а в листьях. Следует подчеркнуть, что лишь хлорофилл а является первичным донором электронов и обеспечивает способность растений к фотосинтезу [12].

В клетках мезофилла растений, инокулированных A. brasilense 102, выявлено увеличение числа хлоропластов, митохондрий и пероксисом, сравнительно с другими вариантами, что


указывает на высокий уровень клеточного дыхания у инокулированных этим штаммом рас-тений. Растения пшеницы яровой, инокулированной A. brasilense 77 и Azospirillum sp7, содер-жали значительное количество каротиноидов, которые, в частности, способны исполнять роль тепловых фильтров растений при избыточном температурном воздействии.

Таким образом, изучение взаимоотношений сельскохозяйственных культур с различными штаммами азотфиксирующих бактерий на уровне микроассоциаций является одним из важ-ных направлений повышения продуктивности микробно-растительных систем.

Н.І. Адамчук-Чала

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, вул. Академіка Заболотного, 154, Київ, ГСП, D03680, Україна

МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ РОСЛИН ПШЕНИЦІ ЯРОЇ ПРИ ВЗАЄМОДІЇ ІЗ АЗОСПІРІЛАМИ

Р е з ю м еВивчено морфо-функціональні зміни фотосинтетичного апарату пшениці ярої при інокуляції ак-

тивними штамами діазотрофів роду Azospirillum. Інокуляція призводила до збільшення розмірів клітин мезофілу 3-x листків пшениці ярої та кількості хлоропластів в них. Найбільше число гран та об`єм фото-мембран був в хлоропластах рослин, інокульованих A. brasilense 77, що співпадало із збільшенням вмісту хлорофілу b. В клітинах мезофілу рослин, інокульованих A. brasilense 102, виявлено більшу кількість хлоропластів, мітохондрій та пероксисом, порівняно із іншими варіантами. Рослини пшениці ярої, іно-кульовані штамами, містили значну кількість каротиноїдів.

Ключові слова: Azospirillum brasilense, ризосферна мікроасоціація, пшениця яра, фотосинтетичний апарат.

N.I. Adamchuk-Chala

Zabolotny Institute of Microbiology and Virology,National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

MORPHO-FUNCTIONAL CHANGES OF SPRING WHEAT PLANTS UNDER INTERRELATION WITH DIASOTROPHS OF AZOSPIRILLAS

S u m m a r yThe morphological and functional changes of photosynthetic apparatus of spring wheat at inoculation by

active strains of Azospirillium genus diazotrophs were studied. Inoculation resulted in an increase of mesophyll cell size of 3 spring wheat leaves and chloroplasts in them. The largest number of grains and volume of photomembranes were presented in the chloroplasts of plants inoculated by A. brasilense 77, which coincided with an increase in chlorophyll b content. In the mesophyll cells of plants inoculated by A. brasilense 102 a greater number of chloroplasts, mitochondria and peroxysomes was found as compared to other options. The spring wheat plants inoculated by the strains contained a signifi cant amount of carotenoids.

The paper is presented in Russian.K e y w o r d s: Azospirillum brasilense, microassociate of rhyzosphere, spring wheat, photosynthetic

apparatus.T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Adamchuk-Chala N.I., Zabolotny Institute of Microbiology and Virology,

National Academy of Sciences of Ukraine; 154 Acad. Zabolotny St., Kyiv, MSP, D03680, Ukraine.

1. Антипчук А.Ф., Канцелярук Р.М., Рангелова В.М. и др.. Связь между фотоассимиляционной активностью бобовых растений и их симбиотической азотфиксацией //Микробиол. журн. – 1990. – 52, №6. – 49–53.

2. Антонюк Л.П. Почвенные ассоциативные симбиозы бактерій и злаков: от фундаментальних исследований к практическому использованию. Л.П. Антонюк, В.В. Игнатов // В кн. Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии. – Изд-во Сарат. ун-та, 1999. – С. 153–155.

3. Алисова С.М., Тихонович И.А. Использование хлорофильных мутантов гороха в качестве модели для изучения взаимосвязи между фотосинтезом и симбиотической азотфиксацией // Генетика. – 1983. – 19, №9. – С. 1512–1517.


4. Біологічний азот / [Патика В.П., Коць С.Я., Волкогон В.В. та ін.] За ред.. акад.. УААН В.П. Патики. – К.: «Світ», 2003. – 422с.

5. Васильев А.Е., Муравник Л.Е. Динамика клеточных компонентов тканей листа Populus deltoids (Salicageae) в ходе жизненного цикла //Ботан. журн. – 1997, – № 9. – С. 1–3.

6. Волкогон В.В. Ассоциативные азотфиксирующие микроорганизмы // Мікробіол. журн. – 2000. – 62, №2. – С. 51–68.

7. Гродзинский А.М. Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. – Киев: Наук. Думка,1973. – 567 с.

8. Козар С.Ф. Мікробні комплекси за участю азоспірил як регуляторів росту рослин // Агроекол. журн. – 2008. – Спец. вип. – С. 109–111.

9. Копылов Е.П. Селекция эффективных штаммов диазотрофов для инокуляции яровой пшеницы // Мікробіологія і біотехнологія. – 2007. – №1. – С. 67–73.

10. Копилов Є.П., Надкерничний С.П., Адамчук-Чала Н.І. Грунтовий сапрофітний гриб Chaetomium cochliodes Palliser як біотичний чинник формування ефективних асоціацій азоспірил з рослинами пшениці ярої // Вісник Харківського Національного Аграрного університету, серія Біологія. – 2010. – вип. 1(19). – С. 91–100.

11. Коць С.Я., Маличенко С.М., Кругова О.Д. та ін. Фізіолого-біохімічні особливості живлення рослин біологічним азотом. – К.: Логос, 2001. – 271с.

12. Кочубей С.М. Организация фотосинтетического апарата высших растений. – Киев: «Альтерпрес», 2001. – 204с.

13. Шипман Л.Л. Электронная структура и функции хлорофиллов и их феофитинов // Фотосинтез / Под ред. ОРТ. Д. Говинджи. – М.: Мир, 1987. – Т. 1. – С. 403–410.

14. Bassi R., Dainese P. The role of light-harvesting complex II and of the minor chlorophyll a/b proteins in the organization on the photosystem II antenna system // Current Researches Photosynthesis / Ed. M. Baltscheffsky. – Netherlands: Kluwer Acad. Publ., 1990. – 2. – P. 209–216.

15. Davey M.E., O`Toole G.A. Microbial biofi lms: from ecology to molecular genetics // Microbiol. and Mol. Biol. Revs. – 2000. – 64, N4. – P. 847–867.

16. Dobereiner J., Pedrosa F.O. Nitrogen fi xing bacteria in non leguminous crop plants. – Berlin; Heydelberg; N.Y.: Springer Verlag, 1987. – P. 155.

17. Gallori E. Effect of nitrogen compounds on nitrogenase activity in Azospirillum brasilense / E. Gallori, M. Bazzicalupo // FEMS Microbiol. Lett. – 1985. – 28. – P. 35–38.

18. Haas D., Reimmann C., Valverde C. Common mechanisms in benefi cial and deleterious host-microbe interactions // Biology of Plant Microbe Interactions: New bridges between рast and future: Proceeding of the 11 International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. – St. Peterburg, July 18-26, 2003. – St. Paul (Minn), 2004. – Р. 537–541.

Отримано 12.09.2011


УДК: 632.981.3 + 579.262

Титова Л.В., Бровко И.С., Леонова Н.О., Воцелко С.К., Иутинская Г.А., Патыка В.Ф.

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, ул. Академика Заболотного, 154, Киев, МСП, Д 03680, Украина

РОЛЬ ЛИПКОГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ В ПОВЫШЕНИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РИЗОБИЙ И

ПРОДУКТИВНОСТИ СОЕВО-РИЗОБИАЛЬНОГО СИМБИОЗАНа основе природного экзополисахарида ксантана и экзополисахаридакриламида разработана лип-

когенная композиция, добавление которой в культуральную жидкость обеспечивало увеличение жизне-способности клеток Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6035 при хранении инокулянта в 26,3 раза. Вве-дение регуляторов роста растений ивина или биосила в липкогенную композицию повышало выживае-мость ризобий. Применение гельного инокулянта B. japonicum способствовало активизации развития ризосферных микроорганизмов, накоплению в почве биогенных элементов и повышению продуктивности соево-ризобиального симбиоза.

Ключевые слова: ризобии, экзополисахариды, полиакриламид, физиологическая активность, соя Glycine max (L.) Merr., симбиоз, ризосфера, продуктивность.

Современные биотехнологии для растениеводства предусматривают использование био-препаратов на основе почвенных микроорганизмов, соответствующих требованиям экологи-ческой безопасности и обладающих широким спектром полезного действия на растения и ок-ружающую среду. Высококачественные микробные препараты способны сохранять высокий титр и физиологическую активность биоагентов в течение длительного времени. Актуальным является создание новых препаративных форм микробных препаратов, введение в их состав наполнителей, стабилизаторов, биологически активных веществ, гелеобразующих компонен-тов, способствующих не только пролонгированию сроков хранения, но и повышению адгезив-ных свойств биоагентов и их выживанию после инокуляции.

Улучшение адгезивных характеристик микробных препаратов может достигаться как за счёт увеличения продукции экзополисахаридов микроорганизмами-биоагентами, так и за счёт введения в культуральную жидкость гелеобразующих компонентов – силикагеля, полиакрила-мида, экзополисахаридов других микроорганизмов. Такие добавки должны быть безвредными для природных экосистем и человека, стабильными и обеспечивать активную жизнедеятель-ность интродуцированных микроорганизмов.

В настоящее время в растениеводстве широко используются липкогенные препараты, сре-ди которых – экологически безопасный препарат экзополисахаридакриламид (ЭПАА), разра-ботанный в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины [3, 11]. Препарат используется в технологиях выращивания сельскохозяйственных растений в качестве прилипателя. Показано, что ЭПАА увеличивает полевую всхожесть и стимулирует рост растений; повышает их устойчивость к корневым гнилям, головне, другим заболеваниям, к стрессам; продлевает срок действия микробных препаратов и пестицидов.

На основе бактериального экзополисахарида (ЭПС) ксантана и ЭПАА нами разработана липкогенная композиция, введение которой в инокулянты обеспечивает выживаемость ризо-бий при хранении [2, 9, 12].

Целью работы было изучение роли липкогенных композиций на основе ксантана и ЭПАА в улучшении качества бактериального препарата, продлении сроков его хранения, увеличении физиологической активности ризобий, а также повышении продуктивности соево-ризобиаль-ных систем.

Материалы и методы. Объектом исследований был высокоэффективный производс-твенный штамм клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6035 из кол-лекции отдела общей и почвенной микробиологии Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины [10].

В работе использовали липкогенные композиции на основе следующих гелевых компонен-тов: ЭПС ксантан, продуцентом которого является Xanthomonas campestris pv. сampestris ІМВ

© Òèòîâà Ë.Â., Áðîâêî È.Ñ., Ëåîíîâà Í.Î., Âîöåëêî Ñ.Ê., Èóòèíñêàÿ Ã.À., Ïàòûêà Â.Ô. 2012


В-8158; ЭПАА – сополимер, полученный полимеризацией акриламида (АА) и ксантана [11]. Кроме того, для повышения физиологической активности клубеньковых бактерий сои [13] в некоторые гелевые композиции вносили регуляторы роста растений ивин или биосил (про-изведены в Межведомственном научно-техническом центре НАН и МОН Украины «Агробио-тех»). Составы исследуемых липкогенных композиций и объемные соотношения компонентов приведены в табл. 1.

Таблица 1

Соотношение компонентов исследуемых липкогенных композиций№ п/п

Варианты липкогенных композиций

Соотношение компонентовАА, % ЭПС ксантан, % РРР, 1·10-10 мл/мл смеси

1 А 30 70 –2 В (ЭПАА) 70 30 –3 С 20 % В (ЭПАА) 80 –4 D 50 % В (ЭПАА) 50 –5 Е 30 % В (ЭПАА) 70 –6 F 30 % В (ЭПАА) 70 биосил7 G 30 % В (ЭПАА) 70 ивин

Клубеньковые бактерии сои выращивали в течение 4 суток на жидкой питательной среде следующего состава ( г /л): NaCl – 0,1; K2HPO4– 0,5; MgSO4 · 7Н2О – 0,2; FeCl3 – 0,01; маннит – 10,0; глюконат кальция – 1,5; дрожжевой экстракт – 2,0; рН 7,2.

В опытах по изучению динамики выживания ризобий в стерильные флаконы вносили ге-левые композиции и культуральную жидкость клубеньковых бактерий (в соотношении 1:1), перемешивали и оставляли на длительное хранение при комнатной температуре. В компози-ции № 6 и 7 вносили регуляторы роста растений ивин и биосил в концентрациях 1·10-10 мл/мл инокулянта. В контрольный вариант вместо гелевой композиции вносили стерильную водо-проводную воду. Динамику выживания ризобий в инокулянте изучали, определяя количество жизнеспособных клеток методом предельных разведений с последующим высевом на агари-зованную маннитно-дрожжевую среду.

Изучение эффективности гельных инокулянтов проводили на трех сортах сои: Романтика (опытные поля Уманского национального университета садоводства в Черкасской области), Алиса (опытные поля Института агроэкологии НААН Украины в Киевской области) и Арка-дия одесская (производственные поля ООО «Сербское» в Одесской области). Предпосевную обработку семян контрольного варианта проводили стерильной водопроводной водой, а опыт-ных вариантов – культуральной жидкостью B. japonicum (жидкий инокулянт) и свежеприго-товленной смесью культуральной жидкости и липкогена Е (гельный инокулянт). При этом бактериальная нагрузка на семена была одинаковой (107 клеток/семя). В полевом опыте с соей сорта Романтика определяли показатели формирования и функционирования фотосинтетичес-кого аппарата (количество хлорофиллов в листьях, ассимиляционную поверхность растений, содержание сухих веществ в листьях и стеблях, чистую продуктивность фотосинтеза), урожай и его качество по общепринятым методикам. В опыте с соей сорта Алиса учитывали количес-тво ризосферных микроорганизмов основных эколого-трофических групп [15], урожай и его качество, а также содержание биогенных элементов в почве до посева и в конце вегетацион-ного периода. Количество микроорганизмов, мобилизирующих органофосфаты, определяли на среде Менкиной с фенолфталеинфосфатом натрия. Содержание легкогидролизуемого азота определяли по Корнфилду, обменного калия и подвижного фосфора – по Кирсанову согласно ГОСТ 4288:2004 [5].

Экспериментальные результаты обрабатывали статистическим методом дисперсионного анализа с использованием пакетов специальных программ Microsoft Excel’03.

Результаты и обсуждение. Как показали предварительные испытания (рис. 1), самые благоприятные условия для выживания ризобий были в варианте с композицией Е, которая содержала 30 % ЭПАА и 70 % ЭПС. В контрольном варианте численность жизнеспособных клеток за 80 суток хранения уменьшалась в 3,0 раза. При введении липкогенной композиции в состав инокулянта (1:1) титр жизнеспособных клеток B. japonicum УКМ В-6035 в конце срока хранения превышал контрольную величину в 26,3 раза и составлял 2,8·1010 КОЕ/мл.


0

5

10

15

20

25

30

Количество жизнеспособны

х клеток

, мл

рд. К

ОЕ/

мл

Контроль А В С D Е

Рис. 1. Количество жизнеспособных клеток B. japonicum УКМ В-6035 при хранении в течение 80 суток в гелевых композициях:

А – 30% АА + 70% ЭПС; В – 70% АА + 30% ЭПС; С – 20% В + 80% ЭПС; D – 50% В + 50% ЭПС; Е – 30% В + 70% ЭПС.

* Численность бактерий до хранения составляла 3,3 · 109 кл/мл.** Здесь, а также на рис. 2 и в табл. 2 средние стандартные ошибки опытов не превышали 5-7 %.

Добавление в гелевый инокулянт регуляторов роста растений ивина или биосила (компо-зиции F и G) способствовало повышению жизнеспособности клубеньковых бактерий сои. Че-рез 50 суток хранения численность жизнеспособных клеток в этих вариантах была, соответс-твенно, в 5,0 и 3,3 раза выше, чем в варианте с композицией Е без фиторегуляторов (рис. 2).

0

1

2

3

4

5

Кол

ичес

тво

жиз

несп

особ

ных

клет

ок, м

лрд.

КО

Е/ м

л

Е F G

Рис. 2. Влияние гелевой композиции и регуляторов роста растений на жизнеспособность B. japonicum УКМ В-6035 при хранении в течение 50 суток.

* Численность бактерий до хранения составляла 1,0 · 109 кл/мл.

Результаты полевых испытаний гелевого инокулянта B. japonicum УКМ В-6035 свидетель-ствуют о его стимулирующем действии на растения сои. Как известно, содержание хлорофил-ла в листьях – один из основных факторов продуктивности растений, отражающий эффектив-ность фотосинтетического аппарата и степень его адаптации к условиям окружающей среды. Нами показано, что при обработке семян сои сорта Романтика исследуемыми микробными препаратами содержание хлорофилла в листьях растений в варианте с жидким препаратом в фазу бутонизации составляло 109,1 %, а в варианте с гельным препаратом – 136,4 % отно-сительно контроля без инокуляции (табл. 2). В фазе налива бобов самое высокое количество хлорофилла было отмечено в варианте с обработкой семян гельной композицией – 138,5 % по отношению к контролю.

Следует подчеркнуть стимулирующее влияние гельного инокулянта на развитие ассими-ляционной поверхности растений сои. В фазу бутонизации площадь листьев на 1 га посевов


этого варианта увеличивалась на 34,5 %, а в фазу налива бобов – на 60,5 % по сравнению с контролем.

Одним из важных физиологических показателей, характеризующих продуктивность рас-тений и определяющих эффективность агротехнологий во время формирования урожая, яв-ляется чистая продуктивность фотосинтеза. Обработка семян сои сорта Романтика исследу-емыми биопрепаратами способствовала увеличению этого показателя (табл. 2). Наивысшая продуктивность фотосинтеза была получена в варианте с обработкой семян гельным иноку-лянтом и составляла в фазу бутонизации 3,5 г/м2 за сутки или 120,7 % относительно контроля. В этом варианте отмечалось наибольшее количество сухого вещества в надземных органах сои, которое в фазе бутонизации и в фазе налива бобов составляло, соответственно, в листьях 108,8 и 105,3 %, а в стеблях – 106,6 и 126,8 %.

Таблица 2

Влияние обработки семян жидким и гельным инокулянтами на формирование и функционирование фотосинтетического аппарата у растений сои сорта Романтика

Вариант

Содержание хлоро-филла в листьях (а+b)

Ассимиляционная поверх-ность растений сои

Содержание сухих ве-ществ, % к контролю

Чистая продук-тивность фотосин-теза

Фаза буто-низации

Фаза на-лива бобов

Фаза бутони-зации

Фаза налива бобов

Фаза буто-низации

Фаза нали-ва бобов

мг/г

сухой ма

ссы

%

мг/г

сухой ма

ссы

%

Площадь листьев

на 1га

, м2

%

Площадь листьев

на 1га

, м2

%

Листья

Стебли

Листья

Стебли

г/м2 з

а сутки

% к

контролю

Контроль (без об-работки препара-тами)

1,1 100,0 1,3 100,0 15933,0 100,0 30289,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 2,9 100,0

Жидкий инокулянт 1,2 109,1 1,5 115,4 16390,2 102,9 36664,4 121,0 102,4 134,3 103,3 127,3 3,1 106,9

Гельный инокулянт 1,5 136,4 1,8 138,5 21427,8 134,5 48611,2 160,5 108,8 106,6 105,3 126,8 3,5 120,7

Установлено, что в вариантах с инокуляцией в корневой зоне растений сои увеличивалась численность микроорганизмов основных эколого-трофических групп (табл. 3). В фазе цвете-ния их количество преобладало над таким в контроле в 1,5-3,1 раза, а в фазе сбора урожая – в 1,4-4,0 раза. Особенно активизировалось развитие фосфатмобилизирующих, амилолитичес-ких и прототрофных бактерий. В конце вегетационного периода в варианте с гельным иноку-лянтом они были наиболее многочисленными. При этом количество прототрофных микроор-ганизмов превышало контрольный показатель в 4 раза, фосфатмобилизирующих – в 3 раза, амилолитических – в 1,6 раза.

Таблица 3

Влияние жидкого и гельного инокулянтов на развитие микроорганизмов разных эколого-трофических групп в корневой зоне сои сорта Алиса

ВариантЧисленность микроорганизмов, КОЕ млн./г почвы

Аммонифи-цирующие

Фосфатмоби-лизирующие

Амилолити-ческие

Прототроф-ные

Олигоазо-трофные

Фаза цветенияКонтроль (без инокуляции) 2,0±0,01 1,3±0,04 2,3±0,03 1,3±0,02 2,2±0,05Жидкий инокулянт 3,9±0,03 2,3±0,05 7,1±0,12 2,2±0,07 4,5±0,08Гельный инокулянт 3,6±0,09 1,4±0,07 4,1±0,10 2,5±0,04 3,3±0,07

Конец вегетационного периодаКонтроль (без инокуляции) 3,4±0,12 0,7±0,01 3,6±0,08 1,1±0,07 2,8±0,08Жидкий инокулянт 3,6±0,07 1,9±0,02 5,0±0,06 2,9±0,04 4,7±0,05Гельный инокулянт 2,4±0,08 2,1±0,08 5,8±0,08 4,4±0,09 3,8±0,09


Последействие инокуляции проявилось в статистически достоверном увеличении содер-жания основных биогенных элементов (легкогидролизуемого азота, подвижного фосфора, об-менного калия) в ризосферной почве сои в период сбора урожая (табл. 4).

Таблица 4Содержание биогенных элементов в ризосферной почве при выращивании сои сорта

Алиса с применением жидкого и гельного инокулянтов

Вариант

Содержание биогенных элементов в ризосферной почве в конце вегетационного периода

Легкогидроли зуемого азота, мг/кг

подвижного фосфора, мг/кг

обменного калия, мг/кг

Контроль (без инокуляции) 39 102 90Жидкий инокулянт 44 125 100Гельный инокулянт 41 171 94НСР0,05 0,12 0,34 2,02

Интегральным показателем эффективности агротехнологий является продуктивность рас-тений. Применение гельного инокулянта ризобий сои в производственных условиях позво-лило получить прибавки урожая зерна на трех сортах сои: Аркадия одесская – 23,5 %, Алиса – 25,1 %, Романтика – 31,2 % (табл. 5), что составило, соответственно, 6,0, 5,1 и 4,3 ц/га. При этом увеличивался вес 1000 семян у сои сорта Романтика – на 8,0 % относительно контроля и на 5,2 % относительно варианта с жидким инокулянтом, а у сои сорта Алиса – на 11,9 % относительно контроля.

Таблица 5Влияние разных препаративных форм инокулянта на продуктивность сои сортов

Романтика, Алиса и Аркадия одесская (полевые опыты)

ВариантУрожай сои сорта

Романтика Аркадия одесская Алисац/га % к контролю ц/га % к контролю ц/га % к контролю

Контроль 13,8 100,0 19,5 100,0 20,3 100,0Жидкий инокулянт 16,2 110,1 22,5 113,3 23,2 114,3Гельный инокулянт 18,1 131,2 25,5 123,5 25,4 125,1НІР0,05 1,94 0,3 1,1

Таким образом, сочетание полезных свойств сополимера экзополисахаридакриламида и бактериального экзополисахарида ксантана в разработанной нами липкогенной композиции позволило улучшить качество и повысить эффективность инокулянта клубеньковых бактерий.

Подходы к изготовлению гельных форм микробных препаратов на основе полиакрилами-да были разработаны в 1979 г. Y.R. Dommergues и соавт. [17]. Немного позже G. Jung с соавт. предложили использовать с этой целью другие биополимеры (альгинат, ксантан, камедь рож-кового дерева) [21]. Живые микробные клетки, включенные в гель этих полимеров, оказыва-лись защищенными от действия неблагоприятных факторов среды, а после внесения в почву полимер разлагался, освобождая микроорганизмы.

Гельные препараты имеют ряд преимуществ и, по данным многих авторов, часто оказыва-ются более эффективными, чем жидкие [7, 8, 16, 18, 20].

Гелеобразующие полимеры, покрывая семена воздухо- и водорегулирующей пленкой, спо-собствуют повышению устойчивости растений к стрессам и фитопатогенам в ранних фазах онтогенеза. Кроме того, они оказывают защитное действие на интродуцируемые и абориген-ные почвенные микроорганизмы от повреждающего действия экстремальных факторов (тем-пературы, высушивания, УФ-радиации) [14, 22].

Известно, что ЭПС микроорганизмов принимают участие в ряде биологических процес-сов, протекающих в почве: образовании гумуса и формировании структуры почвы [23]; со-здании биопротекторного эффекта по отношению к гуминовым кислотам [1]; образовании комплексных металлорганических соединений, из которых растения могут потреблять труд-нодоступные элементы питания [6]. Эти полимеры могут также влиять на интенсивность азотфиксации [8, 18].


Данные литературы свидетельствуют о трофической роли ЭПС как для самих продуцен-тов, так и для сопутствующих бактерий, что позволяет рассматривать эти вещества как важ-ный фактор, влияющий на функционирование микробных сообществ почвы [1]. Как показали наши исследования, гельный инокулянт способствовал активизации развития в ризосфере сои микроорганизмов основных эколого-трофических групп, особенно прототрофных, фосфатмо-билизирующих и амилолитических.

Микроорганизмы способны использовать внеклеточные полисахариды в качестве энерге-тических субстратов и источника электронов в реакциях дегидрирования, являющихся обя-зательным этапом окислительно-восстановительных процессов в микробной клетке, а также в качестве источников углеродного питания, включая ЭПС или продукты их деструкции в конструктивный обмен [4].

По данным M. Grula, почвенные микроорганизмы могут использовать в качестве субстрата и утилизировать азот полиакриламида, отщепляя аммонийные группы [19]. Показано также, что сульфатредуцирующие микроорганизмы способны использовать полиакриламид в качес-тве донора электронов.

Наблюдаемое нами увеличение сроков поддержания высокого титра ризобий сои в гель-ном инокулянте может свидетельствовать об использовании бактериями компонентов лип-когенной композиции в качестве субстрата. Введение этой композиции в состав инокулянта, по-видимому, способствовало повышению экологической пластичности ризобий. Кроме того, отмечалось лучшее развитие микроорганизмов основных эколого-трофических групп, что по-ложительно отразилось на продуктивности сои и показателях плодородия почвы.

Следует подчеркнуть, что полевые опыты проводились в условиях засухи. Так, по гидро-метеорологическим данным в Черкасской области апрель 2009 года характеризовался отсутс-твием осадков, а в мае и июне, в период активного роста растений и формирования симбиоза, количество осадков было, соответственно, на 31,2 и 41,7 % ниже среднемесячной нормы. В августе, когда растения находились в фенофазе налива бобов, осадков выпало в 13,3 раза меньше нормы. Вероятно, в этих условиях инокулированные гельным препаратом растения и их микросимбионты были защищены от засухи, и симбиотический аппарат функциониро-вал более активно. Бактериальные симбионты в cоставе липкогенного инокулянта быстрее адаптировались к неблагоприятным факторам среды и были лучше обеспечены питательными веществами, чем в варианте с жидким инокулянтом.

Таким образом, гелевые композиции на основе природного экзополисахарида ксантана и ЭПАА являются перспективными компонентами для повышения качества микробных препа-ратов с пролонгированным сроком хранения и стабильными свойствами. Гелевые микробные препараты обладают стимулирующим и адаптогенным действием на растения.

Л.В. Титовa., І.С. Бровко, Н.О. Леонова, С.К. Воцелко, Г.О. Іутинська, В.П. Патика

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ

РОЛЬ ЛИПКОГЕННИХ КОМПОНЕНТІВ У ПІДВИЩЕННІ ФІЗІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ РИЗОБІЙ ТА ПРОДУКТИВНОСТІ

СОЄВО-РИЗОБІАЛЬНОГО СИМБІОЗУ

Р е з ю м еНа основі природного екзополісахариду ксантану і екзополісахаридакриламіду розроблена липкоген-

на композиція, додавання якої в культуральну рідину забезпечувало збільшення життєздатності клітин Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6035 при зберіганні інокулянту в 26,3 рази. Введення регуляторів росту рослин івіну або біосилу в липкогенну композицію підвищувало життєздатність ризобій. Застосування гельного інокулянту B. japonicum сприяло активізації розвитку ризосферних мікроорганізмів, накопичен-ню в ґрунті біогенних елементів і підвищенню продуктивності соєво-ризобіального симбіозу.

Ключові слова : ризобії, екзополісахариди, поліакриламід, фізіологічна активність, соя Glycine max (L.) Merr., симбіоз, ризосфера, продуктивність.


L.V. Tytova, I.S. Brovko, N.O. Leonova, S.K. Votselko, G.O. Іutynska, V.P. Patyka

Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

ROLE OF STICKY-GENE COMPONENTS IN THE INCREASE OF RHIZOBIA PHYSIOLOGICAL ACTIVITY AND PRODUCTIVITY OF SOYBEAN-

RHIZOBIA SYMBIOSIS

S u m m a r yOn the basis of natural exopolysaccharide xanthan and exopolyacrylamide the sticky-gene composition

has been developed. Addition of that composition to the culture medium provided a 26.3 times higher viability of Bradyrhizobium japonicum UCM B-6035 cells during its storage. Introduction of plant growth regulators biosil or ivin into this composition increased the survival of rhizobia. Application of gel inoculant B. japonicum favored more intensive growth of rhizosphere microorganisms, nutrient’s accumulation in the soil and increased productivity of soybean-Rhizobium symbiosis.

The paper is presented in Russian.K e y w o r d s: rhizobia, exopolysaccharides, polyacrylamide, physiological activity, soybean Glycine max

(L.) Merr., symbiosis, rhizosphere, productivity.

T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Tytova L.V., Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine; 154 Acad. Zabolotny St., Kyiv, MSP, D 03680, Ukraine.

1. Андреюк Е.И., Иутинская Г.А., Изжеурова В.В., Васильев В.Н., Кигель Н.Ф., Иванова Н.И. Использование бактериальных экзополисахаридов ассоциациями почвенных микроорганизмов // Микробиол. журнал. – 1986. – 48, № 1. – С. 15–21.

2. Верхотурова І.С. Збереження життєздатності Rhizobium leguminosarum bv. vicеae в гелевих композиціях на основі липкогену ЕПАА // Матеріали V міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 12 -15 травня 2009р.): Тез. доп. – Львів, 2009. – С. 215.

3. Воцелко С.К., Гвоздяк Р.І., Данкевич Л.А., Литвинчук О.О., Патика В.П. ЕПАА – універсальний біологічний прилипач пестицидів і регуляторів росту рослин (Методичні рекомендації) – К., 2007. – 26 с.

4. Гоголева Е.В., Гречушкина Н.Н., Егоров Н.С. Экзополисахарид Mycobacterium lacticolum штамм 121 // Тез. докл. V съезда Всесоюзн. микробиол. о-ва. – Ереван, 1975. – С. 118.

5. Електронний збірник основоположних національних стандартів України в галузі ґрунтознавства, агрохімії та охорони ґрунтів. – Харків: ННЦ «Інститут ґрунтознавства та агрохімії імені О.Н. Соколовського», Технічний комітет стандартизації ТК 142 «Ґрунтознавство», 2008.

6. Зак Г.А. Роль хелатизирующих бактерий в почвенном питании растений // Тез. докл. V съезда Всесоюзн. микробиол. о-ва. – Ереван, 1975. – С. 91–96.

7. Каменєва І.А., Грітчина Л.Ю., Мельничук Т.М., Патика В.П., Воцелко С.К., Алексєєнко Н.В. Перспектива розробки гельних препаратів на основі агрономічно корисних мікроорганізмів // Матеріали ХІІ з’їзду Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (25–30 травня 2009 р.) – Ужгород: Ужгородський національний університет, 2009. – C. 376.

8. Кругова О.Д., Мандровська Н.М., Охріменко С.М. Вплив бактеріального екзополісахариду на ефективність симбіотичної азотфіксації рослин гороху і сої // Физиол. и биохимия культ. раст. – 2003. – 34, № 3. – С. 239–244.

9. Леонова Н.О., Гергало И.С., Титова Л.В., Воцелко С.К., Иутинская Г.А. Влияние липкогена «ЭПАА» и гелевых композиций на жизнеспособность клубеньковых бактерий сои // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. – Минск: Изд. И.П. Логвинов, 2008. – Т. 2. – С. 81–84.

10. Патент України 3324 UA, МКІ1 C1 C05 F 11/08, C 12 N 1/20 Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання добрив під сою / Скочинська Н.М., Антипчук А.Ф., Рангелова В.М., Канцелярук Р.М., Танцюренко О.В. // Опубл. 1994. – Бюл. № 6–1.

11. Патент України UA 24856A C 08F 120/56 Спосіб одержання співполімеру поліакриламіду (ЕПАА) / Видющенко Є.М., Воцелко С.К., Гвоздяк Р.І., Гнідець В.П., Литвинчук О.О., Сарібєков Г.С., Болоховська В.А. // Опубл. 15.02.2002. – Бюл. № 10.

12. Патент України UA 89120 С12 №1/00, А 01С 1/00 Композиція для інокуляції насіння бобових рослин на основі бульбочкових бактерій та липкогена ЕПАА / Леонова Н.О., Воцелко С.К., Титова Л.В., Гергало І.С., Іутинська Г.О., Патика В.П. // Опубл. 25.12.2009. – Бюл. № 24.


13. Патент України на корисну модель № 37579 Спосіб підвищення активності мікробних препаратів /Іутинська Г.О., Титова Л.В., Валагурова О.В., Козирицька В.Є., Леонова Н.О., Петрук Т.В., Білявська Л.О. // Опубл. 10.12.2008. – Бюл. № 23.

14. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко Ю.Р. Защитные функции экзополисахаридов, синтезируемых бактериями Acinetobacter sp. // Микробиология, – 1997. – 66, № 3. – С. 335–340.

15. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учебное пособие для вузов / под. ред. В.К. Шильниковой. –М.: Дрофа, 2005. – 256 с.

16. Шерстобоева Е.В., Дудинова И.А., Крамаренко С.Н., Шерстобоев Н.К. Биопрепараты азотфиксирующих бактерий: проблемы и перспективы применения // Мікробіол. журн. – 1997. – 59, № 4. – С. 109–117.

17. Dommergues Y.R., Diem H.G., Divies C. Polyacrylamide-entrapped Rhizobium as an inoculant for legumes // Appl. Environ. Microbiol. – 1979. – 37, N 4. – Р. 779–781.

18. Elegba M.S., Rennie R.J. Effect of different inoculant adhesive agent on rhizobial survival, nodulation and nitrogenase (acetylene-reducing) activity of soybeans (Glycine max (L.) Merrill) // Can. J. Soil Science. – 1984. – 64, N 4. – P. 631–636.

19. Grula M., Huang May-Lin, Sewell G. Interactions of certain polyacrilamides with soil bacteria // Soil Sci. – 1994. – 158, N 4. – P. 291–300.

20. Jawson M.D., Franzluebbers A.J., Berg R.K. Bradyrhizobium japonicum survival in and soybean inoculation with fl uid gels // Appl. Environ. Microbiol. – 1989. – 55, N 3. – P. 617–622.

21. Jung G., Mugnier J., Diem H.G., Dommergues Y.R. Polymer-entrapped rhizobium as an inoculant for legumes // Plant Soil. – 1982. – 65, N 2. – Р. 219–231.

22. Kremer R.J., Peterson H.L. Effects of carrier and temperature on survival of Rhizobium spp. in legume inocula: development of an improved type of inoculant // Appl. Environ. Microbiol. – 1983. – 45, N 6. – P. 1790–1794.

23. Martin J.P. Decomposition and binding action of polysaccharides in soil // Soil. Biol. Biochem. – 1971. – 3, N 1. – P. 33–41.


УДК 577.152.32

Е.В. Гудзенко, Л.Д. Варбанец

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины,ул. Академика Заболотного, 154, Киев МСП, Д 03680, Украина

ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА α-L-РАМНОЗИДАЗЫ CRYPTOCOCCUS ALBIDUS 1001

Из культуральной жидкости Cryptococcus albidus 1001 фракционированием сульфатом аммония, хроматографией на TSК-гелях Toyopearl HW-60 и Fractogel DEAE-650-s, а также на Sepharose 6B выде-лена α-L-рамнозидаза. Фермент очищен в 42 раза, его выход 0,7 %. Ферментный препарат не содержал других гликозидазных (кроме β-D-глюкозидазной) и протеолитической активностей. Молекулярная мас-са фермента по данным гель-фильтрации на Sepharose 6B составила 50 кДа. α-L-Рамнозидаза стабиль-на в течение 2 суток при 20 ºС. рН-Оптимум составил 4,0-5,0, термооптимум 60 ºС.

Ключевые слова: Cryptococcus albidus 1001, α -L-рамнозидаза, β-D-глюкозидаза, очистка, рН- и тер-мооптимум, рН- и термостабильность.

α-L-Рамнозидаза (α-L-рамнозид-рамногидролаза – К.Ф. 3.2.1.40) гидролитически отщеп-ляет концевые невостановленные α-1,2, α-1,4 и α-1,6 связанные остатки L-рамнозы в α-L-рамнозидах: гликолипидах, гликозидах, камедях, пигментах, смолах, специфических иммуно-полисахаридах, гетерополисахаридах бактериальных клеточных стенок, биофлаваноидах [2]. α-L-Рамнозидазу синтезируют некоторые млекопитающие, растения, грибы и бактерии. Изу-чены бактериальные продуценты α-L-рамнозидаз среди фитопатогенных бактерий Corticium rolfsii, представителей кишечной микрофлоры человека ─ Bacteroides, Sphingomonas sp. и природных изолятов, например, Clostridium stercorarium, выделенного из геотермального

© Å.Â. Ãóäçåíêî, Ë.Ä. Âàðáàíåö, 2012


источника. [18]. Из грибных продуцентов α-L-рамнозидаз в промышленности используются ферментные препараты Penicillium decumbens и Aspergillus niger.

Несмотря на то, что микробные α-L-рамнозидазы широко используются для улучшения аромата вин и уменьшения горечи в цитрусовых соках, о наличии этой ферментативной ак-тивности у дрожжей известно мало. Вместе с тем дрожжи с технологической точки зрения являются наилучшими продуцентами, поскольку характеризуются высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать любые источники питания и, в отличие от грибов, не загрязняют воздух спорами. Так, низкие уровни рамнозидазной актив-ности были обнаружены у Saccaromyces cerevisiae Tokaj 7, Hansenula anomala, Debaryomyces polymorphus [14], Aureobasidium pullulans, Candida guillermondii и Pichia angusta X349 [18]. Однако все эти продуценты синтезируют внутриклеточные α-L-рамнозидазы, что значительно затрудняет работу с ними.

Ранее [7] в результате скрининга дрожжевых музейных культур отдела физиологии про-мышленных микроорганизмов ИМВ НАН Украины, был отобран перспективный штамм Cryptococcus albidus 1001, продуцент внеклеточной α-L-рамнозидазы, изучены его трофичес-кие особенности, отработана оптимальная среда и условия культивирования с использовани-ем математических методов планирования эксперимента [8].

В данной статье приводятся результаты исследований по выделению, очистке, а также изу-чению ряда физико-химических свойств α-L-рамнозидазы C. albidus 1001.

Материалы и методы. Обьектом исследования был штамм Cryptococcus albidus 1001 (Saito) Skinner ІМВ Y-5039 – продуцент внеклеточной α-L-рамнозидазы, изолированный из филосферы кукурузы, 1968 г., Украина.

C. albidus культивировали глубинным способом на среде следующего состава, г/л: рамно-за – 1, пептон – 5, дрожжевой екстракт – 3, мальтэкстракт – 3, рН- 6; при температуре 28 °С на качалке со скоростью вращения 220 об/мин в течение 4 суток. По окончании ферментации биомассу отделяли центрифугированием при 5000 g, 30 мин.

α-L-Рамнозидазную активность определяли по методу Davis [9], используя в качестве суб-страта нарингин. За единицу активности энзима принимали такое его количество (концентра-ция белка 1 мг/мл), которое гидролизует 1 мкмоль субстрата за минуту в условиях опыта. Ре-акционная смесь содержала 0,1 мл раствора энзима в 0,1 М фосфат-цитратном буфере (ФЦБ), рН 5,2, 0,1 мл 2,5 мМ раствора субстрата. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 370С. Реакцию останавливали добавлением 3 мл 4 М раствора NaOН. Через 30 мин измеряли ин-тенсивность окрашивания реакционной смеси при длине волны 310 нм на спектрофотометре СФ26. Удельную активность рассчитывали как количество единиц активности, отнесенное к 1 мг белка.

При определении активности гликозидаз в качестве субстратов использовали следующие нитрофенильные производные (п-НФ) углеводов («Sigma», USA): п-НФ-β-Д-галактопиранозид, п-НФ-2-ацетамидо-2-дезокси-β-Д-галактопиранозид моногидрат, п-НФ-β-Д-ксилопиранозид, п-НФ-β-Д-глюкопиранозид, п-НФ-2-ацетамидо-2-дезокси-α-Д-глюкопиранозид, п-НФ-N-ацетил-β-Д-глюкозаминид, п-НФ-β-Д-глюкоронид, п-НФ-α-Д-маннопиранозид, п-НФ-α-Д-фукопиранозид, п-НФ-α-Д-ксилопиранозид.

Для определения активности гликозидаз к 0,1 мл раствора ферментного препарата добав-ляли 0,2 мл 0,1 М фосфат-цитратного буфера (ФЦБ) рН 5,2 и 0,1 мл 0,01 М раствора соответс-твующего субстрата в ФЦБ. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при темпе-ратуре 37оС. Реакцию останавливали добавлением 2 мл 1 М раствора бикарбоната натрия. К контрольной пробе добавляли те же компоненты, однако, в обратном порядке. Количество п-нитрофенола, который образуется в результате гидролиза, определяли колориметрическим методом по поглощению при 400 нм [1]. За единицу активности исследуемых гликозидаз (Е) принимали такое его количество, которое гидролизует 1 мкмоль соответствующего субстрата (“Sigma”, США) за минуту в условиях опыта.

Для выделения ферментного препарата к супернатанту культуральной жидкости добавля-ли сухой сульфат аммония до концентрации 30 % насыщения под контролем рН (~6,0). Смесь выдерживали в течение 10-12 ч при температуре 4 ºС, центрифугировали при 5000 g, 30 мин. Осадок отбрасывали, к надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония до 90 % насыще-ния. Смесь выдерживали в течении 6 ч при 4 ºС, центрифугировали при тех же условиях.


Осадок, полученный в результате фракционирования сульфатом аммония, центрифугиро-вали, растворяли в 1,5 объеме 0,01 М фосфатного буфера рН 7,0. Образец (приблизительно 30 мг белка) наносили на колонку (2,5 х 90 см) с TSК-Toyopearl HW-60 «Toyo Soda», (Япония), уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,0. Элюцию проводили тем же буфером, скорость протока 90 мл/ч. Фракции, в которых выявляли α-L-рамнозидазную активность, со-бирали, объединяли, концентрировали упариванием под вакуумом (до 9-10 мл, 5-10 мг белка) и наносили на колонку (3х35 см) с Fractogel DEAE-TSК-650-s «Merck» (Германия), уравно-вешенную 0,01 М трис-HCl буфером рН 6,0. Элюцию проводили в линейном градиенте NaCl (0-1 М), скорость 24 мл/ч. Рехроматографию проводили на колонке (1,3х52 см) с Sepharose 6B, уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,0. Элюцию осуществляли тем же буфером с 0,1 М NaCl со скоростью 60 мл/ч. На колонку наносили 2 мл образца (~3 мг белка).

Определение общей протеолитической активности проводили по методу Ансона в моди-фикации Петровой [5].

Содержание белка на всех этапах исследования регистрировали на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм, его количественное содержание определяли методом Lowry et al. [11]. Содержание нуклеиновых кислот определяли методом Спирина [6], нейтральных моносахаридов – методом Dubois et al. [10].

Молекулярную массу фермента оценивали методом гель-фильтрации на колонке с Sepharose 6B (1,3х52 см) в 0,01 М фосфатном буфере, рН 6,0. Калибровочную кривую для расчета моле-кулярной массы строили с помощью низкомолекулярных белков-маркеров («Pharmacia», Шве-ция): рибонуклеаза (13,7 кДа), протеиназа К (25 кДа), овальбумин куриный (43 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа).

Исследование влияния на ферментативную активность температуры проводили в интерва-ле от 0 до 80 ºС и значениях рН от 2,0 до 11,0, последний создавали с использованием 0,01 М универсального фосфатного буфера (УФБ). Термостабильность препарата определяли при температуре 37 ºС (время экспозиции 90 мин), рН-стабильность – при значениях рН реакци-онной смеси 4,0; 5,0; 6,0 и 7,0 (время экспозиции 24 часа). После истечения срока действия на фермент того или иного фактора отбирали аликвоты по 0,1 мл и определяли активность, как описано выше.

Результаты всех исследований статистически обрабатывали, используя критерий Стью-дента [4].

Результаты и их обсуждение. Получение высокоактивных ферментов в гомогенном со-стоянии – очень сложная задача, поскольку на многих его этапах необходимо контролировать изменение их активности, чтобы избежать значительных потерь. В то же время для каждого продуцента необходима своя, индивидуальная последовательность этапов получения высоко-очищенного препарата фермента. Поскольку бактериальные и особенно грибные продуценты есть полиферментными, α-L-рамнозидаза, как правило, синтезируется в комплексе с другими гликозидазами [2].

Изучение спектра гликозидазных активностей (β-галактозидазной, α- и β-ксилозидазной, α- и β-глюкозидазной, α- и β-глюкозаминидазной, β-глюкоронидазной, α-маннозидазной, α-фукозидазной) в культуральной жидкости C. albidus 1001 показало, что кроме α-L-рамнозидазной (0,3 ед/мг белка), выявлено только β-Д глюкозидазную активность (0,1 ед/мг белка).

Для выделения и очистки ферментного препарата α-L-рамнозидазы C. albidus 1001 ис-пользовали фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрацию, ионообменную хрома-тографию и рехроматографию на сефарозе 6В. Результаты очистки приведены в таблице.

В результате фракционирования сульфатом аммония активность α-L-рамнозидазы была повышена в 1,13 раза, а β-Д глюкозидазы в 1,2 раза, а в результате гель-фильтрации 90 % вы-сола сульфата аммония на TSК-HW-60 была получена фракция І (рис. 1), в которой в 16,6 раза была повышена активность α-L-рамнозидазы и в 20 раз β-Д глюкозидазы .

Последующая очистка ионообменной хроматографией фракции І на Fractogel DEAE-TSК-650-s с использованием градиента NaCl (0-1 М) (рис. 1) привела к дальнейшему повышению удельной активности обоих ферментов (в 22 и 21 раза по сравнению с исходной) соответс-твенно для α-L-рамнозидазы и β-Д глюкозидазы (рис. 2). Рехроматографией на сефарозе 6В ферментный препарат был очищен от остаточных сопутствующих белков (рис. 3, І ), что дало


возможность повысить активность α-L-рамнозидазы и β-Д глюкозидазы в 42 и 39 раза, соот-ветственно (рис. 3; ІІ а, ІІ б).

Однако, при помощи использованных методов очистки не удалось избавиться от β-Д-глюкозидазы, активность которой составляет 3,9 ед/мг.

Ферментный препарат был свободен от нуклеиновых кислот и содержал приблизительно 5 % углеводов. В препарате не выявлено протеазной активности.

Таблица

Основные этапы очистки ферментного препарата C. albidus 1001

Стадии очистки

Фрак-ция

Общее со-держание белка, мг

Общая актив-

ность*, Е

Выход, %

Удельная актив-ность,

Е/мг белка

Сте-пень очист-ки

Содержа-ние нук-леиновых кислот, мг

Содер-жание углево-дов, мг

Культуральная жидкость - 390 а-120

б- 40 100 а-0,3б-0,1 0 67 1260

Фракциони-рование 90% сульфатом аммония

- 30 а-10,2б-3,1 7,7 а-0,34

б-0,121,131,2 31 504

Гель-филь-трация на Toyopearl HW-60

I 5,46 а-27б-8,7 1,4 а-5,0

б-2,016,620 15 76

Анионооб-менная хро-матография на Fractogel DEAE-650-s

1 а1 б 3,3 а-33

б-10,2 0,85 а-6,6б-2,1

2221 0 34

Рехрома-тография на Sepharose 6B

II аII б 2,8 а-35,2

б-11 0,7 а-12,5б-3,9

4239 0 5

*Примечание: «а» - α- L-рамнозидазная активность; «б» - β-D-глюкозидазная активность.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 79 81 83 85 87

, 28

0

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6,

/-L-

D-

Рис. 1. Профиль элюции комплексного ферментного препарата C. albidus 1001 на TSK-HW-60


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101 106 111 116 121 126 131 136 141

, 28

0;

,/

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

NaC

l,

-L -D- NaCl

2

1

1

Рис. 2. Профиль элюции ферментного препарата C. albidus 1001 на Fractogel DEAE-650-s в градиенте NaCl (0-1 M)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5 10 15 20 25 30 35

, 28

0

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

, /

-L- - -

Рис. 3. Профиль элюции ферментного препарата C. albidus 1001 на сефарозе 6В

Молекулярная масса ферментного препарата, определенная с помощью гель-фильтрации на сефарозе 6В, составляла 50 кДа (рис. 4). Согласно данным литературы [14] диапазон моле-кулярных масс α-L-рамнозидаз различного происхождения очень широкий и разнообразный. Так, молекулярная масса фермента из грибных продуцентов составляла от 70 до 96 кДа, из бактериальных − от 95 до 240 кДа.


0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Kav

logW

1

2

3

4

Рис. 4. Молекулярная масса ферментного препарата C. albidus 1001 (Ф). Маркеры молекулярных масс: 1 – рибонуклеаза (13,7 кДа), 2 – протеиназа К (25 кДа),

3 – овальбумин куриный (43 кДа), 4 – бычий сывороточный альбумин (67 кДа)рН-Оптимум α-L-рамнозидазы C. albidus составлял 4,0-5,0, а в диапазоне значений рН от

4,0 до 6,0 сохранялось до 70-80 % от максимальной активности (рис. 5). Ферментный препарат характеризовался высокой стабильностью в данном диапазоне значений рН. В течение 12 мес. при рН 5,0 (4 ºС) не только сохранялась исходная активность α-L-рамнозидазы C. albidus, но и наблюдалось ее увеличение на 10 % (препарат сохранялся в 3М растворе сульфата аммония).

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14

, %

Рис. 5. рН-Оптимум действия α-L-рамнозидазы C. albidus 1001 (в процентах от максимальной активности)

По литературным данным [15,16,17,18], показатели рН-оптимумов и рН-стабильностей грибных гликозидаз находятся в интервале значений 4,0-6,0. Так, α-L-рамнозидаза A. niger стабильна в интервале рН 3,0-5,0 на протяжении 8 ч при 30°С [15]. Фермент A. terreus сохра-нял более 95 % активности при рН 4,0-6,5. При рН > 6,5 активность фермента прогрессив-но снижалась, а при рН 8,5 составляла только 10 % от максимальной [16]. α-L-Рамнозидаза A. aculeatus стабильна при рН 3,0-5,0, а A. nidulans – при рН 4,5 на протяжении 24 ч [17]. Фермент, выделенный из P. paucimobilis, был стабилен при рН 5,5-9,0 [14].

Как правило, скорость реакции, которую катализируют ферменты, увеличивается до опти-мального значения при увеличении температуры до точки, в которой фермент инактивируется. Было определено, что термооптимум активности α-L-рамнозидазы C. albidus находится при 60 ºС (рис. 6). Известно [15], что температурный оптимум действия большинства грибных α-L-рамнозидаз составляет 60-65 °С, очищенной α-L-рамнозидазы A. nidulans – 60 °С; при снижение температуры до 30 °С ее активность составляла 30 %, а до 20-25 °С – только 15 % исходной максимальной активности.


0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90, °

, %

Рис. 6. Термооптимум действия препарата α-L-рамнозидазы C. albidus 1001 (в процентах от максимальной активности)

Важным показателем для ферментных препаратов является их термостабильность. Извес-тно [3], что α-L-рамнозидазы различного происхождения отличаются термостабильностью: грибные и бактериальные α-L-рамнозидазы сохраняют активность на протяжении 4-6 ч при условии хранения их в температурном режиме 20-40 °С. Фермент, выделенный из A. terreus, был стабилен после 24 ч инкубации при 20 °С. Известно также, что после замораживания до -20 °С α-L-рамнозидаза P. paucimobilis оставалась стабильной на протяжении нескольких ме-сяцев при оптимальных значениях рН [2,12,13].

Нами показана высокая термостабильность исследованного фермента C. albidus. Так, на-блюдалось полное сохранение активности α-L-рамнозидазы при 20 ºС в течение двух суток, а при 37 ºС – в течение 90 мин. Подтверждена высокая стабильность препарата при сохранении его в насыщенном растворе сульфата аммония (3М) при 4 ºС в течение 1,5 лет и лиофильно высушенного препарата − в течение 6 мес. Замораживание препарата не снижало его актив-ности.

Таким образом, из культуральной жидкости C. albidus выделен и очищен ферментный пре-парат, который проявлял α-L-рамнозидазную и β-глюкозидазную активности (12,5 и 3,9 ед/мг белка соответственно), что немного выше удельной активности препаратов нарингиназы со-ответствующей степени очистки, выпускаемых зарубежными фирмами («Sigma» и «Аldrich»), в составе которых также присутствует β-D-глюкозидаза. Так, активность коммерческих пре-паратов нарингиназы из Penicillium decumbens и Penicillium sp. составляет не более 10 ед/мг белка, а гесперидиназы из A. niger − 0,5 ед/мг белка.

Штамм-продуцент любезно предоставлен нам из коллекции микроорганизмов отдела фи-зиологии промышленных микроорганизмов, канд. биол. наук С.С. Нагорной, за что выражаем ей искреннюю благодарность.

O.В. Гудзенко, Л.Д. Варбанець


ОЧИСТКА ТА ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ α-L-РАМНОЗИДАЗИ – CRYPTOCOCCUS ALBIDUS 1001

Р е з ю м еЗ культуральної рідини Cryptococcus albidus 1001 фракціонуванням сульфатом амонію, хроматогра-

фією на TSК-гелях Toyopearl HW-60 і Fractogel DEAE-650-s та Sepharose 6B виділена α-L-рамнозидаза. Фермент очищений в 42 рази, його вихід 0,7 %. Ферментний препарат не містив глікозидазних (крім β-D-глюкозидазної) і протеолітичної активності. Молекулярна маса ферменту за даними гель-фільтрації на Sepharose 6B склала 50 кДа. α-L-Рамнозидаза стабільна протягом 2 діб при 20ºС. рН-оптимум склав 4,0-5,0, термооптимум при 60ºС.

Ключові слова: Cryptococcus albidus 1001, α-L-рамнозидаза, β-D-глюкозидаза, очистка, рН- і тер-мооптимум, рН- і термостабільність


O.V. Gudzenko, L.D. Varbanets

Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev

PURIFICATION AND PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF CRYPTOCOCCUS ALBIDUS 1001 α-L- RHAMNOSIDASE

S u m m a r yA scheme of isolation and purifi cation of the enzyme with α-L-rhamnosidase activity from culture

liquid Cryptococcus albidus 1001 has been developed. It included fractionation by ammonium sulfate and chromatography on TSK-gels Toyopearl HW-60, Fractogel TSK DEAE-650-s and Sepharose 6B. The enzyme was purifi ed 42 times with the yield of 0.7 %. The enzyme preparation did not contain any glycosidase (except of β-D-glucosidase) and proteolytic activity. Molecular mass of the α-L-rhamnosidase preparation by the data of Sepharose 6B gel-fi ltration was 50 kDa. The enzyme preparation was stable during 48 hours at 20 °C, its pH and thermal optimum were 4.0-5.0 and 60 °C, correspondingly.

The paper is presented in Russian.K e y w o r d s: Cryptococcus albidus 1001, α-L-rhamnosidase, β-D-glucosidase, purifi cation, pH-and

thermal optimum, pH- and thermal stability.

T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Gudzenko O.V., Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine; 154 Acad. Zabolotny St., Kyiv, MSP, D 03680, Ukraine.

Борзова Н.В., Маланчук В.Н.1. Скрининг продуцентов α-N-ацетилгалактозаминидазы среди микроорганизмов различных таксономических групп // Микробиол. журн. – 2000. – 62, №5. – С.34–41.Варбанець Л.Д., Борзова Н.В.2. Глікозидази мікроорганізмів і методи їх дослідження. − Київ: Наук. думка, 2010. − 437 с.Диксон М., Уэбб Э3. . Ферменты. – М.: Мир,1982. – 816 с.Лакин Г.Ф.4. Биометрия. – М.: Высшая школа. – 1990. – 352с.Петрова И.С., Винцюнайте М.Н5. . Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробного происхождения // Прикл. биохим. и микробиол. –1966. – 2, №1. – С. 322–327.Практикум6. по биохимии / Под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьевой. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1989. – 509 с.Рзаєва О.М., Варбанець Л.Д., Нагорна С.С.,7. Скринінг продуцентів α-L-рамнозидази серед дріжджів //Мікробіол. журн. – 2010. – 72, №6. – C.11–17.Рзаєва О.М., Варбанець Л.Д., Гудзенко О.В8. . Оптимізація умов культивування дріжджів Cryptococcus albidus продуцентів α-L-рамнозидази // Там само. – 2010. – 72, №1. – С. 11–16.Davis W.B9. . Determination of fl avonones in citrus fruits // Anal. Chem. – 1947. –19, № 7. – Р. 476–478. 10. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Ibid. – 1956. – 28, N 3. – P. 350–356. 11. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R. J. Protein measurement with folinphenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – 193, N 2. – P. 265–275. 12. Manzanares P, van den Broeck H.C., de Graff L.H., Visser J. Purifi cation and characterization of two different α-L-rhamnosidases, Rha A and Rha B, from Aspergillus aculeatus // Appl. Environ. Microbiol. – 2001. – 67, N 5. – P. 2230 – 2234. 13. Manzanares P., Orejas M., Ibanez E., Valles S. et al. Purifi cation and characterization of an α-L-rhamnosidase from Aspergillus nidulans // FEMS Microbiol. Lett. – 2000. – 31 – P. 198–202. 14. Manzanares P., Valles S., Ramon D., Orejas M. α-L-rhamnosidase: old and new insights //Industrial Enzymes. – Springer, 2007. – Р. 117–140. 15. Monti D., Pisvejcova A., Kren V., Lama M., Riva S. Generation of an α-L-rhamnosidase library and its application for the selective derhamnosylation of natural products // Biotechnol. Bioengin. – 2004. – 87, N 6. – P. 765–771. 16. Soares N. F., Hotchkiss J.H. Naringinase immobilization in packaging fi lms for reducing naringin concentration in grapefruit juice // J. Food. Sci. – 2002. – 34. – P. 461–465. 17. Spagna G., Barbagallo R.N., Martino A., Pifferi P.G. A simple method for purifying glycosydases: α-L-rhamnopyranosidase from Aspergillus niger to increase the aroma of Moscato wine // Enzyme Microbiol. Technol. – 2000. – 27. – P. 522–530. 18. Takaaki Y., Michikatsu S. Purifi cation and characterization of an α-L-Rhamnosidase from Pichia angusta X 349 // Biosci. Biotechnol. Biochem. –2000. – 64. – P. 2179–2185. 19. Terada Y., Kometani T., Nishimura T., Takii H., et al. Prevention of hesperidin crystal formation in canned mandarin orange syrup and clarifi ed orange juice by hesperidin glycosides // Food Sci. Technol. Int. – 1995. – 1. – P. 29–33.



УДК 579.841+615

В.В. Шепелевич, Е.А. Киприанова, Л.В. Ярошенко, Л.В. Авдеева

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины,ул. Академика Заболотного, 154, Киев ГСП, ДО3680, Украина

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS К АНТИБИОТИКАМ И ХИМИЧЕСКИМ СРЕДСТВАМ ЗАЩИТЫ

РАСТЕНИЙИзучение чувствительности 10 штаммов трёх подвидов Pseudomonas chlororaphis к 54 антибио-

тикам показало, что все исследованные представители P.chlororaphis subsp. chlororaphis, P.chlororaphis subsp. aureofaciens и P.chlororaphis subsp. aurantiaca были чувствительны к антибиотикам-аминоглико-зидам и препаратам группы фторхинолона. Лишь часть испытанных штаммов были чувствительны к некоторым β -лактамным антибиотикам, имипенему и меропенему. В отличие от представителей двух других подвидов, оба штамма P.chlororaphis subsp. сhlororaphis оказались чувствительными к хлортет-рациклину и цефепиму, что позволяет рассматривать это отличие как дифференцирующий признак. Все изученные штаммы P.chlororaphis были резистентными к химическим фунгицидам (Скор и Свитч) и регуляторам роста насекомых (Матч, Люфокс, Энжио, Актеллик). Устойчивость бактерий к этим гербицидам свидетельствует о возможности их совместного применения.

Ключевые слова: Pseudomonas chlororaphis, чувствительность к антибиотикам, синтетическим фунгицидам и регуляторам роста насекомых.

Описанный ещё в 1894 г. вид Pseudomonas chlororaphis включает в настоящее время три подвида − P.chlororaphis subsp. chlororaphis, P.chlororaphis subsp. aureofaciens и P.chlororaphis subsp. aurantiaca. Все они были ранее описаны как самостоятельные виды псевдомонад, од-нако в связи с генетической близостью и фенотипическим сходством объединены под одним видовым названием [5].

Несмотря на более чем столетнюю историю исследований, до сих пор в биологии P.chlororaphis не всё пока выяснено. Набор признаков, дифференцирующих подвиды, крайне ограничен. Не охарактеризована их чувствительность к антибиотикам и другим химическим агентам, которая (в случае отличий между подвидами) могла бы служить дополнительным критерием для их дифференциации.

Вопрос об отношении штаммов P.chlororaphis к различным по своему строению биологи-чески активным веществам имеет и другой, чисто прикладной аспект. Штаммы P.chlororaphis subsp. aureofaciens являются перспективными агентами для биологического контроля заболе-ваний сельскохозяйственных растений [4]. Примером таких препаратов может служить био-препарат гаупсин [1, 6], созданный на основе двух штаммов P. chlororaphis subsp. aureofaciens и обладающий наряду с антифунгальной и антибактериальной значительной энтомопатоген-ной активностью. А поскольку для борьбы с возбудителями заболеваний и насекомыми-вре-дителями широко используются химические средства защиты растений, актуальным является выяснение вопроса о чувствительности к ним штаммов P.chlororaphis, от чего зависят возмож-ности их совместного использования.

Целью нашей работы было изучение чувствительности штаммов P.chlororaphis к антиби-отикам и применяемым в практике сельского хозяйства химическим средствам защиты рас-тений.

Материалы и методы. Объектом исследований служили 10 штаммов P.chlororaphis, поддерживаемых в Украинской Коллекции Микроорганизмов (УКМ), в том числе типо-вые штаммы двух подвидов P.chlororaphis subsp. chlororaphis УКМ В-106Т (АТСС 9446Т) и P.chlororaphis subsp. aureofaciens УКМ В-108Т (АТСС 13985Т), штаммы, изолированные нами ранее из различных источников: P.chlororaphis subsp. chlororaphis УКМ В-107 (ризосфера ба-нана), P.chlororaphis subsp. aureofaciens УКМ В-109, В-110, В-111 (почва), В-306 (ризосфера капусты), В-112 (АТСС 13986) а также штаммы P.chlororaphis subsp. aurantiaca (полученные ранее из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов как P.aurantiaca) УКМ В-113 (ВКМ В-548) и В-361 (ВКМ В-14). При испытании их чувствительности к антибиотикам для сравнения ис-пользовали типовой штамм P.aeruginosa B-1T (ATCC 10145Т).

© Â.Â. Øåïåëåâè÷, Å.À. Êèïðèàíîâà, Ë.Â. ßðîøåíêî, Ë.Â. Àâäååâà, 2012


Чувствительность бактерий к антибиотикам исследовали на среде Мюллера-Хинтона диф-фузионным методом с использованием стандартных дисков фирмы HiMedia Labs Ltd c бен-зилпенициллином, оксациллином, ампициллином, амоксиклавом, карбенициллином, азлоцил-лином, пиперациллином, амоксициллином, тикарциллином, стрептомицином, неомицином, канамицином, гентамицином, тобрамицином, сизомицином, амикацином, нетилмицином, олеандомицином, эритромицином, азитромицином, кларитромицином, рокситромицином, линкомицином, клиндамицином, тетрациклином, доксициклином, хлортетрациклином, цефа-золином, цефалексином, цефуроксимом, цефтибутеном, цефаклором, цефотаксимом, цефтри-аксоном, цефоперазоном, цефтазидимом, цефомандолом, цефепимом, фурадонином, фуразо-лидоном, нитроксолином, рифампицином, левомицетином, ванкомицином, тейкопланином, налидиксовой кислотой, офлоксацином, ципрофлоксацином, норфлоксацином, левофлоксаци-ном, спарфлоксацином, пефлоксацином, имипенемом, меропенемом. Чувствительность либо устойчивость бактерий к антибиотикам оценивали согласно стандартам NCCLS [7].

Для изучения действия на бактерии химических инсекто- и фунгицидов использовали препараты фирмы «Сингента» (Швейцария), предлагаемые в Украине для защиты растений от возбудителей заболеваний и насекомых-вредителей: фунгициды Скор и Свитч и регуля-торы роста насекомых Матч, Люфокс, Энжио, Актеллик. Препараты разводили в стерильной дистиллированной воде и вносили в расплавленный мясо-пептонный агар из такого расчета, чтобы их концентрация в питательной среде соответствовала максимальной концентрации растворов, используемых на практике, а также была в 2, 5 и 10 раз ниже. В качестве контроля в среду вносили дистиллированную воду. Приготовленные таким образом чашки засевали сус-пензиями суточных культур бактерий (1х109 клеток в мл по стандарту Мак-Ферлайна). Опыты учитывали после 18 часов инкубации при 28 оС.

Результаты и их обсуждение. Изучение действия на штаммы P.chlororaphis 54 антибиоти-ков и синтетических лекарственных веществ различного химического строения показало, что представители этого вида высоко устойчивы к антимикробным агентам. В их числе пеницил-лин и ряд его полусинтетических производных (табл. 1). Карбенициллин, эффективный в от-ношении типового штамма P.aeruginosa, не действует на испытанные штаммы P.chlororaphis. Интересно, что штамм В-111, входящий в состав биопрепарата гаупсин, устойчив к азлоцил-лину и пиперациллину, в то время как второй компонент препарата – штамм В-306 – слабо чувствителен к первому антибиотику и чувствителен ко второму, что позволяет отличать эти штаммы один от другого и определять их соотношение в популяции в процессе фермента-ции.

Таблица 1

Чувствительность к антибиотикам штаммов различных подвидовPseudomonas chlororaphis

Антибиотик№№ иследованных штаммов P. chlororaphis subsp.

chlororaphis aureofaciens aurantiaca 106т 107 108т 109 110 111 306 112 113 361

Зона задержки роста (мм)Азлоциллин 20S 18S 10R 18S 19S -R 17R 15R 16R 23S

Пиперациллин 28S 27S 18S 23S 24S 13R 18S 20S 17R 27S

Тикарциллин 25S 20S 0R 12R 15R -R 12R -R -R -R

Стрептомицин 20S 10R -R -R 11R -R 12R 15R -R -R

Неомицин 19S 20S 19S 17R 20S 20S 20S 16R 18R 19S

Канамицин 21S 23S 22S 23S 25S 28S 25S 25S 21S 24S

Гентамицин 21S 20S 19S 17S 19S 25S 22S 19S 17S 17S

Тобрамицин 21S 21S 20S 21S 20S 26S 26S 19S 17S 19S

Сизомицин 21S 22S 20S 17S 19S 23S 25S 19S 18S 19S

Амикацин 21S 20S 20S 20S 21S 25S 28S 25S 17S 23S

Нетилмицин 22S 20S 15S 15S 17S 22S 21S 16S 14R 15S

Тетрациклин 17I 17I 9R 8R 11R 11R 15R 12R 11R 10R

Доксициклин 15I 17S 9R 10R 9R 14R 10R 9R 10R 10R

Хлортетрациклин 20S 19S 10R 12R 12R 13R 15I 10R 13R 12R


Продолжение табл . 1Цефотаксим 30S 12R -R 10R 12R -R -R 10R -R 13R

Цефтриаксон 25S 10R -R -R -R -R -R 9R -R -R

Цефоперазон 28S 19I 20I 15R 16I 20I 15R 15R 18I 20I

Цефтазидим 25S 16I 16I 14R 20S 10R 10R 15I 18S 20S

Цефепим 27S 19S 12R 12R 16I -R 14R 11R 17I 14R

Рифампицин 10R 15R -R -R 12R 12R 15R -R 9R 9RНалидиксовая к-та 19S 12R -R -R 11R 10R 12R 9R 9R 10R

Офлоксацин 25S 25S 24S 21S 22S 25S 25S 22S 25S 26S

Ципрофлоксацин 26S 25S 25S 26S 30S 30S 30S 25S 28S 30S

Норфлоксацин 24S 22S 28S 25S 24S 30S 30S 22S 30S 30S

Левофлоксацин 24S 25S 28S 20S 25S 26S 25S 22S 30S 30S

Спарфлоксацин 24S 27S 22S 20S 26S 22S 25S 20S 23S 26S

Пефлоксацин 23S 24S 23S 22S 25S 28S 24S 23S 24S 27S

Имипенем 31S 14I 16S 17S 18S 27S 14I 29S 14I 20S

Меропенем 33S 10R 15I 12R 17S 28S 11R 25S 11R 20S

Примечание: S (sensitive) – чувствительные; I (intermediate) – промежуточные; R (resistant) – устойчивые; - – зона угнетения роста отсутствует.

Все штаммы устойчивы: к пенициллину, оксациллину, ампициллину, карбенициллину, амоксициллину, амоксиклаву, олеандомицину, эритромицину, азитромицину, кларитромици-ну, рокситромицину, линкомицину, клиндамицину, цефазолину, цефалексину, цефуроксиму, цефтибутену, цефаклору, цефомандолу, фурадонину, фуразолидону, нитроксолину, хлорамфе-николу, ванкомицину, тейкопланину.

Представители всех трех подвидов P.chlororaphis резистентны и к большинству антибио-тиков цефалоспориновой группы. Только на единичные культуры действовали цефтриаксон, цефотаксим, цефоперазон. Неэффективными в отношении этого вида бактерий были макро-лиды и многие другие антибиотики и синтетические антимикробные препараты. Высокую антимикробную активность в отношении всех штаммов P.chlororaphis проявляли антибиотики-аминогликозиды (кроме стрептомицина) и препараты группы фторхинолонов (от офлоксаци-на до пефлоксацина включительно).

Таким образом, P.chlororaphis – высоко резистентный к антибиотикам вид, сходный по своим антибиограммам с синегнойными бактериями. На этом фоне обращают на себя вни-мание штаммы P.chlororaphis subsp. chlororaphis, которые с одной стороны, отличались более высокими уровнями чувствительности к антибиотикам в целом, чем остальные изученные культуры. С другой стороны представители этого подвида (в отличие от штаммов двух других подвидов) оказались чувствительными к хлортетрациклину и цефепиму.

Для окончательных выводов необходимо испытание на более широком наборе культур, однако полученные данные свидетельствуют о возможности пополнить немногочисленный перечень отличий между подвидами P.chlororaphis их чувствительностью к хлотетрациклину и цефепиму (табл. 2).

Таблица 2

Фенотипические отличия между подвидами P.chlororaphis*

Признак P.chlororaphis subsp.chlororaphis

P.chlororaphis subsp.aureofaciens

P.chlororaphis subsp. aurantiaca

Пигменты-производные феназина:хлорорафинфеназин-карбоксилат

+-

-+

-+

Денитрификация + - -Ассимиляция: l-арабинозы 5-кетоглюконата

-+

++

+-

Чувствительность к тетрациклинуцефепиму

++

--

--

* по данным [3, 5] и настоящей работы

Представители подвидов «aureofaciens» и «aurantiaca» не отличались своими антибио-граммами.


Целью наших исследований было также выяснение отношения штаммов P.chlororaphis к химическим средствам защиты растений.

Все 10 изученных нами штаммов различных подвидов хорошо росли в присутствии высоких доз фунгицидов: 25−250 мкг/мл дифеноксазола и 180–1800 мкг/мл ципродинила в комбинации с 120−1200 мкг/мл флудиоксонила. Не ингибировали их рост и регуляторы роста насекомых: люфенурон (60−600 мкг/мл), феноксикарб (150−1500 мкг/мл), лямбда-ци-галотрин и тиаметоксам (3,8−38 мкг/мл и 5−50 мкг/мл, соответственно), метилпиримифос (100−1000 мкг/мл).

Полученные данные касались всех исследованных нами штаммов P.chlororaphis. Более де-тально мы сосредоточимся на двух из них – компонентах препарата гаупсин.

Из таблицы 3 видно, что активность гаупсина направлена против широкого спектра воз-будителей заболеваний и насекомых-вредителей. Большинство этих патогенов и вредителей являются и мишенью действия химических средств защиты растений.

Таблица 3Спектр биологической активности гаупсина

и некоторых химических средств защиты растений

Название препарата

Активные компоненты, входящие в состав

препарата

Характер биологической активности

Грибные заболевания и насекомые-вредители, чувствительные к препарату

Гаупсин

Штаммы P.chlororaphis subsp.

aureofaciens УКМ В-111,УКМ В-306

Инсекто-фунгицид

Оидиум, мильдью, черная пятнистость, серая гниль, мучнистая роса, аскохитоз, вертициллез, септориоз, фузариоз, фитоспороз, макроспориоз, пероноспороз и др. грибные инфекции; многие виды листоверток, тлей, пядениц, огневок, пло-до жерок, яблоневая моль, колорадский жук и др.

Скор ДифеноксазолФунгициды

Парша, мучнистая роса, альтернариоз, фитофтороз, серая гниль,белая и бурая пятнистость, плодовые гнили при хранении Свитч Ципродинил+

ФлудиоксонилМатч Люфенурон

Регуляторы роста насекомых

Чешуекрылые, плодожерки, листовертки, клещи, моли, щитовки, тли, пильщики, трипсы, колорадский жук, долгоносики и др.

Люфокс Феноксикарб + Люфенурон

Энжио Лямбда-цигало-трин + Тиаметоксам

Актеллик Метилпиримифос

Расход гербицидов для защиты яблоневого сада (взятого в качестве примера) составляет 7,5−9,0 кг инсектицидов и 12−14 кг фунгицидов за сезон на каждом гектаре [1]. По-видимому их совместное применение с гаупсином (о возможности которого свидетельствует устойчи-вость штаммов P.chlororaphis subsp. aureofaciens − компонентов биопрепарата гаупсин − к средствам химической защиты растений) могло бы привести к суммарному полезному эф-фекту, а с другой стороны – к сокращению расхода химических препаратов, существенному уменьшению пестицидного пресса на биоценозы и получению урожая, свободного от вред-ных химикатов.

Это предположение подтверждается сообщениями о попытках успешного применения гаупсина в комбинации с химическими средствами защиты растений в виде смесей для обра-ботки садов и виноградников [2], причем штаммы, входящие в состав гаупсина, были несов-местимы только с бордосской жидкостью и препаратами, содержащими медь. Таким образом, выводы, полученные в настоящей работе, находятся в соответствии с результатами работы садоводов-практиков, полученными эмпирическим путём.

В.В.Шепелевич, О.А.Кіпріанова, Л.В.Ярошенко, Л.В.АвдєєваІнститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,

Київ

ЧУТЛИВІСТЬ PSEUDOMONAS CHLORORAPHISДО АНТИБІОТИКІВ І ХІМІЧНИХ ЗАСОБІВ ЗАХИСТУ РОСЛИН

Р е з ю м еДослідження чутливості 10 штамів різних підвидів Pseudomonas chlororaphis до 54 антибіоти-

ків показало, що всі досліджені представники P.chlororaphis subsp. chlororaphis, P.chlororaphis subsp.


aureofaciens і P.chlororaphis subsp. aurantiaca були чутливі до антибіотиків-аміноглікозидів та препа-ратів групи фторхінолону. Лише частина досліджених штамів були чутливими до деяких β – лактамних антибиотиків, іміпенему і меропенему.

На відміну від представників двох інших підвидів обидва штами P.chlororaphis subsp. сhlororaphis виявилися чутливими до хлор- тетрацикліну і цефепіму, що дозволяє розглядати цю відміну як диферен-ціюючу ознаку.

Всі досліджені штами P.chlororaphis були резистентними до хімічних фунгіцидів (Скор і Світч) і регуляторам росту комах (Матч, Люфокс, Енжіо, Актеллік). Стійкість бактерій до цих гербіцидів свідчить про можливість їх спільного застосування.

К л ю ч о в і с л о в а : Pseudomonas chlororaphis, чутливість до антибіотиків, синтетичних фунгі-цидів і регуляторів росту комах

V.V.Shepelevich, E.A.Kiprianova, L.V.Yaroshenko, L.V.Avdeeva

.Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

SENSITIVITY OF PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS TO ANTIBIOTICS AND СHEMICAL TOOLS OF PLANT PROTECTION

S u m m a r yЕxamination of sensitivity of 10 Pseudomonas chlororaphis strains belonging to different subspecies to

54 antibiotics has shown that all studied representatives of P.chlororaphis subsp. chlororaphis, P.chlororaphis subsp. aureofaciens and P.chlororaphis subsp. aurantiaca were sensitive to aminoglycoside antibiotics and fl uo-roquinolones derivatives. Only part of studied strains has shown sensitivity to some β-lactam antibiotics, imi-peneme and meropeneme.

In contrast to representatives of two other subspecies both strains of P.chlororaphis subsp. сhlororaphis proved to be sensitive to chlortetracycline and cefepime that allows to consider this difference as the character-istic useful for differentiation.

All studied P.chlororaphis strains were resistant to chemical fungicides (Scor and Svitch) and the insect growth regulators (Match, Lufox, Engio, Actellik). Resistance of bacteria to these herbicides gives evidence that their combined use is possible.

The paper is presented in Russian.

K e y w o r d s: Pseudomonas chlororaphis, sensitivity to antibiotics, synthetic fungicides and insect growth regulators.

T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Shepelevich V.V., .Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine; 154 Acad. Zabolotny St., Kyiv, MSP, D 03680, Ukraine.

1. Гораль В.М., Лаппа Н.В., Гораль С.В., Гарагуля А.Д., Киприанова Е.А., Омельянец Т.Г., Смирнов В.В. Инсектофунгицидный препарат гаупсин на основе штаммов Pseudomonas aureofaciens // Прикл. Биохим. Микробиол. – 1999. – 35, № 5. – C. 596–598.

2. Гриценко А. Н. Биологический лекарь наших садов и виноградников // Сад, виноград і вино України. – 2004. – № 5–-6. – C. 42–43.

3. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. – Киев: Наук. думка, 1990. – 263 с. 4. Miller S.H., Mark G.L., Franks A., O.Gara F. Pseudomonas – Plant Interactions : Pseudomonas. Model

Organism, Pathogen, Cell Factory / Ed. by B.H.Rehm. – Weinheim :Wiley-VCH Verlag, 2008. – P. 353–370. 5. Рeix A., Valverde A., Rivas R., Igual J., Ramirez-Bahena M., Mateos P., Santa-Regina I., Rodrigues-Barrueco

C., Martinez-Molina E., Velazquez E. Reclassifi cation of Pseudomonas aurantiaca as a synonym of Pseudomonas chlororaphis and proposal of three subspecies, P.chlororaphis subsp.chlororaphis subsp. nov., P.chlororaphis subsp. aureofaciens subsp. nov., comb. nov. and P.chlororaphis subsp. aurantiaca subsp. nov., comb. nov. // Intern. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2007. – 57. – P.1286–1290.

6. Патент України № 73682 АО 1N 63/00 C 12 N 1/20. Інсектофунгіцидний препарат гаупсин для боротьби із шкідниками і хворобами сільськогосподарських культур / О.А. Кіпріанова, С.В. Гораль. – Опубл. 15.08.2005, Бюл. № 8.

7. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Fifteenth Informational Supplement // Clinical and Laboratory Standards Institute. – 2005. – 25, N 1. – P. 87–151.



УДК 579.87:612.455-032.32

Т.М. Ногина, Т.У. Думанская, Л.А. Хоменко, В.С. Подгорский

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины,ул. Академика Заболотного, 154, Киев ГСП, Д03680, Украина

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА «ЭКОЛАН-М» ДЛЯ ОЧИСТКИ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ ПОЧВЫ

Исследована эффективность очистки препаратом «Эколан-М» загрязненного нефтью чернозема суглинистого. В течение 12 месяцев комплексная биоремедиация почвы с использованием препарата и люцерны в качестве фитомелиоранта на завершающем этапе очистки привела к уменьшению содер-жания углеводородов на 97,0 %, а в отсутствии препарата – на 65,5 %. При этом в варианте опыта с препаратом через 8 месяцев достигнуто 100 % снижение фитотоксичности почвы и наблюдалось зна-чительное стимулирование роста и развития растений. Процесс очистки почвы сопровождался интен-сивным развитием углеводородокисляющих микроорганизмов, количество которых по мере снижения концентрации нефти постепенно уменьшалось, приближаясь к уровню в контрольной незагрязненной почве.

Ключевые слова : нефтяное загрязнение, углеводородокисляющие микроорганизмы, актинобак-терии, биоремедиация, фитотоксичность.

Нефть и нефтепродукты признаны в настоящее время наиболее распространенными ан-тропогенными факторами загрязнения окружающей среды [8, 11]. Высокое содержание этих веществ в почве нарушает экологическое равновесие природных ландшафтов, изменяет био-логические и агрохимические свойства почвы – повышает гидрофобность, уменьшает аэра-цию, отрицательно влияет на азотный, фосфорный и углеводный обмен, замедляет развитие или вызывает гибель почвенной флоры и фауны [5, 17]. Все это приводит к отчуждению за-грязненных земельных угодий из сельскохозяйственного оборота, которые становятся прак-тически непригодными для земледелия.

Наиболее эффективными и экологически безопасными являются биологические методы очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений, в которых решающее значение име-ет активность комплекса углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ). Искусственное внесение (интродукция) чистых или смешанных культур УОМ в загрязненную среду и со-здание благоприятных условий для их развития позволяет сократить сроки биоремедиации в пять и более раз [8]. Следует отметить, что деструкция нефти и нефтепродуктов в природных условиях является сложным многофакторным процессом, на который оказывают влияние со-став, концентрация и продолжительность действия загрязнителя, многообразие и изменчи-вость почвенно-климатических условий и биологических характеристик экосистемы, а также другие факторы. Это объясняет необходимость адаптации биоремедиационных технологий к конкретным условиям на загрязненной территории.

Целью данной работы было определение эффективности использования препарата «Эко-лан-М» для очистки загрязненной нефтью почвы.

Материалы и методы. Биоремедиацию загрязненной нефтью почвы (чернозем суглинис-тый) проводили в условиях полевого эксперимента с использованием разработанного нами ранее препарата «Эколан-М», который включает иммобилизованные на нефтепоглощающем сорбенте углеводородокисляющие актинобактерии и биогенные добавки. Эксперименталь-ная площадка была разделена на 3 части, каждая из которых состояла из 2-х отделенных друг от друга участков, площадью 1м2 каждый (рис. 1). Перед началом проведения работ почву пе-рекапывали на глубину 10–15 см, увлажняли до 60 % от полной влагоемкости почвы, подде-рживая ее на таком уровне в течение вегетационного опыта. На участки 1–4 вносили нефть в количестве 20 г/кг почвы, что в 5 раз превышает принятую в Украине норму ориентировочно допустимой концентрации (ОДК) нефти в почве [2].

© Ò.Ì. Íîãèíà, Ò.Ó. Äóìàíñêàÿ, Ë.À. Õîìåíêî, Â.Ñ. Ïîäãîðñêèé, 2012


Участки 1, 2 (Опыт)Нефть Препарат Минеральное удобрениеИзвесть

Участки 3, 4 (Контроль)

Нефть

Участки 5, 6 (Контроль)

Незагрязненная почва

Рис. 1. Схема полевого эксперимента

Для оптимизации соотношения углерода (С) и азота (N), нарушенного вследствие загряз-нения углеводородами, в почву вносили 625 г на 1 м2 минерального удобрения нитроаммо-фоски из расчета, что рекомендуемое соотношение С:N для нормального роста и развития нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненной среде составляет 100:5 [13]. При этом 1/3 от общего количества удобрения была внесена сразу, а остальные 2/3 – через две недели при повторной обработке почвы препаратом. С целью поддержания нейтрального значения рН среды в процессе окисления углеводородов в почву добавляли известь в количестве 2 г/кг почвы. Препарат вносили на загрязненные участки в таком количестве, чтобы численность УОМ составила не менее 106 клеток/г почвы. В качестве контроля использовали загрязнен-ную и незагрязненную почву, в которую не добавляли препарат и другие ингредиенты.

Всего биоремедиация включала 3 периода: І – умеренно теплый период продолжитель-ностью 3 месяца (август – октябрь), в течение которого проводилась агротехническая обра-ботка почвы на 1 и 2 участках; II – холодный период продолжительностью 6 месяцев (ноябрь-апрель), когда не проводилась обработка почвы; IIІ – теплый период продолжительностью 3,5 месяца (май – август), в течение которого проводилась фиторемедиация почвы путем выращивания люцерны (Medicago sativa L.). Основной целью продолжения эксперимента в холодный и последующий теплый период была оценка возможности протекания процесса деструкции углеводородов при низких температурах и максимальное снижение количества остаточных углеводородов в почве.

Отбор и подготовку образцов почвы для анализа проводили по стандартным методикам [7]. Количество УОМ исследовали на жидкой минеральной среде Бердичевской [1] c исполь-зованием метода десятикратных предельных разведений с применением для пересчета таб-лиц Мак-Креди [14]. Содержание углеводородов определяли на анализаторе нефтепродуктов АН-1 с предварительной их экстракцией четыреххлористым углеродом [12]. Фитотоксичные свойства почвы изучали по приросту биомассы надземной части и корней, а также, по общей массе тест-растения кукурузы (Zea mays L.) сорта Брусница [18]. Контролем служила чистая почва.

Все опыты выполняли в трех повторностях, статистическую обработку данных проводи-ли с использованием компьютерной программы Microsoft Offi ce Excel 2003.

Результаты и их обсуждение. Исследование фракционного состава использованной в ра-боте сырой нефти (плотность 0,88 г/мл) показало, что она содержала 63,9 % парафино-нафте-новой, 32,2 % ароматической и 3,9 % смолисто-асфальтеновой фракции углеводородов.

Установлено, что геохимический фон (кларк) углеводородов в контрольной незагрязнен-ной нефтью почве составлял 0,56 г/кг. Это незначительно превышает кларк углеводородов в почвах европейских стран (0,01–0,5 г/кг почвы), однако ниже, чем в крупных городах Украи-ны (1–3 г/кг) и на территориях, прилегающих к предприятиям переработки и добычи нефти, где фон достигает 6 г/кг почвы [16]. Согласно предложенным для черноземной зоны Украины градации загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами [3, 16] использованная нами в работе концентрация нефти 20 г/кг почвы соответствует сильному уровню загрязнения.

Изучение динамики деструкции углеводородов на загрязненных участках показало, что уже через 15 суток после начала эксперимента уровень деструкции нефти препаратом «Эко-лан-М» достиг значения 34,3 %, что в 5,5 раз превышало показатели варианта опыта без препарата, где проходили процессы самоочистки почвы аборигенными нефтеокисляющими микроорганизмами (рис. 2). В конце первого периода эксперимента (август – октябрь) эф-фективность деструкции углеводородов при использовании препарата достигла 75,6 %, что соответствовало снижению уровня загрязнения с 20 г/кг до 4,9 г/кг, то есть имело близкое к ОДК значение. При этом в почве без препарата уровень деструкции углеводородов был зна-чительно ниже (30,4 %).


0102030405060708090

0,5 1 2 3 8

,

, %

+ + +

Рис. 2. Динамика деструкции нефти в течение 8 месяцев (август – март) в черноземе суглинистом.

Дальнейшие наблюдения показали, что процесс разложения углеводородов частично про-должался и в холодный период года (ноябрь – март). За это время концентрация нефти в поч-ве, где использовался препарат, уменьшилась на 8,7 %, а содержание углеводородов в ней (3,1 г/кг почвы) было в 1,3 раза ниже ОДК, но превышало их фоновое количество в 5,6 раза. Таким образом, за первые два периода эксперимента уровень деструкции углеводородов при использовании препарата достиг 84,3 % (рис. 2). В отличие от этого, в почве без препарата деструкция углеводородов протекала значительно медленнее и составила всего 37,2 %, что соответствовало содержанию остаточных углеводородов 12,6 г/кг почвы.

Анализ динамики численности УОМ в почвах всех вариантов опыта показал, что началь-ное количество этих микроорганизмов в незагрязненной почве составляло 7,2 х 104 клеток/г почвы. При внесении препарата в загрязненную почву численность УОМ в ней достигла зна-чения 2,1 × 106 клеток/г почвы (рис. 3).

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

0 0,5 1 2 3 8

c ,

,

/

+ + +

103

104

105

106

107

108

109

Рис. 3. Численность углеводородоокисляющих микроорганизмов в почве при ее биоремедиации.

Наибольшее количество УОМ в загрязненной почве как при использовании препарата, так и без него наблюдалась через 1 месяц от начала эксперимента и составляла 3,3 × 108 и 8,5 × 105 клеток/г почвы, соответственно. По мере снижения содержания нефти численность УОМ в почве, где использовался препарат, постепенно уменьшалась, приближаясь к значению в незагрязненной почве, исключая тем самым возможность побочного негативного явления


интродукции – дополнительного микробного загрязнения окружающей среды. Полученные нами данные согласуются с представленными в литературе результатами изучения процессов биоремедиации нефтезагрязненных почв и их влияния на развитие углеводородокисляющих микробных сообществ [11, 15].

Известно, что одним из основных критериев пригодности очищенной от нефти и нефтеп-родуктов почвы для сельскохозяйственного использования является уровень ее фитотоксич-ности [5, 6]. При этом следует отметить, что негативное влияние углеводородов нефти на рост и развитие растений обусловлено не только непосредственным токсическим действием этих веществ, но и нарушением водного режима почвы, главным образом из-за увеличения ее гидрофобности и снижения влагоемкости [8, 17]. Установлено, что в условиях нашего эк-сперимента внесение нефти уменьшало влагоемкость почвы на 46,5 % относительно незаг-рязненной почвы (рис. 4).

0102030405060708090

100

0 3 8

,

, %

+ + +

Рис. 4. Влияние нефтяного загрязнения на влагоемкость почвы.В процессе биоремедиации по мере уменьшения содержания нефти, влагоемкость почвы

в варианте опыта с препаратом постепенно возрастала и через 3 месяца приблизилась к значе-ниям в контрольной незагрязненной почве. В отсутствии препарата этот показатель увеличи-вался более медленно, достигнув к 8 месяцам 45,0 %.

Тестирование загрязненной нефтью почвы по токсикологическим параметрам показало, что ее первоначальная фитотоксичность по отношению к тест-растениям кукурузы достига-ла 85,1 %. Через месяц после начала эксперимента почва еще обладала достаточно высоким уровнем фитотоксичности, что проявлялось, как в уменьшении всхожести семян кукурузы (рис. 5), так и в ингибировании прироста биомассы тест-растений (рис. 6). Установлено, что в варианте опыта, где вносился препарат, ингибирование прироста массы проростков кукурузы по сравнению с контрольной незагрязненной почвой было значительно меньшим (41,3 %), чем без препарата (65,3 %).

1 2 3 1 2 3

Рис. 5. Влияние загрязненной и очищенной препаратом в течение месяца почвы на прорастание семян кукурузы: 1 – почва + нефть + препарат; 2 – почва + нефть;

3 – незагрязненная почва.


8

2 1

-80-60-40-20

020406080

,

, %

+ + +

Рис. 6. Изменение фитотоксичности почвы в процессе ее биоремедиации.

Уже через 2 месяца в обработанной препаратом почве всхожесть семян сравнялась с ана-логичными показателями незагрязненной почвы, а в варианте опыта без препарата всхожесть достигала значения 70,0 % от уровня в незагрязненной почве. При этом в почве с препаратом угнетение прироста биомассы тест-растений относительно незагрязненной почвы составило 17,5 %, а без препарата – 46,3 % (рис. 6).

В конце второго периода биоремедиации (через 8 месяцев от начала эксперимента) в за-грязненной нефтью почве без препарата уровень фитотоксичности снизился до 15,8 %. К это-му времени очищенная препаратом почва не только не проявляла фитотоксичности, но и вы-зывала значительное (на 61,5 %) стимулирование роста и развития тест-растений кукурузы. Это может быть связано с влиянием метаболитов, синтезируемых УОМ при усвоении нефти и/или промежуточных продуктов ее деструкции, которые содержат вещества – регуляторы роста растений. Подтверждением этого служат полученные нами ранее [4] данные о способ-ности, входящих в состав препарата актинобактерий, при усвоении углеводородов синтези-ровать поверхностно активные вещества, содержащие трегалозолипиды, которые, по данным литературы [15], стимулируют рост растений. Кроме того, известно, что углеводородокисля-ющие бактерии ризосферной зоны растений при метаболизме ароматических углеводородов и их производных способны синтезировать фитогормоны [10].

Исследование влияния очищенной препаратом и загрязненной нефтью почвы на прирост биомассы надземной части и корней кукурузы (рис. 7, 8) показало, что в вариантах опыта с препаратом наблюдалось значительное стимулирование прироста надземной части (78,7 %), и в меньшей степени – корней растения (25,6 %) по сравнению с незагрязненной почвой. Вместе с тем, в загрязненной нефтью почве, где не использовался препарат, было отмечено ингибирование на 25,7 % развития надземной части растений и незначительное стимулиро-вание (на 14,9 %) прироста биомассы корней.

1 2 3 1 2 3Рис. 7. Развитие кукурузы в очищенной препаратом в течение 8 месяцев

и загрязненной нефтью почве: 1 – почва + нефть + препарат; 2 – почва + нефть; 3 – незагрязненная почва.


60

80

100

120

140

160

180

200

При

рост

био

мас

сы, %

к к

онтр

олю

Корни Надземная часть

Почва+ нефть+ препарат

Почва+ нефть

Рис. 8. Влияние очищенной препаратом в течение 8 месяцев и загрязненной нефтью почвы на развитие корней и надземной части кукурузы.

На завершающем этапе очистки почвы от нефтяного загрязнения во время третьего пери-ода (май – август) была проведена фиторемедиация с использованием люцерны. Как извест-но, основной задачей этого этапа очистки является интенсификация почвенно-биологических процессов, способствующих кометаболическому разложению наиболее труднодоступных компонентов остаточной нефти [8, 9]. Использование в наших опытах люцерны как фито-мелиоранта основывалось на том, что это растение повышает эффективность детоксикации нефтезагрязненных почв, проявляет устойчивость к нефтяным углеводородам и к неблагопри-ятным факторам среды, в частности, засухе и засоленности [17, 6].

Нами установлено, что люцерна, выросшая на почве, где ранее использовался препарат, давала более ранние (на 10 суток) и более дружные (на 20 %) всходы по сравнению с конт-рольной незагрязненной почвой. При этом в почве без обработки препаратом наблюдалась существенная (до 20 суток) задержка появления всходов относительно незагрязненной почвы. После фиторемедиации почва не проявляла фитотоксичности, содержание остаточных угле-водородов в варианте опыта, где вносился препарат, снизилось до близкого к фоновому значе-нию и составило 0,6 г/кг почвы, а в варианте опыта без применения препарата их количество снизилось до 6,9 г/кг почвы. Суммарная очистка обработанной препаратом почвы за весь пе-риод наблюдений составила 97,0 %, а в отсутствии препарата – 65,5 %.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами установлено, что препарат «Эколан-М» проявляет высокую эффективность при очистке загрязненной нефтью почвы, оказывает стимулирующее действие на рост и развитие высших растений и является экологи-чески безопасным для окружающей среды, что свидетельствуют о перспективности его про-мышленного использования для биоремедиации нефтязагрязненных экосистем.

Т.М Ногіна, Т.У. Думанська, Л.А. Хоменко, В.С. Підгорський

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ

ЕФЕКТИВНІСТЬ ПРЕПАРАТУ «ЕКОЛАН-М» ДЛЯ ОЧИЩЕННЯ НАФТОВИХ ЗАБРУДНЕНЬ ҐРУНТУ

Р е з ю м еДосліджено ефективність очищення препаратом «Еколан-М» забрудненого нафтою чорнозему суг-

линкового. Протягом 12 місяців комплексна біоремедіація ґрунту з використанням препарату і люцер-ни як фітомеліоранта на завершальному етапі очищення призвела до зменшення вмісту вуглеводнів на 97,0 %, а за відсутності препарату – на 65,5 %. При цьому у варіанті досліду з препаратом через 8 місяців досягнуто 100 % зниження фітотоксичності ґрунту и спостерігалось значне стимулювання росту і роз-витку рослин. Процес очищення ґрунту супроводжувався інтенсивним розвитком вуглеводнеокисню-вальних мікроорганізмів, кількість яких по мірі зниження концентрації нафти поступово зменшувалась, наближаючись до їхнього рівня у контрольному незабрудненому ґрунті.

Ключові слова : нафтове забруднення, вуглеводнеокиснювальні мікроорганізми, актинобактерії, біоремедіація, фітотоксичність.


T.M. Nogina, T.U. Dumanskaya, L.A. Khomenko, V.S. Pidgorskyi


EFFICIENCY OF THE PREPARATION “EKOLAN-M” FOR PURIFICATION OF OIL POLLUTED SOIL

S u m m a r yThe effi ciency of purifi cation of oil contaminated loamy chernozem by the preparation “Ekolan-M” was

investigated. During 12 months a complex soil bioremediation using the preparation and alfalfa, as the land-improving plant, at the fi nal stage of purifi cation resulted in the reduction of hydrocarbon content by 97.0 %, and without the preparation – by 65.5 %. In the version of experiment with the preparation a 100% decrease of soil phytotoxicity was achieved and a signifi cant stimulation of plant growth and development was observed. The process of soil purifi cation was accompanied by intensive development of hydrocarbon-oxidizing microorganisms, the amount of which during the process of oil concentration gradually decreased, approaching the level in the control uncontaminated soil.

The paper is presented in Russian.K e y w o r d s: oil contamination, hydrocarbon-oxidizing microorganisms, actinobacteria, bioremediation,

phytotoxicity.T h e a u t h o r’ s a d r e s s: Nogina T.M., Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National

Academy of Sciences of Ukraine; 154 Acad. Zabolotny St., Kyiv MSP, D03680, Ukraine.

Бердичевская М.В., Козырева Г.И., Благиных А.В.1. Численность, видовой состав и оксигеназная актив-ность углеводородокисляющего сообщества нефтезагрязненных речных акваторий Урала и Западной Сибири // Микробиология. – 1991. – 60, №. 6. – С. 122–128.ГСТУ2. 41-00 032 626-00-007-97. Галузевий стандарт України. Охорона довкілля. Спорудження розві-дувальних і експлуатаційних свердловин на нафту та газ на суші. Демидиенко А. Я3. . Пути восстановления плодородия нефтезагрязненных почв черноземной зоны Ук-раины // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. – М.: Наука, 1988. – C. 197–205.Думанська Т. У., Карпенко О. В., Ногіна Т. М., Вільданова-Марцишин Р. І., Підгорський В. С.4. Поверхнево активні властивості штамів Rhodococcus erythropolis, Gordonia rubrоpertinctus та Acinetobacter cal-coaceticus // Наукові записки НаУКМА. Серія Біологія та екологія. – 2006. – 54. – С. 35–39.Киреева Н.А., Кузяхметов Г.Г., Мифтахова А.М., Водопьянов В.В.5. Фитотоксичность антропогенно-загрязненных почв. – Уфа: Гелем, 2003. – 266 с. Киреева Н.А., Тарасенко Е.М., Огнегова Т.С., Бакаева М.Д.6. Комплексаная биоремедиация нефтезаг-рязненных почв для снижения токсичности // Биотехнология. – 2004. – № 6. – С. 63–70.Методы7. почвенной микробиологии и биохимии. / Под ред. Д.Г.Звягинцева. − М.: Изд-во Мocк. ун-та, 1991. − 304 с.Микроорганизмы8. и охрана почв. / Под ред. Д.Г. Звягинцева. − М.: Изд-во Мocк. ун-та, 1989. − 206 с.Муратова А.Ю., Турковская О.В., Хюбнер Т., Кушк П9. . Использование люцерны и тростника для фито-мередиации загрязненного углеводородами грунта // Прикладная биохимия и микробиология. – 2003. – 39, № 6. – С. 681 – 688.Назаров А.А.10. Микробно-растительное взаимодействие при нефтяном загрязнении дерново-подзолис-тых почв Южной тайги Предуралья: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Пермь, 2000. – 24 с.Нечаева И.А.11. Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкто-рами: Автореф. дис. … канд. биол. наук. − Пущино, 2009. − 30 с.ОСТ12. 38.01378-85. Охрана природы. Гидросфера, определение нефтепродуктов в сточных водах мето-дом инфракрасной спектрофотометрии. − Москва: Изд-во стандартов, 1985. − 8 с.Пиковский Ю.И. 13. Трансформация техногенных потоков нефти в почвенных экосистемах // Восстанов-ление нефтезагрязненных почвенных экосистем. − М.: Наука, 1988. − С. 7–22.Руководство14. к практическим занятиям по микробиологии. / Под ред. Н.С.Егорова. – Москва: Изд-во Мocк. ун-та, 1983. – 221 с.Рычкова М.И.15. Влияние Rhodococcus–биосурфактантов на процессы десорбции и деградации нефтя-ных углеводородов в почве: Автореф. дис. … канд. биол. наук. − Пермь, 2007. − 26 с.Соловьев В.И., Кожанова Г.А., Гудзенко Т.В., Кривицкая Т.Н.,16. Семина Н.В. Биоремедиация как осно-ва восстановления нефтезагрязненных почв. Проблемы сбора, переработки и утилизации отходов, Сборник научных статей. − Одесса: ОЦНТЭИ, 2001. − С. 339–345.Терек О.І, Величко О.І, Джура Н.М.17. Фізіологічні аспекти адаптації рослин до нафтозабрудненого ґрунту. В кн. Фізіологія рослин: проблеми та перспективи розвитку. У двох томах. Том 2. // Під ред. В.В.Моргун. К.: Логос, 2009. − С. 217−225.Фомин Г.С., Фомин А.Г.18. Почва. Контроль качества и экологической безопасности по международным стандартам. Справочник. − М.: Изд-во «Протектор», 2001. − 304 с.



УДК 577.182.75:632.952:632.955/577.215

В.А. Циганкова1, Я.В. Андрусевич1, Л.О. Білявська2, В.Є. Козирицька Г.О.2, Г.О. Іутинська2, А.П.Галкін3, Т.О.Галаган4, О.В.Болтовська4

1Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії HAH України, вул. Мурманська, 1, Київ,02094

2Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Д03680, ДСП, вул. Заболотного, 154, Київ

3Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України,вул. Осиповського, 2а, Київ, 04123

4Інститут захисту рослин НААН України, вул. Васильківська, 33, Київ, 03022

РІСТСТИМУЛЮЮЧІ, ФУНГІЦИДНІ І НЕМАТИЦИДНІ ВЛАСТИВОСТІ НОВИХ СУБСТАНЦІЙ МІКРОБНОГО

ПОХОДЖЕННЯ ТА ЇХ ВПЛИВ НА СИНТЕЗ МАЛИХ si/mi РНК В КЛІТИНАХ РОСЛИН

Нові субстанції на основі метаболітів ґрунтових стрептоміцетів, а також композиції препарату аверком з еліситорами виявляють рістрегулюючу активність та біозахисні властивості, підтверджені в дослідах на пшениці ярій сорту Грізо і на огірках сорту Ніжинський. Більшість створених субстанцій показують антагоністичну дію щодо фітопатогенних грибів, а також нематицидну активність до галової нематоди Melodoidyne incognita. За умов штучного інфікування нематодами препарат аверком та його модифікації виявляють 85-100 %-ий захисний ефект на проростки огірка сорту Ніжинський. Методом ДОТ-блот гібридизації встановлено значні різниці у показнику відсотка гомології між малими регуляторними РНК (si/mi РНК) та мРНК дослідних (оброблених субстанціями на інфекційному фоні) і контрольних рослин огірків та пшениці. Обговорена роль si/miРНК у підвищенні резистентності рослин до патогенних та паразитичних організмів за умов застосування створених субстанцій.

Ключові слова: стрептоміцети, фітопатогенні гриби, нематоди, рослини, малі регуляторні РНК (si/miРНК).

За останні роки значно збільшився спектр хвороб основних сільськогосподарських куль-тур порівняно з 90-ми роками ХХ століття. Фітопатогени, окрім зниження кількості і якості врожаю, призводять до накопичення в рослинній продукції токсинів, небезпечних для здоров'я людини і тварин [6]. Незважаючи на появу нових хімічних препаратів, загальна ситуація при-нципово не змінюється: хвороби часто-густо носять епідемічний характер, крім того ми є свід-ками не тільки збільшення шкодочинності відомих патогенів, але й появи нових небезпечних видів, часто з переліку карантинних об’єктів. Погіршуються харчові, кормові та технологічні властивості товарної продукції, посівна якість насіння. Має місце розвиток як бактеріозів, так і змішаних інфекцій, викликаних декількома збудниками. Відомо також, що значні втрати врожаю овочів, особливо в закритому ґрунті, наносять ґрунтові фітогельмінти – нематоди. Кількість уражених нематодозами рослин може досягати 100 %, і протягом 2-х місяців після висадки розсади овочів розвиток інвазійного процесу призводить до загибелі рослин. За дани-ми ФАО, недобори врожаю від патогенів і шкідників коливаються від 15-20 до 40-50 % [2].

Інтенсивне використання хімічних засобів захисту рослин викликає ряд негативних на-слідків: зниження родючості ґрунту, забруднення навколишнього середовища і рослинної про-дукції залишками хімікатів, формування стійких рас збудників хвороб, збіднення кількісного і якісного складу природних мікробних ценозів, в основному, за рахунок зменшення чисель-ності корисних членів мікробіоти [1]. В сільському господарстві постійно зростає інтерес до отримання продукції без використання пестицидів, із застосуванням екологічно збалансова-них агротехнологій, в яких важливе місце посідають мікробні препарати [3, 5, 15].

Важливу роль у покращенні фітосанітарного стану ґрунту та підвищенні стійкості рослин до фітопатогенів відіграють ґрунтові мікроорганізми, а саме представники роду Streptomyces. Створені на основі стрептоміцетів препарати є перспективною складовою інтегрованої сис-теми захисту сільськогосподарських культур [2]. В останні десятиліття в практику сільського господарства впроваджуються препарати на основі макролідного антибіотика авермектину –

© Â.À. Öèãàíêîâà, ß.Â. Àíäðóñåâè÷, Ë.Î. Á³ëÿâñüêà, Â.ª. Êîçèðèöüêà Ã.Î., Ã.Î. ²óòèíñüêà, À.Ï.Ãàëê³í, Ò.Î.Ãàëàãàí, Î.Â.Áîëòîâñüêà, 2012


продукту метаболізму ґрунтового стрептоміцету Streptomyces avermitilis. На основі авермек-тину створено ряд препаратів, які використовують як біопестициди для регуляції чисельності екзо- і ендопаразитів рослин, у тому числі і нематод [15].

У проведених нами молекулярно-генетичних дослідженнях [8] показано, що нові вітчиз-няні полікомпонентні регулятори росту рослин природного походження, до складу яких вхо-дять авермектини, значно підвищують стійкість рослин до різних патогенних та паразитичних організмів завдяки стимуляції ними синтезу в клітинах малих регуляторних si/miРНК (small interfering RNA – siRNA та microRNA - miRNA), які відіграють важливу роль в резистентності рослин до різноманітних шкідників. Дослідження впливу нових біологічних препаратів на геном рослин, у тому числі на синтез si/miРНК у наш час є актуальним.

Співробітники Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України селекціонували штам стрептоміцету Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179, здатний до син-тезу авермектинів, на основі якого створено вітчизняний препарат – аверком із високою не-матицидною та рістстимулюючою дією [2]. До складу аверкому окрім авермектину входить широкий комплекс біологічно активних сполук: амінокислоти, вітаміни, ліпіди, жирні кисло-ти, фітогормони. Ці речовини впливають на ростові процеси рослин, індукують стійкість до захворювань і підвищують врожайність [2,15].

Зважаючи на те, що нагальною потребою сучасного рослинництва є розробка системи біологічного захисту рослин від змішаних інфекцій (бактеріозів + мікозів + нематодозів), особливої актуальності набуває питання розробки поліфункціональних препаратів на основі метаболітів S. avermitilis УКМ Ас-2179 і пошук нових перспективних штамів.

Метою цієї роботи було вивчення антигрибкової і антинематодної дії нових композицій-них субстанцій на основі метаболітів S.avermitilis УКМ Ас-2179 та інших ґрунтових стреп-томіцетів, а також дослідження їхнього впливу на зміни пулу малих регуляторних si/miРНК в клітинах рослин за умов біотичних стресів, викликаних грибковими або нематодними ура-женнями.

Матеріали і методи. Об’єктами досліджень були:– штам Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 з колекції відділу загальної і ґрунтової мікробіоло-

гії ІМВ НАНУ і комплексний препарат аверком, отриманий етанольною екстракцією з міцелію 7-добової культури продуцента;

– стрептоміцети-антагоністи фітопатогенних мікроорганізмів з колекції відділу загальної і ґрунтової мікробіології ІМВ НАНУ: S. marinolimosus УКМ Ас-2186, S. cremeospinus УКМ Ас-2187, S. violans УКМ Ас-2189, S. violarus УКМ Ас-2191 і субстанції на основі етанольних екстра-ктів з біомаси зазначених штамів (співвідношення етанолу до біомаси дорівнювало 4:1);

– тест-культури фітопатогенних грибів із колекції відділу фізіології і систематики мікромі-цетів ІМВ НАНУ: Alternaria alternatа 16814 – збудник альтернаріозу плодів томатів; Fusarium oxysporum 54201 – збудник фузаріозу плодів томатів; F. oxysporum n.33 – збудник фузаріозної кореневої гнилі пшениці;

– сапрофітні і паразитичні нематоди, у тому числі галові нематоди Meloidogyne incognita для визначення нематицидної дії розроблюваних субстанцій;

– насіння сільськогосподарських культур: пшениці ярої сортів Колективна 3 і Грізо (ні-мецької репродукції) та огірків сорту Ніжинський.

Співробітниками відділу загальної і ґрунтової мікробіології ІМВ НАНУ були розроблені нові субстанції на основі аверкому у комплексі з такими еліситорами як саліцилова кислота і хітозан: стрептовіт (супернатант культуральної рідини S. avermitilis УКМ Ас-2179 + саліци-лова кислота), аверком-нова 1 (аверком+стрептовіт) і аверком-нова 2 (аверком + полісахарид хітозан).

Культивування стрептоміцетів. Для культивування стрептоміцетів використовували вів-сяний агар і середовище Чапека [4]. Стрептоміцети вирощували поверхневим (на агаризова-них середовищах) або глибинним (у рідких середовищах) способами. У першому випадку використовували чашки Петрі чи пробірки. У другому випадку культури вирощували на ро-торних качалках (240 об./хв) у скляних колбах об’ємом 750 мл (по 50 мл середовища у 1 кол-бу). Культивування проводили при температурі +28 ± 1оС. Тривалість вирощування складала


6–10 діб, залежно від мети досліду. Посівний матеріал вирощували впродовж доби і засівали ферментаційне середовище у кількості 5 %/ V.

Визначення антибіотичної активності стрептоміцетів. Антибіотичну активність 10-до-бових агаризованих культур стрептоміцетів визначали методом блоків, а 6-добових рідких культур – методом циліндриків [4].

Досліди з рослинами. Лабораторні випробовування дії культур стрептоміцетів на рослини проводили на насінні пшениці ярої сортів Колективна 3 і Грізо та огірків сорту Ніжинський. Насіння рослин обробляли протягом 2 годин досліджуваними субстанціями, а потім пророщу-вали у чашках Петрі на зволоженому фільтрувальному папері при температурі +20±10С.

Досліди з нематодами. Для дослідження антинематодної активності мікробних субстанцій наважки ґрунту (200 г) вміщували у пластикові стаканчики і вносили аверком у концентрації 2,0 мкг/мл за 2 доби або безпосередньо перед висадкою насіння пшениці ярої сорту Колектив-на 3, яке спочатку замочували в аверкомі (концентрація авермектинів у препараті становила 2 мкг/мл). У контролі насіння замочували у стерильній водогінній воді. Після замочування насіння пророщували 2 доби і висаджували у пластикові стаканчики по 5 зернин у кожний і вирощували протягом 20 діб, підтримуючи вологість ґрунту на рівні 60-70 % повної вологоєм-ності. Наприкінці досліду відбирали зразки ґрунту для визначення кількості нематод.

Лабораторні досліди проводили в 3-х кратному повторенні. Розрахунки і статистичну обробку даних виконували за допомогою комп’ютерних програм Statistica 6.0 та Microsoft Excel ’00.

Молекулярно-генетичні досліди. Виділення si/miРНК з клітин дослідних рослин пшениці ярої сорту Грізо та огірків сорту Ніжинський виконували розробленим нами та опублікованим раніше оригінальним методом [7], який складається з наступних етапів:

- виділення сумарного препарату РНК з клітин рослин; - полімерність виділених сумарних препаратів РНК аналізували за допомогою електрофо-

резу в 1,5 %-м гелі агарози в присутності 7 М сечовини за методом Локера [12] (гелі забарвлю-вали розчином етидіумброміду перед фотографуванням фракцій РНК в ультрафіолеті);

- розділення полі(А)+РНК (тобто мРНК) та полі(А)-РНК проводили на оліго(dT)-целю-лозній колонці [13];

- осадження високомолекулярної полі(A)-мРНК з елюату проводили за допомогою 10 %-ого розчину поліетиленгліколя (мол. маса 8000) з 0,5 М NaCl, а si/miРНК - рівним об’ємом 96 % етанолу при -22 0C впродовж доби; з колонки полі(А)+РНК знімали 2-3 об’ємами буферу на-ступного складу: 10 мM Трис-НС1 (pH 7.5), 1 мM ЕДТА, 0.05 % ДДС-Na, а після елюції з колонки полі(A)+мРНК осаджували етанолом;

- молекулярна гібридизація в розчині 2хSSC низькомолекулярних si/miРНК з фрак-цією полі(A)+мРНК з наступною температурною (95 0С) денатурацією гібридних молекул полі(A)+мРНК з si/miРНК;

- відокремлення полі(A)+мРНК від si/miРНК методом фракціонування на оліго(dT)-целю-лозній колонці;

- повторне осадження si/miРНК 96%-им етанолом та перевірка чистоти виділених si/miРНК за допомогою електрофорезу у 15 %-ому поліакриламідному гелі (ПААГ-електрофорез);

- нативність препаратів полі(А)+РНК визначали Нозерн-блот методом [13]. Для дослідів по ДОТ-блот гібридизації si/miРНК з мPHK (через кДНК) дослідних (оброб-

лених субстанціями на інфекційному фоні) та контрольних рослин пшениці і огірків, перед одержанням si/miРНК, її мітили in vivo 33P за допомогою Na2HP33O4 [13].

Статистичну обробку отриманих даних проводили методом дисперсійного аналізу за Стьюдентом.

Результати та їх обговорення. Антагоністичні властивості культур щодо фітопатогенних грибів оцінювали за зонами відсутності росту тест-культур навколо блоків із стрептоміцета-ми, вирощеними на різних середовищах (табл. 1). Найбільш активними щодо фітопатогенних грибів виявились S. marinolimosus УКМ Ас-2186 і S.cremeospinus УКМ Ас-2187: вони при-гнічували ріст усіх трьох фітопатогенних грибів - збудників захворювань томатів і пшениці. Діаметри зон відсутності росту коливались від 12 до 30 мм. Менш активними були S. violans УКМ Ас-2189 і S. violarus УКМ Ас-2191; слід відмітити, що рівень антагоністичної актив-


ності зазначених культур стрептоміцетів був вищим за активність S. avermitilis УКМ Ас-2179 – продуценту антибіотика авермектину, який було взято для порівняння.

Таблиця 1

Антагоністична дія стрептоміцетів на фітопатогенні гриби

Стрептоміцети

Діаметр зон відсутності росту, ммAlternaria alternata

16814Fusarium oxysporum

54201Fusarium oxysporum

n.33Середовища для вирощування стрептоміцетів

1* 2* 1 2 1 2S. marinolimosus УКМ Ас-2186 30 24 15,5 20 12 13S. cremeospinus УКМ Ас-2187 23 19 14 14 12 13S. violans УКМ Ас-2189 0 21,5 0 17 12 14S. violarus УКМ Ас-2191 21,5 16 18 11 14 12S. avermitilis УКМ Ас-2179 19 0 12,5 0 11 12

Примітка: * 1 – вівсяний агар, 2 – середовище Чапека, m = ±0,7 – ±2,8;«0» – антагонізму не виявлено

Враховуючи те, що досліджувані культури стрептоміцетів-антагоністів призначені для ви-користання в рослинництві, ми вважали за необхідне вивчити їх вплив на рослини. Насіння пшениці ярої сорту Грізо обробляли супернатантами культуральних рідин (КР) зазначених стрептоміцетів (табл.2).

Таблиця 2

Дія супернатантів культуральних рідин відібраних стрептоміцетів на ріст проростків пшениці ярої сорту Грізо

Варіант досліду Витрата КР*, мл/т насіння

Довжина коренів Висота стебел Сира маса 100 проростків

мм % до К мм % до К Г % до ККонтроль (К) 0 41,7 100 32,0 100 12,5 100S. marinolimosus УКМ Ас-2186 50 46,0 110,4 33,9 105,3 12,9 103,2S. cremeospinus УКМ Ас-2187 50 48,0 115,1 36,3 113,3 14,0 112,0S. violarus УКМ Ас-2191 50 42,9 102,9 34,4 107,4 12,8 102,4

Примітка: m = ± 1,25±1,43. КР - супернатант культуральної рідини стрептоміцету

Найкращі умови, з огляду на результати, склались за дії КР S. cremeospinus УКМ Ас-2187: ріст коренів, довжина стебел і накопичення біомаси проростків зростали відповідно на 15, 13 і 12 % порівняно з контролем, де насіння пшениці обробляли еквівалентною кількістю сте-рильної водогінної води. За дії КР інших досліджуваних стрептоміцетів ці показники також були загалом вище за контрольні.

Отже, отримані результати свідчать про стимулюючі властивості цих культур щодо рослин пшениці.

Окрім перевірки нових штамів стрептоміцетів також були проведені дослідження дії на рослини нових субстанцій: стрептовіту і композицій аверкому з еліситорами. Дані щодо дії зазначених субстанцій на насіння ярої пшениці сорту Грізо наведені у табл. 3. Усі розроб-лені композиції стимулювали ріст проростків і корінців порівняно з контролем (замочування у воді). Порівняно з базовим препаратом аверком його модифікована субстанція - стрептовіт (супернатант культуральної рідини S. avermitilis УКМ Ас-2179 + саліцилова кислота), більш активно діяла на ріст корінців (119 %) та збільшувала сиру масу проростків (118 %). Аверком – нова 1 (аверком+стрептовіт) і аверком – нова 2 (аверком +хітозан) також стимулювали ріст корінців більш активно порівняно з аверкомом.

Для вивчення нематицидної дії досліджуваних субстанцій нами був проведений аналіз ви-дового складу гельмінтів в природно інфікованому ґрунті (табл. 4). Кількість фітогельмінтів, які уражують рослини, була високою і сягала 584 особини/100 см3 ґрунту. Серед паразитичних нематод переважали представники виду Pratylenchus pratensis, чисельність яких перевищу-вала допустиму норму у 2,4–3,7 рази, а також представники виду Tylenchorbynchus dubius– у 5,2–5,4 рази. Були виявлені також сапробіонтні нематоди і представники мікогельмінтів, які рослинам не шкодять.


Таблиця 3

Вплив субстанцій на проростки рослин ярої пшениці сорту Грізо за обробки насіння

БіопрепаратиДовжина стебел Довжина коренів Сира маса 100 проростків

мм% до

контролюмм % до контролю Г % до контролю

Контроль (вода) 35,0 100 57,0 100 14,2 100Аверком 2,5 мл/т 40,3 115 63,2 111 15,5 109Стрептовіт 10 мл/т 37,3 107 68,0 119 16,8 118Аверком–нова 1 2,5 мл/т 39,3 112 67,6 119 15,6 110Аверком–нова 2 2,5 мл/т 36,9 103 67,1 118 16,4 116

Примітка: m =± 1,18± 1,40

Таблиця 4

Чисельність нематод у інфікованому ґрунті(особин в 100 см3 ґрунту)

Варіанти дослідуФітогельмінти

Міко-гельмінти

Сапро-біонтиусього

у т. ч.:Pratylenchus pratensis

у т. ч.:Tylenchorbyn-hus dubius

Контроль (без обробки) 584

128норма

(35 – 53)

456норма

(84 – 88)552 3352

Аверком, 2 мкг/мл перед висадкою

375 0 375 375 3975

Аверком, 2 мкг/мл за 2 доби перед висадкою

135 0 135 162 2033

Перед посадкою насіння пшениці ярої сорту Колективна 3 була проведена санація ґрун-ту шляхом обробки його аверкомом. Ефективним було внесення препарату за 2 доби перед висадкою насіння: загальна чисельність фітогельмінтів у ґрунті зменшилася у 4,3 рази, пред-ставників Tylenchorbynchus dubius – у 3,4 рази. Найбільш вразливими виявились представни-ки Pratylenchus pratensis, обробка аверкомом викликала їхню повну загибель.

Після перевірки ефективності дії аверкому у ґрунт, природно інфікований нематодами, було висаджено насіння пшениці ярої сорту «Колективна 3», яке було оброблене аверкомом. Пшениця вирощувалась протягом 20 діб, після чого був проведений облік нематод. У дослід-них варіантах спостерігали подальше зниження чисельності паразитичних фітонематод на 90-93 % порівняно з контролем.

Нами були проведені дослідження захисної дії нових модифікацій аверкому на насіння огірків сорту «Ніжинський» за умов штучного інфекційного фону і без нього. У інтактних рослин за відсутності дії нематод відмічали стимулювальну дію аверкому і стрептовіту на ріст стебел і накопичення сирої маси проростків – ці показники в досліді були відповідно на 10–34 % і 7–27 % вищі порівняно з контролем (табл. 5).

Захисну дію препаратів визначали на штучному інфекційному фоні. Для цього у кожну чашку Петрі, де пророщували насіння протягом 3 діб, додавали по 0,1 г коренів рослин, ура-жених галовими нематодами M. incognita. Результати розвитку проростків враховували на 10-у добу досліду. Як показали одержані дані, найвищу захисну дію проти нематод мав авер-ком-нова 1, за обробки насіння яким не було відмічено проявів пригнічення розвитку рослин: довжина стебел, коренів і сира маса проростків становили 99 – 108 % порівняно з незара-женим контролем. Дещо нижчою захисною дією характеризувався аверком-нова 2: довжина стебел проростків порівняно з контролем становила 77,8 %, довжина коренів – 105 %, сира маса проростків – 93 % порівняно з інтактним контролем.

В молекулярно-генетичних експериментах визначали відсоток гомології складових імун-ної системи si/miРНК до мРНК контрольних інтактних та дослідних рослин огірків сорту Ні-жинський та ярої пшениці сорту Грізо. В табл. 6 наведені результати дослідів щодо гомології мРНК контрольних рослин до si/miРНК з 7-денних проростків дослідних рослин огірків, які оброблялись біозахисними субстанціями із регулюючими ріст властивостями. Так, порівняно


з контролем (98 % гомології) під дією препарату аверком у концентрації 2 мкг/мл відсоток гомології зменшується на 4 %, а під дією препарату на інфекційному фоні (у присутності лічинок галової нематоди M.incognita) відсоток гомології становить 88 %, тобто зменшується на 10 %. Порівнюючи ці дані з результатами розвитку проростків (табл. 5) слід зазначити, що за умов застосування біосубстанцій, дослідні рослини зберігали життєздатність, хоча дещо пригнічувався їх ріст і розвиток, тоді як рослини, що пророщували на інфекційному фоні без застосування авермектинвмісних препаратів, гинули на 4–5-у добу досліду. Близькі до цього результати були одержані і при використанні препарату аверком у меншій концентрації (2.10-3 мкг/мл) як при дії препарату на інфекційному фоні, так і без нього.

Таблиця 5

Вплив субстанцій на проростки огірка сорту Ніжинський

№ БіопрепаратиДовжина стебел Довжина коренів

Сира маса 100 проростків

мм% до

контролюмм

% до контролю

г% до

контролюІнтактні рослини

1 Контроль (вода) 30,5 100 42,8 100 1,37 1002 Аверком 0.01 мл/кг 41,0 134 38,2 89 1,73 1274 Стрептовіт 0,025 мл/кг 33,5 110 30,5 71 1,47 1075 Аверком-нова 1

0.02 мл/кг25,7 84 34,7 81 1,36 99

7 Аверком-нова 2 0,02 мл/кг

30,5 100 51,4 120 1,79 131

На фоні штучного інфікування M. incognita.1 Контроль (без зараження

нематодами)23,0 100 31,6 100 10,5 100

2 Контроль із зараженням нематодами

Проростки гинули на 4-5-у добу досліду

2 Аверком 2мкг/мл 19,7 86 29,0 92 9,8 933 Аверком 0,002 мкг/мл 16,5 72 29,5 93 8,1 774 Стрептовіт 0,025 мл/кг 21,6 94 24,5 78 10,6 1015 Стрептовіт 0,015 мл/кг 17,6 77 37,2 118 10,7 1026 Аверком-нова 1

0,005 мл/кг23,0 100 31,4 99 11,3 108

7 Аверком-нова 2 0,015 мл/кг

17,9 90 33,2 105 9,8 93

Таблиця 6

Відсоток гомології si/miРНК проростків огірків сорту Ніжинський до мРНК (через кДНК) контрольних рослин

Мікробні субстанції

% гібридизації

si/m

iРНК

з гомологічни

ми

мРН

К контрольних

інтактни

х проростків

огірків


мРН


рослин

з si

/miРНК

рослин

, одерж

аних

з насінн

я, обробленого

препаратом


мРН


рослин

з si

/miРНК

рослин

, одерж

аних

з насінн

я, обробленого

препаратом

, що

пророщ

увалось в

присутності лічин

ок

нематод

Дистильована вода (контроль) 98±0,96* – –Аверком, 2 мкг/мл 94±1,2** 88±1,4**Аверком , 2.10-3 мкг/мл 96±1,3** 84±1,6**Стрептовіт, 0,025 мкг/мл 95±1,4** 88±1,3**Стрептовіт, 0,015 мкг/мл 96±1,1** 89±1,2**Аверком-нова-1, 0,015 мкг/мл 92±1,6** 82±1,4**Аверком-нова 2, 0,005 мкг/мл 94±1,4** 88±1,4**

Примітка: наявність достовірних відмінностей дослідних показників** щодо контролю*, р<0,05, n=3 “–“ не досліджено.


При використанні стрептовіту були одержані показники гомології, ближчі до контрольних порівняно з аверкомом у рослин як не інфікованих, так і інфікованих. За обробки насіння збільшеною дозою (0,025 мкг/мл) знижувався відсоток гомології на 3 % порівняно з контроль-ними рослинами, а при обробці стрептовітом інфікованих рослин в цієї концентрації відбува-лось зниження відсотка гомології на 10 %. Аверком-нова 1 знижував на 6% відсоток гомології порівняно з контролем у інтактних рослин і на 16 % порівняно з контролем на інфекційному фоні; аверком–нова 2 відповідно – на 4 і 10%.

Таким чином, розглянуті композиційні препарати знижують % гомології si/miРНК віднос-но мРНК контролю у інтактних рослин в діапазоні 2–6 %. У інфікованих рослинах на фоні біозахисної дії субстанцій показники відсотку гомології були на 9–16 % нижчими порівняно з контролем і на 6–12 % порівняно з неінфікованими рослинами. Це означає, що обробка композиційними препаратами призводить до популяційних змін як транскриптів мРНК, так і si/ miРНК, а також додаткових змін під впливом інфекції.

У другій серії дослідів ми вивчали у вегетаційних експериментах ступінь гомології si/ miРНК до мРНК дорослих (одномісячних) рослин пшениці, які були одержані з насіння, обробленого біозахисними субстанціями, а також до мРНК двомісячних рослин, які одержу-вались з насіння, обробленого регуляторами та вирощувались на інфекційному фоні, створе-ному мікроміцетом F. oxysporum (табл. 7). У зв’язку з різною тривалістю вирощування рослин використовували відповідно 2 контроля, вказані в табл. 7. Вивчали дію хімічного фунгіцида Maxim порівняно з біологічними субстанціями. Показано, що фунгіцид знижує на 9 % відсоток гомології з рослинами у контролі 1 і на 3% порівняно з інфікованими рослинами у контролі 2 (тобто без дії препаратів). При використанні субстанції на основі S. marinolimosus УКМ Ас-2186 виявлено, що у неінфікованих рослин відсоток гомології щодо контролю 1 знижувався на 3%, а у інфікованих при дії субстанції становив 89 %, що на 9 % нижче порівняно з контро-лем 1 і на 5% більше за контроль 2. Під дією субстанцій на основі штамів S. cremeospinus УКМ Ас-2187 і S. violarus УКМ Ас-2191 у інтактних рослин відсоток гомології був нижче на 3–5%, ніж у контролі, а за умов штучної інфекції при використанні субстанції з S. marinolimosus УКМ Ас-2186 був на 6 % вище ніж у контролі 2. Подібну різницю в гомології відмічено і за дії субстанції з S. violarus УКМ Ас-2191. Подальше зниження відсотку гомології на 4-6 % в досліді 1 спостерігалось при використанні суміші екстрактів вказаних вище 3-х штамів стреп-томіцетів (Mix) і складало 89 %.

Таблиця 7

Ступінь гомології (%) si/miРНК з мРНК (через кДНК) одномісячних рослин пшениці сорту Грізо, одержаних з насіння, обробленого біозахисними препаратами і вирощеного на безінфекційному фоні та двомісячних рослин за штучної інфекції

Fusarium oxysporum

№ п/п

Назви біозахисних субстанцій (екстракти з біомаси стрептоміцетів)

Варіанти дослідів

Без зараження За штучної інфекції F. oxysporum

1 Контроль 1 ─ рослини, вирощені без обробки препаратами на безінфекційному фоні. 98±0,96*

-

2 Контроль 2─(рослини, вирощені на інфекційному фоні без обробки субстанціями

-83±1,2*

3 Mаксім (хімічний фунгіцид) 89±1,4** 80±1,54 S. marinolimosus УКМ Ас-2186 95±1,2 89±1,3**5 S. cremeospinus УКМ Ас-2187 93±1,4** -6 S. violarus УКМ Ас-2191 94±1,1** 89±1,6**7 Mix штамів 2186 +2187 +2191 89±1,6** -9 Аверком 94±1,8** -

Примітка: а) “–“ не досліджено;б) наявність достовірних відмінностей дослідних показників** щодо контролю*, р<0,05, n=3в) % гомології у контролі (у колонці 1) розраховувався за % гібридизації si/miРНК до гомологічних

мРНК рослин, що не оброблялися препаратами і стрептоміцетом;г) відповідно % гомології у контролі у колонці 2 розраховувався за % гібридизації si/miРНК до

гомологічних мРНК рослин, що вирощувались на інфекційному фоні;д) розрахунки % гомології в колонках 1 та 2 віднесено до контрольних показників у цих колонках.


Препарат аверком в концентрації 2·10-3 мкг/мл зменшував відсоток гомології на 4 %. Отже на фоні грибкової інфекції щодо контролю 2 відсоток гомології підвищувався при застосуван-ні субстанцій на основі зазначених штамів на 6-9%.

Обговорюючи одержані дані, слід зазначити, що експериментальні роботи останніх років свідчать про здатність si/miРНК регулювати у більшості еукаріот експресію генів у таких клі-тинних процесах як цілісність та стабільність геному, диференціацію клітин, формування та розвиток органів, тривалість життя, адаптативну відповідь на біотичний та абіотичний стреси [17]. Отримано факти, які підтверджують участь si/miРНК у захисних реакціях імунної сис-теми рослин у відповідь на ураження паразитичними та патогенними організмами [9, 11]. Ендогенні si/miРНК представляють собою короткі некодуючі РНК молекули (розміром 20–24 нт), що утворюються з подовжених (~70 нт) pre-miРНК та дволанцюгових dsРНК (double-stranded RNA) попередників - транскриптів з різних геномних локусів шляхом ендонуклеаз-ного розщеплення за допомогою Dicer-подібної (DCL) рибонуклеази - RNase-III та функціо-нують спільно з Argonaute (AGO) білками в РНК-індукованому сайленсінговому комплексі (RISC) – головному учаснику посттранскрипційного сайленсінгу генів (PTGS) [16]. У ході цього процесу малі регуляторні si/miРНК діють двома шляхами: блокують трансляцію або власних мРНК-транскриптів генів, що контролюють ріст та розвиток рослин, експресія яких індукується патогенами [10], або молекул-мішеней mРНК патогенних і паразитичних організ-мів (завдяки присутності в них антисенсових з високим ступенем гомології нуклеотидних послідовностей), а також знищують їх шляхом ферментативного розщеплення (за допомогою екзо- та ендонуклеаз RISC комплексу) [16]. Крім участі в PTGS встановлено також головну роль si/miРНК в іншої важливої захисної відповіді імунної системи рослин на проникнення патогенів - процесі транскрипційного сайленсінгу генів (TGS), внаслідок якого відбувається або метилювання ДНК, або модифікація хроматину за участю si/miРНК [14].

В наших молекулярно-генетичних дослідженнях одержано достовірні розбіжності в по-казниках відсотків гомології si/miРНК, ізольованих із 7-денних проростків огірків сорту Ні-жинський, оброблених біозахисними субстанціями і вирощених на безнематодному середо-вищі та інфекційному фоні (у присутності личинок галової нематоди M.incognita), до мРНК контрольних рослин, що не оброблялись субстанціями та пророщувалось на безнематодному фоні. Методом ДОТ-блот гібридизації si/miРНК з мРНК дорослих (одномісячних) рослин пшениці ярої сорту Грізо, оброблених біозахисними субстанціями з регулюючою ріст актив-ністю в вегетаційних дослідах та двомісячних рослин, що вирощувались на інфекційному фоні, створеному мікроміцетом F. oxysporum, встановлено також достовірні зміни в показнику відсотка гомології si/miРНК до мРНК, в особливості за сумісної дії F. oxysporum та біоза-хисних субстанцій. Очевидно, одержані нами суттєві зміни у популяційних характеристиках si/ miРНК свідчать, що біологічний ефект (підвищення стійкості рослин до патогенних та па-разитичних організмів) досліджуваних субстанцій відбувається шляхом “включення” (акти-вації) ними генів в мультигенних сімействах генів, які контролюють синтез в клітинах рослин захисних малих регуляторних si/miРНК із антипатогенною та антипаразитарною активністю.

Таким чином, у проведеній роботі відібрано перспективні культури стрептоміцетів, які одночасно виявляють інгібуючий ефект до фітопатогенних грибів, нематод, позитивно впли-вають на ріст проростків рослин (озима та яра пшениці, огірки). Розроблені нові модифікації препарату аверком, які в умовах лабораторного досліду характеризувались підвищеною фіто-захисною дією щодо нематод. Виявлено вплив нових субстанцій, синтезованих ґрунтовими стрептоміцетами на синтез si/miРНК.

Робота виконана за фінансової підтримки наукового проекту «Молекулярні основи ство-рення біологічно активних та екологічно безпечних препаратів з біозахисними та імуномо-дулюючими властивостями» цільової комплексної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України «Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехноло-гій».


В.А. Циганкова1, Я.В. Андрусевич1, Л.А. Белявская2, В.Е. Козырицкая2, Г.А. Иутинская2, А.П.Галкин3, Т.А.Галаган4, Е.В.Болтовская4

1Институт биоорганической химии и нефтехимии HAH Украины, Киев 2Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев,

3Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев 4 Институт защиты растений НААН Украины, Киев

РОСТСТИМУЛИРУЮЩИЕ, ФУНГИЦИДНЫЕ И НЕМАТИЦИДНЫЕ СВОЙСТВА НОВЫХ СУБСТАНЦИЙ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА

СИНТЕЗ si/mi РНК В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙР е з ю м е

Новые субстанции на основе метаболитов почвенных стрептомицетов, а также композиции препара-та аверком с элиситорами проявляют рострегулирующую активность и биозащитные свойства, подтвер-джденные в опытах на пшенице яровой сорта Гризо и на огурцах сорта Нежинский. Большинство создан-ных субстанций проявляют антагонистическое действие на фитопатогенные грибы, а также нематицид-ную активность по отношению к галловой нематоде Melodoidyne incognita. В условиях искусственного инфицирования нематодами препарат аверком и его модификации проявляют 85-100%-ое защитное действие на проростки огурца сорта Нежинский. Методом ДОТ-блот гибридизации выявлены значитель-ные различия в показателе процента гомологии между малыми регуляторными РНК (si/miРНК) и мРНК опытных (которые обрабатывались субстанциями на инфекционном фоне) и контрольних растений огур-цов и пшеницы. Обсуждена роль si/miРНК в повышении резистентности растений к патогенным и пара-зитическим организмам при применении разработанных субстанций.

Ключевые слова : стрептомицеты, фитопатогенные грибы, нематоды, растения, малые регулятор-ные РНК (si/miРНК).

V.A. Tsygankova 2, Ya.V. Andrusevich1, L.A. Beljavskaja2, V. Е., Kozyritskaja2, H.A. Iutinskaja2, A.P. Galkin3, T.A. Galagan4, E.V. Boltovskaya4

1 Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2 Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

3Institute of Food Biotechnology and Genomics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 4 Institute of Plant Protection, National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine, Kyiv

GROWTH STIMULATING, FUNGICIDAL AND NEMATICIDAL PROPERTIES OF NEW MICROBIAL SUBSTANCES AND THEIR IMPACT ON si/miRNA

SYNTHESIS IN PLANT CELLS

S u m m a r yNew substances on the basis of soil streptomycete Streptomyces avermitilis metabolites and also compositions

of preparation averkom with elicitors show growth regulating activity and bioprotective properties, proved in experiments with wheat spring of variety Grizo and cucumbers of variety Nezhinskiy. Most of the created substances possess the antagonistic action in relation to phytopathogenic fungi, as well as antinematode activity in relation to the gallic nematode Melodoidyne incognita. In the conditions of the artifi cial nematode infecting the preparation averkom and its modifi cations demonstrate protective action (up to 85-100 %) on cucumber sprouts of Nezhinskiy variety. The considerable differences were found out in the index of homology percentage between small regulatory RNA (si/miRNA) and mRNA of experimental (that were treated by substances on the infectious background) and control cucumbers, and wheat plants.

The paper is presented in Ukrainian. K e y w o r d s: streptomycetes, phytopathogenic fungi, nematodes, plants, small regulatory RNA

(si/miRNA). T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Tsygankova V.A., Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry,

National Academy of Sciences of Ukraine, 1, Murmanska St., Kyiv, 02094, Ukraine.

Андріюк К.І., Іутинська Г.О., Антипчук А.Ф. та ін.1. Функціонування мікробних ценозів в умовах антропогенного навантаження. – К.: Обереги, 2001. – 240 с.Биорегуляция микробно-растительных систем / Иутинская Г.А., Пономаренко С.П., Андреюк К.И. 2. и др. – Под ред. Г.А. Иутинской, С.П. Пономаренко – Киев: Ничлава, 2010. – 464 с.


Курдіш І.К.3. Інтродукція мікроорганізмів у агроекосистеми \ К.: HП НВП «Наукова думка». – 2010. – 256 с.Методы4. почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д. Г. Звягинцева. – М.: Изд-во Моск. yн-та, 1991. – 303 с.Мікробні5. препарати у землеробстві. Теорія і практика / Волкогон В.В., Надкренична О.В., Ковалевська Т.М. та ін. / За ред. Волкогона В.В. – К.: Аграрна наука, 2007. – 312 с.Фітопатогенні6. бактерії. Бактеріальні хвороби рослин: Монографія / Гвоздяк Р.І., Пасічник Л.А, Яковлева Л.М. і ін. / За ред. В.П. Патики – К.: ТОВ «НВП «Інтерсервіс», 2011. – 444 с.Циганкова В.А., Андрусевич Я. В., Блюм Я. Б. 7. Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miРНК з антинематодною активністю // ДАН України. – 2011. – № 9. – С. 159–164. Циганкова В.А., Стефановська Т.Р., Андрусевич Я.В., Пономаренко С.П., Галкін А.П., Блюм Я.Б. 8. Індукція регуляторами росту біосинтезу si/miРНК з антипатогенними та антипаразитарними властивостями в клітинах рослин // Біотехнологія. – 2012. – 5, № 3. – С. 62–74. Fuller V.L., Lilley C.J., Urwin P.E.9. Nematode resistance // New Phytologist. – 2008. – 180. – P. 27–44.Hewezi T., Howe P., Maier T.R., Baum T.J.10. Arabidopsis small RNAs and their targets during cyst nematode parasitism // Molecular Plant-Microbe Interactions. – 2008. – 21, N 12. – P. 1622–1634.Katiyar-Agarwal S., Morgan R., Dahlbeck D. et al.11. A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 2006. – 103. – P. 18002–18007.Locker J.12. Analytical and preparative electrophoresis of RNA in agarose-urea // Anal. Biochem. – 1979. – 98, N 2. – P. 358–367. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J.13. Molecular cloning: A laboratory manual. – New York: Cold Spring Harbor Lab., 1982. – 480 p.Matzke M., Kanno T., Huettel B., Daxinger L., Matzke A.J.M.14. Targets of RNA-directed DNA methylation // Curr. Opin. Plant. Biol. – 2007. – 10, N 5. – P. 512–519.New plant growth regulators: basic research and 15. technologies of application: Monograph / Ed. S.P. Ponomarenko, G.O. Iutynska. – Kyiv: Nichlava, 2011. – 211 p.Park W., Li J., Song R., Messing 16. J. and Chen X. CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, Act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana induced silencing complex (RISC), which targets homologous RNAs for degradation // Current Biology. – 2002. – 12. – P. 1484–1495.Zhang,B., Wang Q. and Pan X.17. MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants // J. Cell. Physiol. – 2007. – 210. – P. 279–289.



УДК 368.51: 632.35:579.22

О.М. Захарова 1 , М.Д. Мельничук 1, Л.А. Данкевич 2, В.П. Патика 2 1

Національний університет біоресурсів і природокористування України,вул. Героїв Оборони, 15, 03041, Київ, Україна

2Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, вул. Академіка Заболотного, 154, Київ ГСП, Д 03608, Україна

БАКТЕРІАЛЬНІ ХВОРОБИ РІПАКУУ посівах ріпаку ярого та озимого виявлені та описані бактеріальні ураження культури, ідентифі-

ковані їх збудники. Характерні симптоми захворювання були такі: побуріння тканини стебла та його ослизнення, хлороз листя, пожовтіння та початок м’якого гниття у місцях прикріплення черешків лис-тків, втрата пігментації (фіолетове забарвлення). Досліджено патогенні властивості колекційних та морфолого-культуральні і фізіолого-біохімічні властивості виділених штамів збудників бактеріальних хвороб ріпаку. Встановлено, що всі виділені нами ізоляти є високо- та середньоагресивними щодо різних сортів ріпаку. За комплексом фенотипових ознак 44 % від загальної кількості виділених нами ізолятів споріднені з представниками роду Pseudomonas, 37 % − Xanthomonas та 19 % − Pectobacterium.

Ключові слова: бактеріальні хвороби ріпаку, бактерії родів Xanthomonas, Pseudomonas, Pectobacterium, бактеріоз коренів, слизовий бактеріоз.

Ріпак є цінною олійною культурою, адже насіння містить 40-44 % олії та 18-22 % білка. 90 % насіння використовують для виробництва жирів, а решту для технічних цілей. Він є хорошим попередником, ефективним сидеральним добривом, добрим медоносом, фітосані-таром полів тощо. Проте, як і інші сільськогосподарські культури за певних несприятливих умов, порушення технології вирощування, різких змін кліматичних умов, збільшення ант-ропогенного навантаження, а також інтродукції великої кількості нових сортів як закордон-ної, так і вітчизняної селекції, ріпак уражується хворобами різної етіології, що призводить до зниження якості його насіння та урожайності [3, 6, 7, 9]. І хоча на думку сучасних фі-топатологів найбільшої шкоди посівам ріпаку наносять збудники хвороб грибної етіології, аналіз фітосанітарного стану посівів ріпаку свідчить про стрімке збільшення відсотка рос-лин, уражених саме бактеріальними збудниками, які є не менш шкідливими, ніж грибні [5, 8, 11, 14]. Відомо, що до основних бактеріальних хвороб ріпаку належить бактеріоз коренів (Xanthomonas campestris pv. campestris та Pseudomonas fl uorescens), слизовий бактеріоз (Pectobacterium carotovorum subsp. сarotovorum та Pseudomonas fl uorescens) та бактеріальний опік ріпаку, який згідно з даними літератури, є менш шкодочинним захворюванням та викли-кається як Xanthomonas campestris pv. campestris, так і Pseudomonas syringae pv. syringae [3, 11, 14]. Крім того, ріпак потенційно здатні уражувати Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas viridifl ava, Pseudomonas marginalis pv. marginalis тощо. При розробці заходів для захисту рослин від бактеріозів велике значення відіграє екосистемний моніторинг, діагностика захворювань та вивчення біологічних властивостей їх збудників, які вивчені ще недостатньо.

Тому метою наших досліджень був моніторинг бактеріальних хвороб ріпаку з наступною їх ідентифікацією за допомогою патогенних, морфолого-культуральних та фізіолого-біохіміч-них властивостей.

Матеріали і методи. Збір зразків уражених рослин ріпаку проводили регулярно в ве-гетаційні періоди 2010-2012 рр. на дослідних полях і ділянках Національного університету біоресурсів і природокористування України (Київська обл.), Коростишівського району Жито-мирської області, Інституту сільського господарства Степової зони (Дніпропетровська обл.), Інституту сільськогосподарської мікробіології і агропромислового виробництва НААН Ук-раїни (Чернігівська обл.).

Для виділення і культивування бактерій використовували картопляний агар (КА). Дослід-жували 18 ізолятів бактерій, збудників слизового бактеріозу та бактеріозу коренів, виділених нами з різних уражених органів та тканин ріпаку. Для порівняльних досліджень використа-ли 32 штами фітопатогенних бактерій Xanthomonas campestris pv. сampestris (8003б, 8171, 8185, 8173, 8050, 820, 8160, 8188, 8172, 8196, 8182, 8174, 8836, 8659, 8147, 8195, 8166, 8159, © Î.Ì. Çàõàðîâà , Ì.Ä. Ìåëüíè÷óê, Ë.À. Äàíêåâè÷, Â.Ï. Ïàòèêà, 2012


8154, 8170, 8149, 8161, 8156, 8194, 8179, 8148, 8189, 8176, 8175, 8188, 8183, 8180) та штами Pseudomonas fl uorescens 8573, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum УКМ В-1075т, P. syringae рv. syringae В1027т, P. marginalis pv. marginalis 9175т з колекції культур відділу фі-топатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології (ІМВ) ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Патогенні властивості ізолятів визначали шляхом штучного зараження рослин ріпаку у фазі формування розетки листків до періоду бутонізації та цвітіння. У дослідженнях викорис-товували 6 сортів ріпаку ярого (Марінс, Антарія, Оксамит, Марія, Микитинецький, Лужок), 2 сорти озимого ріпаку (Чорний Велетень та Аріон). Для штучного зараження використову-вали однодобову бактеріальну суспензію титром 107 кл/мл. Контролем слугувала стерильна водогінна вода. Рослини інокулювали потрійним уколом тканини з подальшим нанесенням бактеріальної суспензії. Облік агресивності штамів проводили за розробленою нами 10-и бальною шкалою [4]. Штами з патогенністю від 7 до 9 балів вважалися агресивними, від 5 до 7 балів середньоагресивними та від 5 до 1 балів − низькоагресивними. Культурально-фізіоло-гічні властивості бактерій вивчали загальноприйнятими класичними методами [1]. Здатність засвоювати вуглеводи та спирти, як єдине джерело живлення, визначали за ростом бактерій та зміною забарвлення середовища Омелянського, що містило індикатор бром-тимол синій та 0,5 % розчин досліджуваного вуглеводу чи спирту. Облік результатів здійснювали на 3, 7, 14 та 21 добу культивування. Наведені у роботі дані є середнім значенням досліджень, проведених у чотирьох повторах. Математичну обробку результатів проводили стандартними методами математичної статистики з використанням комп'ютерної програми МS ЕXEL.

Результати та їх обговорення. Обстеження посівів ріпаку показали, що бактеріальні па-тогени частіше уражують ріпак озимий. Розвиток захворювання розпочинається у першій де-каді жовтня місяця, у більш теплих регіонах і пізніше з утворенням порожнини всередині ко-реневої шийки, в меншій кількості інших частинах кореня. З часом тканини кореня буріють. На початку весни більшість уражених коренів ослизнюється і розмочалюється, що призво-дить до загибелі рослин. У 2011 році весною спостерігали збільшення кількості уражених рослин із причини контрастної зимової температури і безсніжжя.

Як на озимих і, особливо, ярих сортах ріпаку при підвищеній вологості спостерігається ураження серцевини стебла, яка з часом загниває і висихає, внаслідок чого стебло стає цілком порожнім. Уражені місця стебла іноді чорніють. На дорослих рослинах зазначена хвороба виявляється у вигляді в’янення як верхніх, так і нижніх листків. Згодом листки відмирають, починаючи з нижніх, зморщуються і прикривають стебло.

За період з 2010 по 2012 рр. нами проаналізовано близько 250 зразків рослин ріпаку з вищенаведеними ознаками ураження, зі 130 зразків ізольовано бактерії (табл. 1). При бак-теріологічному аналізі зразків нами ізольовано 18 патогенних ізолятів бактерій, виділених із різних уражених органів та тканин ріпаку з ознаками слизового бактеріозу та бактеріозу коренів.

Слід зазначити, що бактерії виділяли протягом усього періоду вегетації ріпаку, як восени, весною (ярий ріпак), так і у другій половині літа під час збирання врожаю. При вивченні патогенних властивостей виділених нами ізолятів та колекційних штамів виявлено різну аг-ресивність (рис. 1).

Таблиця 1

Результати фітобактеріологічного аналізу зразків ріпаку

Зразки Кількість ізолятів

Проаналізовано

З яки

х ізольовані

бактерії

Ізольовано

В т.ч. ізолятів з колоніями

жовтого кольору з рівними краями

сірувато-білого кольору напівпрозорих з піднятим центром і хвилястим краєм

сірувато-білі, опуклі, з конусним центром і рівними краями

250 130 18 6 9 3


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5 6 7 8

Cорти

Патогенність,

бали

32 штамиX.campestrispv.campestris

P.fluorescens8573

P.carotovorumsubsp.carotovorum B-1075

Рис. 1. Агресивність колекційних штамів щодо різних сортів ріпаку: 1 - Чорний Велетень, 2 - Аріон, 3 - Марінс, 4 - Антарія, 5 -Оксамит, 6 - Марія,

7 - Микитинецький та 8 - Лужок (середнє значення)

Аналізуючи агресивність колекційних штамів щодо різних сортів ріпаку видно, що най-більш стійкими до збудників бактеріозу коренів (Xanthomonas campestris pv. campestris та Pseudomonas fl uorescens) виявилися саме сорти озимого ріпаку Чорний Велетень та Аріон, а до слизового бактеріозу (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum та Pseudomonas fl uorescens) − ярий сорт Марія. Зовсім не чутливими до слизового бактеріозу є сорти Окса-мит та Микитинецький. Згідно з даними Зробок О.М. та ін. [8] найбільш стійким сортом до окремих збудників грибних хвороб ріпаку (фомоз, ботрідіоз та склеротініоз) виявився саме сорт Микитинецький. Крім того, найменша уражуваність альтернаріозом, як найбільш шко-дочинним захворюванням грибної етіології, спостерігалась у сортів Оксамит та Лужок.

Показано, що агресивність виділених нами ізолятів щодо різних сортів ріпаку відріз-няється (рис.2).

012345678

1 2 3 4 5 6 7 8

,

Рис. 2. Середня агресивність виділених ізолятів щодо озимих (1 - Чорний Велетень, 2 – Аріон) та ярих (3 - Марінс, 4 - Антарія, 5 -Оксамит, 6 - Марія,

7 - Микитинецький, 8 – Лужок) сортів ріпаку

Перевірка стійкості районованих сортів ріпаку до виділених нами штамів, які викликають бактеріальні хвороби даної культури показала, що найменш чутливими до збудників вияви-лися саме сорти ─ Оксамит та Микитинецький. Натомість, сорти ріпаку ярого ─ Марінс та


Марія, а також сорт ріпаку озимого ─ Аріон були найменш стійкими до виділених нами шта-мів (рис. 2). Отже, найвищий рівень резистентності як до збудників грибної так і до збудників бактеріальної етіології виявили сорти ─ Оксамит та Микитинецький. Відмічена нами подіб-ність стійкості сортів до грибних та бактеріальних хвороб узгоджується з даними літератури [8] та свідчить про однакову їхню генетичну детермінованість, що полегшує селекційну ро-боту під час виведення сортів з широкою стійкістю до патогенів.

Найбільш агресивними виявились штами 8, 9, 4а, 6а, агресивність яких в середньому ста-новила 7 балів за 10-ти бальною шкалою. Найменш агресивними виявились штами під номе-ром 1, 3А та 14, з агресивністю 5 балів (рис. 3).

0123456789

1 2 5 7 8 9 2 3 2 4 6 7 5 6 7 8 9 14

,

Рис. 3. Середня агресивність виділених штамів до різних сортів ріпаку

Слід також зазначити, що колекційні та виділені нами штами були гетерогенні за рів-нем агресивності. Так, серед колекційних, відсоток штамів із низькою агресивністю становив 36 %, а серед ізольованих нами лише − 11 %. Кількість високо- та середньоагресивних ізолятів у природній популяції виділених нами збудників бактеріальних хвороб ріпаку складає − 78 %. Натомість, відсоток колекційних штамів з високим- та середнім рівнем агресивності складає всього − 66 %, що дещо нижче порівняно з виділеними нами штамами. На наш погляд, даний факт, напевно, пояснюється тим, що під час тривалого зберігання у колекції агресивність штамів дещо знижується, що не суперечить даним літератури [4]. Спеціалізацію виділених нами штамів вивчали на окремих овочевих культурах. В результаті досліджень показано, що виділенні нами та колекційні штами є середньо- та високоагресивними для капусти сорту Амагер, моркви сорту Велес F1, картоплі сорту Слов'янка та томатів сорту Новічок, що свід-чить про широку їх патогенність для ряду сільськогосподарських культур. Слід зазначити, що деякі виділені нами штами були досить агресивними щодо всіх досліджуваних нами об’єктів, що свідчить про високу агресивність досліджуваних ізолятів.

За результатами досліджень морфолого-культуральних та фізіолого-біохімічних власти-востей штами (2О, 3А, 2а, 5в, 6а, 6, 7в, 8в, 9в) це − прямі, рухомі палички, розташовані поо-диноко або парами, грамнегативні і не утворюють спор. На картопляному агарі через дві доби утворюють сірувато-білі, напівпрозорі, блискучі, круглі, діаметром 1,0-2,5 мм, плоскі, з під-нятим центром і, в основному, слабохвилястим краєм колонії, типові для роду Pseudomonas [2, 12]. Штами ростуть на МПБ (м’ясо-пептонний бульйон), пептонізують або згортають мо-локо, пошарово розріджують желатин. Здатні утворювати каталазу і оксидазу, підлужують лакмусову сироватку, не утворюють індол і сірководень. На мінеральному середовищі Оме-лянського, до якого додавали як єдине джерело вуглецю глюкозу, галактозу, арабінозу, манозу, фруктозу, ксилолу − утворюють кислоту. Не здатні зброджувати рамнозу, сахарозу, рафінозу, лактозу, мальтозу і манітол. Не засвоюють дульцитол та саліцин. Вивчений нами комплекс фе-нотипових властивостей підтверджує спорідненість їх з представниками роду Pseudomonas, а саме оксидазопозитивними представниками видів P. fl uorescens та P. marginalis pv. marginalis


[2, 12]. Здатність виділених нами штамів уражувати окрім ріпаку, ще ряд рослин також свід-чить на користь їх спорідненості з представниками видів P. fl uorescens та P. marginalis pv. marginalis, які є класичними поліфагами.

Показано, що штами (1, 2, 5, 7, 8, 9) це − прямі, рухомі палички, розташовані поодино-ко або парами, грамнегативні і не утворюють спор. При рості на картопляному агарі утво-рюють невеликі, округлі, гладкі, блискучі, жовті колонії з рівними краями, характерні для роду Xanthomonas [2, 12]. Дані ізоляти ростуть на МПБ, пептонізують або згортають молоко, розріджують желатин. Не здатні редукувати нітрати, утворюють каталазу, але не синтезують оксидазу, підлужують лакмусову сироватку. На мінеральному середовищі Омелянського, до якого додавали як єдине джерело вуглецю глюкозу, галактозу, арабінозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу, рафінозу, манітол − утворюють кислоту, але не здатні засвоювати рамнозу, лактозу, дульцитол і саліцин.

Вивчення комплексу ознак фенотипу даних штамів підтверджує їх спорідненість із ти-повими представниками роду Xanthomonas і зокрема колекційним штамом X. campestris pv. сampestris 8185 [2].

Є. Матвеєвою і О. Ігнатовим [9] виявлено, що ріпак, як і соняшник може уражуватися не тільки представниками виду X. campestris pv. сampestris, а й X. аrboricola. Показано, що виділені з ріпаку штами не несли характерного для X. campestris pv. сampestris гену цитохро-му П450, відрізнялися за послідовностями генів гірази В, генів xсс006-007 і не мали жодного із 19 досліджуваних генів авірулентності [13, 10, 15]. Тобто, коректна ідентифікація збудни-ків, які належать до роду Xanthomonas і здатні викликати захворювання ріпаку та соняшнику можлива лише із залученням сучасних молекулярно-генетичних методів.

Досліджені нами штами (4а, 7а, 14) − це прямі, рухливі поодинокі або розташовані па-рами, грамнегативні, аспорогенні палички. На картопляному агарі через дві доби утворю-ють сірувато-білі, опуклі, з конусним центром і рівними краями колонії типові для роду Pectobacterium [2, 7]. Здатні рости на МПБ, редукувати нітрати і пошарово розріджувати желатин. Варіабельні за здатністю пептонізувати і згортати молоко. Оксидазонегативні та каталазопозитивні. На мінеральному середовищі Омелянського, до якого додавали як єдине джерело вуглецю фруктозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, рафінозу, галактозу, глюкозу, сахаро-зу, манітол та саліцин, утворюють кислоту. Не здатні використовувати дульцитол. Вивчений нами комплекс фенотипових властивостей вказує на спорідненість даних штамів із типови-ми представниками роду Pectobacterium і зокрема типовим штамом P. carotovorum subsp. carotovorum В-1075т [2, 12].

Отже, на основі дослідження патогенних властивостей нами показано, що популяція збуд-ників бактеріальних хвороб ріпаку у природі гетерогенна − 78 % високо- і середньоагресив-них та 11 % низькоагресивних штамів. Слід зазначити, що найбільш агресивними серед усіх виділених нами ізолятів виявився збудник слизового бактеріозу Pectobacterium carotovorum subsp. сarotovorum, а найменш агресивним − поліфаг Pseudomonas fl uorescens. Всі досліджу-вані нами штами є досить агресивними, як на різних сортах ріпаку, так і капусті сорту Амагер, та за основними морфолого-культуральними і біохімічними властивостями є спорідненими з основними збудниками бактеріозу коренів Xanthomonas campestris pv. campestris, слизового бактеріозу Pectobacterium carotovorum subsp. сarotovorum та Pseudomonas fl uorescens. Ізоль-овані нами збудники потребують наступної коректної ідентифікації із залученням новітніх молекулярно-генетичних методів досліджень, що і планується надалі.


О.М. Захарова 1 , М.Д. Мельничук 1, Л.А. Данкевич 2, В.Ф. Патыка 2

1Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев 2Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ РАПСА

Р е з ю м еВ посевах рапса ярового и озимого обнаружены, описаны бактериальные поражения культуры и

идентифицированы их возбудители. Характерные симптомы заболевания были следующие: побурение ткани стебля и его ослизнения, хлороз листьев, пожелтение и начало мягкого гниения в местах прикреп-ления черешков листьев, потеря пигментации (фиолетовая окраска). Исследованы патогенные свойства коллекционных и морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства выделенных нами штаммов возбудителей бактериальных болезней рапса. Установлено, что все выделенные нами изоляты являются высоко- и среднеагрессивными по отношению к разным сортам рапса. По комплексу феноти-пических признаков 44% от общего количества выделенных нами изолятов близкородственны с предста-вителями рода Pseudomonas, 37% - Xanthomonas и 19% - Pectobacterium.

К л ю ч е в ы е с л о в а: бактериальные болезни рапса, бактерии родов Xanthomonas, Pseudomonas, Pectobacterium, бактериоз корней, слизистый бактериоз

O.M.Zakharova1, M.D. Melnichuk1, L.A. Dankevich2, V.F. Patyka2

1National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kyiv2Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

BACTERIAL DISEASES OF RAPE

S u m m a r yBacterial destruction of the culture was described and its agents identifi ed in the spring and winter rape

crops. Typical symptoms are the following: browning of stem tissue and its mucilagization, chlorosis of leaves, yellowing and beginning of soft rot in the place of leaf stalks affi xion to stems, loss of pigmentation (violet). Pathogenic properties of the collection strains and morphological, cultural, physiological, and biochemical properties of the agents of rape’s bacterial diseases isolated by the authors have been investigated. It was found that all the isolates selected by the authors are highly or moderately aggressive towards different varieties of rape. According to the complex of phenotypic properties 44% of the total number of isolates selected by the authors are related to representatives of the genus Pseudomonas, 37% – to Xanthomonas and 19% – to Pectobacterium.

The paper is presented in Ukrainian.K e y w o r d s: rape’s bacterial diseases, Xanthomonas, Pseudomonas, Pectobacterium, bacteriosis of roots,

slimy bacteriosis.T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Zakharova O.M., National University of Life and Environmental Sciences

of Ukraine; 15 Heroiv oborony St., Kyiv, 03041, Ukraine.

1. Бельтюкова К.И., Матышевская М.С., Куликовская М.Д., Сидоренко С.С. Методы исследования возбудителей бактериальных болезней растений. – Киев: Наук. думка, 1968. – 316 с.

2. Билай В.И, Гвоздяк Р.И., Скрипаль И.Г., и др. Микроорганизмы – возбудители болезней растений. – Киев: Наук. думка, 1988. –552 с.

3. Гвоздяк Р.І., Пасічник Л.А, Яковлева Л.М., Мороз С.М., Литвинчук О.О., Житкевич Н.В., Ходос С.Ф., Буценко Л.М., Данкевич Л.А., Гриник І.В., Патика В.П. Фітопатогенні бактерії. Бактеріальні хвороби рослин / За ред. В.П.Патики . – К.: ТОВ «НВП «Інтерсервіс», 2011. – 444 с.

4. Данкевич Л.А Гвоздяк Р.І. Патогенні та біохімічні властивості збудника бурої бактеріальної плямистості люпину − Pseudomonas lupini // Агроекологічн. журн. – 2005. – №1. – С. 63–68.

5. Довідник із захисту рослин / Під ред. М.П. Лісового. – К.: Урожай, 1999. – 743 с.6. Житкевич Н.В., Жмурко Л.Г. Розповсюдження бактеріальних захворювань сої у Київській області //

X з’їзд Товариства мікробіологів України: Тези доповідей (15-17 вересня, 2004 р.). − Одеса, 2004. – С. 275.


7. Житкевич Н.В., Новохацький Л.М., Данкевич Л.А., Гнатюк Т.Т. Curtobacterium fl acumfaciens − новий збудник захворювання сої в Україні // Матеріали ХІІ з’їзду Товариства мікробіологів України ім. С.М. Винограцького (25–30 травня, 2009 р) – Ужгород: Ужгородський національний університет, 2009. – С. 303.

8. Зробок О.М., Боборусь С.В. Біологічна стійкість проти збудників хвороб і продуктивність сортів ріпака ярого а агроекологічних умовах полісся // Збірник наукових праць Уманського Державного Аграрного університету. – 2009. – Вип. 71, №1. – С. 78–85.

9. Матвеева Е.В, Игнатов А.Н., Политыко В.А., Фокина В.Г. Бактериальные болезни рапса // Защита растений. – 2008. – №12. – C. 23–24.

10. Пунина Н.В., Матвеева Е.В., Игнатов А.Н., Пехтерева Э.Ш., Политыко В.А., Шаад Н.В. Оценка генетического разнообразия генов 16SpPNK, GYRB и межгенных транскриптируемых регионов 16S – 23SpPHK и XCC 0006-0007 бактерий рода Xanthomonas // 50 лет на страже продовольственной безопасности страны. Юбилейный сборник ВНИИФ. – 2008. – C. 330–347.

11. Технологія вирощування і захисту ріпаку. [Секун М.П., Лапа О.М., Марков І.Л., Ретьман С.В.,Журавський В.В.] / за ред.. М.П. Секуна та О.М. Лапи. – Укр. Акад. аграрних наук, Інститут захисту рослин, Національний аграрний університет, 2008. – 62 с.

12. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology [Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J. T., Garrity G.M]. − New York; USA: Springer Science+ Business Media, 2005. –Vol.2. – 1108 p.

13. Bradbury J.F. Guide to Рlant Pathogenic Bacteria. – Ferry Zane; Kew; Syrrey, England: CAB Int. Mycolog. Institute, 1986. – 332 p.

14. Henry A.W. Letal J. Etiological and pathogenicity studies on the bacterial pod spot of rape // Canadian Plant Disease Survey. – 1977. – 57, N 1-2. – P. 23–28.

15. Ignatov, A., Monakhos G., Djalilov F., Pozmogova E.V. Avirulence gene in Xanthomonas campesrtis pv. campesrtis homologous to avrBs2 is recognized by two race-specifi c resistance genes in Brassica oleracea // Genetika. – 2002. – N 38 – P. 1656–1662.



УДК 579.842.61:616-092.8

M. Mudryk

Uzhhorod National University, Ukraine46, Pidhirna St., Uzhhorod, 88000,Ukraine

PLANT-ISOLATED PANTOEA AGGLOMERANS – NEW LOOK INTO POTENTIAL PATHOGENICITY

Pantoea agglomerans strains have been isolated from the surface of different edible plants which are ma-jor ingredients of traditional foods of the Black Sea region countries. Bacterial strains did not possess their pathogenic properties when tested routinely in vitro, but evinced the resistance to broad-spectrum antibiotics. Experiments on murine model (BALB/c mice) have demonstrated the ability of P. agglomerans to penetrate into internal organs and provoke the distinct dose-dependent physiological changes in the intestine and gut associ-ated lymphoid tissues (GALT).

Key words: edible plants, Pantoea agglomerans, potentially pathogenic bacteria, opportunistic infections, quality of food, food borne pathogens.

Being the essential source of vitamins, bioactive compounds, starches, etc., vegetables, fruits, greens and berries take a positive effect on health. By contrast, the uncooked edible plants can be a source of the food-borne infections, caused by pathogenic and opportunistic microorganisms. The urgency of the food safety abidance is evident from the recent numerous outbreaks related to con-taminated plant foods.

Pantoea agglomerans (former – Enterobacter agglomerans) is the typical resident of the plants’ leaves and fruits’ surface but also known as an opportunistic pathogen in the immunocompromised, causing wound, blood and urinary-tract infections. This bacterium is successfully used in agricul-ture as a postharvest biological fungi antagonist [7]. In the last years the number of the articles concerning the problem of Pantoea-associated opportunistic diseases (abscesses [9], arthritis [4], nosocomial outbreaks [1] etc) has increased. And this tendency is expected to rise within increasing Pantoea-related diseases, mostly in agricultural countries [10].

It is proved that Pantoea includes hrp genes that control the ability to cause diseases [6] and might possess virulence potential [10]. Despite this no signifi cant gene differences have been found between clinical and non-clinical isolates toward human pathogenicity [11] and no marker uniquely associated to clinical strains was identifi ed [8].

The lack of data available concerning the mechanisms which are involved in potential negative infl uence of P. agglomerans on the human host initiates our current study aimed to clarify the P. agglomerans pathogenic properties in vitro and in vivo on the animal model following to microbio-logical detection of contamination of plant ingredients with P. agglomerans of the traditional foods in the Black Sea region countries.

Materials and Methods. The plant samples collected in Georgia, Bulgaria, Russia, Romania, Ukraine and Turkey have been examined for the persistence of representatives of Enterobacteri-aceae family. About 60-70 % of isolated strains were identifi ed as P. agglomerans.

In current study four strains have been used: from carrot (Bulgaria), green beans (Turkey), pars-ley (Ukraine) and carrot (Ukraine).

In vitro pathogenicity was investigated via: (1) test of activity to coagulate the serum; (2) their haemolytic properties and (3) activity to utilise lecithin. For the fi rst test 24-hour bacterial culture inoculates were introduced into the tube with dissolved rabbit plasma and incubated at a temperature of 37 °C for 1, 4, 18 and 24 hours. Positive reaction was observed as visualised cloudy contents in experimental vs. clean tubes (negative control). To detect haemolytic activity of the tested strains the latter were inoculated on the agar with 5% defi brinated human donors’ blood and incubated at a temperature of 37 °C for 18 hours. The detection of visualised haemolytic zones (α or β) was per-formed, correspondingly. Finally, the ability to utilise the lecithin strains of P. agglomerans has been detected by opalescence zones of colonies growth on lecithin containing agar.

All the samples were tested for sensitivity to 7 antibiotics using Kirbi-Bauer method accord-ing to EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) recommendation: ampicillin (10 mg), amoxycilline/clavunate (20/10 mg), cefotaxime (10 mg), ceftazidime (30 mg),

© M. Mudryk, 2012


ciprofl oxacin (5 mg), amikacin (30 mg), gentamycin (10 mg) (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, India). Inoculum was prepared by suspending of isolated 24-hour colony from non-selective agar medium in PBS with density of 0.5 by McFarland turbidity standard. Visible growth zone inhibition measurement was conducted in 24 hours of incubation.

P. agglomerans isolated from green beans (Turkey) which were characterised by the highest level of resistance to tested antibiotics had been chosen for in vivo experiment. Three groups of the BALB/c mice (9 animals per each group) of the same age, sex, weight, feed and drink (diet con-sumption) were formed and used in our study [2]. Suspension of the 24-hour P. agglomerans culture had been prepared in potassium-buffer solution (PBS) in three different concentrations (1.4 · 105, 2.5 · 106 and 4.5 · 108 in 200 μl/mouse) and mice were orally inoculated.

Three mice from each group were sacrifi ced with CO2 inhalation on the 24, 48 and 72nd hour of the experiment in accordance with ethical permit requirements. The following examinations had been carried out: (1) macroscopic observation of the changes of lungs, heart, liver, spleen, small and large intestine, caecum, Payer patches (PPs) and mesenteric lymph nodes (MLNs); (2) microbiologi-cal analyses of persistence of inoculant in the trachea, lung, heart, liver, spleen and other tissues in order to examine their potential to translocate into such parenchymal organs and detection of key intestinal representatives of host microbiota in content of colon – to estimate their infl uence on gut homeostasis.

Macroscopic assay was performed immediately after mice autopsy according to standard pro-cedure, microbiological investigation was conducted by sterile instrument in laminar box with maintenance of aseptic conditions. During microbiological experiment the following media for the dissemination investigation were used: meat infusion agar, MacConkey agar, potato agar, Strepto-coccus- and Enterococcus agar, MRS agar, URI-select media. Final identifi cation was carried out us-ing commercial standard biochemical tests systems (API-tests and ENTERO-tests, correspondingly produced by bioMérieux, France and LACHEMA, Brno).

Results and Discussions. All of four tested strains of P. agglomerans were not able to coagulate serum, or demonstrate haemolytic and lecithin utilising properties. The strains of P. agglomerans, isolated from different countries, were characterized by approximately identical resistance to the tested antibiotics, in particular, to ampicillin, amoxycilline/clavunate and cefotaxime, which partly may indicate this feature as a species not strain-specifi c resistance. Two isolates were susceptible to ceftazidime and all the examined strains were sensitive to fl uroquinolone and aminoglycosides (Table 1). Antibiotic-sensitivity was detected according to the EUCAST recommendation for Enter-obacteriaceae in the last Clinical Breakpoint Table [3].

Table 1

Antibiotics relation of strains of P.agglomerans isolated from different plants

№ Antibiotics

P.agglomeransEUCAST Zone diameter

breakpoint, mmStrain 1,carrot,

Bulgaria

Strain 2, green beans,

Turkey

Strain 3,parsley, Ukraine

Strain 4,carrot,

Ukraine1 Ampicillin (10 mg) Res Res Res Res 14 mm (Sens ≥, Res <)

2 Amoxycilline/clavunate (20/10 mg) Sens Res Res Res 17 mm (Sens ≥, Res <)

3 Cefotaxime (10 mg) Sens Res Res Res 20 mm (Sens ≥), 17 mm (Res <)4 Ceftazidime (30 mg) Res Res Sens Sens 22 mm (Sens ≥), 19 mm (Res <)5 Ciprofl oxacin (5 mg) Sens Sens Sens Sens 22 mm (Sens ≥), 19 mm (Res <)6 Amikacin (30 mg) Sens Sens Sens Sens 16 mm (Sens ≥), 13 mm (Res <)7 Gentamycin (10 mg) Sens Sens Sens Sens 16 mm (Sens ≥), 13 mm (Res <)

Notes: “Res” – resistant to antibiotic, “Sens” – sensitive to antibiotic

All tested doses of P. agglomerans inoculant did not result in the death of experimental animals. Macroscopic examination of internal organs at the same time have revealed the dose-dependent morphological alteration of some internal organs of experimental animal. Particularly, mice which received the highest dose of bacterial suspension were characterized by early (within fi rst 24 hours) reaction to the inoculation: PPs and MLNs’ hypertrophy, moderate hepatomegalia and fl atulence. A group of mice, which received inoculums in lower doses had the same alterations, but later on (72 hours after bacterial gavage). The results of macroscopic examination are shown in Table 2.


Table 2The results of macroscopic investigation of internal organs and lymph nodes of mice

inoculated with different doses of P. agglomerans.Dose

(CFU/mouse) Hours Changes in internal organs

1.4 · 105

24 No visible pathological changes observed48 Moderate hepatomegalia, cholecele

72

Lungs – with intense vascular pattern;Liver – hepatomegalia, cholecele;Spleen – with intense vascular pattern;Small intestine – infl ated, with intense vascular pattern and intestinal distension;Large intestine – proximal parts are infl ated and overfi lled by faeces, distal one is empty;Submandibular and subaxillary lymph nodes - enlarged

2.5 · 106

24

Liver – enlarged, cholecele;Small intestine – moderately infl ated; Large intestine – no visible pathological changes; Submandibular lymph nodes- enlarged

48Liver – enlarged; Small intestine – infl ated;Large intestine - no visible pathological changes, thin faecal masses

72

Hepatomegalia;Small and large intestine – infl ated, thin fecal masses;Submandibular and subaxillary lymph nodes – enlarged;Mesenteric lymph nodes – enlarged

4.5· 108

24 No visible pathological changes

48

Spleen – moderately enlarged;Small intestine –infl ated;Large intestine – no visible pathological changes, thin faecal masses;Submandibular and axillary lymph nodes – enlarged

72

Lungs - with intense vascular pattern;Hepatomegalia, cholecele; Spleen - with intense vascular pattern; Small intestine and large intestine – infl ated;Submandibular and axillary lymph nodes – enlarged

Control mice No visible pathological changes

Translocation of P. agglomerans into the spleen, lungs and liver was observed in the mice inocu-lated with the lowest dose of suspension; translocation into the heart – in the mice inoculated with the middle and the highest dose; and into the trachea in each experimental group on the 48th hour of the experiment (Table 3).

Table 3 Translocation of P. agglomerans into parenchymal organs of experimental animals

in different inoculated doses in the dynamicAmount of isolated P. agglomerans , CFU/g

Time of experiment, hours 24 48 72

Experimental group, dose

1 1.4 · 105

11.4 · 105

22.5 · 106

34.5 · 108

11.4 · 105

Trachea (6.5±0.3) · 104 (5.7±0.27) · 103 (1.8±0.1) ·104 (1.8±0.12) ·104 (4.4±0.47) ·104

Heart 0 0 (5.5±0.24) ·103 (4.5±0.27) ·103 0Lungs (1.8±0.13) · 106 0 0 0 0Liver 0 (3.2±0.32) ·103 0 0 0

Spleen (5.8±0.45) · 104 0 0 0 0Kidney 0 0 0 0 0

Notes: “0” means absence of bacterial growthChanges of key microorganisms in content of the colon of all the experimental mice were not

dependent statistically on the oral dose of P. agglomerans suspension.The presence of all strains-inoculants in the gut of all experimental groups was confi rmed; the

insuffi cient decreasing of Lactobacteriaceae and moderate declining of lactose-positive Escheri-chia coli had been detected; the suffi cient diminishing until to complete absence of Enterococcus spp., which proportionally depended on concentration of inoculated strains suspension, had been also observed.


The summarized results of alteration of the gut microbiota homeostasis with oral gavage of dif-ferent doses of P. agglomerans in all experimental groups of mice on the 72th hour after inoculation are presented in Table 4.

Table 4 The shift of key microbial isolates in colon in different groups of mice inoculated

with P. agglomerans (72 hours) vs. to control groupGroup of mice, number Group 1 Group 2 Group 3 ControlP. agglomerans (2.1±0.2)·103 (2.1±0.1)·103 (6.3±0.3)·104 0Lactobacillus spp. (5.3±0.4)·105 (3.3±0.3)·104 (2.7±0.2)·105 (2.6±0.3)·105

Staphylococcus spp. (4±0.2)·106 0 (4.76±0.4)·104 (7.2±0.54)·104

Streptococcus spp. (5.3±0.3)·105 (1.3±0.1)·105 (2±0.2)·105 (4.3±0.7)·103

Enterococcus spp. (9.47±0.5)·102 0 0 (4.3±0.36)·103

E. coli lactose + (2.1±0.12)·106 (3.2±0.3)·104 (3.17±0.2)·104 (3±0.17)·106

E. coli lactose - (2.2±0.2)·103 (2.8±0.2)·104 (5.6±0.37)·104 (3.8±0.26)·102

Notes: “0” means absence of bacterial growth

Exp. group 1

(inoculated dose 1.4 · 105 CFU/mouse)

Exp. group 2


Exp. group 3


Control group

Fig. 1. Macroscopic changes of the abdominal cavity organs detected in mice, orally inoculated with different doses of P. agglomerans suspension and in control group

Finally, we can conclude that resistance of the investigated P. agglomerans strains to the most frequently used antibiotics (ampicillin, amoxicillin, cephalosporines) illustrates their importance as causative organisms in case of either food-borne or nosocomial infections. The absence of patho-genic properties in vitro could cause one to come to a false conclusion about P. agglomerans harm-lessness, but detrimental effect on the organism could be proved within in vivo investigation. Dif-ferent orally inoculated doses of bacterial suspension leave the life-threatening functions of the immunocompetent organism unaltered. But P. agglomerans-associated diseases could be crucial for immunocompromised organisms due to the bacteria’s ability to provoke lymph nodes hypertrophy; to translocate into different internal organs as a precondition for the sepsis beginning; to change microbial content of faeces via the benefi cial bacteria suppression up to the total absence.

Our results indicate the necessity of in vivo research in order to clarify the pathogenic properties of microorganisms with obligatory detection of their potential infl uence on microbial homeostasis of the intestine and then on the local (mucosal) immune response (data not shown here). This research is important to develop or improve the national and EFSA regulation to food safety and quality is-sues especially in case when vegetable products are fresh-eaten.

This work is funded under the EU FP7 Theme 2: Food, agriculture, fi sheries, and biotechnology, Grant Agreement No: 227118.


М.Р. МудрикДВНЗ «Ужгородський національний університет», вул. Підгірна, 46, м. Ужгород, 88000, Україна

ІЗОЛЬОВАНА З ПОВЕРХНІ РОСЛИН PANTOEA AGGLOMERANS – НОВИЙ ПОГЛЯД НА ПРОБЛЕМУ ПОТЕНЦІЙНОЇ ПАТОГЕННОСТІ

Р е з ю м еШтами P. agglomerans були ізольовані з поверхні різних їстівних рослин, які є основними компонен-

тами традиційних страв країн чорноморського регіону. У даних ізолятів не виявлено факторів патоген-ності in vitro, однак штами характеризувались стійкістю до антибіотиків широкого спектру дії. Експери-менти на мишах (BALB/с лінія) продемонстрували здатність P. agglomerans проникати в деякі внутрішні органи мишей і провокувати дозозалежні фізіологічні зміни в кишечнику та в асоційованій лімфатичній тканині кишечнику (КАЛТ).

К л ю ч о в і с л о в а: їстівні рослини, Pantoea agglomerans, потенційно патогенні бактерії, опортуніс-тичні інфекції, якість харчових продуктів, харчові патогени.

М.Р. МудрыкГВУЗ «Ужгородский национальный университет», ул. Пидгирна, 46, г. Ужгород, Украина, 88000

ИЗОЛИРОВАНАЯ С ПОВЕРХНОСТИ РАСТЕНИЙ PANTOEA AGGLOMERANS – НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА ПРОБЛЕМУ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ

ПАТОГЕННОСТИ

Р е з ю м еШтаммы P. agglomerans были изолированы с поверхности различных съедобных растений, которые

являются основными компонентами традиционных блюд стран черноморского региона. Нами не выявлено у них факторов патогенности in vitro, однако данные штаммы характеризовались устойчивостью к антибиотикам широкого спектра действия. Эксперименты на мышах (линия BALB/с) продемонстрировали способность P. agglomerans проникать во внутренние органы мышей и провоцировать дозозависимые физиологические изменения в кишечнике и в ассоциированной лимфатической ткани кишечника (КАЛТ).

К л ю ч е в ы е с л о в а: съедобные растения, Pantoea agglomerans, потенциально патогенные бакте-рии, оппортунистические инфекции, качество пищевых продуктов, пищевые патогены.

Bergman K.A., Arends J.P., Schölvinck E.H1. . Pantoea agglomerans septicemia in three newborn infants // Pediatric Infectious Disease Journal. – 2007. – 26, Iss. 5. – P. 453–454.Boyko N., Kobuley D., Weiser J. N., Cebra J. J.2. Are B1 cells selectively and specifi cally stimulable by antigen based on their BCR? // Clin. Inv. Med. (Suppl.). – 2004. – 27. – Р. 4–5.EUCAST3. Clinical Breakpoint Table V 2.0, valid from 01.01.2012. [www.eucast.org].Kratz A., Greenberg D., Barki Y., Cohen E., Lifshitz M4. . Pantoea agglomerans as a cause of septic arthritis after palm tree thorn injury; case report and literature review // Archives of Disease in Childhood. – 2003. – 88. – P. 542–541.Lindgren P.B.5. The role of hrp genes during plant-bacterial interactions // Annual Review of Phytopathology. – 1997. – 35. – P. 129–152.Naha K., Ramamoorthi, Prabhu M6. . Spontaneous septicaemia with multiorgan dysfunction – a new face for Pantoea agglomerans // Asian Pacifi c Journal of Tropical Medicine. – 2012. –5, Iss. 1. – P. 83–84.Nunes C., Usall J., Teixidó N., Viñas I7. . Biological control of postharvest pear diseases using a bacterium Pantoea agglomerans (CPA-2) // Int. J. Food Microbiology. – 2001. – 70, Iss. 1-2. – P. 53–61.Rezzonico F., Smits T., Montesinos E., Frey J.E., Duffy B8. . Genotypic comparison of Pantoea agglomerans plant and clinical strains. – 2009. – [doi:10.1186/1471-2180-9-204].Rodrigues A.L., Lima I.K., Koury A.-Jr, de Sousa R.M., Meguins L.C9. . Pantoea agglomerans liver abscess in a resident of Brazilian Amazonia // Tropical Gastroenterology. – 2009. – 30 (3). – P. 154–155. Völksch B., Thon S., Jacobsen I.D., Gube M.10. Polyphasic study of plant- and clinic-associated Pantoea agglomerans strains reveals indistinguishable virulence potential // Original Research Article Infection, Genetics and Evolution. – 2009. – 9, Iss. 6. – P. 1381–1391. Weinthal D.M., Barash I., Panijel M., Valinsky L., Gaba V., Manulis-Sasson S.11. Distribution and replication of the pathogenicity plasmid pPATH in diverse populations of the gall-forming bacterium Pantoea agglomerans // Applied and Environmental Microbiology. – 2007. – 73, Iss. 23. – P. 7552–7561.



УДК 579.6:663.1

И.Р. Притула, А.Б. Таширев

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украиныул. Академика Заболотного, 154, Киев ГСП, Д 13680, Украина

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ВОДОРОДОБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА CLOSTRIDIUM

Усовершенствован метод выделения и количественного учета чистых культур облигатно-анаэ-робных водородобразующих клостридий. Из ассоциации спорообразующих бактерий выделен штамм водородобразующих бактерий Clostridium sp. ВУ-11. При росте штамма на жидкой среде определены количественные показатели синтеза водорода и сбраживания крахмала. Концентрация Н2 в газовой фазе – 49 %, из 1 кг крахмала микроорганизмы синтезировали 128 л Н2, за 6 суток масса крахмала уменьшалась в 7 раз. Указанные показатели синтеза водорода и сбраживания крахмала, а также в дальнейшем других модельных органических субстратов являются основой для создания промышленной биотехнологии получения энергоносителя – водорода при обезвреживании экологически опасных твер-дых пищевых отходов.

Ключевые слова: биотехнологии синтеза энергоносителей, водородобразующая ассоциация, Clostridium sp., техника анаэробиоза.

Клостридии и другие анаэробные водородобразующие бактерии используются в биотех-нологиях синтеза молекулярного водорода при сбраживании органических субстратов (dark fermentation) [5]. Такое брожение может быть проведено как с помощью чистых культур во-дородобразующих бактерий, так и ассоциаций. В состав ассоциаций также могут входить не образующие водород бактерии. Использование ассоциаций технологически более оправдано, так как несколько видов могут одновременно сбраживать широкий спектр субстратов, что уменьшает стоимость и повышает эффективность процесса синтеза Н2. Кроме того, ассоци-ации являются более стабильными в промышленных условиях, чем чистые культуры мик-роорганизмов. Тем не менее, для промышленного синтеза Н2 чаще всего используют чистые культуры. Основными аргументами в их пользу являются: избирательность субстратов, легко достигаемая регуляция метаболизма, высокий суммарный синтез Н2 вследствие уменьшения выхода нежелательных продуктов метаболизма. Кроме того, считается, что синтез Н2 на осно-ве чистых культур является легко воспроизводимым. Однако использование чистых культур для синтеза Н2 значительно повышает его себестоимость вследствие дороговизны стерильных условий культивирования [6].

В последние годы наибольшее количество среди работ по получению Н2 хемоорганотроф-ными бактериями посвящено использованию чистых культур клостридий и ассоциаций [7]. Ранее нами из пастеризованной почвы получена ассоциация Bacillus и Clostridium, которая быстро сбраживает картофель и крахмал и в больших количествах синтезирует Н2 [2]. Для направленной регуляции синтеза Н2 с помощью ассоциаций или чистых культур бактерий не-обходимым является выделение и изучение типовых (репрезентативных) штаммов. Важными задачами для получения изолированных колоний является оптимизация условий культивиро-вания на жидких и твердых питательных средах, выбор метода культивирования, подбор ис-точника питания и восстановителя, определение необходимых для микроорганизмов факторов роста.

Среди методов выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов надежными и удобными являются метод покровных стеклянных или полимерных пластинок (метод Штурм в модификации Дуды) [1], культивирование в анаэробных камерах типа анаэростатов и перча-точных боксах, метод Хангейта и его модификации [4]. Анаэробные условия достигаются при-менением физических, химических и биологических методов или их комбинированием [1, 3].

В технике культивирования облигатно-анаэробных микроорганизмов наиболее часто ис-пользуются сульфид (S2-)-содержащие восстановители, такие как H2S, Na2S, аморфный FeS, цистеин, цистеин-сульфид и др. [1, 4]. Однако большинство из них ингибирующее действуют на клостридии. Поэтому для оптимизации метода культивирования Н2-синтезирующих клост-

© È.Ð. Ïðèòóëà, À.Á. Òàøèðåâ, 2012


ридий мы использовали предложенный Таширевым [4] восстановитель железо(II), так как он нетоксичен и быстро (10-15 сек) снижает редокс-потенциал (ОВП, Eh) до -150 мВ.

Целью нашей работы было выделение из природной аэробно-анаэробной ассоциации де-структоров крахмала репрезентативных культур водородобразующих бактерий рода Clostridium и оптимизация условий их выращивания на жидких и твердых питательных средах.

Материалы и методы. Для выделения водородобразующих штаммов Clostridium полу-чали ассоциации микроорганизмов в картофельном заторе, как описано в работе [2]. Почву и нарезанный неочищенный картофель выдерживали 10 мин на водяной бане при 100 °С, инку-бировали в термостате при 30 °С, а затем вносили в стеклянные флаконы с питательной сре-дой. Для культивирования использовали флаконы объёмом 100 мл с резьбой на горловине. Их герметично закрывали с помощью эластичных резиновых пробок или металлических колпач-ков (с отверстием диметром 3-7 мм в центре для отбора проб газа и культуральной жидкости с помощью шприца). Все последующие культивирования проводили при 30 °С. Ассоциацию микроорганизмов культивировали на двух жидких питательных средах.

Крахмальная среда №1 (г/л): крахмал пищевой – 10,0; K2HPO4 – 2,5; KH2PO4 – 0,5; NH4Cl – 2; Na2SO4 – 0,5; дрожжевой экстракт – 0,5; пептон – 0,5; дистиллированная вода – 1000 мл; рН=7,1-7,3. Заваренный крахмал, пептон и дрожжевой экстракт стерилизовали отдельно при 0,5 атм (20 мин), минеральные соли – при 1,5 атм (20 мин). Для контроля ОВП в среде ис-пользовали резазуринат натрия, который вносили в количестве 1 мл/л (0,1% раствор). При Eh≤ -50 мВ фиолетово-красный резазурин переходит в форму ярко красно-розового резоруфи-на, а при Eh≤ -100 мВ образует бесцветную форму – лейкорезоруфин. Для колориметричес-кого измерения рН в среду вносили 3,6 мл/л 0,0005% раствора бромтимолового синего. При рН≤6 индикатор имеет жёлто-оранжевый цвет, при рН=7 – переходит в зелёный, а при рН>7,5 и выше – в сине-зелёный и далее синий цвет.

Среда с нативным картофелем (г/л): нативный картофель – 143,0; K2HPO4 – 2,5; KH2PO4 – 0,5; NH4Cl – 2; Na2SO4 – 0,5; дрожжевой экстракт – 0,2; дистиллированная вода – 1000 мл; рН=7,1-7,3; резазурин – 1 мл 0,1% раствор; бромтимоловый синий – 3,6 мл 0,0005% раствор. Нативный картофель стерилизовали методом двукратной стерилизации. Для этого герметично закрытые флаконы с сырым (нативным) картофелем, дистиллированной водой и резазурином 10 мин выдерживали на кипящей водяной бане. После 24 ч инкубации при 30 °С повторно кипятили на водяной бане 5 мин и снова инкубировали при 30 °С. Отсутствие роста микроор-ганизмов и обесцвечивания резазурина в течение 3-5 суток свидетельствовали о стерилизации картофеля.

Изолированные колонии клостридий в анаэростате выделяли на четырёх агаризованных средах (агар – 15 г/л): 1) агаризованная среда №1, 2) среда с тёртым картофелем (отжатая мякоть картофеля – 300 г/л), 3) среда с картофельным пюре «Мивина» (сухое пюре – 30 г/л) и 4) картофельный агар. Минеральные соли, те же что и в крахмальной среде №1, вносили в первые три среды; дрожжевой экстракт и пептон – в первые две среды; резазурин – во все четыре среды. Стерилизацию компонентов среды проводили, как описано для крахмальной среды №1.

Изолированные колонии клостридий по методу Штурм выделяли на крахмальной агари-зированной среде №2 (агар – 15 г/л). Последующую реизоляцию колоний проводили с исполь-зованием крахмальной среды №2. Состав среды (г/л): крахмал пищевой – 10,0; K2HPO4 – 6,0; NH4Cl – 2,0; Na2SO4 – 0,5; дрожжевой экстракт – 0,5; пептон – 0,5; дистиллированная вода – 1000 мл; резазурин – 1 мл (в жидкой среде) и 4 мл (в агаризованной среде) 0,1% раствора; бромтимоловый синий (в агаризованную среду не вносили) – 3,6 мл 0,0005% раствор; рН=8,4-8,6. Стерилизацию компонентов среды проводили, как описано для крахмальной среды №1. Необходимость высокого значения рН среды обусловлена тем, что рН восстановителя в хела-тированной форме составляет 5,0-5,1, и при его внесении (300-600 мг/л в пересчёте на катион Fe2+) рН среды снижается до нейтральных или слабощёлочных значений 7,2-7,4.

Восстановитель сероводород получали в стеклянных флаконах объемом 50 мл с резьбой на горловине следующим образом: флакон №1 на ½ высоты заполняли насыщенным раствором Na2S, а флакон №2 – сухой лимонной кислотой. Флаконы продували 10 мин аргоном под ватно-марлевыми, затем закрывали эластичными резиновыми пробками, которые фиксировали ме-таллическими фиксаторами с отверстиями в центре. Проколов иглой пробку, отбирали 2,0 мл Na2S и вкалывали его во флакон с лимонной кислотой. В результате реакции нейтрализации получали 40 мл H2S. Сероводород отбирали шприцем с резиновой прокладкой на поршне.


Последовательность операций посева клостридий в модифицированном методе Штурм была следующей: в стеклянные флаконы объемом 100 мл с ватно-марлевыми пробками вноси-ли по 40 мл крахмальной агаризированной среды №2 и помещали на водяную баню (45-55 °С). Выделение микроорганизмов проводили методом 6-7 последовательных десятикратных разве-дений инокулята из флаконов, где происходило сбраживание картофеля или крахмала водоро-добразующей ассоциацией. В контрольном варианте во флакон инокулят не вносили. В среду вносили восстановитель Fe2+, перемешивали её до обесцвечивания резазурина (Eh≤ -100 мВ) и вносили в крышку чашки Петри. После внесения среды у краев крышки помещали 3 стек-лянные цилиндра (d= 4 мм; l = 10 мм). Щель между крышкой и чашкой заполняли стерильной смесью вазелинового масла и парафина (вазпаром) в объемном соотношении 1:1.

Рабочий раствор восстановителя Fe2+ готовили следующим образом: во флакон объёмом 30 мл с резьбой на горловине под ватно-марлевой пробкой вносили 2,0 г двузамещённого цит-рата натрия (С6Н5О7Na2 • 1,5 Н2О) и 2,0 г железа (II) в виде FeSO4 • 7H2O (20 г/л в пересчете на катион Fe2+). Содержимое продували аргоном 20 мин, а затем, не прекращая продувки, вно-сили 20 мл дистиллированной воды и продували еще 10 мин. Далее флакон закрывали пени-циллиновой пробкой и навинчивали алюминиевый колпачок с отверстием (d=5 мм) в центре для отбора восстановителя с помощью шприца. Проколов иглой резиновую пробку, во флакон подавали аргон до избыточного давления 0,4-0,5 атм и стерилизовали 10 мин на водяной бане при 100° С.

Газово-хроматографический анализ проводили, как описано в работе [2].Результаты и их обсуждение. Ассоциация споровых бактерий (Bacillus и Clostridium) по-

лучена методом пастеризации. Поэтому она не содержит физиологических групп микроорга-низмов, потребляющих Н2 и снижающих его концентрацию в газовой фазе (денитрифицирую-щие, азотфиксирующие, ацетогенные, сульфатвосстанавливающие, метанобразующие и др.). Кроме того, при контаминации споровой ассоциации нежелательными видами микроорганиз-мов, от них можно легко избавиться повторной пастеризацией.

Такую ассоциацию мы получили в картофельном заторе, который обычно используется для получения накопительной культуры маслянокислых бактерий. Селективные условия для роста клостридий создавали следующим образом:

1) использованием крахмала картофеля, как источника углерода, доступного только для микроорганизмов, содержащих амилолитические ферменты (α- и β-амилаза, глюкоамилаза, пуллуланаза и др.);

2) пастеризацией, которая обеспечивала выживание только клостридий, сбраживающих крахмал с образованием Н2;

3) созданием анаэробных условий (отсутствие О2 – конкурентного терминального акцеп-тора электронов).

С целью сбора газа в пробирке ватно-марлевую пробку на третьи сутки заменили резино-вой. Через 2,5 часа провели газово-хроматографический анализ для подтверждения того, что синтезированный газ содержит Н2. Проколов иглой шприца пробку, отбирали пробы. Концен-трация водорода в газовой фазе в различных вариантах составляла 2,0-6,4 %.

Мы считаем, что балансовые эксперименты лучше проводить на синтетических или полу-синтетических средах. Для этого ассоциацию пересевали на жидкие полусинтетические сре-ды с а) крахмалом и б) нативным картофелем. Синтез газа при сбраживании двух субстратов происходил в течение 9-11 и 13-15 суток, соответственно. Концентрация Н2 составляла от 18 до 55 % и от 15 до 54 %, соответственно.

Выделение изолированных колоний на поверхности агаризованной среды является важной задачей работы, так как их морфологическое описание необходимо для идентификации выде-ленных штаммов. Поэтому вначале мы выбрали способ культивирования в анаэростатах. Одна-ко в коммерческих анаэростатах газогенерирующие пакеты не обеспечивают полное удаление кислорода. Для культивирования облигатно-анаэробных микроорганизмов, кроме удаления О2 из среды, также необходимо создание отрицательных значений ОВП (Eh≤ -100 мВ). Общепри-нято, что для роста облигатно анаэробных бактерий достаточным является ОВП -150 мВ. Это-го можно достичь внесением такого восстановителя, как Н2S в среду или газовую фазу. Однако конструкция большинства поликарбонатных анаэростатов не позволяет технически внести в него сероводород. Поэтому мы использовали недорогой, но надёжный стеклянный анаэростат.


Воздух из него удаляли трёхкратным вакуумированием с последующим внесением аргона. Удаление следов О2 и снижение ОВП в питательной среде достигалось внесением в газовую фазу H2S. Известно, что H2S, как и другие восстановители, в зависимости от их дозы, оказыва-ют токсический эффект на бактерии. Так, одни клостридии могут расти в широком диапазоне концентраций H2S, для других – даже следовые его количества подавляют их рост.

Изолированные колонии клостридий вначале выделяли на агаризованной среде №1 как среде наиболее известного состава. В результате многократных экспериментов мы выясни-ли следующее: в концентрации от 1 до 1,8 % H2S создавал в среде необходимый потенци-ал –150 мВ (резазурин оставался бесцветным в течение 10-15 суток). Однако клостридии на поверхности среды не росли. При уменьшении концентрации H2S от 1 до 0,65% – клостри-дии также не росли, так как в среде не создавалось необходимое для их роста значение ОВП (резазурин оставался окрашенным в розовый цвет или был бесцветным всего 1 сутки). Мы предположили, что в указанном концентрационном диапазоне, Н2S токсичен для клостридий, а поэтому непригоден для их выделения на агаризованной среде №1. Поэтому мы проверили возможность роста на средах сходных по составу к нативному картофелю: среда с тёртым кар-тофелем, среда с картофельным пюре «Мивина» и картофельный агар. Однако и в этом случае рост клостридий отсутствовал. Это является подтверждением того, что отсутствие роста клос-тридий обусловлено токсическим действием на них H2S. Поэтому мы отказались от культиви-рования клостридий в анаэростате в атмосфере аргона с добавлением сероводорода.

Далее мы изучили возможность применения метода Штурм для выделения Н2-образу-ющих клостридий. Достоинствами метода являются: 1) доступность, 2) проста в работе и 3) эффективность для культивирования облигатных анаэробов. Существенными недостатками оригинального метода, первые два из которых обусловлены выливанием среды с крышки при неравномерном накрывании её чашкой, являются: 1) невозможность создания фиксированно-го объема и слоя среды; 2) сложность соблюдения стерильности; 3) непригодность парафина для герметизации щели между крышкой и чашкой.

Для устранения недостатков, а также усовершенствования метода для выделения Н2-обра-зующих клостридий, мы осуществили следующие модификации:

1. Стандартизация толщины слоя и объёма среды: после внесения бактериального агара (бактагар: среда с инокулюмом) у краев крышки помещали 3 стеклянные цилиндра, благодаря которым среда не выливалась и имела фиксированную высоту, равную их диаметру. При ди-метре цилиндра 4 мм объём среды был 40 мл.

2. Использование вазпара для герметизации: благодаря своей коллоидной структуре он со-четает в себе преимущества своих составляющих и лишён их недостатков. Так, окисляющий среду О2 воздуха диффундирует через пористую структуру парафина, а сквозь вазелиновое масло он может проникнуть путем конвекции. Вазпар надёжно защищает среду от контакта с О2. Поскольку после застывания крахмальный агар и вазпар сходны по цвету (бело-матовые), для их контрастирования и обнаружения щелей при заливке, вазпар целесообразно подкраши-вать неполярными красителями (например, судан III). Рост колоний в камерах из чашек можно наблюдать в течение длительного периода времени (более 1 месяца), не нарушая целостности таких камер.

3. Выбор восстановителя: наиболее подходящим жидким восстановителем для культиви-рования анаэробных микроорганизмов является Fe2+. Преимущества соединений железа (II) следующие: 1) в рабочих (эффективных) концентрациях не токсичны для бактерий, 2) очень быстро поглощают следы О2 из газовой фазы и питательной среды: в нейтральных условиях редокс-равновесие в –150 мВ устанавливается уже через 10-15 сек; 3) препараты Fe2+ (FeSO4 • 7Н20, FeSO4(NH4)2SO4 • 6H2O (соль Мора)) являются дешевыми и удобными в технике культи-вирования анаэробов. В нейтральных и слабощелочных условиях катион Fe2+ образует нерас-творимые соединения (Fe(OH)3, FeCO3, FeHPO4). Поэтому для стабилизации катиона Fe2+ мы хелатировали его двухзамещенным цитратом натрия. При приготовлении этого комплексного соединения, необходимо соблюдать молярное соотношение ионов железа и цитрата 1:1,5. Эк-спериментально установлено, что железо(II) сульфат (300-600 мг/л Fe2+) не угнетал рост ис-следуемых клостридий, обеспечивал достаточный для облигатных анаэробов величину ОВП и необходимую редокс-буферную ёмкость. Использование железа как восстановителя также повышает активность гидрогеназы, ответственную за образование H2. Известно, что в актив-


ном центре этого фермента содержится уникальный биметаллический (Fe-Fe) центр с небел-ковыми лигандами (СО, CN) [8].

4. Корректировка рН питательной среды: при использовании крахмальной среды № 1 мы столкнулись с проблемой значительного снижения её рН (до 3,9-4,0) при внесении кислого раствора (рН 5,0-5,1) восстановителя. При этом рост клостридий отсутствовал. Для стабили-зации нейтральных значений рН (7,2-7,4) использовали крахмальную агаризированную среду №2, в которой, по сравнению с предыдущей средой, был убран кислый KH2PO4, и была увели-чена до 6 г/л концентрация щёлочного K2HPO4.

5. Определение факторов роста: для этого выделение клостридий проводили на трёх вари-антах среды: по 0,2 г/л, по 0,5 г/л и без добавления дрожжевого экстракта и пептона. В разве-дениях с первого по четвёртое, во всех вариантах на первые сутки был рост газоном. С пятого по седьмое разведение при отсутствии факторов роста визуально рост колоний наблюдали на вторые сутки. Добавление факторов роста стимулировало рост клостридий, и визуально рост колоний наблюдали уже на 17-20 ч роста.

Колонии Н2-образующих клостридий отбирали по способности к гидролизу крахмала и образованию газа. Визуальными признаками этих процессов было появление светлого кольца вокруг колонии и отрицательная йодокрахмальная реакция кольца, а также образование газо-вых пузырьков и разрывов агара в зоне роста колоний (рис.1).

1

2

3

Рис.1. Рост изолированных колоний водородобразующих штаммов Clostridium на крахмальной агаризированной среде №2 по оптимизированному методу Штурм: 1 – отдельные колонии; 2 – светлые зоны гидролиза крахмала; 3 – газовые разрывы в

зоне роста колоний.

Для доказательства выделения Н2-образующих колоний клостридий определяли состав газовой фазы в чашках. Для этого отобрали чашку, где было обильное образование газовых разрывов среды. В такой чашке вазпар давлением выдавливался из щели, и под ним образовы-вался газовый пузырь. Из него отбирали 2,5 мл газа для газово-хроматографического анализа. Концентрация Н2 составляла больше 6 %.

Для проверки чистоты культуры и дальнейших физиологических исследований колонии переносили на жидкую среду. Для этого дно чашки снимали, стерильным шпателем вырезали агаровый блок с колонией и переносили во флакон с крахмальной средой №2. Флакон проду-вали аргоном, герметично закрывали и шприцем вносили железо(ІІ) в концентрации 400 мг/л. Известно, что рост клостридий в первые сутки сопровождается активным образованием кис-лот: уксусной, масляной, пропионовой и др. [6]. Поэтому на 1-2 сутки роста мы отмечали из-менение цвета рН-индикатора бромтимолового синего с сине-зелёного на жёлто-оранжевый. Это свидетельствовало о снижении рН как минимум до 6,0. Для более точного определения рН использовали индикатор метиловый красный (переход окраски от красной к жёлтой при pH=4,4-6,2). При добавлении к отобранной шприцем пробе культуральной жидкости индика-тора, его окраска изменялась на красную, а в некоторых вариантах на пурпурную, что свиде-тельствовало о снижении значений рН до 4,4 и ниже. Для корректировки рН на уровне 6,5-7,5,


шприцем вносили 1 М стерильный раствор натрия карбоната. Последовательную реизоляцию с жидкой на агаризованную среду проводили трижды. Во втором и третьём пассажах наблю-дался рост морфологически одинаковых колоний: белые неправильные или древовидные, диа-метр 0,4-2 мм.

Результаты микроскопических исследований свидетельствуют о том, что клетки выде-ленного штамма Н2-образующих клостридий грамположительные, прямые палочки с закруг-ленными концами размером 0,8-1х2,5-3,1 мкм; с центральными овальными спорами (рис. 2). Рабочее название штамма – Clostridium sp. ВУ-11. При росте штамма в жидкой среде на про-тяжении 3 пассажей определены количественные показатели синтеза водорода и сбраживания крахмала (рис. 3). Максимальная концентрация Н2 в газовой фазе 49 %, а средняя – 37 %. Из 1 кг крахмала штамм синтезировал 128 л Н2, время деструкции крахмала – 6 суток; коэффици-ент деструкции (уменьшение массы крахмала) – 7.

Рис. 2. Морфология окрашенных по Граму клеток штамма Clostridium sp. ВУ-11 при росте на крахмальной среде №2 (х1500).

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7

,

,

0

20

40

60

80

100

, %

2, %

2, %2

2

Рис. 3. Динамика синтеза газа и состава газовой фазы при росте штамма Clostridium sp. ВУ-11 на крахмальной среде № 2.

Таким образом, в данной работе, на основе метода Штурм усовершенствован метод вы-деления чистых культур и количественого учета облигатно-анаэробных бактерий. Выделен штамм Н2-образующих бактерий Clostridium sp. ВУ-11, который при росте на полусинтетичес-кой среде с крахмалом образует до 49 % Н2. Следующим этапом работы будет идентификация выделенного штамма с помощью классических культурально-морфологических и молекуляр-но-генетических методов. Фундаментальный аспект исследования Н2-образующих видов бак-терий заключается в количественной оценке их участия в глобальных циклах Н2 и углерода. Выделение и изучение типовых штаммов Н2-образующих клостридий является необходимым для направленной регуляции синтеза Н2 в технологических процессах с помощью ассоциа-ции Bacillus и Clostridium или чистых культур клостридий. Полученные результаты являются основой для создания промышленной биотехнологии получения энергоносителя – водорода при обезвреживании экологически опасных твёрдых пищевых отходов путем их сбраживания ассоциацией бактерий Bacillus и Clostridium.


І.Р. Притула, О.Б. Таширев

Інститут мікробіології і вірусології НАН України ім. Д.К. Заболотного, Київ

УДОСКОНАЛЕННЯ МЕТОДУ ВИДІЛЕННЯ ВОДЕНЬУТВОРЮЮЧИХ БАКТЕРІЙ РОДУ CLOSTRIDIUM

Р е з ю м еУдосконалено метод виділення та кількісного обліку чистих культур облігатно-анаеробних воденьут-

ворюючих клостридій. З асоціації спороутворюючих бактерій виділено штам воденьутворюючих бак-терій Clostridium sp. ВУ-11. При рості штаму в рідкому середовищі визначені кількісні показники синтезу водню і зброджування крохмалю. Концентрація Н2 в газовій фазі - 49%, з 1 кг крохмалю мікроорганізми синтезували 128 л Н2, за 6 діб маса крохмалю зменшувалася у 7 разів. Зазначені показники синтезу водню і зброджування крохмалю, а також в подальшому інших модельних органічних субстратів є основою для створення промислової біотехнології отримання енергоносія - водню при знешкодженні екологічно небезпечних твердих харчових відходів.

К л ю ч о в і с л о в а: біотехнології синтезу енергоносіїв, воденьутворююча асоціація, Clostridium sp., техніка анаеробіозу

I.P. Pritula, A.B.Tashyrev


IMPROVEMENT OF THE METHOD OF ISOLATION OF HYDROGEN-FORMING BACTERIA OF CLOSTRIDIUM GENUS

S u m m a r y The method of isolation and quantitative account of pure cultures of obligate anaerobic hydrogen-forming

clostridia is improved. A strain of hydrogen-forming bacteria Clostridium sp. ВУ-11 has been isolated from the association of sporulating bacteria. Quantitative indices of hydrogen synthesis and starch fermentation have been determined when growing the strain in the liquid medium. Concentration of H2 in the gas phase was 49%, microorganisms synthesized 128 l of H2 from 1 kg of starch, the mass of starch decreased 7 times for 6 days. The mentioned indices for hydrogen synthesis and starch fermentation and for other organic model substrates in the future are the basis for creating the industrial biotechnology for production of hydrogen as the energy carrier under disposal of ecologically dangerous solid food waste.

The paper is presented in Russian.

K e y w o r d s: biotechnology of synthesis of energy carriers, hydrogen-forming association, Clostridium sp., anaerobiosis technique.

T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Pritula I.P., Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine; 154 Acad Zabolotny St., Kyiv, MSP, D 03680, Ukraine.

1. Методы выделения и культивирования // Теоретические и методические основы изучения анаэробных микроорганизмов. – Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СРСР, 1978. – С. 7–45.

2. Матвеева Н.А., Левишко А.С., Притула И.Р., Таширева А.А., Рокитко П.В., Таширев А.Б. Образование молекулярного водорода ассоциацией спорообразующих микроорганизмов // Мікробіологічний журнал. – 2011. – 73, № 1. – С. 36–43.

3. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учебное пособие / Под. ред. Н.П. Елинова – Москва: Медицина, 1988. – 208 с.

4. Таширев О.Б. Біотехнології очищення промислових стічних вод на основі термодинамічного прогнозування взаємодії мікроорганізмів з металами та радіонуклідами: Автореф. дис. ... д-ра техн. Наук. – Київ, 2005. – 33 с.

5. Das D., Veziroglu T.N. Hydrogen production by biological processes: a survey of literature // Int. J. Hydrog. Energy. – 2001. – 26, N 1. – P. 13–28.

6. Ntaikou I., Antonopoulou G., Lyberatos G. Biohydrogen production from biomass and wastes via dark fermentation: a review // Waste Biomass Valor. – 2010. – 1, N 1. – P. 21–39.

7. Sen U.K., Shakdwipee M., Banerjee R. Status of biological hydrogen production // Journal of scientifi c and industrial research. – 2008. – 67, N 11. – P. 980–993.

8. Das D., Dutta Т., Nath K., Kotay S.M., Das A.K., Veziroglu T.N. Role of Fe-hydrogenase in biological hydrogen production // Current science. – 2006. – 90, N 12. – P. 1627–1637.



УДК 663.12+637.344.8

О.Д. Янева, С.В. Сичкарь, А.А. Воронина, В.С. Подгорский

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украиныул. Академика Заболотного, 154, Киев ГСП, Д03680, Украина

ОТБОР ТЕРМОФИЛЬНЫХ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ, АКТИВНО СБРАЖИВАЮЩИХ ЛАКТОЗУ

Проведен скрининг и отбор лактозоферментирующих штаммов дрожжей среди 97 штаммов раз-ных таксономических групп дрожжей Украинской коллекции микроорганизмов с целью получения эта-нола из лактозы сыворотки. Из 18 штаммов дрожжей, способных ферментировать лактозу при 480С (1 штамм K.lactis, 16 штаммов K.marxianus и 1 штамм C.kefyr), 15 штаммов активно утилизировали лактозу в первые 24-48 ч культивирования. Наблюдалось значительное ингибирование роста отобран-ных штаммов (более 80 %) в среде, содержащей 6 % этанола.

Ключевые слова: сыворотка, лактозоферментирующие дрожжи, этанол.

Биоэтанол является самым распространенным видом биотоплива. В нынешнее время его получают преимущественно путем ферментации растительного сырья, чаще всего сахарного тростника и зерновых [2, 9]. Однако в связи с ростом цен на пищевые продукты возникает необходимость поиска альтернативных источников сырья для производства этанола. К таким можно отнести сыворотку, которая является основным отходом производства сыра и может приводить к загрязнению окружающей среды. Сыворотка – это недорогой и богатый пита-тельными веществами продукт, который содержит лактозу (4,5-5 %), растворимые белки (0,6-0,8 %), липиды (0,4-0,5 %), минеральные соли (8-10 % сухого веса), и может служить источником питания для некоторых дрожжей. Хотя к аэробной ассимиляции лактозы способ-ны многие виды дрожжей, лактозоферментирующих дрожжей гораздо меньше, среди них – Kluyveromyces marxianus и Kluyveromyces lactis [5].

В результате производства 1 кг сыра получают 9 л сыворотки. По разным данным, боль-ше половины сыворотки, производимой в мире, попадает в отходы [6]. В связи с этим ис-пользование активных штаммов дрожжей, способных сбраживать лактозу сыворотки, может служить одним из альтернативных и перспективных процессов получения биоэтанола, что одновременно позволит решить проблему загрязнения окружающей среды отходами произ-водства сыра [5].

Ряд авторов отмечают преимущества использования термофильных штаммов дрожжей в ферментационных процессах: снижение риска инфицирования, уменьшение затрат на охлаж-дение [3, 8].

Целью данной работы было провести скрининг и отбор штаммов дрожжей, способных ферментировать лактозу в широком диапазоне температур.

Материалы и методы. В работе использовали 97 штаммов дрожжей из Украинской коллекции микроорганизмов: Kluyveromyces marxianus (36 штаммов), Kluyveromyces lactis (11 штаммов), Kluyveromyces dobzhanskii (5 штаммов), Kluyveromyces wickerhamii (1 штамм), Candida kefyr (9 штаммов), Candida odintsovae (1 штамм), Candida intermediae (1 штамм), Candida cacaoi (1 штамм), Candida rugosa (6 штаммов), Candida parapsilosis (15 штаммов), Dekkera bruxellensis (8 штаммов) и Saccharomyces bayanus (3 штамма).

Способность дрожжей ферментировать лактозу исследовали в среде, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта и 2 % лактозы, в трубках Дунбара на протяжении 28 суток при темпе-ратуре 28°С, а также при температуре 42 0С и 48 0С в течении 7 суток.

Для определения способности дрожжей ферментировать лактозу использовали среду следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 – 3, MgSO4 – 0,5, KH2PO4 – 1, дрожжевой экстракт – 3. Поскольку клюйверомицетам для брожения сахаров предпочтительны анаэробные или лими-тированные по кислороду условия [13], в среду добавляли 200 мг/л тиогликолята натрия [11]. В качестве единственного источника углерода добавляли лактозу (30 г/л). Также использовали среду на основе сыворотки, которую готовили следующим образом: нативную сыворотку про-гревали до 85-900С, фильтровали через фильтровальную бумагу несколько раз до просветле-ния жидкости и доводили pH среды до 5 с помощью серной кислоты, добавляли минеральные © Î.Ä. ßíåâà, Ñ.Â. Ñè÷êàðü, À.À. Âîðîíèíà, Â.Ñ. Ïîäãîðñêèé, 2012


соли и дрожжевой экстракт в концентрациях, указанных выше. Суточную культуру дрожжей вносили в среду и культивировали в стационарных условиях (без перемешивания) при 28 0С.

Устойчивость дрожжей к этанолу определяли в среде YPD (г/л): глюкоза – 20, пептон – 20, дрожжевой экстракт – 10, pH=5,5. Этанол добавляли после стерилизации непосредственно перед инокуляцией дрожжей. Культивирование проводили при 28 0С на качалках при 240 об/мин. Биомассу определяли на колориметре КФК-2 при 540 нм с пересчетом по калибровочной кривой.

Концентрацию лактозы в среде определяли с помощью колориметрического метода с ан-троном [10].

Все эксперименты проводили в 3 повторностях.Результаты и их обсуждение. Способность ассимилировать лактозу в аэробных условиях

характерна для многих видов дрожжей, а сбраживать лактозу с образованием этанола способ-ны лишь немногие, в их числе Kluyveromyces marxianus и Kluyveromyces lactis [5]. Нами было исследовано 97 штаммов дрожжей, принадлежащих к разным таксономическим группам, которые, согласно литературным данным [4, 14], способны хотя бы к слабой ферментации лактозы (табл. 1).

Таблица 1

Ферментация лактозы коллекционными штаммами дрожжей при 28 0С

Вид

Общ

ее колич

ество

штаммов

Количество штаммов, ферментирующих лактозу

7 суток культивирования



- + ++ +++

++++ - + ++ +++

++++ - + ++ +++

++++

K. dobzhanskii 5 5 5 5K. lactis 11 8 2 1 7 1 3 7 1 3K. marxianus 36 11 3 2 1 19 9 2 1 2 22 5 3 2 2 24K. wickerhamii 1 1 1 1C. cacaoi 1 1 1 1C.intermedia 1 1 1 1C. kefyr 9 6 1 2 6 3 6 3C.odintsovae 1 1 1 1C.parapsilosis 15 15 15 15C.rugosa 6 6 6 6S. bayanus 3 3 3 3D. bruxellensis 8 8 8 8

Примечание: «+» – слабая ферментация лактозы, «++» – образовавшийся газ вытесняет среду из трубки Дунбара на ½, «+++» – образовавшийся газ вытесняет среду из трубки Дунбара на 2/3, «++++» – образовавшийся газ полностью вытесняет среду из трубки Дунбара, «-» – лактоза не ферментируется.

Было показано, что подавляющее большинство штаммов, принадлежащих к виду K.marxianus (31 штамм из 36 исследованных) и ряд штаммов, принадлежащих к видам K.lactis (4 штамма) и C.kefyr (3 штамма) сбраживали лактозу при 28 0С. Часть из них ферментировали лактозу уже в первые 2-3 суток культивирования. Однако ряд штаммов продемонстрировали замедленную ферментацию лактозы, т.е. после 7 суток культивирования.

Штаммы, принадлежащие к видам K.dobjhanskii, K.wickerhamii, C.odintsovae, C.intermedia, C.cacaoi, C.rugosa, С.parapsilosis, D.bruxellensis и S.bayanus не сбраживали лактозу.

Для дальнейших исследований было отобрано 32 штамма дрожжей, активно сбражива-ющих лактозу. Была исследована способность отобранных штаммов ферментировать лак-тозу при повышенной температуре (42 0С та 48 0С). Значительная часть отобранных штам-мов дрожжей активно сбраживали лактозу при 42 0С, однако при повышении температуры до 48 0С количество штаммов, ферментирующих лактозу, резко сократилось: из 32 исследо-ванных штаммов 28 ферментировали лактозу при 420С, и лишь 18 штаммов были способны сбраживать лактозу при 480С – 1 штамм K.lactis, 16 штаммов K.marxianus и 1 штамм C.kefyr (табл. 2). Все они были отобраны для дальнейших исследований.


Таблица 2

Ферментация лактозы коллекционными штамма дрожжей при повышенной температуре

№ п/п

Штамм (УКМ Y-)

Фермен-тация лактозы при 420С


№ п/п

Штамм (УКМ Y-)



1 K.lactis 325 - 17 K.marxianus 315 ++++ -2 K.lactis 327 +++ ± 18 K.marxianus 317 ++++ +++3 K.lactis 328 ++ - 19 K.marxianus 318 ++++ ++++4 K.lactis 331 ++ - 20 K.marxianus 319 ++++ ++++5 K.marxianus 295 ± - 21 K.marxianus 320 ++++ ++++6 K.marxianus 296 - 22 K.marxianus 1996 ++++ +7 K.marxianus 297 ++++ ++ 23 K.marxianus 2071 ++++ +++8 K.marxianus 301 ++++ ± 24 K.marxianus 2096 ++++ +++9 K.marxianus 302 +++ - 25 K.marxianus 2098 ++++ ++++10 K.marxianus 303 ++++ ++++ 26 K.marxianus 2387 ++++ ++11 K.marxianus 304 +++ - 27 K.marxianus 2388 ++++ ++++12 K.marxianus 306 ++ - 28 K.marxianus 13 + -13 K.marxianus 308 ++++ ++++ 29 K.marxianus 17 ++++ ++++14 K.marxianus 309 ++++ - 30 C.kefyr 900 ++++ ++++15 K.marxianus 312 ++ - 31 C.kefyr 2511 -16 K.marxianus 313 ++++ ++++ 32 C.kefyr 60 -

Примечание: «+» – слабая ферментация лактозы, «++» – образовавшийся газ вытесняет среду из трубки Дунбара на ½, «+++» – образовавшийся газ вытесняет среду из трубки Дунбара на 2/3, «++++» – образовавшийся газ полностью вытесняет среду из трубки Дунбара, «-» – лактоза не ферментируется.

Как известно, для наиболее эффективного сбраживания лактозы клюйверомицетам не-обходимо низкое содержание кислорода в среде [13]. Для этого в среду был добавлен ти-огликолат натрия в концентрации 200 мг/л [11]. Была исследована способность отобранных штаммов ферментировать лактозу в стационарных условиях (без перемешивания) в потенци-ально анаэробных условиях в среде, где единственным источником углерода служила лактоза (30 г/л) или лактоза сыворотки (40 г/л) (рис. 1).

Было показано, что подавляющее большинство исследованных штаммов в стационарных условиях (без перемешивания) за 48 ч культивирования при 28 0С утилизировали 75-85 % лак-тозы в среде с лактозой и 70-78 % лактозы в среде с сывороткой. 3 штамма K.marxianus УКМ Y-301, Y-317 и Y-2071 в данных условиях утилизировали лактозу значительно медленнее.

Наиболее активная утилизация лактозы клюйверомицетами происходила уже в первые сутки культивирования. Неполная ассимиляция лактозы отобранными штаммами (до 80% лактозы за 48 ч культивирования) может быть связана с невысокой устойчивостью данных штаммов к этанолу, который образуется в результате брожения лактозы. В связи с этим была изучена устойчивость к этанолу 15 отобранных штаммов дрожжей, сбраживающих лакто-зу. Первоначально был изучен рост данных штаммов в аэробных условиях на качалках с 240 об/ мин в среде YPD, содержащей 6 % этанола (рис. 2). Согласно данным ряда авторов [1,7] подобная концентрация этанола в среде приводит к заметному подавлению роста клюй-веромицетов. Спустя 20 ч культивирования при 280С в среде YPD, содержащей 6 % этанола, накопление биомассы у большинства штаммов составляло менее 20 % от контроля (в среде YPD без этанола). Наиболее чувствительными к действию этанола были штаммы K.marxianus УКМ Y-308 и C.kefyr УКМ Y-900, накопление биомассы которых снижалось на 97,28 % и 97,58 %, соответственно. Штаммы K.marxianus УКМ Y-320 и Y-2098 характеризовались наи-большей устойчивостью к этанолу, в частности, рост штамма Y-320 снижался на 79,14 %, а штамма Y-2098 – на 79,57 %. Во всех случаях наблюдали значительную задержку нача-ла экспоненциальной фазы роста, как показано на рис. 3 на примере штаммов K.marxianus УКМ Y-313 и Y-319. Такую невысокую устойчивость к этанолу клюйверомицетов по срав-нению с другими штаммами дрожжей, широко применяемыми для получения биоэтанола,


– Saccharomyces cerevisiae, отмечали и другие авторы [7,12]. Необходимы дополнительные исследования относительно перспективности отобранных штаммов для получения этанола.

0

5

10

15

20

25

30

35

K.lacti

s 327

K.mar

xianu

s 297

K.mar

xianu

s 301

K.mar

xianu

s 303

K.mar

xianu

s 308

K.mar

xianu

s 313

K.mar

xianu

s 317

K.mar

xianu

s 318

K.mar

xianu

s 319

K.mar

xianu

s 320

K.mar

xianu

s 199

6

K.mar

xianu

s 207

1

K.mar

xianu

s 209

6

K.mar

xianu

s 209

8

K.mar

xianu

s 238

7

K.mar

xianu

s 238

8

K.mar

xianu

s 17

C.kefyr

900 K

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

K.lacti

s 327

K.marx

ianus

297

K.marx

ianus

301

K.marx

ianus

303

K.marxi

anus

308

K.marx

ianus

313

K.marx

ianus

317

K.marx

ianus

318

K.marxi

anus

319

K.marxi

anus

320

K.marxi

anus

1996

K.marx

ianus

2071

K.marx

ianus

2096

K.marx

ianus

2098

K.marxi

anus

2387

K.marx

ianus

2388

K.marxi

anus

17

C.kefyr

900 K

Рис. 1. Утилизация лактозы коллекционными штаммами дрожжей в среде с лактозой (А) и сывороткой (Б) в стационарных условиях. Колонки черного цвета – 24 ч

культивирования, белого – 48 ч культивирования.

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

%

6%

Рис. 2. Влияние этанола на накопление биомассы лактозоферментирующими дрожжами: 1 – K.marxianus УКМ Y-1996, 2 –K.marxianus УКМ Y-17, 3 – K.marxianus УКМ Y-297, 4 – K.marxianus УКМ Y-303, 5 – K.marxianus УКМ Y-308, 6 – K.marxianus УКМ Y-313, 7 – K.marxianus УКМ Y-318, 8 – K.marxianus УКМ Y-319, 9 – K.marxianus УКМ Y-320, 10 – K.marxianus УКМ Y-2096, 11 – K.marxianus УКМ Y-2098, 12 – K.marxianus УКМ Y-2387,

13 – K.marxianus УКМ Y-2388, 14 – C.kefyr УКМ Y-900, 15 – K.lactis УКМ Y-327.


0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20

,

, /

313

313 6%

319

319 6%

Рис. 3. Динамика роста штаммов K.marxianus УКМ Y-313 и Y-319 в среде, содержащей 6 % этанола.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о значительных различиях в способности ферментировать лактозу, а также устойчивости к этанолу изученных штаммов дрожжей. Дальнейший отбор штаммов для получения биоэтанола будет определяться не толь-ко высокой сбраживающей активностью, но и устойчивостью штамма-продуцента к темпера-туре, повышенным концентрациям этанола и субстрата.

О.Д. Янєва, С.В. Січкар, Г.О. Вороніна, В.С. Підгорський


ВІДБІР ТЕРМОФІЛЬНИХ ШТАМІВ ДРІЖДЖІВ, АКТИВНО ФЕРМЕНТУЮЧИХ ЛАКТОЗУ

Р е з ю м еПроведено скринінг та відбір штамів дріжджів, здатних ферментувати лактозу, серед 97 штамів

різних таксономічних груп Української колекції мікроорганізмів, з метою отримання етанолу з лактози сироватки. З 18 штамів дріжджів, здатних ферментувати лактозу при 480С (1 штам K.lactis, 16 штамів K.marxianus та 1 штам C.kefyr) 15 штамів активно утилізували лактозу в перші 24-48 год культивування. Спостерігали значне пригнічення росту відібраних штамів (більш ніж 80%) в середовищі, що містило 6% етанолу.

К л ю ч о в і с л о в а: сироватка, лактозоферментуючі дріжджі, етанол

O.D. Ianieva, S.V. Sichkar, A.A. Voronina, V.S. Pidgorskyi

Zabolonty Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

SELECTION OF THERMOPHILIC LACTOSE-FERMENTING YEAST STRAINS

S u m m a r yThe screening and selection of lactose-fermenting yeasts among 97 collection yeast strains belonging to

different taxonomic groups has been conducted to obtain ethanol from whey. The strains (n=18) (1 strain of K.lactis, 16 strains of K.marxianus and 1 strain of C.kefyr) fermented lactose at 48 0С and 15 selected strains rapidly consumed lactose within 24-48 h of cultivation. The presence of 6% of ethanol in the medium resulted in a considerable growth inhibition (more than 80%) of the selected strains.

The paper is presented in Russian.K e y w o r d s: whey, lactose-fermenting yeasts, ethanol.T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Ianieva O.D., Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National

Academy of Sciences of Ukraine; 154, Acad. Zabolotny St., Kyiv, D 03680, Ukraine.


Голубев В.И., Голубев Н.В.1. Отбор и характеристика дрожжей, активно сбраживающих лактозу // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. – 40, №3. – С. 332–336.Antoni D., Zverlov V.V., Schwarz W.H.2. Biofules from microbes // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2007. – 77, N 1. – P. 23–35.Banat I.M., Nigam P., Singh D., Marchant R., McHale A.P.3. Review: ethanol production at elevated temperatures and alcohol concentrations: Part 1 – Yeasts in general // World J. Microb. Biot. – 1998. – 14, N6. – P. 809–821Barnett J.A., Payne R.W., Yarrow D., Barnett L.4. Yeasts: Characteristics and Identifi cation. Third edition. – Cambridge: Cambridge University Press, 2000. – 1150 p.Guimarães PM, Teixeira JA, Domingues L5. . Fermentation of lactose to bio-ethanol by yeasts as part of integrated solutions for the valorisation of cheese whey // Biotechnol. Adv. – 2010. – 28, N 3. – P. 375–384.Kosikowski F.V6. . Whey utilization and whey products // J. Dairy Sci. – 1979. – 62, N 7. – P. 1149–1160.Lee C.H., Yang S.A., Rho J.W., Lee S.Y., Nam D.H7. . Ethanol fermentation in lactose medium using a fusant strain of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces fragilis // J. Microb. Biotechnol. – 1992. – 2, N2. – P. 108–114.Limtong S., Sringiew C., Yongmanitchai W8. . Production of fuel ethanol at high temperature from sugar cane juice by a newly isolated Kluyveromyces marxianus // Bioresour. Technol. – 2007. – 98, N 17. – P. 3367–3374.Mabee W.E.9. Policy options to support biofuel production // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. – 2007. – 108. – P. 329–357.Scott T.A., Mlevin E.H10. . Determination of dextran with anthrone // Anal. Chem. – 1953. – 25, N 11. – P. 1656–1661.Ozmihci S., Kargi F11. . Kinetics of batch ethanol fermentation of cheese-whey powder (CWP) solution as function of substrate and yeast concentrations // Bioresour. Technol. – 2007. – 98, N 16. – P. 2978–84. 12. Rosa M.F., Sá-Correia I. Ethanol tolerance and activity of plasma membrane ATPase in Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae // Enzyme Microb. Technol. – 1992. – 14, N 1. – P. 23– 7. 13. Silveira W.B., Passos F.J.V., Mantovani H.C., Passos F.M.L. Ethanol production from cheese whey permeate by Kluyveromyces marxianus UFV-3: a fl ux analysis of oxido-reductive metabolism as a function of lactose concentration and oxygen levels // Enzyme Microb. Technol. – 2005. – 36, N 7. – P. 930–936. 14. The Yeasts A Taxonomic Study. Forth edition / Ed. C.P. Kurtzman and J.W. Fell. – Amsterdam etc.: Elsevier,

1998. – 1055 p.



УДК 578.233

А.М. Кириченко, І.С. Щербатенко

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН Українивул. Академіка Заболотного, 154, Київ, 03143, Україна

СПОНТАННІ ЗАМІНИ НУКЛЕОТИДІВ У ГЕНАХ X-ВІРУСУ КАРТОПЛІ

З’ясування факторів, що визначають типи і темпи замін нуклеотидів у геномах має важливе значен-ня для вдосконалення розповсюджених моделей молекулярної еволюції, дослідження еволюційного проце-су, розпізнавання кодуючих і некодуючих РНК, ідентифікації біологічно важливих мотивів таких як реп-лікаційні сигнали, регуляторні ділянки тощо. Однак, багато питань стосовно факторів, що впливають на заміни нуклеотидів у геномах вірусів рослин, все ще залишаються нез’ясованими.

В нашій роботі проведено порівняльний комп’ютерний аналіз замін нуклеотидів у геномних сиквенсах десяти пар близько споріднених штамів Х-вірусу картоплі (ХВК) з однаковою довжиною геномів і генів.

Виявлено значне варіювання частоти замін залежно від пар нуклеотидів і штамів, довжини та локалізації ділянок геномів і генів, а також типу замін та їх кодонних позицій. Найбільші відношення частот замін знайдено в різних парах нуклеотидів (u→c/c→g, 1240), кодонних позиціях (третя/друга, 17,3) та типах (транзиції/трансверсії, 5,8); найменші – у прямих і зворотних замін нуклеотидів однієї пари (1,03-1,6). Частота трансверсій набагато менша, але значно більш варіабельна, ніж транзицій і не має чіткої залежності від довжини гена (нуклеотидної ділянки).

Ключові слова: Х-вірус картоплі, геномні сиквенси, заміни нуклеотидів, транзиції, трансверсії, комп'ютерний аналіз.

Дискусійність положення про провідну роль мутаційної мінливості в біологічній еволюції спонукає до глибокого і різнобічного вивчення типів, механізмів і властивостей хромосомних, геномних та генних мутацій. Особливу увагу вчених привертають мало вивчені спонтанні точ-кові мутації, що спричиняють заміни поодиноких амінокислот у білках та/або поодиноких нуклеотидів у генах [8, 15, 17].

Спонтанні заміни нуклеотидів та амінокислот проявляють широкий спектр дії на життєз-датність, вірулентність, та ефективність передачі вірусу, а також на прояв симптомів ураження та вірусостійкості рослин [1, 2, 4, 5, 9, 12]. Проте дані щодо частоти цих мутацій [3, 10, 11, 14, 17] а також їх залежності від функціональної активності і рівня експресії генів, нуклеотидних контекстів та позицій у генах і кодонах дуже фрагментарні і суперечливі [7, 9, 13,15, 16, 19]. У той же час дані про нуклеотидні заміни в наборах сиквенсів споріднених біологічних об’єктів мають особливо важливе значення для моделювання процесів і темпів еволюції [T, 6, 14, 16, 17, 19], оцінки ймовірності та достовірності філогенетичних дерев [T, 19], встановлення коду-ючих ділянок геномів [18] тощо.

Зважаючи на це, наша робота присвячена порівняльним дослідженням спонтанних нуклео-тидних замін у генах п’яти близько споріднених штамів Х-вірусу картоплі (ХВК). Порівняльні аналізи були проведені за типами замін (еквівалентні, нееквівалентні, транзиції, трансверсії, одно-, двох- та трьохнуклеотидні) і місцем їх локалізації (пари штамів, гени, а також геномні, генні та кодонні позиції).

Матеріали і методи. Модельні об’єкти. В роботі використано 5 близько споріднених штамів Х-вірусу картоплі з однаковою довжиною геномів і генів, які відрізняються між со-бою лише за поодинокими замінами нуклеотидів (від 25,4 до 41,7 на 1000). Геномні сиквенси дослідних штамів були отримані з генетичного банку даних GenBank за такими номерами доступу: штам ks (Korean strain) - AF373782.1; штам rb (resistance-breaking strain) - M95516; штам s1 - X05198.1; штам os - AB056718.1; штам x3 - D00344.1. Для порівняльного аналізу транзицій і трансверсій ці нуклеотидні заміни розподілені нами на типи, підтипи і варіанти на основі розповсюджених назви типів нуклеотидів, запропонованих Індіанським університетом США: A, T, U, G, C – стандартні нуклеотиди; R - пуринові (puRine, A або G); Y - піримідинові (pYrimidine, C, U або T); S - сильні (Strong, G або C) та W - слабкі нуклеотиди (Week, A, U або T).

Методи досліджень. Заміни нуклеотидів визначали в десяти парах комбінацій з п’яти шта-мів вірусу, зіставляючи сиквенси генів першого штаму з чотирма іншими (ks / os, ks / rb, ks / s1, ks / x3), другого штаму з трьома (os / rb, os / s1, os / x3), третього з двома (rb / s1, rb / x3) © À.Ì. Êèðè÷åíêî, ².Ñ. Ùåðáàòåíêî, 2012


і четвертого з п’ятим (s1 / x3). В усіх п’яти генах (Re, Cp, Tgb1, Tgb2 та Tgb3) кожної пари підраховували кількість еквівалентних і нееквівалентних однонуклеотидних замін в 1-ій, 2-ій та 3-ій позиціях кодонів, двохнуклеотидних замін – в 1 і 2, 1 і 3 та 2 і 3 позиціях, а також кіль-кість трьохнуклеотидних замін.

Комп’ютерний аналіз нуклеотидних замін у вірусних генах проводили за власними ма-ленькими вузько спеціалізованими комп’ютерними програмами (утилітами), написаними мо-вою QBasic для вирішення кожної конкретної задачі досліджень.

Випадкову збіжність позицій нуклеотидних замін моделювали на 213-нуклеотидних ді-лянках вірусних генів за генератором випадкових чисел у діапазоні 1-213, використовуючи функцію QBasic INT(RND*213+1). Ці числа являють собою позиції випадкових мутацій у ви-падкових кодонних позиціях (першій, другій або третій). Частина з отриманих чисел, які при діленні на 3 дають залишки 1, 2 або 0 представляють позиції випадкових нуклеотидних замін в одній кодонній позиції: першій, другій чи третій, відповідно. Позиції випадкових замін у двох кодонних позиціях представляють числа з залишками від ділення на три рівними 1 або 2, 1 або 0 чи 2 або 0.

Для кожного варіанта кодонних позицій нуклеотидних замін генерували 100 повторностей дійсної кількості замін на ділянках кожного гена і вираховували середнє значення модельо-ваних позицій, які збігаються на ділянках двох, трьох, чотирьох та п’яти генів чи мають різні значення на всіх ділянках.

Статистичну обробку даних (обчислення середніх значень та стандартних відхилень) про-водили за вбудованими статистичними функціями прикладного програмного пакету Microsoft Excel 2002.

Результати досліджень. Кількість нуклеотидних замін у десяти пар штамів Х-вірусу картоплі. Сумарна кількість замін нуклеотидів у генах десяти пар штамів ХВК прямо про-порційна довжині гена (табл. 1). Її величина варіює від 182,2 у генах реплікази (Re) до 5,4 в генах транспортного білка (Tgb3). Кінцеві некодуючі ділянки геномів 3'UTR та 5'UTR іден-тичні у всіх штамів вірусу (не мають нуклеотидних замін), а ідентичність генів має обернено пропорційну залежність від їх довжини і становить від 97,7 % (ген Tgb2) до 95,8 % (ген Re). Кількість замін на 1000 нуклеотидів пропорційна довжині гена і варіює від 41,7 (ген Re) до 25,4 (ген Tgb2).

Таблиця 1Заміни нуклеотидів у генах та нетрансляційних ділянках десяти пар штамів Х-вірусу

картоплі

Пари штамівКількість замін в генах та нетрансляційних ділянках:

Re Cp Tgb1 Tgb2 Tgb3 3’UTR 5’UTR Середнє

ks / os 183 23 21 6 5 0 0 47,6

ks / rb 162 28 21 10 3 0 0 44,8

ks / s1 184 25 23 7 7 0 0 49,2

ks / x3 164 24 20 7 6 0 0 44,2

os / rb 211 30 25 9 4 0 0 55,8

os / s1 217 26 28 5 8 0 0 56,8

os / x3 199 23 23 5 5 0 0 51,0

rb / s1 206 25 25 12 6 0 0 54,8

rb / x3 178 24 20 12 5 0 0 47,8

s1 / x3 118 9 13 6 5 0 0 30,2

Сума замін 1822 237 219 79 54 0 0 1326

Середнє значення 182,2 23,7 21,9 7,9 5,4 0 0 132,6

Замін на 1000 нуклеотидів 41,7 33,3 32,2 22,7 25,4 0,0 0,0 155,2

Довжина гена 4371 711 681 348 213 71 84 837,8

Ідентичність генів, % 95,8 96,6 96,8 97,7 97,5 100 100 88,7


Серед десяти можливих комбінацій пар із п’яти дослідних штамів (5 х 4 : 2 = 10) найменшу спорідненість мають пари os / s1, os / rb та rb / s1, у яких середня кількість замін на геном ста-новить, відповідно, 56,8; 55,8 і 54,8. До найбільш споріднених пар штамів відносяться s1 / x3 та ks / x3, що мають 30,2 і 44,2 нуклеотидних замін на геном. У пари s1 / x3 найменша кількість замін (найбільша спорідненість) проявляється також у довгих генах (Re, Cp і Tgb1), однак за замінами нуклеотидів у гені Tgb2 найбільшу спорідненість мають пари os / s1 та os / x3, а за геном Tgb3 найбільш спорідненими є штами ks і rb (лише 3 заміни на ген).

Порівняння транзицій і трансверсій у генах п’яти штамів ХВК. Серед 12-ти можливих комбінацій замін нуклеотидів: a↔g, a↔u, a↔c, g↔u, g↔c та u↔c (4 х 3 = 12) 4 варіанти замін відносяться до транзицій і 8 до трансверсій (табл. 2). Враховуючи назви типів нуклео-тидів, наведені в розділі «Матеріали і методи», ми виділили 2 типи транзицій (w→s та s→w) з чотирма варіантами (a→g, u→c, g→a, c→u), а також 2 типи трансверсій (y→r та r→y) з чотир-ма підтипами (u→r, c→r, r→u та r→c) і восьми варіантами (u→a, u→g, c→a, c→g, a→u, g→u, a→c, g→c). Порівняння виділених типів, підтипів і варіантів показує, що сумарна кількість транзиції (85,4 %) у 5,8 разів перевищує кількість трансверсій (14,6 %). Відсотки двох типів сумарних транзицій в усіх генах (44,5 і 40,9), а також двох типів (7,2 і 7,4) та двох підтипів трансверсій (4,4 і 4,2) майже однакові між собою, проте сумарна кількість трансверсій підти-пу c→r (4,4 %) в 1,6 разів перевищує кількість трасверсій підтипу u→r (2,8 %). Отже, заміни цитозина на пуринові нуклеотиди значно частіші, ніж тиміна.

Таблиця 2

Сумарна кількість транзицій і трансверсій у генах п’яти штамів Х-вірусу картоплі

Гени

Типи замін нуклеотидів

ТранзиціїТрансверсії

y → r r → yw → s s → w u → r c → r r → u r → c

a → g u → c g → a c → u u → a u → g c → a c → g a → u g → u a → c g → cRe 375 463 378 384 18 23 51 6 16 40 54 14Cp 29 68 51 55 6 0 14 1 3 0 7 3

Tgb1 23 52 23 47 7 14 18 4 10 8 13 0Tgb2 18 21 6 18 1 0 4 2 0 0 7 2Tgb3 9 16 9 14 0 0 6 0 0 0 0 0Сума замін 454 620 467 518 32 37 93 13 29 48 81 19

%замін

18,8 25,7 19,4 21,5 1,3 1,5 3,9 0,5 1,2 2,0 3,4 0,8

44,5 40,92,8 4,4 3,2 4,2

7,2 7,485,4 14,6

За зменшенням сумарної частоти нуклеотидні заміни розподіляються у такий спосіб: u→c (620 замін), c→u (518), g→a (467), a→g (454), c→a (3,9), a→c (3,4), g→u (2,0), u→g (1,5), u→a 1,3), a→u (1,2), g→c (0,8), c→g (0,5). Такий розподіл свідчить про близьку кількість прямих і зворотних замін у всіх варіантах пар нуклеотидів. Максимальна величина відношення частот прямих і зворотних транзицій складає 1,2 (u→c (620 замін), c→u (518)), а трансверсій – 1,6 (g→c (0,8), c→g (0,5)). Найбільша величина відношення частот у варіантів транзицій стано-вить 1,4 (u→c (620), a→g (454)), а серед трансверсій - 7,8 (c→a (3,9), c→g (0,5)). Отже, тра-сверсії мають набагато меншу, але значно більш варіабельну частоту, ніж транзиції.

Визначення кількості нуклеотидних замін у семи кодонних позиціях п’яти генів ХВК. Порівняння сумарної кількості нуклеотидних замін у різних генах п’яти штамів вірусу пока-зує, що переважну їх більшість (від 71,2 до 100 %) складають однонуклеотидні еквівалентні заміни в третій кодонній позиції, які не призводять до замін амінокислот (табл. 3). Еквівалент-ні заміни в першій кодонній позиції генів Re становлять лише 5,1 % (78/1517), генів Cp – 3,0% (6/200), генів Tgb1 – 2,6 % (4/156), генів Tgb3 – 8,9 %(4/45), а в генах Tgb2 такі заміни відсутні. Двохнуклеотидні еквівалентні заміни в першій і третій кодонних позиціях зустрічаються лише в довгих генах Re (1,6 %, 24/1517) та Cp (2,0 %, 4/200). Одно-, двох- чи трьохнуклеотидні екві-валентні заміни у позиціях 2, 1 і 2, 2 і 3 та 1, 2 і 3 відсутні в усіх генах вірусу.


Таблиця 3

Заміни нуклеотидів у різних позиціях кодонів у генах п’яти штамів Х-вірусу картоплі

Позиції замін у кодонах

Кількість еквівалентних замін у генах:* Кількість нееквівалентних замін у генах*:

Re Cp T1 T2 T3 Re Cp T1 T2 T31 78 6 4 0 4 87 20 20 0 02 0 0 0 0 0 84 7 14 0 73 1415 190 152 79 41 37 0 4 0 0

1 і 2 0 0 0 0 0 24 0 6 0 01 і 3 24 4 0 0 0 32 8 8 0 02 і 3 0 0 0 0 0 26 2 8 0 2

1, 2 і 3 0 0 0 0 0 15 0 3 0 0Сума замін 1517 200 156 79 45 305 37 63 0 9Замін на 1000 нук-леотидів

34,7 28,1 22,9 22,7 21,1 7,0 5,2 9,3 0,0 4,2

% замін83,3 84,4 71,2 100 83,3 16,7 15,6 28,8 0,0 16,7

85,4 14,6 * - T1, T2, T3 – скорочені назви генів Tgb1, Tgb2 та Tgb3

Сумарний відсоток нееквівалентних замін нуклеотидів (14, 6) у 5,8 разів менший, ніж екві-валентних (85,4). Кількість нееквівалентних замін у різних генах варіює значно більше, ніж еквівалентних (від 0 до 9,3 на 1000 нуклеотидів) і не має прямої пропорційної залежності від довжини гена, яка чітко проявляється щодо еквівалентних замін.

Розподіл нуклеотидних замін на ділянках генів. Порівняння замін нуклеотидів на різних ділянках генів (від повної довжини до 1/30 частини) показало, що на великих ділянках одна-кового розміру кількість замін практично однакова. Так, у гені Re довжиною 4371 нуклеотид середня кількість замін складає 182,2 ± 29,4; на половинах гена (2035 нуклеотидів – 91,7 ± 15,8; на четвертинах (1093 нуклеотидів) – 46,4 ± 10,4. З подальшим зменшенням довжини ді-лянок варіювання кількості нуклеотидних замін на них швидко збільшується (рис. 1). Так, на 146-нуклеотидних ділянках гена Re (1/30 частина гена) кількість замін варіює від 15,1 ± 11,4 (ділянка 29) до 93,5 ± 29,6 (ділянка 12), а на 21-нуклеотидних ділянках гена Tgb3 (1/10 гена) чітко проявляються зони з високою частотою мутацій (6, 7, 8), з низькою – (1, 4), а також ста-більні ділянки (2, 3, 5, 9, 10). Для з’ясування природи варіювання частоти нуклеотидних замін у різних зонах генів (наявність так званих високо мутабельних гарячих точок чи випадкова локалізація мутацій на певних ділянках) ми дослідили розподіл позицій замін у гені Tgb3 (213 нуклеотидів), а також на 213-нуклеотидних 5’-кінцевих ділянках чотирьох інших генів ХВК.

Рис. 1. Розподіл нуклеотидних замін на ділянках двох генів п’яти штамів Х-вірусу картоплі. Re – 30 ділянок гена реплікази довженою по 145 нуклеотидів. Tgb3 – 10 ділянок

гена транспортного білка довжиною по 23 нуклеотиди


Встановлено, що на досліджених ділянках заміни нуклеотидів локалізовані в 66 позиціях: 11 позицій у генах Re, 20 – у Cp, 10 – у Tgb1, 14 –у Tgb2 та 11 у гені Tgb3 (рис. 2). Більшість (28 із 66) позицій замін різні у різних типах генів, однак 10 з них збігаються у двох типах (позиції: 7 (гени Re, Tgb3), 22 (Re, Tgb2); позиції: 28, 85 (Re, Cp), 97 (Cp, Tgb1); 142, 145 (Tgb2, Tgb3); 154, 157(Cp, Tgb3); 180 (Cp, Tgb1)) і шість – у трьох типах генів (91, 112, 130, 139, 160, 163).

91 112 130 139 160 165

Рис. 2. Позиції замін нуклеотидів в генах 5-ти штамів Х-вірусу картоплі. 10...190 – маркери позицій 213-нуклеотидних ділянок генів. Re – ген реплікази; Cp – ген білка оболонки; Tgb1, Tgb2, Tgb3 – гени транспортних білків. Вертикальні ряди по 10 точок – збіжність (світлі точки) і заміни нуклеотидів (темні кружки) в однакових позиціях генів у 10-ти пар штамів: ks/os, ks/s1, ks/rb, ks/y1, os/s1, os/rb, os/y1, s1/rb, s1/y1, rb/y1 (зверху вниз). ↑(92-164) – збіжні позиції замін нуклеотидів у трьох генах. ⎜– збіжність позицій замін у

двох генахМоделювання випадкового збігання нуклеотидних замін у одній, двох і трьох кодонних

позиціях, проведене шляхом генерування по 100 повторів 11, 20, 14 і 11 випадкових чисел, показало, що більшість позицій випадкових замін (25,7; 41,6 та 48,2) локалізовані лише в од-ному гені (у різних генах ці позиції не збігаються). Найбільша кількість незбіжних позицій (48,2) виявляється за індукування замін у трьох кодонних позиціях, найменша – у одній по-зиції (25,7). Кількість модельованих позицій випадкових нуклеотидних замін, збіжних у двох генах, варіює від 7,4 до 12,4; збіжних у трьох генах – від 1,0 до 5,2. Збіжність позицій випад-кових замін у чотирьох генах зустрічається дуже рідко, а в усіх п’яти генах – його не виявлено в численних модельних дослідженнях. Порівняння наведених (фактичних) величин збіжності позицій нуклеотидних замін з отриманими методом комп’ютерного моделювання показує, що модельована збіжність найкраще відповідає фактичній за умов випадкових замін нуклеотидів в одній із кодонних позицій (першій, другій чи третій).

Таблиця 4

Розподіл дійсних і модельваних позицій нуклеотидних замін на 213-нуклеотидних ділянках п’яти генів Х-вірусу картоплі

Збіжність позицій замін*

Частота заміндійсна модельована за випадкових замін у кодонних позиціях:

в одній у двох у трьох1 28 25,7 ± 2,4 41,6 ± 6,9 48,2 ± 3,72 10 12,4 ± 3,8 9,8 ± 3,0 7,4 ± 1,5 3 6 5,2 ± 2,0 1,7 ± 1,1 1,0 ± 1,24 0 0 0 0,1 ± 0,35 0 0 0 0

Сума замін 66 66,1 66,3 66,4 * - Кількість генів, що мають позиції нуклеотидних замін, відсутні у інших генах.

Обговорення результатів. Для порівняльного аналізу спонтанних нуклеотидних замін у генах вірусів рослин нами відібрано 5 близько споріднених штамів ХВК з однаковою дов-жиною геномів і генів, що виключає можливість кількох типів мутацій у дослідних штамів (делецій, інсерцій, дублікацій, транслокацій тощо) і дозволяє аналізувати нуклеотидні заміни у чистому видгляді. Такий аналіз вбачається доцільним [8].


Всі порівняльні аналізи нуклеотидних замін за їх типами (еквівалентні, нееквівалентні, транзиції, трансверсії, одно-, двох- та трьохнуклеотидні) і місцем локалізації (пари штамів, геноми, гени, генні та кодонні позиції) були проведені за єдиним показником – сумарною кіль-кістю замін у генах десяти пар штамів, що спрощує інтерпретацію результатів досліджень.

Оскільки аналізи нуклеотидних замін були проведені за власними вузько спеціалізова-ними комп’ютерними програмами, написаними для кожної конкретної задачі досліджень, коректність роботи програм постійно контролювалась нами за такими основними тестами: 1) програма виявляє всі заміни нуклеотидів, штучно зроблені в одній з двох копій довільного нуклеотидного сиквенсу і точно визначає їх генні та кодонні позиції; 2) типи і позиції нук-леотидних замін, знайдені програмно, відповідають таким у файлах сиквенсів; 3) результа-ти аналізу, отримані за різними програмами, повністю узгоджуються між собою. Як приклад останнього тесту наводимо сумарну кількість нуклеотидних замін у генах Tgb3, яка дорів-нює 54 за такими програмами: визначення замін у парах штамів (табл. 1); аналіз транзицій і трансверсій (табл. 2: 9 + 16 + 9 + 14 + 6 = 54); визначення замін у кодонних позиціях (табл. 3: 45 + 9 = 54); визначення позицій замін (рис. 2: 54 темні кружки). Аналогічна однозначність даних проявляється також щодо всіх інших генів вірусу, що свідчить про коректність роботи всіх використаних комп’ютерних програм.

На додаток до численних відомих факторів, від яких залежить частота нуклеотидних замін [ 3, 7, 11, 16, 19], нами виявлена залежність її від довжини гена (табл. 1). Поряд із прямо про-порціональною залежністю сумарної кількості замін від довжини гена, що цілком природно, подібна залежність чітко проявляється також щодо питомої величини: середньої кількості замін на 1000 нуклеотидів. Причиною цього явища може бути більша ймовірність спонтанних мутацій у великих генах, ніж у малих, через формування нуклеотидних контекстів, CpG-сай-тів чи інших компонентів, що підвищують частоту нуклеотидних замін [19]. З іншого боку, оскільки мутації, як правило, шкідливі для вірусу [1], то більш ймовірною (менш шкідливою) буде заміна половини нуклеотидів у 10-нуклеотидному сайті, ніж у двохнуклеотидному.

Поряд із наведеною пропорційною залежністю проявляються також помітні відхилення від неї як у генах (частота замін у Tgb3 більша, ніж у Tgb2), так і в парах штамів: пара s1 / x3 має більше замін у гені Tgb1, ніж у Cp. Ці дані узгоджуються з високою варіабельністю часто-ти точкових мутацій у вірусів рослин [3, 10, 14, 15].

Загальновідомо, що частота мутацій у некодуючих ділянках геномів значно більша за таку в функціональних генах, однак у 3’- і 5’-некодуючих ділянках геномів п’яти штамів вірусу нами не виявлено жодної нуклеотинної заміни. Враховуючи малі розміри ділянок (72–84 нук-леотиди), це явище можна пояснити уже обговореною нами малою ймовірністю та великою шкідливістю мутацій у малих генах (нуклеотидних ділянках). Оскільки 3’- і 5’-некодуючі ді-лянки містять регуляторні елементи, важливі для репродукції вірусу, заміни нуклеотидів на цих ділянках не менш шкідливі, ніж у функціональних генах і тому не фіксуються.

Результати наших досліджень (табл. 2) узгоджуються з загальновизнаним положенням про превалювання частоти транзицій над трансверсіями, однак принципово відрізняються від співвідношення цих типів замін у псевдогенах коника [7]. Знайдене нами значне перевищення частоти транзицій у 5,8 разів (84,4/14,6) свідчить про наявність ефективних механізмів об-меження трансверсій у генах ХВК. Оскільки з 12 можливих комбінацій замін нуклеотидів 4 (33,3 %) відносяться до транзицій, а 8 (66,7 %) – до трансверсій, то за відсутності обмежень частота трансверсій повинна бути вдвічі більша, а не в 5,8 разів менша, ніж транзицій. Розподі-лення транзицій і трансверсій на типи, підтипи та варіанти вперше проведене нами дозволило виявити додаткові показники обмеження нуклеотидних замін. Так, частоти обох типів транзи-цій (w→s / s→w = 1,1) і трасверсій (y→r / r→y = 1,02) майже не відрізняються, однак частота підтипу c→r у 1,6 разів більша, ніж u→r (4,4/2,8). Питання про розповсюдженість цього явища та його біологічну роль залишається відкритим.

Встанавлений нами розподіл нуклеотидних замін за кодонними позиціями (табл. 3) уз-годжується з даними про їх розподіл у 15-ти зразках ортологічних генів людини та миші [16]. Найбільша кількість замін у третій кодонній позиції (94,0 % від еквівалентних замін і 9,9 % від нееквівалентних) пояснюється виродженістю генетичного коду. Оскільки кодони однієї аміно-кислоти (синонімічні кодони) відрізняються між собою лише за третім нуклеотидом, заміни у третій кодонній позиції не призводять до замін амінокислот і тому називаються нейтральними чи мовчазними мутаціями або трансляційно незалежними, синонімічними чи еквівалентними


нуклеотидними замінами. Через повне збереження структури і функцій білків за таких мута-цій вони не видаляються добором.

Наявність незначної кількості еквівалентних замін у першій кодонній позиції (4,6 %) та подвійних (двохнуклеотидних) замін у першій і третій позиціях (1,4 %) пояснюється тим, що по 2 кодони двох амінокислот: аргініна (AGA/CGA, AGG/CGG) та лейцина (UUA/CUA, UUG/CUG) містять сайти еквівалентних замін не в третій, а в перщій кодонній позиції. Цікаво, що дві з цих замін (C↔T) є транзиціями, а дві інщі (C↔A) – найбільш частими трансвенсіями (табл. 2). Оскільки 4 кодона з 61 складають 6,6 % , сумарний відсоток еквівалентних замін у першій та першій і третій кодонних позиціях (4,6+1,4) дуже близький до очікуваного (6,6), особливо з урахуванням поправки на меншу частоту трансверсій, ніж транзицій. Відсутність одно-, двох- та трьохнуклеотидних еквівалентних заміни у кодонних позиціях 2, 1 і 2, 2 і 3 та 1, 2 і 3 зумовлена структурою генетичного коду: всі синонімічні кодони однієї аміно-кислоти мають однакові два перших нуклеотиди, через що еквіваленні заміни нуклеотидів у першій і другій кодонній позиції неможливі, за винятком раніше наведених кодонів аргініна та лейцина. Цікаво, що 9 двохкодонних амінокислот у третій позиції мають або пуринові, або піримідинові нуклеотиди, що сприяє еквівалентним замінам і обмежує нееквівалентні через більшу ймовірність транзицій, ніж трансверсій. Сумарна кількість всіх транзицій і трансверсій в третій кодонній позиції досліджених штамів ХВК складає 79,6 % і перевищує кількість нук-леотидних замін у першій позиції у 8,7 разів, у другій – у 17,3; у першій і другій – у 66,3; у першій і третій – у 24,9; у другій і третій – у 49,8 і в усіх трьох позиціях – у 113,7 разів.

Розподіл нуклеотидних замін на ділянках генів досліджених штамів ХВК цілком узгод-жується з висновком, зробленим за результатами аналізу мутацій у геномних сиквенсах при-матів [19], однак принципово відрізняється від розподілу замін нуклеотидів у генах трьох видів тетрахітеми [11]. В геномах і на великих ділянках генів ХВК частоти нуклеотидних замін кількісно подібні, що наводить на думку про однакову ймовірність мутацій на всіх ділянках генома. Розподіли замін на коротких ділянках, представлені на рисунках 1 та 2, не суперечать цьому припущенню, оскільки через малу кількість і випадкову локалізацію мутацій, у генах повинні зустрічатись короткі ділянки без замін, а також з малою і великою їх кількістю.

Найбільш інтригуючим результатом наших досліджень є шість випадків збіжності позицій нуклеотидних замін на однакових ділянках трьох різних генів (рис. 2), що можна інтерпре-тувати як наявність у всіх (зовсім різних за властивостями) генах вірусу високо мутабельних точок у позиціях 91, 112, 130, 139, 160 та 163 від початку гена. Перевірка такої можливості шляхом моделювання збіжності позицій замін на основі отриманих експериментальних даних (фактичної кількості замін на ділянках кожного гена) і припущення про однакову ймовірність заміни кожного нуклеотида ділянки показала, що результати моделювання найкраще відпові-дають експериментальним даним за умов програмної генерації замін лише в одній (будь-якій) із трьох кодонних позицій. В свою чергу дані моделювання узгоджуються з тим, що основну кількість всіх нуклеотидних замін складають еквівалентні заміни саме в одній (у третій) ко-донній позиції. Переважна більшість нуклеотидних замін відбувається в одній позиції.

Оскільки наша модель не враховує обмеження типів замін у певних позиціях, з точки зору проведеного моделювання всі кодонні позиції є рівнозначними і мають однакові середні зна-чення замін. При цьому модельовані позиції замін, які збігаються на ділянках двох чи трьох генів, не відповідають (і не повинні відповідати) дійсним позиціям за умов проведеного мо-делювання. Важливо лише те, що наша модель переконливо показує можливість випадкового збігу позицій нуклеотидних замін у двох, трьох і дуже рідко в чотирьох генах при наявності випадкових мутацій лише в одній кодонній позиції. Через те, що переважну більшість точ-кових мутацій становлять нуклеотидні заміни в третій кодонній позиції, збіжність позицій замін на ділянках двох-трьох генів може бути випадковою. В той же час на основі проведених досліджень ми не можемо стверджувати, що в геномах штамів ХВК відсутні ділянки зі ста-тистично значимими відмінностями частоти мутацій. Для з’ясування цього питання потрібні подальші дослідження.

За результатами проведених досліджень можна вважати, що основним типом спонтанних точкових мутацій в геномах штамів ХВК є транзиції, спричинені помилками включення пури-нових (G замість A, або A замість G), а також піримідинових нуклеотидів (U замість C, або C замість U) в процесі синтезу вірусних РНК.

Сумарна кількість всіх нуклеотидних замін у генах десяти пар штамів, а також їх кількість на 1000 нуклеотидів мають прямо пропорційну залежність від довжини гена. Кількість замін


на 1000 нуклеотидів у різних генах варіює від 41,7 до 25,4, однак кінцеві некодуючі ділянки геномів 3'UTR та 5'UTR ідентичні в усіх штамів вірусу.

За зменшенням сумарної частоти нуклеотидні заміни розподіляються у такий спосіб: u→c (620 замін), c→u (518), g→a (467), a→g (454), c→a (3,9), a→c (3,4), g→u (2,0), u→g (1,5), u→a 1,3), a→u (1,2), g→c (0,8), c→g (0,5). Такий розподіл свідчить про близьку кількість прямих і зворотних замін у всіх варіантах пар нуклеотидів, а також про набагато меншу, але значно більш варіабельну частоту трасверсій, ніж транзиції.

Переважна більшість нуклеотидних замін (79,6 % від загальної кількості) локалізується в третій кодонній позиції. В першій позиції кодонів їх частота мешша в 8,7 разів, а в другій – в 17,3 рази.

В геномах ХВК і на великих ділянках однакових генів однакового розміру частоти нуклео-тидних замін практично однакові, але в цих же генах зустрічаються короткі ділянки без замін нуклеотидів, а також з малою і великою їх кількістю. Моделювання розподілу нуклеотидних замін на 213-нуклеотидних ділянках свідчить про можливість випадкового збігу позицій нук-леотидних замін у двох, трьох і дуже рідко в чотирьох генах за умови випадкових мутацій лише в одній кодонній позиції.

А. Н. Кириченко, И.С. Щербатенко

Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины им. Д.К.Заболотного, Киев

СПОНТАННЫЕ ЗАМЕНЫ НУКЛЕОТИДОВ В ГЕНАХ X-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ

Р е з ю м еВыяснение факторов, определяющих типы и темпы замен нуклеотидов в геномах имеет важное зна-

чение для совершенствования распространенных моделей молекулярной эволюции, исследования эво-люционного процесса, распознавание кодирующих и некодирующих РНК, идентификации биологически важных мотивов таких как репликационные сигналы, регуляторные участки и тому подобное. Однако, многие вопросы относительно факторов, влияющих на замены нуклеотидов в геномах вирусов растений все еще остаются не выясненными.

В нашей работе проведен сравнительный компьютерный анализ замен нуклеотидов в геномных сик-венсах десяти пар близко родственных штаммов Х-вируса картофеля (ХВК) с одинаковой длиной гено-мов и генов.

Выявлено значительное варьирование частоты замен в зависимости от пар нуклеотидов и штаммов, протяженности и локализации участков геномов и генов, а также типа замен и их кодонных позиций. На-ибольшие отношения частот замен найдено в разных парах нуклеотидов (u→c/ c→g, 1240), кодонных по-зициях (вторая/третья, 17,3) и типах (транзиции / трансверсии, 5,8); наименьшие - в прямых и обратных замен нуклеотидов одной пары (1,03-1,6). Частота трансверсий намного меньше, но значительно более вариабельна, чем транзиций и не имеет четкой зависимости от длины гена (нуклеотидного участка).

К л ю ч е в ы е с л о в а: Х-вирус картофеля, геномные сиквенсы, замены нуклеотидов, транзиции, трансверсии, компьютерный анализ

A.N. Kyrychenko, I.S. Shcherbatenko.


SPONTANEOUS NUCLEOTIDE SUBSTITUTION IN POTATO VIRUS X GENES

S u m m a r yElucidation of the factors underlying nucleotide substitution types and rates in genomes is of signifi cance

for improving the prevalent models for molecular evolution, and is essential in studying the evolution process, distinguishing the coding and noncoding RNAs, identifying biologically signifi cant motifs such as replication signals, control regions and so on. However, many questions concerning the factors that affect the nucleotide substitutions in plant virus genomes still remain unclear.

In this paper a comparative computer analysis of nucleotide substitution in genomic sequences of 10 pairs of closely related potato virus X (PVX) strains having equal genome and gene length has been carried out.

A signifi cant frequency variation of nucleotide substitutions, depending on nucleotide and strain pairs, length and localization of genome and gene regions as well as substitution types and their codon positions, was


found. The highest relations of substitution frequency are found in different nucleotide pairs (u→c/c→g, 1240), codon positions (third/second, 17.3) and substitution types (transitions/transversions, 5.8), the least ones – in forward and back substitutions in the same nucleotide pairs (1.03-1.6). The transversion frequencies are gener-ally signifi cantly lower but more variable than the transition one, and there is no direct relationship between gene (region) length and transversion frequency.

The paper is presented in Ukrainian.K e y w o r d s: potato virus X, genomic sequences, genomic substitutions, conservative sites, transitions,

transversions, computer analysis.

T h e a u t h o r’ s a d d r e s s: Shcherbatenko I.S.,Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine; 154 Acad. Zabolotny St., Kyiv, MSP, D 03680, Ukraine.

1. Carrasco P., de la Iglesia F., Elena S.F. The distribution of fi tness and virulence effects caused by single-nucleotide substitutions in Tobacco etch virus // J. Virol. – 2007. – 81, N 23. – P. 12979–12984.

2. Chowda-Reddy R.V., Sun H., Chen H., Poysa V., Ling H., Gijzen M., Wang A. Mutations in the P3 protein of soybean mosaic virus G2 isolates determine virulence on Rsv4-genotype soybean // Mol. Plant Microbe Interact. – 2011. – 24, N1. – P. 37–43.

3. Grigoras I., Timchenko T., Grande-Perez A., Katul L., Vetten H.J., Gronenborn B. High variability and rapid evolution of a nanovirus // J. Virol. – 2010. – 84, N 18. – P. 9105–9117.

4. Hasiow-Jaroszewska B., Borodynko N., Jackowiak P., Figlerowicz M., Pospieszny H. Single mutation converts mild pathotype of the Pepino mosaic virus into necrotic one // Virus Res. – 2011. – 159, N 1. – P. 57–61.

5. Hirata H., Lu X., Yamaji Y., Kagiwada S., Ugaki M., Namba S. A single silent substitution in the genome of Apple stem grooving virus causes symptom attenuation // J. Gen. Virol. – 2003. – 84. – P. 2579–2583.

6. Jayaswal V., Jermiin L.S., Poladian L., Robinson J. Two stationary nonhomogeneous Markov models of nucleotide sequence evolution // Syst. Biol. – 2011. – 60, 1. – P. 74–86.

7. Keller I., Bensasson D., Nichols R.A. Transition-transversion bias is not universal: a counter example from grasshopper pseudogenes // PLoS Genet. – 2007. – 3, N 2. – e22.

8. Lebre S., Michel C.J. A stochastic evolution model for residue Insertion-Deletion Independent from Substitution // Comput. Biol. Chem. – 2010. – 34, N 5-6. – P. 259–267.

9. Lopez C., Aramburu J., Galipienso L., Soler S., Nuez F., Rubio L. Evolutionary analysis of tomato Sw-5 resistance-breaking isolates of Tomato spotted wilt virus // J. Gen. Virol. – 2011. – 92. – P. 210–215.

10. Malpica J.M., Fraile A., Moreno I., Obies C.I., Drake J.W., Garcia-Arenal F. The rate and character of spontaneous mutation in an RNA virus // Genetics. – 2002. – 162, 4. – P.1505–1511.

11. Moradian M.M., Beglaryan D., Skozylas J.M., Kerikorian V. Complete mitochondrial genome sequence of three tetrahymena species reveals mutation hot spots and accelerated nonsynonymous substitutions in Ymf genes // PLoS ONE. – 2007. – 2, 7. – e650.

12. Moreno A., Hebrard E., Uzest M., Blanc S., Fereres A. A single amino acid position in the helper component of caulifl ower mosaic virus can change the spectrum of transmitting vector species // J. Virol. – 2005. – 79, 21. – P.13587–13593.

13. Nakken S., Rodland E.A., Hovig E. Impact of DNA physical properties on local sequence bias of human mutation // Hum. Mutat. – 2010. – 31, N 12. – P. 1316–1325.

14. Pagan I., Firth C., Holmes E.C. Phylogenetic analysis reveals rapid evolutionary dynamics in the plant RNA virus genus tobamovirus // Mol. Evol. – 2010. – 71, N 4. – P. 298–307.

15. Roossinck M.J., Schneider W.L. Mutant clouds and occupation of sequence space in plant RNA viruses//Curr. Top. Microbiol. Immunol. – 2006. – 299. – P.337–348.

16. Wang G.Z., Chen L.L., Zhang H.Y. Phase-dependent nucleotide substitution in protein-coding sequences // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2007. – 355, N 3. – P. 599–602.

17. Wang H. Confi dence intervals for the substitution number in the nucleotide substitution models // Mol. Phylogenet. Evol. – 2011. – 60, N 3. – P. 472–479.

18. Washietl S., Findeiss S., Muller S.A., Kalkhof S., von Bergen M., Hofacker I.L., Stadler P.F., Goldman N. RNAcode: robust discrimination of coding and noncoding regions in comparative sequence data // RNA. – 2011. – 17, N 4. – P. 578–594.

19. Zhang W., Bouffard G.G., Wallace S.S., Bond J.P. NISC comparative sequencing program. Estimation of DNA sequence context-dependent mutation rates using primate genomic sequences // J. Mol. Evol. – 2007. – 65, N 3. – P. 207–214.



UDC 579.864.1:615.331

L.P. Babenko1, L.M. Lazarenko1, L.M. Shynkarenko1,2, V.V. Mokrozub1, V.S. Pidgorskyi, M.Y. Spivak1,3

1 Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, 154, Acad. Zabolotny St., Kyiv,MSP, D03680, Ukraine

2Pure Research Products, LLC, Boulder, Colorado, USA3 LCL «Diaprof», 35, Svetlickiy St., Kyiv, 04123, Ukraine

THE EFFECT OF LACTO- AND BIFIDOBACTERIA COMPOSITIONS ON THE VAGINAL MICROFLORA IN CASES OF INTRAVAGINAL

STAPHYLOCOCCOSISThe effect of intravaginal injection of Lactobacillus casei ІМV В-7280, Lactobacillus acidophilus ІМV

В-7279, Bifi dobacterium animalis VKL and Bifi dobacterium animalis VKB strains in various compositions on the range of microfl ora of the urogenital tract on the model of experimental intravaginal staphylococcosis of mice was determined. It was established that under the infl uence of various compositions of these strains chang-es in microfl ora spectrum occurred: the number of representatives of normofl ora increased and the number of pathogenic microorganisms, including staphylococci, streptococci, coliform bacteria and fungi, signifi cantly decreased. It was determined that strains of lacto- and bifi dobacteria, that were studied, are prospective compo-nents of future probiotic drugs effi cient in treating staphylococcosis.

K e y w o r d s: Lactobacillus, Bifi dobacterium, Staphylococcus, vagina, microfl ora, mice

Urogenital infection- infl ammatory bacterial diseases are common in modern clinical practice. One of the basic causes of the urogenital infections is a violation of vaginal microecology, which is very sensitive to various factors such as hormonal status, sexual activity, use of oral contraceptives, the glycogen content, the pH of the vagina, therapy with glucocorticoids, immunosuppressive treatment, etc. [2, 5, 6].

Despite the great importance, approaches to the therapy of these diseases did not change signifi cantly in recent years. Thus, the main agents in the treatment of urogenital infections are antibiotics and antimycotics, but with the growth of antibiotic resistance, the effectiveness of these drugs is reducing, and their use in pregnancy is not always possible [9, 12].

The concept of the protective role of normal microfl ora of the vagina (e.g., lactobacilli) became the basis for the treatment of urogenital infections by probiotics. Later it was shown that Lactobacillus strains can colonize the vagina after the use of vaginal suppositories [1, 7], reduce the risk of urinary tract infections and fungal vaginitis [1, 11] and bacterial vaginosis [14]. The advantage of probiotic therapy, in addition to the lack of adverse drug reactions, is the possibility of their use in daily diet. The disadvantage of the concept is the lack of the results of controlled studies of the effect of probiotics on the human body. Nevertheless, a number of microorganisms are widely used for this purpose at present [6, 15].

The mechanism of the impact of probiotics on the vaginal mucosa in cases of urogenital infections is presumably multifactorial in nature and is caused by the production of lactic acid, microbicides and hydrogen peroxide, a modifi cation of the immune response, production of biosurfactant and collagen-binding proteins (inhibition of adhesion of pathogenic bacteria), synthesis of the specifi c molecules, that are capable to reduce the virulence of pathogens and other factors [2, 4, 13], which requires further study on models both in vitro, and in vivo.

Previously [10, 13] we have characterized the strains of lacto- and bifi dobacteria: Lactobacillus casei IMV B-7280, L. acidophilus IMV B-7279, Bifi dobacterium animalis VKL and B. animalis VKB. It was established that these probiotic strains in monoculture and in various compositions have antistaphylococcal effect on the model of experimental intravaginal staphylococcosis of mice. It was found that under the infl uence of these strains and their various compositions, the in vitro growth of S. aureus was inhibited, and the number of colonies of S. aureus plated from the vagina of infected mice was signifi cantly reduced [10], but the most effective elimination of S. aureus in vivo was observed under the infl uence of these probiotic strains in different compositions. However, the changes in the range of other pathogenic bacteria, that can also cause the infectious-infl ammatory diseases of the urogenital tract, have not been studied yet. © L.P. Babenko, L.M. Lazarenko, L.M. Shynkarenko, V.V. Mokrozub, V.S. Pidgorskyi, M.J. Spivak, 2012


Therefore, the aim of this study was to determine the effect of probiotic strains of lactobacilli and/or bifi dobacteria in various compositions to the range of opportunistic vaginal microfl ora on the model of experimental intravaginal staphylococcosis of mice.

Materials and Methods. Experimental studies were performed on six-week-old female BALB/c mice that were kept in the vivarium in standard conditions during the experiment. All studies were performed taking into account the rules of the European Convention for the protection of vertebrate animals [14].

Four strains of lactic acid bacteria – L. casei IMV B-7280, L. acidophilus IMV B-7279, B. animalis VKL and B. animalis VKB were used in various compositions. Before each experiment the viability of the probiotic cultures was tested by monitoring their growth on the Man-Rogosa-Sharpe (MRS) agar medium at 37 °C for 24-48 h. The study was performed using bacteria lyophilized in Cuddon Freeze Dryer FD1500 (New Zealand). “Labilakt®” (Ariadna, Odessa, Ukraine), that includes a composition of lyophilized strains of lacto- and bifi dobacteria was used at work for comparison.

Staphylococcus aureus 8325-4 strain, that had plasmid-based resistance to gentamicin, was used in the study. Before injection into mice vagina, S. aureus 8325-4 was grown on selective medium for staphylococci (BAIRD-PARKER-Agar, Merck, Germany) containing gentamicin (15 μg/ml) at 37 °C for 24 h. Staphylococcosis was modeled through intravaginal administration of the S. aureus 8325-4 daily culture to mice, in doses of 5 x 107 cells per animal.

Twenty-four hours after infection, mice were given an intravaginal injection of a suspension of lyophilized lacto- and/or bifi dobacteria cells in saline solution at a dose of 1 х 106 cells per animal, once per day for 7 days. Strains were injected in the following compositions: L. casei ІМV В-7280 - L. acidophilus ІМV В-7279; L. casei ІМV В-7280 - B. animalis VKL; L. casei ІМV В-7280 - B. animalis VKB; L. acidophilus IMV В-7279 - B. animalis VKL; L. acidophilus IMV В-7279 - B. animalis VKB; B. animalis VKL - B. animalis VKB; L. casei IMV В-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB; L. casei IMV В-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279; L. acidophilus IMV B-7279- B. animalis VKL - B. animalis VKB; L. casei IMV В-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279; L. casei IMV В-7280 - B. animalis VKB - B. animalis VKL- L. acidophilus IMV B-7279 in equal proportion.

Other separate groups were intact and infected mice that did not receive probiotic strains, but intravaginally received the same volume of saline, and infected mice that recieved “Labilakt®” in the same way as the other compositions of probiotic strains.

On the 1, 3, 6, 9 and 12th days after the injection of lacto- and/or bifi dobacteria strains in various composition or “Labilakt®” material was collected from the vagina and plated onto six nutrient mediums: MRSA (Man-Rogosa-Sharpe agar medium for lactobacilli), Meat-Peptone Agar (MPA, selective medium for aerobic and facultative anaerobic organisms), BAIRD-PARKER-Agar (Merck, Germany; selective medium for staphylococci), KF-Streptococcus agar (Merck, Germany; selective medium for streptococci), ENDO (NSСАМВ, Obolensk, Russia; selective medium for coliform bacteria) and Sabouraud agar (selective medium for fungi). The material was collected using standardized sterile cotton tampons. Swabs from each tampon were performed with 1 ml of saline. After cultivation at 37 °C for 24 h, the number of colony forming units (CFU) was counted, given that one such colony corresponds to one bacterium.

All digital data obtained were processed with the help of the Origin Pro 8.5. software through analysis of variance. Numerical data were represented as arithmetic average and standard error (M ± m). The null hypothesis for the control and experimental comparative groups was checked using Wilcoxon-Mann-Whitney (U) and Kolmogorov-Smirnov nonparametric criteria. The differences between the groups were considered statistically meaningful at P < 0.05.

Results and Discussion. The results of the investigation of intravaginal injection of probiotic strains in the compositions of two cultures to the range of microfl ora of the urogenital tract are presented in Table 1. It should be noted that in mice infected with S. aureus, that did not receive probiotic strains, the signifi cant changes in the microfl ora of the urogenital tract was observed. Thus, after injection of the infectious agent, the number of aerobic and facultative anaerobic microorganisms, as well as staphylococci and streptococci increased during the observation period, and coliform bacteria and fungi – on the 1st and 9th days. On the contrary, the number of lactobacilli decreased from the 6th day and during the subsequent period of observation.


Table 1 Number of colonies of opportunistic microorganisms, that were sowed from the vagina of the infected mice after receiving intravaginal injection of compositions of two probiotic strains

of lacto- and/or bifi dobacteria, each of them separately

Groups of mice / time

of observation, day

Colony forming units (lg/ml)Meat-

Peptone Agar

Baird-Parker-Agar

KF-Streptococcus

agar

Man-Rogosa-Sharpe

ENDO Sabouraud agar

Intact mice - 2.24 ± 0.10 2.51 ± 0.09 2.08 ± 0.10 2.68 ± 0.03 1.08 ± 0.02 2.07 ± 0.09

Mic

e in

fect

ed w

ith

S. a

ureu

s

1 day 3.78 ± 0.13* 4.54 ± 0.08* 3.53 ± 0.05* 2.79 ± 0.13 1.60 ± 0.04* 2.63 ± 0.05*

3 day 3.82 ± 0.09* 4.30 ± 0.05* 3.45 ± 0.03* 2.63 ± 0.04 1.48 ± 0.03* 1.48 ± 0.02*

6 day 3.83 ± 0.11* 4.25 ± 0.07* 3.34 ± 0.07* 2.00 ± 0.01* 1.48 ± 0.05* 2.18 ± 0.08

9 day 3.51 ± 0.08* 4.22 ± 0.11* 3.26 ± 0.11* 2.23 ± 0.02* 1.30 ± 0.01 2.34 ± 0.05*

12 day 3.36 ± 0.08* 4.19 ± 0.09* 3.22 ± 0.08* 2.32 ± 0.03* 1.48 ± 0.04* 1.90 ± 0.02

Rec

eive

d L.

cas

ei

ІМV

В-7

280

- B.

ani

mal

is V

KB 1 day 2.45 ± 0.07• 2.98 ± 0.09*• 2.40 ± 0.09*• 4.16 ± 0.18*• 1.00 ± 0.04• 2.28 ± 0.08•

3 day 2.18 ± 0.10• 3.00 ± 0.13*• 2.79 ± 0.13*• 3.72 ± 0.09*• 0*• 2.51 ± 0.05*•

6 day 2.81 ± 0.04*• 2.88 ± 0.07*• 2.72 ± 0.04*• 3.80 ± 0.02*• 0*• 1.90 ± 0.04•

9 day 2.90 ± 0.09*• 2.73 ± 0.05• 2.69 ± 0.05*• 3.81 ± 0.11*• 1.00 ± 0.02• 2.74 ± 0.09*•

12 day 2.86 ± 0.07*• 2.68 ± 0.04• 2.73 ± 0.04*• 3.49 ± 0.12*• 0*• 2.08 ± 0.05•

Rec

eive

d L.

cas

ei

ІМV

В-7

280

- B.

ani

mal

is V

KL 1 day 3.11 ± 0.07*• 3.11 ± 0.08*• 2.96 ± 0.09*• 1.70 ± 0.03* 1.11 ± 0.02• 0*•

3 day 3.26 ± 0.11*• 3.06 ± 0.04*• 2.75 ± 0.08*• 2.56 ± 0.09 0*• 0*•

6 day 3.05 ± 0.12*• 2.21 ± 0.05• 2.64 ± 0.04*• 3.23 ± 0.10*• 1.75 ± 0.03*• 1.00 ± 0.02*•

9 day 2.48 ± 0.09• 2.55 ± 0.04• 2.22 ± 0.03• 4.32 ± 0.12*• 0*• 0*•

12 day 3.27 ± 0.08* 2.28 ± 0.03• 2.33 ± 0.08• 2.02 ± 0.04*• 1.11 ± 0.01• 0*•

Rec

eive

d L.

aci

do-

philu

s ІМ

V В

-727

9 - B

. ani

mal

is V

KB 1 day 4.12 ± 0.14* 3.99 ± 0.11*• 3.44 ± 0.04* 3.03 ± 0.07* 1.45 ± 0.02*• 1.75 ± 0.03•

3 day 3.99 ± 0.13* 4.03 ± 0.03*• 3.54 ± 0.08* 3.50 ± 0.05*• 0*• 2.12 ± 0.02•

6 day 3.68 ± 0.09* 3.85 ± 0.09*• 2.78 ± 0.04*• 3.05 ± 0.04*• 1.75 ± 0.03*• 2.15 ± 0.03

9 day 3.35 ± 0.04* 3.79 ± 0.10*• 2.66 ± 0.08*• 2.60 ± 0.07• 0*• 2.44 ± 0.04*

12 day 3.22 ± 0.08* 3.85 ± 0.09*• 2.65 ± 0.05*• 1.60 ± 0.10*• 0*• 1.55 ± 0.08*•

Rec

eive

d L.

aci

do-

philu

s ІМ

V В

-727

9 - B

. ani

mal

is V

KL 1 day 3.26 ± 0.07*• 3.77 ± 0.08*• 2.40 ± 0.11• 4.23 ± 0.14*• 1.11 ± 0.01• 2.44 ± 0.03*•

3 day 3.48 ± 0.05*• 3.55 ± 0.05*• 2.35 ± 0.03• 4.13 ± 0.08*• 0*• 1.17 ± 0.02*•

6 day 3.66 ± 0.08* 3.44 ± 0.04*• 2.20 ± 0.02• 3.66 ± 0.07*• 0*• 2.10 ± 0.04

9 day 3.73 ± 0.04* 3.37 ± 0.07*• 2.15 ± 0.04• 2.81 ± 0.04• 1.45 ± 0.03 1.66 ± 0.02*•

12 day 3.62 ± 0.04* 3.54 ± 0.09*• 2.10 ± 0.03• 2.18 ± 0.04* 0*• 1.00 ± 0.01*•

Rec

eive

d B.

ani

ma-

lis V

KB

- B.

ani

ma-

lis V

KL

1 day 4.08 ± 0.09* 2.08 ± 0.02*• 4.24 ± 0.11*• 4.14 ± 0.11*• 1.30 ± 0.03• 2.88 ± 0.08*•

3 day 4.13 ± 0.12* 1.90 ± 0.01*• 4.26 ± 0.07*• 4.51 ± 0.13*• 2.23 ± 0.04*• 3.91 ± 0.07*•

6 day 3.92 ± 0.05* 2.11 ± 0.08*• 4.18 ± 0.01*• 4.08 ± 0.14*• 2.93 ± 0.05*• 2.83 ± 0.04*•

9 day 3.98 ± 0.14*• 2.32 ± 0.03• 4.12 ± 0.11*• 3.79 ± 0.09*• 2.72 ± 0.04*• 2.88 ± 0.09*•

12 day 3.94 ± 0.09*• 2.23 ± 0.04• 4.08 ± 0.13*• 3.77 ± 0.11*• 2.69 ± 0.05*• 2.58 ± 0.08*•

Rec

eive

d L.

aci

do-

philu

s ІМ

V B

-727

9 -

L. c

asei

ІМV

В-7

280 1 day 4.21 ± 0.16* 3.15 ± 0.13*• 3.66 ± 0.09* 2.11 ± 0.05*• 1.15 ± 0.02• 2.67 ± 0.09*

3 day 3.77 ± 0.14* 3.11 ± 0.08*• 3.71 ± 0.11* 2.22 ± 0.07*• 0*• 3.14 ± 0.02*•

6 day 3.65 ± 0.04* 2.95 ± 0.04*• 3.55 ± 0.05* 3.14 ± 0.05*• 1.98 ± 0.03*• 1.16 ± 0.02*•

9 day 3.14 ± 0.04*• 2.44 ± 0.03• 3.61 ± 0.11* 2.94 ± 0.07*• 0*• 1.92 ± 0.04•

12 day 3.12 ± 0.02* 2.06 ± 0.04*• 3.12 ± 0.11* 2.16 ± 0.08* 1.11 ± 0.01• 1.36 ± 0.03*•

Note: Signifi cant differences with the control is represented by * (P < 0.05) while differences with the indicators of the infected mice who did not receive probiotic strains are represented by • (P < 0.05)


It was found that the number of lactobacilli in the vagina increased throughout the period of observation under the infl uence of compositions L. casei IMV В-7280 - B. animalis VKB or B. animalis VKB - B. animalis VKL compared with the infected mice that did not receive probiotic cultures. The increase of the number of lactobacilli in the vagina of infected mice was observed under the effect of L. acidophilus IMV В-7279 - B. animalis VKL (on the 1, 3, 6 and 9th days), L. acidophilus IMV В-7279 - B. animalis VKB (on the 3, 6 and 9th days) or L. casei IMV В-7280 - B. animalis VKL (on the 6 and 9th days). However, the number of lactobacilli in the vagina appeared lower than in the infected mice not treated with probiotic cultures on the 1 and 12th days under the infl uence of compositions L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL or L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB and also under the effect of L. casei IMV B-7280 - L. acidophilus IMV B-7279 (on the 1 and 3rd days). After injection of “Labilakt®”, the number of lactobacilli in the vagina of infected mice increased on the 3, 6, 9 and 12th days. The drug “Labilakt®” induced the increasing of the number of lactobacilli in the vagina of infected mice on the 3, 6, 9 and 12th days. It should be noted that after the injection of almost all the compositions of two probiotic cultures, the number of lactobacilli in the vagina of the infected mice appeared to be even greater than in the control (intact mice). The number of lactobacilli in the vagina of mice treated with L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL (on the 3rd day), L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB (on the 9th day), L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL (on the 9th day) or “Labilakt®” (throughout the period of observation) was at the level of the control group.

It was found that in the vagina of mice infected with S. aureus, the number of aerobic and facultative anaerobic microorganisms was reduced under the infl uence of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB during the whole experimental period, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL – on the 1, 3, 6 and 9th days, L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL – on the 1 and 3rd days and L. casei IMV B-7280 - L. acidophilus IMV B-7279 – only on the 9th day compared with the infected mice that did not receive probiotic cultures. But the number of aerobic and facultative anaerobic microorganisms in the vagina of mice treated with composition B. animalis VKB - B. animalis VKL even increased on the 9 and 12th days. Instead, after the injection of the composition L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB, the number of these microorganisms in the vagina during the whole observation period was the same as in the infected mice that did not receive probiotic cultures. “Labilakt®” reduced the number of aerobic and facultative anaerobic microorganisms in the vagina of mice infected with S. aureus during the term of the experiment. Under the infl uence of only two compositions: L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB (on the 1 and 3rd days) or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL (on the 9th day) the number of aerobic and facultative anaerobic microorganisms in the vagina of infected mice decreased to the level of the control group.

As shown in Table 1, the number of staphylococci appeared lower after the injection of all the compositions of two probiotic strains throughout the observation period compared with the infected mice that did not receive probiotic compositions. The number of staphylococci in the vagina of infected mice decreased to the level of control under the infl uence of only three compositions: L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB (on the 9 and 12th days), L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL (on the 6, 9 and 12th days), L. acidophilus IMV B-7279 - L. casei IMV B-7280 (on the 9th day).

The number of staphylococci in the vagina of infected mice appeared smaller than in the control group (intact mice) after the administration to the infected mice B. animalis VKB - B. animalis VKL (on the 1, 3 and 6th days) and on the 9 and 12th days – remained at the level of the control group (intact mice). Under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279 - L. casei IMV B-7280 the number of staphylococci in the vagina of infected mice on the 12th day was also lower than in the control. The number of staphylococci also reduced to the control level under the infl uence of “Labilakt®” on the 6, 9 and 12th days.

The number of streptococci decreased after injection of L. casei IMV В-7280 - B. animalis VKB, L. casei IMV В-7280 - B. animalis VKL or L. acidophilus IMV В-7279 - B. animalis VKL throughout the period of observation in comparison with the infected mice that did not receive probiotic cultures. Under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB a decreased level of streptococci was observed on the 6, 9 and 12th days.

After intravaginal injection of L. acidophilus IMV B-7279 - L. casei IMV B-7280 composition the number of streptococci in the vagina of infected mice did not change signifi cantly, but under the infl uence of B. animalis VKL - B. animalis VKB their number increased throughout the period of observation. The “Labilakt®” injection was characterized by increasing the number of streptococci in the vagina of infected mice on the 1 and 3rd days, but on the 6, 9 and 12th days their number was the


same as in the infected mice not treated with probiotic cultures. The number of streptococci decreased to the control level only under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL during the period of observation and L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL – on the 9 and 12th days.

The number of coliform bacteria in the vagina decreased under the infl uence of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB (throughout the period of observation), L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL (on the 1, 3, 9 and 12th days), L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB (on the 1, 3, 9 and 12th days), L. acidophilus IMV B-7279 - L. casei IMV B-7280 (on the 1, 3, 9 and 12th days), L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL (on the 1, 3, 6 and 12th days), B. animalis VKL - B. animalis VKB (on the 1st day) in comparison with the infected mice not treated with probiotic cultures. The reduced number of coliform bacteria under the infl uence of the “Labilakt®” drug was observed only on the 6th day.

However, after the injection of some of these compositions to the infected mice, the number of coliform bacteria in the vagina appeared to be even greater than in the control group and in the vagina of mice infected with S. aureus, that did not receive probiotic cultures. It was observed after the injection of L. casei IMV B-7280 - B. longum VK, L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB and L. acidophilus IMV B-7279 - L. casei IMV B-7280 (on the 6th days), the “Labilakt®” drug (on the 1 and 9th days) or B. animalis VKL - B. animalis VKB (on the 3, 6, 9 and 12th days).

It was shown that administration of different compositions of two probiotic strains into the vagina of the infected mice changed the number of fungi in their vaginal fl ora. Their number decreased throughout the period of observation under the infl uence of the composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL compared with the infected mice not treated with probiotic cultures and the control group (intact mice). The composition L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL induced the reduction of fungal fl ora on the 1, 3, 9 and 12th days, L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB – on the 1 and 12th days, L. acidophilus IMV B-7279 - L. casei IMV B-7280 – on the 9 and 12th days, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB – on the 1st day. However, the number of fungi increased under the infl uence of the last composition on the 3, 6, 9 and 12th days. The composition L.acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB also caused the increase of the number of fungi on the 3rd day, and L. acidophilus IMV B-7279 - L. casei IMV B-7280 – on the 3 and 6th days. It should be noted that the number of fungi in the vagina of infected mice increased under the infl uence of composition B. animalis VKL - B. animalis VKB on the 1, 3, 6, 9 and 12th days. The drug “Labilakt®” increased the number of fungi on the 3, 9 and 12th days. In other terms of observation under the infl uence of this drug the number of fungi was the same as in the infected mice that did not receive probiotic cultures. The increase of the number of fungi in the vagina of the infected mice took place under the infl uence of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB (on the 3 and 9th days), L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKB (on the 9th day), L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL (on the 1st day), L. acidophilus IMV B-7279 - L. casei IMV B-7280 (on the 1 and 3rd days) or B. animalis VKL - B. animalis VKB (throughout the period of observation) in comparison with the control group (intact mice). The drug “Labilakt®” induced the increase of the number of fungi in the vagina of infected mice on the 1, 3 6 and 9th days (in comparison with the control group).

The compositions of the two strains being compared, their antistaphylococcal action was equal. The number of coliform bacteria effectively reduced under the infl uence of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB, and fungi – under the infl uence of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL.

The results of studying the infl uence of compositions of three or four strains on the vaginal microfl ora spectrum are presented in Table 2.

The number of lactobacilli in the vagina of mice infected with S. aureus during the observation period increased under the infl uence of the compositions L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279, L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL - B. animalis VKB or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 as compared with the infected mice not treated with probiotic cultures. The number of lactobacilli increased also on the 3, 6, 9 and 12th days after the injection of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279. On the 1st day after the injection of the composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB to the infected mice, the number of lactobacilli was the same as in the vagina of the infected mice, but higher than in the control (intact mice). However, in the vagina of infected mice treated with the composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279, the number of lactobacilli temporarily decreased on the 1st day.


Table 2 Number of colonies of opportunistic microorganisms, that were sowed from the vagina of the infected mice after receiving intravaginal injection of compositions of three or four probiotic

strains of lacto- and/or bifi dobacteria, each of them separately

Groups of mice / time of observation, day

Colony forming units (lg/ml)

Meat-Peptone Agar

Baird-Parker-Agar

KF-Streptococcus

agar

Man-Rogosa-Sharpe ENDO Sabouraud

agar

Intact mice - 2.24 ± 0.03 2.51 ± 0.07 2.08 ± 0.03 2.68 ± 0.05 1.08 ± 0.05 2.07 ± 0.07

Mic

e inf

ecte

d w

ith S

. aur

eus 1 day 3.78 ± 0.13* 4.54 ± 0.08* 3.53 ± 0.05* 2.79 ± 0.13 1.60 ± 0.04* 2.63 ± 0.05*

3 day 3.82 ± 0.09* 4.30 ± 0.05* 3.45 ± 0.03* 2.63 ± 0.04 1.48 ± 0.03* 1.48 ± 0.02*6 day 3.83 ± 0.11* 4.25 ± 0.07* 3.34 ± 0.07* 2.00 ± 0.01* 1.48 ± 0.05* 2.18 ± 0.089 day 3.51 ± 0.08* 4.22 ± 0.11* 3.26 ± 0.11* 2.23 ± 0.02* 1.30 ± 0.01 2.34 ± 0.05*12 day 3.36 ± 0.08* 4.19 ± 0.09* 3.22 ± 0.08* 2.32 ± 0.03* 1.48 ± 0.04* 1.90 ± 0.02

Rece

ived

L. c

asei

ІМV

В-

7280

- B.

ani

mal

is V

KL

- B. a

nim

alis

VK

B 1 day 2.28 ± 0.02• 3.06 ± 0.11*• 2.88 ± 0.04*• 3.10 ± 0.10* 1.90 ± 0.05*• 1.48 ± 0.03*•

3 day 3.09 ± 0.12*• 3.34 ± 0.07*• 2.23 ± 0.05• 2.88 ± 0.05• 0*• 1.60 ± 0.09*

6 day 2.54 ± 0.02*• 2.08 ± 0.02*• 2.57 ± 0.05*• 3.14 ± 0.07*• 2.20 ± 0.04*• 1.30 ± 0.01*•

9 day 2.72 ± 0.07*• 2.96 ± 0.02*• 2.65 ± 0.07*• 3.32 ± 0.12*• 1.30 ± 0.01 1.70 ± 0.02*•

12 day 2.67 ± 0.08*• 2.52 ± 0.05• 2.73 ± 0.01*• 3.22 ± 0.11*• 1.48 ± 0.02* 1.30 ± 0.05*•

Rece

ived

L. c

asei

ІМV

В-

7280

- B.

ani

mal

is V

KL

- L.

aci

doph

ilus ІМ

V B

-727

9

1 day 2.34 ± 0.09• 2.58 ± 0.07• 1.90 ± 0.01• 3.26 ± 0.10*• 1.00 ± 0.01• 1.30 ± 0.07*•

3 day 2.40 ± 0.07• 3.23 ± 0.03*• 2.18 ± 0.11• 3.49 ± 0.10*• 0*• 0*•

6 day 3.27 ± 0.05*• 2.34 ± 0.07• 1.12 ± 0.02*• 3.53 ± 0.10*• 0*• 1.60 ± 0.04*•

9 day 2.86 ± 0.07*• 2.49 ± 0.04• 1.60 ± 0.01*• 3.45 ± 0.14*• 1.30 ± 0.03 1.00 ± 0.01*•

12 day 2.71 ± 0.03*• 2.28 ± 0.07• 2.40 ± 0.05*• 3.38 ± 0.11*• 1.00 ± 0.01• 1.00 ± 0.01*•

Rece

ived

L. a

cido

philu

s IM

V B

-727

9 - B

. ani

mal

is V

KL

- B. a

nim

alis

VK

B 1 day 4.19 ± 0.07*• 3.39 ± 0.04*• 4.08 ± 0.11*• 3.22 ± 0.01*• 1.48 ± 0.02* 2.15 ± 0.07•

3 day 4.20 ± 0.10*• 3.51 ± 0.07*• 4.11 ± 0.11*• 3.45 ± 0.05*• 0*• 2.40 ± 0.08*•

6 day 4.29 ± 0.09*• 3.32 ± 0.08*• 3.99 ± 0.07*• 3.54 ± 0.07*• 0*• 1.00 ± 0.05*•

9 day 4.13 ± 0.11*• 3.24 ± 0.07*• 4.04 ± 0.08*• 3.33 ± 0.08*• 1.60 ± 0.01*• 1.90 ± 0.07•

12 day 4.08 ± 0.10*• 2.96 ± 0.05*• 3.80 ± 0.09*• 3.50 ± 0.03*• 1.00 ± 0.02• 1.95 ± 0.04

Rece

ived

L. c

asei

ІМV

В-

7280

- B.

ani

mal

is V

KB

- L.

aci

doph

ilus ІМ

V B

-727

9 1 day 3.21 ± 0.12* 3.62 ± 0.04*• 3.98 ± 0.09*• 2.25 ± 0.03* 1.00 ± 0.02• 1.65 ± 0.02*•

3 day 3.14 ± 0.03*• 3.32 ± 0.12*• 3.76 ± 0.04*• 3.11 ± 0.08*• 0*• 2.11 ± 0.04•

6 day 3.13 ± 0.05*• 3.30 ± 0.08*• 3.88 ± 0.09*• 3.15 ± 0.08*• 1.17 ± 0.02• 2.03 ± 0.03

9 day 3.22 ± 0.07*• 3.16 ± 0.09*• 3.68 ± 0.08*• 3.55 ± 0.08*• 0*• 1.85 ± 0.04•

12 day 3.36 ± 0.09* 2.89 ± 0.08*• 3.55 ± 0.04*• 3.11 ± 0.09*• 1.36 ± 0.03 1.17 ± 0.02•

Rece

ived

L. c

asei

ІМV

В-7

280

- B. a

nim

alis

VK

B - B

. ani

mal

is V

KL-

L. a

cido

philu

s ІМ

V B

-727

9

1 day 4.28 ± 0.10*• 4.27 ± 0.12* 4.13 ± 0.13*• 3.41 ± 0.11*• 3.76 ± 0.05*• 3.46 ± 0.14*•

3 day 4.23 ± 0.12*• 4.28 ± 0.12* 4.08 ± 0.11*• 2.98 ± 0.15• 3.78 ± 0.07*• 3.57 ± 0.13*•

6 day 4.32 ± 0.11*• 3.83 ± 0.07*• 3.23 ± 0.12* 4.11 ± 0.05*• 3.54 ± 0.09*• 2.65 ± 0.05*•

9 day 4.22 ± 0.12*• 3.86 ± 0.02*• 3.46 ± 0.08* 4.05 ± 0.15*• 3.51 ± 0.05*• 2.80 ± 0.05*•

12 day 4.18 ± 0.08*• 3.50 ± 0.09*• 3.93 ± 0.07*• 3.98 ± 0.07*• 3.32 ± 0.03*• 2.62 ± 0.02*•

Note: Signifi cant differences with the control is represented by * (P < 0.05) while differences with the indicators of the infected mice who did not receive probiotic strains are represented by • (P < 0.05)


The number of aerobic and facultative anaerobic microorganisms in the vagina of infected mice decreased under the infl uence of compositions L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB and L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 during the observation period in comparison with the infected mice not treated with probiotic cultures. However, their number increased after the injection of L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL - B. animalis VKB and L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 throughout the period of observation. Under the infl uence of composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279, the number of these bacteria decreased on the 3, 6 and 9th days, and in other terms of observation it was the same as in the vagina of the infected mice that did not receive probiotic cultures.

The number of staphylococci in the vagina of the infected mice decreased throughout the period of observation under the infl uence of the compositions L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279, L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL - B. animalis VKB, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB as compared with the infected mice not treated with probiotic cultures. But under the infl uence of the composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 on the 1 and 3rd days, the number of staphylococci in the vagina was the same as in the vagina of the infected mice, but on the 6, 9 and 12th days it decreased. Under the infl uence of composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 the number of staphylococci in the vagina of infected mice decreased to the level of control (intact mice) on the 1, 6, 9 and 12th days, and under the infl uence of L. casei IMV B-7280 - B.animalis VKL - B. animalis VKB – only on the 12th day.

Throughout the period of observation the number of streptococci in the vagina of the infected mice decreased under the infl uence of compositions L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279, but increased under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL - B. animalis VKB, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279 in comparison with the infected mice that did not receive probiotic cultures. The composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 increased the number of streptococci on the 1, 3 and 12th days. The number of streptococci in the vagina of infected mice decreased to the level of the control group only under the infl uence of compositions the L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 (on the 1 and 3rd days) or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB (on the 3rd day).

The number of coliform bacteria in the vagina of the infected mice decreased after the injection of compositions L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 (on the 1, 3, 6 and 12th days), L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279 (on the 1, 3, 6 and 9th days), L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL - B. animalis VKB (on the 3, 6 and 12th days) or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB (on the 3rd day) as compared with the infected mice. However, the composition L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL - B. animalis VKB increased the number of bacteria on the 9th day and L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB – on the 1 and 6th days.

There was the increase in the number of fungi in the vagina of the infected mice under the infl uence of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 during the observation period as compared with the infected mice that did not receive probiotic strains and the control group (intact mice). The composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279 induced the reduction of the number of fungi on the 1, 9 and 12th days, and L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL - B. animalis VKB – on the 1, 6 and 9th days. The number of fungi also increased on the 3rd day after the infected mice were injected with L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279 or L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL - B. animalis VKB.

The number of fungi in the vagina of the infected mice decreased under the infl uence of these two compositions on the 1 and 6th days, respectively, in comparison with the control group. In the vagina of infected mice treated with the composition L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 the number of fungi and coliform bacteria increased as compared with a group of infected animals not treated with probiotic cultures.


The results of the comparative analysis of the effectiveness of compositions of three or four probiotic strains that we studied showed that the antistaphylococcal activity during the observation period was observed in four compositions of the three strains: L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279, L. acidophilus IMV B-7279- B. animalis VKL - B. animalis VKB, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 and L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB. However, the number of streptococci and fungi in the vagina of the infected mice aws reduced more effectively by the compositions L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279. The number of coliform bacteria was effectively reduced under the infl uence of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279.

Thus, the obtained data shows that L. casei IMV B-7280, L. acidophilus IMV B-7279, B. animalis VKL and B. animalis VKB in various compositions of two, three or four strains had an impact on the number of pathogenic bacteria in the vagina of staphylococcus infected mice. It should be noted that after the injection of probiotic cultures in different compositions the number of lactobacilli in the vagina increased. All the compositions of probiotic bacteria induced the reducing of the number of staphylococci in the vagina. The number of streptococci decreased effectively under the infl uence of the composition L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL. The number of fungi was effectively reduced in the infected mice vagina under the infl uence of the compositions L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279. The number of coliform bacteria was effectively reduced under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279 - B. animalis VKL, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279 or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB - L. acidophilus IMV B-7279.

When testing compositions of two strains in vivo [10], the L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL composition was the most effective on the model of intravaginal staphylococcus infection in mice. This composition appeared to be a more active antagonist of staphylococci than L. casei IMV B-7280 or B. animalis VKL separately. The composition of three strains (L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB) also had high antistaphylococcal activity in vivo. The antistaphylococcal activity of the of L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB composition on the 3, 6, and 9th days appeared to be higher than of all these monocultures used separately, and on the 12th day it was higher than that of B. animalis VKL. The antistaphylococcal activity of the two-strain compositions (L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB), was the same as that of the L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB composition on the 3 and 6th days. However, on the 9th day S. aureus 8325-4 was still recovered from the vagina after the injection of the L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL or L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKB compositions, but was completely eliminated from the vagina of mice treated with the L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB composition. L. casei IMV B-7280, B. animalis VKL and B. animalis VKB, which were part of this composition, had high adhesive activity in respect of epithelial cells (unpublished data), and B. animalis VKB and L. casei IMV B-7280 demonstrated the best antistaphylococcal activity when injected into mice separately in comparison with the other studied strains of bacteria. It should be noted that after the injection of a composition of four strains into the infected mice, S. aureus 8325-4 was recovered from the vagina of mice in larger amounts than after the injection of some probiotic cultures or their compositions.

We have not investigated the mechanisms of lacto- and bifi dobacteria infl uence on the vaginal microfl ora. However, the literature data showed some mechanisms of antimicrobial action of lactic acid bacteria. So, it is considered that [8] the main mechanism of probiotics action against urogenital infections is the production of biosurfactants and collagen-binding proteins, which leads to suppression of the pathogenic bacteria adhesion, that was shown for the following pathogens: E. coli 67, E. coli Hu734, E. faecalis 1131, E. faecalis 1396, P. mirabilis 28cii, P. aeruginosa AK1, S. epidermidis 3059, K. pneumoniae 3a [3], as well as for some fungi. As it was established earlier [3, 8] L. acidophilus or L. rhamnosus GR-1 and L. fermentum RC-14 for 2 months led to the recovery from the bacterial vaginosis or to reduction of the incidence of the bacterial vaginosis recurrences and / or [11, 15] to increase of the number of lactobacilli in the vagina and restoring of the normal microfl ora of the vagina signifi cantly more often in comparison with the group which was not treated or treated with placebo. The positive impact on the microfl ora of the urogenital tract and the ability to


prevent the development of bacterial vaginosis by reducing the number of pathogens has been shown for the strain Lactobacillus crispatus CTV-05 [11].

Since the protective mechanisms could include not only inhibition of growth and adhesion of pathogens, but also immune modulation, in our recent studies we have investigated the immunomodulatory properties of probiotic strains of L. casei ІMV B-7280, L. acidophilus ІMV B-7279, B. animalis VKB and B. animalis VKL. It was established that the phagocytic cells were activated and the parameters of cellular immune response normalized under their infl uence [10, 16].The production of interferons [10] and other Th1-type cytokines also increased (unpublished data).

Thus, the strains L. casei IMV B-7280, L. acidophilus IMV B-7279, B. animalis VKB and B. animalis VKL in various compositions are all promising for the development of probiotic drugs with antistaphylococcal activity and for correction of the urogenital tract microfl ora, but the most successful compositions are B. animalis VKB - B. animalis VKL, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - L. acidophilus IMV B-7279, L. casei IMV B-7280 - B. animalis VKL - B. animalis VKB, that caused not only S. aureus elimination, but also normalization of the vaginal microfl ora. It should be noted that for the fi nal selection of the most effective composition of probiotic microorganisms it is important to give attention not only to the effects of probiotic strains on the microfl ora, but also to their immunomodulatory properties.

Л.П. Бабенко1, Л.М. Лазаренко1, Л.М. Шинкаренко1,2, В.В. Мокрозуб1, В.С. Підгорський, М.Я. Співак1

1Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, вул. Академіка Заболотного, 154, Київ, МСП, Д03680, Україна

2ТОВ «Pure Research Products», м. Боулдер, штат Колорадо, США

ВПЛИВ КОМПОЗИЦІЙ ЛАКТО- ТА БІФІДОБАКТЕРІЙ НА СПЕКТР ВАГІНАЛЬНОЇ МІКРОФЛОРИ ПРИ ІНТРАВАГІНАЛЬНІЙ

СТАФІЛОКОКОВІЙ ІНФЕКЦІЇ

Р е з ю м еВизначено вплив інтравагінального введення штамів Lactobacillus casei IMV В-7280, Lactobacillus

acidophilus IMV В-7279, Bifi dobacterium animalis VKL та Bifi dobacterium animalis VKB у складі різних композицій на спектр мікрофлори урогенітального тракту на моделі експериментальної інтравагінальної стафілококової інфекції у мишей. Встановлено, що під впливом різних композицій цих штамів відбува-лася зміна спектру мікрофлори, збільшення кількості представників нормофлори та суттєво знижувалась кількість умовно-патогенних мікроорганізмів, зокрема стафілококів, стрептококів, бактерій групи киш-кової палички та грибів. Визначено, що штами лакто- та біфідобактерій, які досліджувались, є перспек-тивними для створення пробіотичних препаратів, ефективних при лікуванні інтравагінальної стафілоко-кової інфекції.

К л ю ч о в і с л о в а: Lactobacillus, Bifi dobacterium, Staphylococcus, піхва, мікрофлора, миші

Л.П. Бабенко1, Л.Н. Лазаренко1, Л.Н. Шинкаренко1,2, В.В. Мокрозуб1, В.С. Подгорский, Н.Я. Спивак1

1Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, ул. Академика Заболотного, 154, Киев, МСП, Д03680, Украина

2ООО «Pure Research Products», г. Боулдер, штат Колорадо, США

ВЛИЯНИЕ КОМПОЗИЦИЙ ЛАКТО- И БИФИДОБАКТЕРИЙ НА СПЕКТР ВАГИНАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ ПРИ ИНТРАВАГИНАЛЬНОЙ

СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

Р е з ю м еОпределено влияние интравагинального введения штаммов Lactobacillus casei IMV В-7280, Lacto-

bacillus acidophilus IMV В-7279, Bifi dobacterium animalis VKL и Bifi dobacterium animalis VKB в составе различных композиций на спектр микрофлоры урогенитального тракта на модели экспериментальной интравагинальной стафилококковой инфекции у мышей. Установлено, что под влиянием различных композиций этих штаммов происходило изменение спектра микрофлоры, увеличение количества пред-ставителей нормофлоры и существенно снижалась количество условно-патогенных микроорганизмов,


в частности стафилококков, стрептококков, бактерий группы кишечной палочки и грибов. Определено, что штаммы лакто- и бифидобактерий, которые исследовались, являются перспективными для создания пробиотических препаратов, эффективных при лечении интравагинальной стафилококковой инфекции.

К л ю ч е в ы е с л о в а: Lactobacillus, Bifi dobacterium, Staphylococcus, вагина, микрофлора, мыши

1. Boris S., Suarez J.E., Vazquez F., Barbes C. Adherence of human vaginal lactobacilli to vaginal epithelial cells and interaction with uropathogens // Infect. Immun. – 1998. – 66, N 3. – P. 1985–1989.

2. Cadieux P., Burton J.G., Gardiner I., et al. Lactobacillus strains and vaginal ecology// JAMA. – 2002. – 28, N 7. – P. 1940–1941.

3. Delia A., Morgante G., Rago G., et al. Effectiveness of oral administration of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei F19 in association with vaginal suppositories of Lactobacillus acidophilus in the treatment of vaginosis and in the prevention of recurrent vaginitis // Minerva Ginecol. – 2006. – 58, N 3. – P. 227–231.

4. Drago L., De Vecchi E., Nicola L., et al. Activity of a Lactobacillus acidophilus-based douche for the treatment of bacterial vaginosis // J. Altern. Complement Med. – 2007. – 13, N 4. – P. 435–438.

5. Eschenbach D.A., Thwin S.S., Patton D.L., et al. Infl uence of the normal menstrual cycle on vaginal tissue, discharge, and microfl ora // Clin Infect Dis. – 2000. – 30, N 6. – P. 901–907.

6. Falagas M.E., Betsi G.I., Athanasiou S. Probiotics for the treatment of women with bacterial vaginosis // Clin. Microbiol. Infect. – 2007. – 13, N 7. – P. 657–664.

7. Galask R.P. Vaginal colonization by bacteria and yeast // Amer. J. Obstet. Gynecol. – 1988. – 158, N 4. – P. 993–995.

8. Hillier S.L., Krohn M.A., Rabe L.K., Klebanoff S.J., Eschenbach D.A. The normal vaginal fl ora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women // Clin. Infect. Dis. – 1993. – 16, Suppl 4. – P. 273–281.

9. Hoesl C.E., Altwein J.E. The probiotic approach: an alternative treatment option in urology // Eur. Urol. – 2005. – 47, N 3. – P. 288–296.

10. Lazarenko L., Babenko L., Shynkarenko-Sichel L., Pidgorskyi V., Mokrozub V. Voronkova O., Spivak M. Antagonistic action of Lactobacilli and Bifi dobacteria in relation to Staphylococcus aureus and their infl uence on the immune response in cases of intravaginal staphylococcosis in mice // Probiotics & Antimicro. Prot. –2012. – 84, N 3.

11. Mclean N., Rosenstein I.J. Characterisation and selection of a Lactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrent bacterial vaginosis // J. Med. Microbiol. –2000. – 49, N 3. – P. 543–552.

12. Reid G., Bocking A. The potential for probiotics to prevent bacterial vaginosis and preterm labor // Amer. J. Obstet. Gynecol. – 2003. – 189, N 4. – P. 1202–1208.

13. Spivak M.Ya., Pidgorsky V.S., Lazarenko L.M., Shynkarenko L.M., Rachkova L.T., Olevinska Z.M. Lactobacillus and Bifi dobacterium infl uence on the indices of immune infl uence on the indices of immune response of the organism showed on experimental model // Microbiol. Biotechnol. – 2009. – 22, N 5. – P. 39–46.

14. Voronkova O.S., Sirokvasha E.A., Vinnikov A.I. Experimental vaginal dysbiosis on the model of white laboratory mice // Mikrobiol. Zhurn. – 2008. – 70, N 6. – P. 47–58

15. Zárate G., Nader-Macias M.E. Infl uence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells // Lett. Appl. Microbiol. – 2006. – 43, N 2. – P. 174–180.

16. Zárate G., Santos V., Nader-Macias M.E. Protective effect of vaginal Lactobacillus paracasei CRL 1289 against urogenital infection produced by Staphylococcus aureus in a mouse animal model // Infect. Dis. Obstet. Gynecol. – 2007. – 31, N 4. – P. 483–485.



УДК: 573.864.1:615.331

V.V.Mokrozub1, L.M. Lazarenko 1, L.P. Babenko 1, L.M. Shynkarenko-Sichel 2, Z.M. Olevinska 1, N.O. Timoshok 1, V.S. Pidgorskyi1, M.Y. Spivak 1, 3

1 Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, 154, Acad. Zabolotny St., Kyiv, MSP, D03680, Ukraine

2Pure Research Products, LLC, 6107, Chelsea Manor Court, Boulder, Colorado, 80301, USA3 LCL «Diaprof», 35, Svetlickiy St., Kyiv, 04123, Ukraine

EFFECT OF PROBIOTIC STRAINS OF LACTO- AND BIFIDOBACTERIA ON THE ACTIVITY OF MACROPHAGES

AND OTHER PARAMETERS OF IMMUNITY IN CASES OF STAPHYLOCOCCOSIS

The immunomodulatory properties of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, Lactobacil-lus casei IMV В-7280, Lactobacillus acidophilus IMV В-7279, Bifi dobacterium animales VKL and B. animales VKB strains on the models of experimental staphylococcosis infection in mice were determined. It was found that after the mice, infected with staphylococcus, were treated by some probiotic strains of lacto- and bifi dobacteria, a normalization of functional activity of phagocytic cells system and increase of the endogenous interferon pro-duction were observed. L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, L. casei IMV В-7280, L. acidophilus IMV В-7279, B. animales VKB and B. animales VKL are promising for the development of probiotics, effective against staphylococci and for the immunity correction.

K e y w o r d s : Lactobacillus, Bifi dobacterium, Staphylococcus, immunity, macrophages, in-terferon, mice.

The rapid growth of widespread infectious diseases, provoked primarily by the aggressive opportunistic commensal microorganisms, including staphylococcus, creates a complex set of problems connected with the necessity of fi nding new treatments that provide a general therapy of pathogen and balancing the immune status of the organism on the level of receptor-ligand interactions. It is urgent to search for a new agonists for receptors that form the immune response in cases of certain pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) appearing in the body [1, 2].

It is known that some strains of probiotic bacteria have antibacterial properties against a wide range of pathogens, including causative agents of the most common infectious diseases. They can also act as adjuvants in the development of immune response in mucous membranes and at the system level [1, 3], activating the factors of innate and acquired immunity. At the same time there is a change in production of immunoregulatory cytokines after the interaction of their PAMPs with different types of Toll-like receptors (TLR-receptors) that are expressed on the surface of dendritic cells (DC), macrophages, intraepithelial T-lymphocytes, etc. [1]. Therefore, these strains are promising in creation of a highly effi cient probiotic – imunobiotic – to correct the immune system in cases of infl ammatory diseases.

It was previously shown that probiotic strains of lacto- and bifi dobacteria: Lactobacillus casei IMV В-7280, L. acidophilus IMV В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, Bifi dobacterium animales VKL and B. animales VKB, isolated from human biological material, suppressed the persistence of staphylococcus in the kidneys of the infected Balb/c line mice and normalized indicators of cellular immunity [4]. However, for complete understanding the mechanisms of protective action of these probiotic strains against staphylococcus it was necessary to examine their impact on the factors of innate immunity and the production of cytokines, which play an important role in defense against bacterial infection.

So, the aim of the work was to determine the immunomodulatory activity of L. casei IMV В-7280, L. acidophilus IMV В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, B. animales VKL and B. animales VKB on the model of experimental staphylococcosis in mice by examining their impact on functional activity of macrophages, the number of natural killer cells and interferon production.

Materials and Methods. Experimental studies were performed on six-week-old female BALB/c mice from the vivarium of the Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine. All studies were performed taking into account the rules of the European Convention for the protection of vertebrate animals (09.20.1985) and the Law of Ukraine № 3447-IV “About the protection of animals from cruelty” [5].© V.V.Mokrozub, L.M. Lazarenko, L.P. Babenko, L.M. Shynkarenko-Sichel, Z.M. Olevinska, N.O. Timoshok, V.S. Pidgorskyi, M.Ya. Spivak, 2012


The study was performed using lyophilized bacteria L. acidophilus IMV В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, L. casei IMV В-7280, B. animales VKL and B. animales VKB. Before each experiment the viability of the probiotic cultures was tested by monitoring their growth on the Man-Rogosa-Sharpe (MRS) agar medium at 37 °C for 24-48 h.

Staphylococcosis was modeled through intraperitoneal administration of the S. aureus 8325-4 daily culture to mice, in a dose of 1 x 109 cells per animal. S. aureus 8325-4 was kindly provided to us by Professor V.S. Zuyeva, N.F. (Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology, Russian Federation) and had plasmid-based resistance to gentamicin. The following clinical manifestations of the infection process were observed in the infected mice: elevation of body temperature, loss of inactivity and appetite.

Twenty-four hours after infection, mice were given a per os administration of a suspension of lyophilized lactobacillus and/or bifi dobacteria cells in saline solution at a dose of 1 х 106 cells per animal, once a day for 7 days. Strains were injected individually or in the composition L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 - L. acidophilus IMV B-7279 (in equal proportion). A separate group was formed by the infected mice that did not receive these strains or their composition, but received the saline intraperitoneally. The control group included intact mice. Experimental studies were conducted in three repetitions.

On the 1, 3, 6, 9 and 12th day after the injection of lactobacillus and/or bifi dobacteria strains, alone or in composition, into the infected mice, peritoneal fl uid, spleen and peripheral blood were taken from the test mice under anesthetic.

The functional activity of peritoneal macrophages (PM) – their ability to accumulate oxygen metabolites in the nitroblue tetrazolium recovery test (NBT-test) and the absorption of latex was studied. Absorptional activity was evaluated in terms of phagocytosis rate (PR) – the number of PM, that are able to absorb latex, and phagocytosis number (PN) – the average number of particles of latex, which were absorbed by PM [6].

The concentration of interferon (IFN) in the blood serum was determined by microtiter method in the culture of sensitive cells L-929. The results accounting was conducted by microscopy under the inverted microscope. Interferon activity was evaluated by inhibition of cytopathic vesicular stomati-tis virus (VSV). The titer of interferon was that sample dilution in which 50 % protection from cyto-pathic action of VSV cells monolayer was observed. Reference α-interferon control (α-international standard B 69/19) with known activity was used at each titration [6].

Surface antigens of natural killer cells (NKC) were investigated with the help of the direct immunofl uorescence method. Monoclonal antibodies against NK-antigens (MACS, Miltenyi Biotec, Germany) were used in the work. Calculation of NKC as well as analysis of the results was performed on a FACStar Plus cytofl uorometer (Becton-Dickinson, USA).

All digital data obtained were processed with the help of the Origin Pro 8.5. software through analysis of variance. Numerical data were represented as arithmetic average and standard error (M ± m). The null hypothesis for the control and experimental comparative groups was checked us-ing Wilcoxon-Mann-Whitney (U) and Kolmogorov-Smirnov nonparametric criteria. The differences between the groups were considered statistically meaningful at P < 0.05.

Results and Discussion. It was found that more rapid elimination of staphylococcus from the kidneys of the infected mice under the infl uence of L. acidophilus IMV В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, L. casei IMV В-7280, B. animales VKL or B. animales VKB, each strain taken separately, or composition L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281 - L. acidophilus IMV В-7279, as it was shown by us earlier [4], accompanied with the changes of innate immunity, includ-ing functional activity of PM (Table 1). It should be noted that the mice infected with staphylococcus had a partial violation of the phagocytic activity, which coincided with our previously obtained data [7]. In this study we observed a decrease in a PR of PM on the 2, 4 and 10th days after staphylococ-cus was administered to the mice, whereas their PN during the whole period of observation had no differences with the control group.

As it is clear from the data presented in Table 1, different probiotic strains of lactic acid bacteria have different effect on the functional activity of PM. So, an increase of PR of PM of the infected mice was detected under the infl uence of B. animales VKL or L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, each strain taken separately, on the 1, 3 and 9th days as compared with the infected mice that did not receive probiotic strains. After per os administration of L. acidophilus IMV B-7279 (on the


3rd day) or L. casei IMV B-7280 (on the 3 and 6th days), each strain taken separately, to the infected mice PR was the same as in the mice that received no probiotic culture, but on the 9th day it increased. Instead, B. animales VKB activated PR of the PM of the infected mice only on the 1 and 6th days. Af-ter administration of the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 to the infected mice PR of the PM increased on the 1, 3 and 9th days.

Table 1

Changes of functional activity of the PM after an oral administration probiotic strains f lacto- and bifi dobacteria to the staphylococcus infected mice, M ± m

Groups of miceTime of observa-tion, day

Rate of phagocyto-

sis, %

Phagocytic number, standard

unit

Stimulated NBT-test, %

Spontaneous NBT-test, %

Functional reserve,

standard unit

Intact mice - 70.0 ± 3.2 • 2.1 ± 0.3 17.0 ± 2.5 11.0 ± 2.6 6.0 ± 1.1

Mice infected with S. aureus 8325-4

1 24.0 ± 2.7 * 1.7 ± 0.2 68.0 ± 3.8 * 56.0 ± 3.8 * 12.0 ± 2.5 *

3 50.0 ± 2.9 * 2.2 ± 0.2 44.5 ± 4.2 * 40.2 ± 3.6 * 4.4 ± 1.7

6 82.9 ± 2.4 * 2.5 ± 0.3 38.9 ± 3.3 * 35.0 ± 4.8 * 3.9 ± 2.0

9 50.0 ± 3.1 * 2.4 ± 0.1 50.0 ± 2.4 * 21.7 ± 4.1 * 28.3 ± 3.1 *

Infected mice, that received B. animales VKL

1 72.0 ± 1.9 • 2.3 ± 0.1 • 46.3 ± 5.3 * • 36.0 ± 4.7 * • 10.3 ± 2.6

3 62.7 ± 2.6 • 1.8 ± 0.3 36.4 ± 3.4 * 25.5 ± 2.8 * • 10.9 ± 2.1 •

6 87.1 ± 3.1 * 2.5 ± 0.3 30.3 ± 2.1 * • 25.8 ± 3.9 * 4.6 ± 2.0

9 68.0 ± 2.8 • 2.9 ± 0.2• 35.0 ± 3.4 * • 25.0 ± 5.1 * 10.0 ± 2.6 •

Infected mice, that received L. acidophilus IMV В-7279

1 36.1 ± 2.6 *• 2.3 ± 0.1 • 35.2 ± 3.8 * • 30.2 ± 4.3 * • 5.0 ± 1.1 •

3 44.0 ± 3.0 * 2.2 ± 0.2 30.0 ± 3.5 * • 20.0 ±2.9 * • 10.0 ± 1.8 * •

6 50.0 ± 3.7 *• 2.1 ± 0.2 30.0 ± 2.8 * 14.0 ± 4.8 • 16.0 ± 1.7 * •

9 70.0 ± 2.4 • 2.6 ± 0.1 48.0 ± 5.1 * 29.0 ± 5.6 * 19.0 ± 3.1 * •

Infected mice, that received L. casei IMV В-7280

1 48.0 ± 3.2 *• 1.9 ± 0.2 50.0 ± 4.1 * • 32.0 ± 2.5 * • 18.0 ± 2.4 * •

3 45.5 ± 2.2 * 2.1 ± 0.3 34.0 ± 3.4 * 30.0 ± 3.9 * • 4.0 ± 1.0

6 83.8 ± 3.3 * 3.5 ± 0.3 * • 33.8 ± 3.6 * 31.7 ± 4.2 * 2.2 ± 1.2 *

9 70.0 ± 3.7 • 2.3 ± 0.1 42.0 ± 4.7 * 31.0 ± 3.8 * • 11.0 ± 1.8 * •

Infected mice,that received B. animales VKB

1 74.0 ± 2.6 • 2.5 ± 0.2 • 40.0 ± 4.0 * • 36.0 ± 3.7 * • 4.0 ± 1.6 •

3 52.0 ± 3.2 * 2.8 ± 0.1• 33.9 ± 2.4 * • 32.3 ± 3.4 * 1.6 ± 1.0 *

6 59.0 ± 7.8 • 3.5 ± 0.2 * • 22.0 ± 1.8 * • 20.3 ± 2.6 * • 1.7 ± 1.2 *

9 54.0 ± 1.9 * 2.0 ± 0.1 40.0 ± 4.3 * • 34.0 ± 3.8 * • 6.0 ± 1.6 •

Infected mice, that received L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281

1 74.0 ± 2.4 • 2.8 ± 0.3 • 40.0 ± 4.9 * • 20.0 ± 5.6 * • 20.0 ± 2.4 * •

3 62.0 ± 1.9 • 3.3 ± 0.4 * • 43.1 ± 3.3 * 23.1 ± 3.1 * • 20.1 ± 1.7 * •

6 85.0 ± 3.4 * 1.9 ± 0.2 27.5 ± 2.4 * • 25.4 ± 3.1 * • 2.2 ± 0.9 *

9 61.7 ± 3.9 • 2.5 ± 0.3 34.0 ± 3.5 * • 16.0 ± 5.1 * • 8.0 ± 1.4 •

Infected mice, that re-ceived L. acidophilus IMV В-7279 - L. del-brueckii subsp. bulga-ricus IMV В-7281

1 79.0 ± 2.6 • 2.3 ± 0.3 38.8 ± 3.5 * • 28.3 ± 2.3 * • 10.4 ± 3.1 *

3 64.0 ± 2.4 • 2.6 ± 0.2 30.0 ± 1.9 * • 21.7 ± 2.9 * • 8.3 ± 2.3

6 76.5 ± 3.4 2.6 ± 0.3 28.0 ± 2.6 * • 20.4 ± 4.8 * • 7.6 ± 1.6

9 64.0 ± 3.1 • 2.5 ± 0.1 35.0 ± 3.4 * • 12.5 ± 3.4 • 22.5 ± 3.3 *

Signifi cant differences with the control are represented by * (P < 0.05) while differences with the indicators of the infected mice who did not receive probiotic strains or their composition are represented by • (P < 0.05).

Some of these probiotic strains of lactic acid bacteria enhanced the intensity of the phagocytic function of PM of the staphylococcus infected mice. In particular, we found the increasing of PN un-der the infl uence of L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 (on the 1 and 3rd days), B. animales VKB (on the 1, 3 and 6th days), B. animales VKL (on the 1 and 9th days), L. casei IMV B-7280 (on the 6th day), L. acidophilus IMV B-7279 (on the 1st day), each strain taken separately, as compared with the infected mice that did not receive probiotic cultures. After the injection of the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 to the infected mice, this indicator did not change during the entire period of observation.


When analyzing the obtained data, we can make a conclusion that only B. animales VKL and L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, each strain taken separately, and the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 completely normalized PR of the PM, affected by staphylococcal infection. However, B. animales VKL, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, B. animales VKB or L. casei IMV B-7280 activated the intensity of their phagocytic function in different periods of observation.

A signifi cant increase of the PM ability to accumulate oxygen metabolites indicates the dysfunc-tion of phagocytes under the infl uence of staphylococcosis. The activation of oxygen-dependent me-tabolism of PM (in spontaneous and stimulated NBT-test) was detected during the period of observa-tion. It should be noted that the inverse correlation between PR and indices of spontaneous NBT-test (R = 0.92; P < 0.05) was found. Therefore it is possible to suppose that the decrease in phagocytic activity of PM from the mice with staphylococcosis, at least for PR, is due in part to the excessive accumulation of these oxygen metabolites. The latter, as known [8], may damage phagocytes and in-fl uence the genetic apparatus of bacteria, causing, in particular, the emergence of strains with multiple resistances to antibiotics.

It was established a lowering of spontaneous NBT-test indicators of the PM from mice with staphylococcosis under the infl uence of L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 or composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 during the entire period of observation as compared with the infected mice that did not receive probiotic strains. The number of NBT-positive PM in spontaneous test also decreased after administration to the infected mice of L. acidophilus IMV B-7279 – on the 1, 3 and 6th days; L. casei IMV B-7280 – on the 1, 3 and 9th days; B. animales VKB – on the 1, 6 and 9th days; B. animales VKL – on the 1 and 3rd days.

The indicators of stimulated NBT-test of staphylococcus infected mice PM were decreasing dur-ing the entire period of observation under the infl uence of B. animales VKB or the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281. Other probiotic strains also cause the reduction of NBT-positive PM in a simulated test – B. animales VKL or L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, each strain taken separately, – on the 1, 6 and 9th days; L. acidophilus IMV B-7279 – on the 1 and 3rd days; L. casei IMV B-7280 – on the 1st day.

The oxygen-dependent bactericidal activity of PM (defi ned in NBT-test) of staphylococcus infect-ed mice treated with these probiotic cultures of lactic acid bacteria or their composition, in most cases remained higher than in control (intact mice). Normalization of spontaneous NBT-test indicators was observed only under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279 on the 6th day or the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 – on the 9th day.

Staphylococcosis does not result in violation of functional reserve of PM. In contrast, this in-dicator was higher than in the control on the 2 and 10th days. Functional reserve of macrophages increased in relation to the infected mice which did not receive probiotic cultures, under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279 on the 3, 6 and 9th days, L. casei IMV B-7280 – on the 1, 6 and 9th days, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 – on the 1, 3 and 6th days, and the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 – on the 1 and 9th days. Functional reserve decreased to the control level on the 1st day under the infl uence of B. animales VKL, L. acidophilus IMV B-7279 and B. animales VKB, on the 9th day – under the infl uence of all probiotic bacteria (separately).

The obtained data (Figure) indicate that staphylococcosis causes a reduction of NKC in the ex-perimental animals for long periods (from 1st to 6th day). The injection of probiotic strains of lactic acid bacteria alone or in composition to the staphylococcus infected mice resulted in changes of NKC number in the spleen. Thus, an oral administration of B. animales VKB to the animals with staphy-lococcosis resulted in the increase of NKC in the spleen during the entire period of observation as compared with the indicators of staphylococcus infected animals that did not receive probiotic strains. The number of NKC also increased after the per os administration of L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 on the 1, 6 and 9th days; L. casei IMV B-7280 – on the 1, 3 and 9th days; L. acidophilus IMV B-7279 – on the 1st day; B. animales VKL – on the 3rd day. After the injection of the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 to the infected animals, the number of NKC remained at the level of intact animals on the 1, 3 and 6th days. Thus, only the composition of two probiotic strains – L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 or B. animales VKB alone for the whole period of observation increased the number of NKC to the level of control group (intact animals).


5

10

15

20

25

1 day 3 day 6 day 9 day

Rel

ativ

e nu

mbe

r of N

KC

, %Intact mice

Infected mice

Infected mice,thatreceived B. longumVK1

Infected mice, thatreceived B. bifidumVK2

5

10

15

20

25

1 day 3 day 6 day 9 day

Rel

ativ

e nu

mbe

r of N

KC

, %

Intact mice

Infected mice

Infected mice, thatreceived L. acidophilusIMV -7279

Infected mice, thatreceived L. casei IMV -7280

Infected mice, thatreceived L. delbrueckiisubsp. bulgaricus IMV -7281

Infected mice, thatreceived L. delbrueckiisubsp. bulgaricus IMV -7281 - L. acidophilus IMV

-7279

Fig.1. The number of NKC in the spleen of infected mice that received probiotic cultures

Probiotic strains had a considerable effect on the endogenous IFN production, which is known [9] to have a wide range of immunomodulatory actions and play an important physiological role, because it is necessary for the maturation of some immune cells, such as dendritic cells, and control their cellular proliferation on the intestinal level.

The titers of serum IFN, which decrease was observed on the 3th day after the mice were infected with staphylococcus, substantially increased under the infl uence of B. animales VKL, L. casei IMV B-7280, B. animales VKB, each strain taken separately – on the 1, 3 and 9th days; L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 – on the 1 and 3th days; L. acidophilus IMV B-7279 – only on the 3th day in comparison with the rates of the infected mice that did not receive probiotic bacteria (Table 2). After the mice, infected with staphylococcus, received the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, the concentration of IFN in the blood serum increased on the 1 and 9th days. These data suggest that the injection of probiotic strains to staphylococcus infected mice at different times of observation led to the activation of IFN production. L. casei IMV B-7280, B. animales VKB, or L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 and a composition of two probiotic bacteria caused an activation of interferon genesis on the 1st day. All strains of lacto- and bifi dobacteria, which were studied, and the composition raise the concentration of IFN in the blood serum on the 3rd day to the level of control as compared with the infected mice that did not receive these probiotic strains.


Table 2

Interferon titers in blood serum under the infl uence of lacto- and bifi dobacteria in cases of staphylococcosis in mice

Group of miceInterferon titers (log2) /the day of the

experiment after injection of probiotic strains1 day 3 day 6 day 9 day

Intact mice (control) 5.3 ± 0.4 5.3 ± 0.4• 5.3 ± 0,4 5.3 ± 0,4

Mice infected with S. aureus 8325-4 4.3 ± 0.4 2.6 ± 0.4* 4.3 ± 0.4 7.3 ± 0.4

Infected mice, that received B. animales VKL 7.3 ± 0.4* 7.0 ± 0.0*• 5.0 ± 0.0 9.0 ± 0.0*•

Infected mice, that received L. acidophilus IMV В-7279 5.0 ± 0.6 8.3 ± 0.4*• 5.3 ± 0.4 8.0 ± 0.6*

Infected mice, that received L. casei IMV В-7280 8.3 ± 0.4*• 7.7 ± 0.4*• 4.7 ± 0.4 4.7 ± 0.4•

Infected mice, that received B. animales VKB 5.7 ± 0.4• 4.0 ± 0.0*• 4.7 ± 0.4 5.0 ± 0.0•Infected mice, that received L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281 6.7 ± 0.4*• 4.3 ± 0.4*• 4.3 ± 0.4 4.3 ± 0.4•

Infected mice, that received L. acidophilus IMV В-7279 – L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281 7.3 ± 0.4*• 4.3 ± 0.4*• 5.3 ± 0.4 4.7 ± 0.4•

Signifi cant differences with the control are represented by * (P < 0.05) while differences with the indicators of the infected mice who did not receive probiotic strains or their composition are represented by • (P < 0.05).

Thus it was found that L. casei IMV B-7280, L. acidophilus IMV B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, B. animales VKL and B. animales VKB strains and the composition L. aci-dophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 on the model of experimental staphylococcosis in mice had immunomodulatory action pointed to the induction of endogenous interferongenesis, increasing the number of NKC and activation of PM in different periods of obser-vation. We can assume that these probiotic strains after interaction with immune and epithelial cells of intestinal mucosa of mice infected with staphylococcus activate them and cause the increased pro-duction of a number of immunoregulatory cytokines, including IFN. This leads to changes of body immunoreactivity on the local and systemic levels. Presumably, the changes of the PM functional activity after the probiotic strains injection is a consequence of the increasing IFN production, as phagocytes are known [7, 9] to be the main target of these cytokines.

After the injection of probiotic bacteria to the staphylococcus infected mice an increase of IFN production with intensifi cation of absorption activity of PM and a decline in their ability to accu-mulate oxygen metabolites were observed. So, L. casei IMV B-7280, L. acidophilus IMV B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, B. animales VKL and B. animales VKB had an im-munomodulatory and antioxidant effects on mice with staphylococcosis. Under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279 and L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, each strain taken separately, or the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, the functional reserve of PM increased. This points not only to the increase of the reserve capacity of phagocytosis, but also to the immunity reserve at all. Presumably, therefore these two probiotic strains and their composition effectively suppressed Staphylococcus persistence in the kid-neys of infected mice as determined by us earlier [4]. It should be noted that L. casei IMV B-7280 and L. acidophilus IMV B-7279 also had the antistaphylococcal and immunomodulatory effect on the intravaginal staphylococcosis of mice, as was shown by us recently [10].

According to results, the effect of L. bulgaricus CRL 423 [11] and L. bulgaricus LB51 [12] strains on the phagocytic activity of macrophages is similar. Such strains as L. delbrueckii UFV-H2b20 [13], L. fermentum AF7, L. acidophilus GG5, and L. plantarum BB9 [14], L. plantarum YU [15], L. casei Shirota [16, 17], L. paracasei KB28 [18] activate different aspects of the functional activity of macrophages in vitro and in vivo. However, L. casei 3260, on the contrary, inhibits the production of TNF and prostaglandin E2 in macrophage Raw 264.7 cells [19]. Some strains of bifi -dobacteria – B. longum [20], B. longum BCRC 14634 [21], B. adolescentis BBMN23 and B. longum BBMN68 showed the ability to activate the phagocytic system cells [22].

We have not determined the mechanisms of lactic acid bacteria action on macrophages. How-ever, it was recently shown that macrophages in vivo and in vitro become activated by live and heat-, acid- or trypsin-killed Lactobacteria, but not by ultrasound-killed Lactobacteria [14]. So, the cell wall components of lactobacilli (polysaccharides [16], lipoteichoic acid [23] and exopolysaccharide


[18]) are critical in the activation of phagocytes. Immunomodulatory properties of bifi dobacteria are associated with the presence of unmethylated CpG sequences in DNA [24, 25], as well as peptido-glycan [26].

Because of the macrophages activation, the probiotic strains of lactic acid bacteria can infl uence the development of congenital and acquired immunity [27]. Previously we have shown that the injec-tion of these probiotic strains of lacto- and bifi dobacteria to the staphylococcus infected mice resulted in changes of the acquired immunity parameters. In particular, under the infl uence of L. acidophilus IMV B-7279, L. casei IMV B-7280, B. animales VKB alone or the in composition L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 - L. acidophilus IMV B-7279 immunoregulatory index CD4/CD8 became normal as compared with the infected mice that did not receive probiotic cultures. B. ani-males VKL, L. acidophilus IMV B-7279, B. animales VKB, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 alone, or the composition L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 - L. acidophilus IMV B-7279 induced the increase of CD19

+ B-lymphocytes number in spleen in different periods of ob-servation. However, B. animales VKB, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, and the com-position L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 - L. acidophilus IMV B-7279 (on the 6 and 9th days) increased the number of CD25

+ cells in the spleen of infected mice. It should be noted that this composition had a wider range of immunomodulatory actions in cases of experimental staphy-lococcosis, since under its infl uence in different periods of observation the activity of PM and their phagocytic reserve increased, endogenous interferongenesis activated, and immunoregulatory index CD4/CD8 became normal (because of the increasing of CD4

+ cells number)[4]. The number of CD19+

B-lymphocytes and CD25+ cells also increased.

In this study was have found that the infected mice after the injection of lacto- or bifi dobacteria probiotic strains alone or in composition increased the number of NKC in the spleen. Some other strains of lacto- and bifi dobacteria (L. casei Shirota, L. rhamnosus GG, L. plantarum NCIMB 8826, L. reuteri NCIMB 11951, B. longum SP 07/3 or B. bifi dum MF 20/5) [28] also induce the increase of the number of NKC and activate them. So, the immunomodulatory properties of different cultures of lacto- and bifi dobacteria are their individual characteristics that should be considered during the development of probiotics for treatment and prevention of infectious diseases.

Thus, when analyzing the obtained data, we can conclude that L. casei IMV B-7280, L. acidophi-lus IMV B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, B. animales VKL, B. animales VKB and the composition L. acidophilus IMV B-7279 - L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 after per os injection to the mice infected with staphylococcus changed the indicators of body im-munoreactivity at the system level. Thus, the activation of PM, higher production of interferon and increase of the number of NKC, is an important protective mechanism of probiotic bacteria action in cases of experimental staphylococcosis in mice. So these probiotic strains and their composition can be used to create a highly-effective immunobiotic, able to inhibit the persistence of Staphylococcus and infl uence the development of the immune response to the pathogen, but more additional studies are needed.

Conclusions. Probiotic bacteria L. casei IMV В-7280, L. acidophilus IMV В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, B. animales VKL, B. animales VKB each strain taken separately, and the composition L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 - L. acidophilus IMV B-7279 in different periods of observation increased an absorptional activity of PM of staphylococcus infected mice and reduced their ability to accumulate oxygen metabolites. L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 and the composition L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 - L. acidophilus IMV B-7279 increased the reserve capacity of phagocytes.

The number of NKC in the spleen of staphylococcus infected mice and the production of interferon, that is confi rmed by the high titers of this cytokine in serum, increased in different periods of observation under the infl uence of L. casei IMV B-7280, L. acidophilus IMV B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, B. animales VKL, B. animales VKB, each strain taken separately, and the composition L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281 - L. acidophilus IMV B-7279.

Probiotic strains L. casei IMV B-7280, L. acidophilus IMV B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, B. animales VKB and B. animales VKL are promising for the creation on their basis of immunobiotic drugs with antistaphylococcal activity and for immunity correction by phagocytosis activation, increasing the number of NKC in the spleen and interferon titers in the blood serum, in cases of infectious-infl ammatory diseases.


Мокрозуб В.В. 1, Лазаренко Л.М. 1, Бабенко Л.П. 1, Шинкаренко-Сішел Л.М. 2, Олевінська З.М. 1, Тимошок Н.О. 1, Підгорський В.С. 1, Співак М.Я. 1

1Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ2Pure Research Products, LLC, 6107, Chelsea Manor Court, Boulder, Colorado, 80301, USA

ВПЛИВ ПРОБІОТИЧНИХ ШТАМІВ ЛАКТО- ТА БІФІДОБАКТЕРІЙ НА АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ ТА ІНШІ ПОКАЗНИКИ ІМУНІТЕТУ

ПРИ СТАФІЛОКОКОВІЙ ІНФЕКЦІЇ

Р е з ю м еВизначено імуномодулювальні властивості штамів Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMV

В-7281, Lactobacillus casei IMV В-7280, Lactobacillus acidophilus IMV В-7279, Bifi dobacterium animales VKL та Bifi dobacterium animales VKB на моделі експериментальної стафілококової інфекції у мишей. Встановлено, що після введення інфікованим стафілококом мишам окремих пробіотичних штамів лакто- та біфідобактерій спостерігали нормалізацію функціональної активності клітин фагоцитарної системи, а також підвищення продукції ендогенного інтерферону. Штами Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, Lactobacillus casei IMV В-7280, Lactobacillus acidophilus IMV В-7279, Bifi dobacterium animales VKB та Bifi dobacterium animales VKL є перспективними для створення пробіотичних препа-ратів, ефективних проти стафілококу, та для корекції імунітету.

К л ю ч о в і с л о в а: Lactobacillus, Bifi dobacterium, імунітет, макрофаги, інтерферон, стафілокок, миші

Мокрозуб В.В. 1, Лазаренко Л.Н. 1, Бабенко Л.П. 1, Шинкаренко-Сишел Л.Н. 2, Олевинская З.М. 1, Тимошок Н.О. 1, Подгорский В.С. 1, Спивак Н.Я. 1

1Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев2Pure Research Products, LLC, 6107, Chelsea Manor Court, Boulder, Colorado, USA

ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТО- И БИФИДОБАКТЕРИЙ НА АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ И ДРУГИЕ

ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА ПРИ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

Р е з ю м еОпределены иммуномодулирующие свойства штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

IMV В-7281, Lactobacillus casei IMV В-7280, Lactobacillus acidophilus IMV В-7279, Bifi dobacterium animales VKL и Bifi dobacterium animales VKB на модели экспериментальной стафилококковой инфекции у мышей. Установлено, что после введения инфицированным стафилококком мышам отдельных проби-отических штаммов лакто- и бифидобактерий наблюдали нормализацию функциональной активности клеток фагоцитарной системы, а также повышение продукции эндогенного интерферона и количес-тва природных киллеров в селезенке. Штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMV В-7281, Lactobacillus casei IMV В-7280, Lactobacillus acidophilus IMV В-7279, Bifi dobacterium animales VKB и Bifi dobacterium animales VKL являются перспективными для создания пробиотических препаратов, эф-фективных против стафилококка, и для коррекции иммунитета.

К л ю ч е в ы е с л о в а: Lactobacillus, Bifi dobacterium, иммунитет, макрофаги, интерферон, стафилококк, мыши.

Bibas Bonet M.E., Perdigo G.1. Proposed Model: Mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria // Clin. Vac. Immunol. – 2007. – 14, N. 5. – P. 485–492.Широбоков В.П., Янковский Д.С., Дымент Г.С.2. Микробная экология человека. – К.: ООО «Червона Рута-Турс», 2010. – 340 с.Perdigon, G., Fuller R., Raya R.3. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system // Curr. Iss. Intest. Microbiol. – 2001. – N 2. – P. 27–42.Мокрозуб В.В., Лазаренко Л.М., Бабенко Л.П., Шинкаренко Л.М., Співак М.Я. 4. Антибактеріальні та імуномодулювальні властивості лакто- та біфідобактерій за експериментальної стафілококової інфекції // Біотехнологія. – 2012. – 2. – С. 98–105.Рєзніков О.5. Проблеми етики при проведенні експериментальних медичних і біологічних досліджень на тваринах // Вісник НАН України. – 2001. – № 1. – С. 5–7.Современные методы диагностики вирусных респираторных инфекций и их терапии с использованием 6. препаратов интерферона (Метод. рекомендации) / Под. ред. А.Ф. Модзолевского, Н.С. Дяченко, Н.Я.Спивака. – Киев, 1994. – 18 с.


Спивак Н.Я., Лазаренко Л.Н., Михайленко О.Н.7. Интерферон и система мононуклеарных фагоцитов. – Киев: Фитосоциоцентр, 2002. – 164 с. Маянский А.Н., Пикуза О.И.8. Клинические аспекты фагоцитоза. – Казань: Магариф, 1993. – 192 с.Ершов Ф.И., Киселев О.И.9. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2005. – 368 с. Liudmyla Lazarenko, Lidiya Babenko, Liubov Shynkarenko, Valentyn Pidhorsky, Viktoriia Mokrozub, 10. Olha Voronkova, Mykola Spivak Antagonistic Action of Lactobacilli and bifi dobacteria in relation to Staphylococcus aureus and their infl uence on the immune response in cases of intravaginal staphylococcosis in mice // Probiotics and Antimicrobial Proteins. – 2012. – V., N . – P Perdigon G., de Macias M. E., Alvarez S., Oliver G., de Ruiz Holgado11. A. A. Effect of perorally administered lactobacilli on macrophage activation in mice // Infect. Immun. – 1986. – 53(2). – Р. 404–410. 12. Popova P., Guencheva G., Davidkova G., Bogdanov A., Pacelli .E, Opalchenova G., Kutzarova T., Koychev C. Stimulating effect of DEODAN (an oral preparation from Lactobacillus bulgaricus “LB51”) on monocytes/macrophages and host resistance to experimental infections // Int. J. Immunopharmacol. – 1993. – 15, N 1. – Р. 25–37. 13. Neumann E., Ramos M.G., Santos L.M., Rodrigues A.C., Vieira E.C., Afonso L.C., Nicoli J.R., Vieira L.Q. Lactobacillus delbrueckii UFV-H2b20 induces type 1 cytokine production by mouse cells in vitro and in vivo // Braz. J. Med. Biol. Res. – 2009. – 42, N 4. – P. 358–367. 14. Lin W.H., Wu C.R., Fang T.J., Lee M.S., Lin K.L., Chen H.C., Huang S.Y., Hseu Y.C..Adherent properties and macrophage activation ability of 3 strains of lactic acid bacteria // J Food Sci. – 2011. – 76, N 1:M1-7. [Електронний ресурс] doi: 10.1111/j.1750-3841.2010.01875.x. Epub 2010 Nov 4.Kawashima T15. ., Hayashi K., Kosaka A., Kawashima M., Igarashi .T, Tsutsui H., Tsuji N.M., Nishimura I., Hayashi T., Obata A. Lactobacillus plantarum strain YU from fermented foods activates Th1 and protective immune responses // Int. Immunopharmacol. – 2011. – 11, N 12. – P. 2017–2024. Yasuda E16. ., Serata M., Sako T. Suppressive effect on activation of macrophages by Lactobacillus casei strain Shirota genes determining the synthesis of cell wall-associated polysaccharides // Appl. Environ. Microbiol. – 2008. – 74, N 15. – P. 4746–4755. Shida K17. ., Nanno M., Nagata S. Flexible cytokine production by macrophages and T cells in response to probiotic bacteria: a possible mechanism by which probiotics exert multifunctional immune regulatory activities // Gut Microbes. – 2011. – 2, N 2. – P. 109–114.Kang H18. ., Choi H.S., Kim J.E., Han N.S. Exopolysaccharide-overproducing Lactobacillus paracasei KB28 induces cytokines in mouse peritoneal macrophages via modulation of NF-κβ and MAPKs // J. Microbiol. Biotechnol. – 2011. – 21, N 11. – P. 1174–1178.Lee J.M19. ., Hwang K.T., Jun W.J., Park C.S., Lee M.Y. Antiinfl ammatory effect of lactic acid bacteria: inhibition of cyclooxygenase-2 by suppressing nuclear factor-kappaB in Raw264.7 macrophage cells // Ibid – 2008. – 18, N 10. – P. 1683–1688.Foo N20. .P., Ou Yang H., Chiu H.H., Chan H.Y., Liao C.C., Yu C.K., Wang Y.J. Probiotics prevent the development of 1,2-dimethylhydrazine (DMH)-induced colonic tumorigenesis through suppressed colonic mucosa cellular proliferation and increased stimulation of macrophages // J. Agric. Food Chem. – 2011. – 59, N 24. – P. 13337–133345. Wu M.H21. ., Pan T.M., Wu Y.J., Chang S.J., Chang M.S., Hu C.Y. Exopolysaccharide activities from probiotic bifi dobacterium: Immunomodulatory effects (on J774A.1 macrophages) and antimicrobial properties // Int. J. Food Microbiol. – 2010. – 144, N 1. – P. 104–110. Yang H.Y22. ., Liu S.L., Ibrahim S.A., Zhao L., Jiang J.L., Sun W.F., Ren F. Z. Oral administration of live Bifi dobacterium substrains isolated from healthy centenarians enhanced immune function in BALB/c mice // Source Nutr. Res. – 2009. – 29, N 4. – P. 281–289. Kang S.S23. ., Ryu Y.H., Baik J.E., Yun C.H., Lee K., Chung D.K., Han S.H. Lipoteichoic acid from Lactobacillus plantarum induces nitric oxide production in the presence of interferon-γ in murine macrophages // Mol. Immunol. – 2011. – 48, N 15-16. – P. 2170–2177. Li Y24. ., Qu X., Yang H., Kang L., Xu Y., Bai B., Song W. Bifi dobacteria DNA induces murine macrophages activation in vitro // Cell. Mol. Immunol. – 2005. – 2, N 6. – P. 473–478.Ménard O25. ., Gafa V., Kapel N., Rodriguez B., Butel M.J., Waligora-Dupriet A.J. Characterization of immunostimulatory CpG-rich sequences from different Bifi dobacterium species // Appl. Environ. Microbiol. – 2010. – 76, N 9. – P. 2846–2855.Wang L.S26. ., Zhu H.M., Zhou D.Y., Wang Y.L., Zhang W.D. Infl uence of whole peptidoglycan of bifi dobacterium on cytotoxic effectors produced by mouse peritoneal macrophages // World. J. Gastroenterol. – 2001. – 7, N 3. – P. 440–443.Miettinen M27. ., Veckman V., Latvala S., Sareneva T., Matikainen S., Julkunen I. Live Lactobacillus rhamnosus and Streptococcus pyogenes differentially regulate Toll-like receptor (TLR) gene expression in human primary macrophages // J. Leukoc. Biol. – 2008. – 84, N 4. – P. 1092–1100.Dong H28. ., Rowland I., Yaqoob P.Comparative effects of six probiotic strains on immune function in vitro // Br. J. Nutr. – 2011. – N 7. – P.1–12. [Epub ahead of print]



Îãëÿä ë³òåðàòóðè

УДК 615.281.9:578.89:578.24

А.Б. Балко

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украиныул. Академика Заболотного, 154, Киев, ГСП Д03680, Украина

ХАРАКТЕРИСТИКА, СВОЙСТВА, ПЕРСПЕКТИВА ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОЦИНОВ

Проанализированы данные литературы, а также результаты собственных исследований бактерио-цинов – одних из наиболее распространенных факторов бактериального антагонизма, которые выде-ляются большинством видов микроорганизмов и обладают бактерицидным действием по отношению к представителям филогенетически близких видов. Принимая во внимание высокую литическую актив-ность и узкую специфичность действия бактериоцинов, рассматривается перспектива их использова-ния в качестве альтернативных антимикробных средств. Приведены основные подходы к классифика-ции бактериоцинов, охарактеризовано их разнообразие, описаны структуры, киллерные свойства и ме-ханизмы литического действия основных типов бактериоцинов относительно чувствительных культур микроорганизмов. Указаны перспективные направления использования и возможное значение данных антибактериальных веществ в медицине.

Ключевые слова: бактериоцины, механизмы литического действия.

Множественная устойчивость микроорганизмов к антибиотикам является глобальной про-блемой здравоохранения всех стран мира [27]. Возбудителями инфекционных болезней все чаще становятся мульти- и панрезистентные штаммы микроорганизмов, в связи с чем лечение вызванных ими заболеваний известными антибиотиками оказывается неэффективным [32]. Широкое распространение антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов приобрета-ет угрожающие темпы и свидетельствует о возрастающем «кризисе антибактериальной тера-пии» [43]. Как следствие, возникает необходимость поиска, детального изучения и введения в медицинскую практику новых, альтернативных антибиотикам противомикробных средств [16]. Среди широкого арсенала факторов бактериального антагонизма, кроме антибиотиков, известны также другие группы высокоактивных веществ, которые могут быть использованы в клинической практике. Одними из них являются бактериоцины – наиболее распространенные природные средства защиты бактерий [4]. Учитывая их высокий киллерный потенциал, в об-зорной статье сделана попытка охарактеризовать бактериоцины относительно перспективы их возможного использования в качестве альтернативных антимикробных средств.

Бактериоцины – это группа гетерогенных антибиотикоподобных веществ, преимущест-венно белковой природы, которые синтезируются большинством бактерий и характеризуют-ся бактерицидным действием относительно представителей филогенетически близких видов [36]. К данной группе относятся киллерные факторы с разными морфологическими и биохи-мическими свойствами: пептиды, низкомолекулярные белки, ферменты, фагоподобные струк-туры [20]. Узкая специфичность действия и белковая природа бактериоцинов отличает их от классических антибиотиков [19].

Классификация. Первое детальное исследование бактериоцинов было проведено Reeves, который разделил их на 16 групп и назвал соответственно виду микроорганизма-продуцента [19]. Таким образом, антибиотические факторы, синтезируемые Escherichia coli, обозначили термином «колицины», Enterobacter cloacae – «клоацины», Pseudomonas aeruginosa – «пиоци-ны» и т.д. [40]. Необходимо отметить, что термин «пиоцины» был использован по отношению к старому названию P. aeruginosa – «синегнойная палочка» или Bacillus pyocyaneus. Со време-нем систематическое положение микроорганизмов изменилось, но более корректное название продуцируемых ими бактериоцинов – «аэругиноцины» так и не прижилось.

В дальнейшем, Bradley предложил дополнительно разделить все бактериоцины на две группы: низко- и высокомолекулярные. К низкомолекулярным бактериоцинам относятся тер-© À.Á. Áàëêî, 2012


мостабильные, невидимые в электронном микроскопе вещества белковой природы, которые не осаждаются при ультрацентрифугировании, свободно диффундируют в агар и характери-зуются высокой чувствительностью к действию протеаз. Высокомолекулярные бактериоцины характеризуются большими размерами молекулы, термолабильностью, нечувствительностью к обработке трипсином. Эти частицы свободно осаждаются при высокоскоростном центри-фугировании и визуализируются при электронной микроскопии [19]. Несколько позже, в от-дельную группу были выделены низкомолекулярные полипептиды – микроцины [30]. Таким образом, среди общего количества исследованных бактериоцинов выделяют структуры трех типов – аналоги фаговых хвостовых отростков (макромолекулярные частицы), вещества бел-ковой природы (колициноподобные бактериоцины) и низкомолекулярные полипептиды (мик-роцины).

Макромолекулярные бактериоцины, согласно электронно-микроскопическим исследо-ваниям, морфологически соответствуют хвостовым отросткам бактериофагов, хотя последние характеризуются несколько большими размерами [19]. Частицы бактериоцинов, как и хвос-товые отростки, состоят из внутреннего стержня, футляра, а также базальной пластинки с фибриллами.

Одними из наиболее изученных частиц этого типа являются пиоцины – бактериоцины Pseudomonas aeruginosa [24]. По строению и размерам молекулы они представляют собой до-вольно большую и разнообразную группу, объединяющую три типа частиц: R, F и S пиоцины [28]. Частицы R-типа напоминают негибкие, сократительные хвостовые отростки бактериофа-гов и разделяются на 5 подгрупп: R1, R2, R3, R4 и R5 [31]. Пиоцины F-типа морфологически близки к гибким и несократительным хвостовым отросткам. Эта группа состоит из пиоцинов F1, F2, F3 и 28, а также частиц 430F [19]. Пиоцины S типа своей организацией напоминают колицины и относятся к низкомолекулярным бактериоцинам [37]. Большинство макромоле-кулярных R-пиоцинов в несокращенном состоянии характеризуются средними размерами 100×15 нм. После их сокращения обнаруживаются полые внутренние стержни размером 100×7 нм и футляры около 45×17 нм [19]. Пиоцины F типа имеют вид палочек 105×10 нм, к концам которых прикреплены фибриллоподобные структуры длиной до 43 нм [28]. Молеку-лярная масса частиц пиоцинов F типа составляет в среднем около 3×106 Да, а R типа – 1×107 Дa [19]. При электронной микроскопии пиоцины обнаруживаются в нескольких конформа-ционных состояниях: в виде сокращенных частиц, полностью замкнутых колец и двух несо-кращенных формах [19]. Тем не менее, киллерная активность характерна только структурам в несокращенном состоянии.

Многочисленные исследования проводятся также и среди каротоворицинов – антибиоти-ческих веществ фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora. Этим микроорганизмам также характерно выделение киллерных факторов двух типов – макромолекулярных частиц типа фаговых хвостовых отростков [8] и колициноподобных бактериоцинов [5]. Макромолекуляр-ные каротоворицины можно разделить на четыре группы. Однако, если учитывать характер лизиса чувствительных культур, то их количество может быть и большим [6]. При электрон-ной микроскопии макромолекулярные каротоворицины имеют вид палочкоподобных струк-тур длиной 128–192 нм и диаметром около 15 – 21 нм. На проксимальном конце хвостовых отростков штамма J2 E. carotovora обнаруживается специфическое образование (структура ANS – abnormal structure), которое отличается по своей организации от основной части чехла и, возможно, состоит из субъединиц особенного белка [8]. В состав макромолекулярных час-тиц E. carotovora J2 входят три мажорных (23, 25, 46 кДа) и четыре минорных полипептидных компонента (31, 54, 58, 91 кДа) [2]. При длительном хранении высокомолекулярные карото-ворицины могут спонтанно переходить в сокращенное состояние. В дальнейшем, на особых центрах кристаллизации возможна повторная самостоятельная сборка частиц, аналогичных по своей морфологии исходным структурам, что свидетельствует о высоком уровне их струк-турной организации и механизмов синтеза [9].

Колициноподобные бактериоцины являются высоко гетерогенной группой веществ бел-ковой природы, к которым относят разные по строению и массе киллерные факторы – от не-больших пептидов до сложных белков. Бактериоцинам этого типа характерна доменная струк-тура. В молекуле колицинов, например, выделяют 3 функциональных домена [14]. N-концевой домен принимает участие в переносе бактериоцинов через клеточную оболочку, центральная


часть отвечает за связывание с бактериальным рецептором, а С-концевой фрагмент характе-ризуется ионофорными, нуклеазными и гидролитическими свойствами [14]. У S пиоцинов порядок расположения доменов транслокации и рецепторного распознавания обратный [19]. В структуре других низкомолекулярных бактериоцинов возможны некоторые отличия. Так, на С-конце клоацина DF13 обнаружен дополнительный фрагмент, который связывается с бел-ком иммунности. Необходимо отметить, что генетические детерминанты колициноподобных бактериоцинов могут иметь различную локализацию. Гены пиоцинов, например, находятся в бактериальной хромосоме [19], а колицинов – в составе плазмид [36]. Генетические детерми-нанты кодируют, преимущественно, два белка, которые формируют одну молекулу и, в даль-нейшем, функционируют вместе [38]. При этом больший компонент отвечает за киллерную активность молекулы, а меньший – за резистентность клеток-продуцентов к собственным бактериоцинам [28]. Описанная структура характерна, например, для колицинов Е2, Е3 [18], пиоцинов AP41, S1 и S2 [38], а также клоацина DF13 [18]. В другом случае порообразующие колицины Ia, Ib, B не содержат в составе бактериоцинового оперона гена, ответственного за их выделение из клетки [36].

Группа низкомолекулярных бактериоцинов E. coli (колицинов) считается наиболее иссле-дованной среди киллерных факторов этого типа [14]. По механизму влияния на чувствитель-ные микроорганизмы и сходству белковых последовательностей среди колицинов выделяют две большие группы: порообразующие колицины и колицины с нуклеазной активностью [36]. Порообразующие колицины по своей структуре достаточно неоднородны и поэтому допол-нительно разделяются на три подгруппы: Ia, E1 и A. Колицины с нуклеазной активностью ха-рактеризуются большим сходством, и, в зависимости от соотношения ДНКазной и РНКазной активностей, среди этих бактериоцинов выделяют две разные подгруппы. Первая подгруппа характеризуется высшей ДНКазной активностью и включает колицины E2, E7, E8, E9, в то время как другая представлена колицинами E3, E5, E6, E4, DF13 с более выраженными РНКаз-ными свойствами [36]. В зависимости от особенностей строения домена транслокации, коли-цины дополнительно разделяются на две группы. К группе А относят бактериоцины, которым для проникновения в цитоплазму чувствительных микроорганизмов необходима клеточная Tol-система транспорта (колицины A, E1, E2, E3, K, L) [33]. В группу В входят частицы, зави-симые от Ton-системы транспорта белков (колицины B, Ia, Ib, V, D, M) [12].

Пиоцины S типа – колициноподобные, протеазочувствительные белки, которые характе-ризуются ДНКазной активностью и представляют собой группу морфологически простых пептидов с молекулярной массой не выше 100 кДа [38]. Среди них выделяют несколько под-типов: S1, S2, S3, Ap41, S4 и S5 [19, 36].

Большинство бактериоцинпродуцирующих штаммов E. carotovora также способны син-тезировать колициноподобные бактериоцины, а в отдельных случаях бактериоциногенность носит множественный характер [10]. При этом выделению разных типов каротоворицинов присущий волнообразный характер [11]. Показано, что за синтез колициноподобных частиц отвечает ген brg размером 1280 пар нуклеотидов. Указанный ген имеет хромосомную локали-зацию и кодирует протеин из 99 аминокислот [15]. В проведенных нами исследованиях пока-зано, что в состав колициноподобных бактериоцинов E. carotovora J2 входит один мажорный полипептид массой 54 кДа [2]. Ген brg, кроме бактериоцинов, может синтезировать также и другие белки, необходимые для полноценного функционирования клетки. Считается, что этот ген оказывает плейотропное влияние на клетку, которое проявляется в осмостойкости, ста-бильности формы и размеров бактерий, регулярности деления, а также устойчивости клеток к УФ-облучению [15].

Микроцинами называют группу антимикробных низкомолекулярных полипептидов, ко-торые выделяются бактериями семейства Enterobacteriaceae [30]. Считается, что микроцины имеют большое значение в бактериальном антагонизме кишечной микрофлоры млекопитаю-щих [21]. На данный момент известно лишь девять микроцинов: E492, 24, J25, H47, B17, C7, D93, V и L [22]. Однако, несмотря на их незначительное количество, некоторые микроцины детально изучены – Н47, C7 и J25, тогда как другие остаются практически не изученными – L, 24, V [29]. Данные факторы антагонизма представляют собой группу простых белков с моле-кулярной массой не выше 10 кДа, резистентных к действию многих протеаз. Кроме того, они характеризуются высокой термостабильностью и устойчивостью к изменениям pH в значи-


тельном диапазоне [29]. Индукция синтеза микроцинов не зависит от активности бактериаль-ной SOS-системы, а происходит при культивировании бактерий в обедненной ростовой среде [29]. Необходимо отметить, что выделение этих веществ не сопровождается гибелью клеток. Учитывая особенности строения и структурной организации микроцинов, было предложено разделить их на две группы [35]. Первая группа включает микроцины B17, C7, J25 и D93, ко-торые представлены небольшими молекулами с молекулярной массой ниже 5 кДа. В процессе созревания большинство бактериоцинов данной группы претерпевают посттрансляционную модификацию, а киллерное влияние осуществляют на специфические внутриклеточные ми-шени [35]. Вторая группа включает микроцины V, E492, H47, L и 24. По своему строению эти частицы в некоторой степени сходны с бактериоцинами IIа класса грам-положительных бакте-рий. Молекулярная масса микроцинов второй группы составляет от 7 до 10 кДа [35]. Выделе-ние микроцинов происходит при помощи транспортной ABC системы клетки, а их антибакте-риальная активность обусловлена взаимодействием с бактериальными мембранами [35].

Реализация киллерной активности макромолекулярных бактериоцинов начинается с их прикрепления к рецепторам на клеточной стенке бактерий. Каротоворицины, например, связываются с компонентами О-цепи бактериальной стенки (S-липополисахарид), которые со-держат маннозу, фукозу, ксилозу и рамнозу [7]. Исследование кинетики адсорбции показало, что это довольно быстрый процесс. За первые две минуты происходит прикрепление основ-ного количества бактериоцинов, тогда как в последующий период (до 60 мин) наблюдается только медленное насыщение рецепторов. При этом на процесс прикрепления бактериоци-нов может также влиять структурная конформация молекул липополисахарида [7]. В даль-нейшем происходит сокращение хвостовых отростков, что приводит к механическому и фер-ментативному разрушению оболочки клетки [28]. Для макромолекулярных каротоворицинов E. carotovora J2 показано, что при контакте с мембраной чувствительных клеток первой сокра-щается свойственная им структура ANS. Вследствие этого последняя претерпевает некоторые конформационные изменения, которые распространяются на футляр хвостового отростка и могут приводить или к его дальнейшему сокращению, или к разрушению дистальной части каротоворицина [8]. Следствием влияния бактериоцинов является выход внутриклеточного содержимого и ингибирование синтеза бактериальных ДНК, РНК и белка. Это, в свою оче-редь, приводит к быстрой и полной остановке роста чувствительной культуры [19]. Таким об-разом, макромолекулярные бактериоцины убивают бактерии лизисом «извне» [31]. Частицы указанного типа в чувствительных микроорганизмах, подобно бактриофагам, не размножа-ются. Исходя из этого следует, что для разрушения одной бактериальной клетки необходимо намного большее количество частиц бактериоцинов, нежели бактериофагов [19]. При сравне-нии киллерных свойств бактериоцинов разных типов было обнаружено, что они отличаются между собой по эффективности. На примере пиоцинов показано, что на одну летальную еди-ницу активности приходится 1–2 частицы R пиоцинов, около 280 киллерных факторов F-типа и более 300 молекул S пиоцинов.

Механизм киллерного действия низкомолекулярных бактериоцинов заключается в их способности влиять на разнообразные клеточные структуры и блокировать большинство про-цессов [42]. Вещества этого типа проявляют свое биологическое действие путем адсорбции к специфическим рецепторам, которые локализованы на поверхности внешней мембраны чувс-твительных клеток [13]. Так, некоторым микроцинам для связывания и транспортирования в бактериальную клетку необходимы белки Ton-Tol системы клетки хозяина [12]. Для проникно-вения в цитоплазму бактерий могут использоваться также и другие структуры. Так, например, микроцин J25 присоединяется к многофункциональному рецептору FhuA, который относится к группе рецепторов сидерофоров, колицины Е – к рецептору BtuB, необходимому для транс-порта витамина В12 [14]. После прикрепления бактериоцины перемещаются через клеточную оболочку и влияют на ряд специфических мишеней внутри бактерий [13]. Как следствие, про-исходит блокирование жизненно важных процессов и наступает гибель клетки.

При более тщательном исследовании механизмов действия бактериоцинов было показано три основных способа их киллерного влияния на клетку. Первый тип влияния заключается в образовании каналов в цитоплазматической мембране, через которые выходят ионы К+, Н+

(микроцины Е492, V; колицины А, Е1, К, Іа, Ів; пиоцин S5) [28, 44]. Это приводит к умень-


шению мембранного потенциала клетки и блокированию поглощения питательных веществ. Бактериоцины первого типа могут также препятствовать накоплению предшественников всех биохимических процессов. Другим механизмом действия является нуклеазная деградация нуклеиновых кислот. На молекулярном уровне такой тип влияния проявляется путем образо-вания одно- и двуцепочечных разрывов ДНК (колицины Е2, Е7, E9) [45], блокирования вклю-чения тимина в молекулу нуклеиновой кислоты (колицин Е2, микроцин В17), а также ингиби-рования синтеза ДНК (микроцины В17, J25) [34]. Наличие неспецифической эндонуклеазной активности было показано нами и для колициноподобных каротоворицинов, причем данная активность дополняет их киллерное действие путем лизогенной индукции умеренных бакте-риофагов [1]. ДНКазные свойства также характерны пиоцинам S1, S2, S3 и AP41 [28]. Кроме разрушения клеточной ДНК, пиоцины S1 и S2 вызывают полное ингибирование липидного синтеза бактерий [38]. Следующий способ деградации заключается в специфическом расщеп-лении рибосомальной 16S РНК, что приводит к угнетению белкового синтеза (колицин Е3 и микроцин С7) [44, 45]. На синтез клеточных белков дополнительно влияет разрушение тРНК колицинами E5, D [26] и пиоцинами S4 [28]. Данная группа также включает вещества, спо-собные ингибировать клеточные ферменты. Например, микроцин С15 связывает гомосерин-О-транссукцинат, необходимый для синтеза метионина. И, наконец, последний тип влияния – это угнетение биосинтеза муреина, что приводит к разрушению клеточной стенки и вызывает лизис бактерий или образование сферопластов (колицин М) [12].

Показано, что клетки-продуценты бактериоцинов устойчивы к летальному действию собственных продуктов. Бактерии также могут быть резистентными и относительно бактерио-цинов других, близкородственных видов. Это свойство обусловлено синтезом относительно низкомолекулярного гидрофобного белкового продукта, названного белком иммунности [45]. Указанные белки встраиваются в цитоплазматическую мембрану бактерий и предотвращают ее разрушение. Для некоторых колицинов белки иммунности прочно связаны с гомологичес-кими молекулами киллеров (колицины E2, E3, DF13), угнетая, таким образом, их литическую активность [44]. В соответствии со степенью резистентности микроорганизмов к действию бактериоцинов бактерии разделяются на два бактериоцинотипа – с высокой и низкой чувстви-тельностью. На примере каротоворицинов показано, что с расширением спектра литической активности частиц, уменьшается бактериоциночувствительность их родительских штаммов к действию бактериоцинов других бактерий [6].

Использование бактериоцинов для лечения инфекционных заболеваний впервые было предложено в 50-х годах минувшего столетия. Например, применение колицина Col V при экспериментальных инфекциях у подопытных мышей показало положительные результаты [41]. Однако стремительное развитие эры антибиотиков отодвинуло большинство данных ис-следований на второй план. В настоящий период в связи с резким увеличением количества антибиотикорезистенных штаммов возрождается заинтересованность бактериоцинами, как альтернативе традиционным антимикробным препаратам [4]. Так, в медицинской практике нашел применение комбинированный препарат для местного применения, содержащий бакте-риоцины – пиолизин [3]. Делаются даже попытки использования бактериоцинов для влияния на полирезистентные штаммы микроорганизмов [25].

Кроме того, в отдельных работах была показана высокая эффективность действия некото-рых киллерных факторов (пиоцин S2) на рост опухолевых клеток [17]. Лантибиотики – бакте-риоцины молочнокислых бактерий (например, низин), уже более 40 лет успешно используют-ся в пищевой промышленности в качестве консервантов [39].

Необходимо отметить, что бактериоцины имеют и ряд недостатков, которые существен-но ограничивают возможность широкого применения их нативных структур в медицине [4]. Сюда следует отнести возможность неучтенной специфической активности бактериоцинов (токсические белки, белки с прионоподобным эффектом), необходимость введения в организм человека большого количества белка и опасность развития аллергических реакций, высокая специфичность и возникновение резистентности при мутациях рецепторов или мишеней, а также некоторые другие [4]. Для устранения указанных недостатков активно разрабатываются бактериоцины, модифицированные с помощью генной инженерии [23]. Тем не менее, бакте-риоцины следует рассматривать как мощный арсенал антимикробных средств, который все


еще требует дальнейших исследований, но имеет полное право быть использованным для ре-шения соответствующих проблем настоящего и будущего.

Автор выражает глубокую признательность заведующему отделом молекулярной генетики бактериофагов, д-р биол. наук Товкачу Ф.И., а также заведующей отделом антибиотиков, д-р мед. наук, Авдеевой Л.В. за консультативную помощь, обсуждение представленных данных и всестороннюю поддержку при проведении исследований.

О.Б. Балко

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН Українивул. Академіка Заболотного, 154, Київ, МСП Д03680, Україна

ХАРАКТЕРИСТИКА, ВЛАСТИВОСТІ, ПЕРСПЕКТИВА ВИКОРИСТАННЯ БАКТЕРІОЦИНІВ

Р е з ю м еПроаналізовано літературні джерела, а також результати власних досліджень бактеріоцинів - одних із

найпоширеніших факторів бактеріального антагонізму, які виділяються більшістю видів мікроорганізмів і володіють бактерицидною дією по відношенню до представників філогенетично близьких видів. Зва-жаючи на високу літичну активність і вузьку специфічність дії бактеріоцинів, розглядається перспектива їх використання як альтернативних антимікробних засобів. Наведено основні підходи до класифікації бактеріоцинів, охарактеризовано їх різноманіття, описано структуру, кілерні властивості і механізми лі-тичної дії основних типів бактеріоцинів щодо чутливих культур мікроорганізмів. Вказано перспективні напрямки використання і можливе значення даних антибактеріальних речовин для медицини.

К л ю ч о в і с л о в а: бактеріоцини, механізми літичної дії.

A.B. Balko


CHARACTERISTIC, PROPERTIES, PROSPECT OF APPLICATION OF BACTERIOCINS

S u m m a r yLiterary data and own research results dedicated to bacteriocin investigations have been analysed. Bacte-

riocins as one of the most widespread factors of bacterial antagonism, which are distinguished by the majority of microorganisms and characterized by bactericidal action in respect of representatives of phylogenetically related species have been considered. Allowing for their high lytic activity and narrow action specifi city, the prospects for the use of the bacteriocins as possible alternative antibacterial remedies are examined. The basic approaches to bacteriocin classifi cation, their variety, structure, killer properties and mechanisms of lytic action are presented. The perspective trends of the use and possible signifi cance of these antibacterial substances in medicine are indicated.

The paper is presented in Russian. K e y w o r d s: bacteriocins, mechanisms of lytic action.T h e a u t h o r’s a d d r e s s: Balko A.B., Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National

Academy of Sciences of Ukraine; 154 Acad. Zabolotny St., Kyiv, MSP, D 03680, Ukraine.

1. Балко О.Б., Товкач Ф.І. Ендонуклеазна активність, асоційована із частками бактеріоцинів Erwinia carotovora // Наук. вісн. Чернів. універ. – 2006. – 297. – С. 132–136.

2. Балко О.Б. Структурно-функціональна організація каротоворіцинів та їх роль в мікробному антагонізмі: Автореф. дис. канд. біол. наук: 03.00.06 / Інт. мікробіол. і вірусол. ім. Д. К. Заболотного НАН України. – К., 2007. – 20 с.

3. Гольдина О.А., Горбачевский Ю.В. Мазь пиолизин эффективное средство монотерапии в широкой дерматологии // Поликлиника. – 2010. – 2. – C. 104–109.


4. Крылов В.Н. Фаготерапия с точки зрения генетики бактериофага: надежды, перспективы, проблемы безопасности, ограничения // Генетика. – 2001. – 37, № 7. – С. 869–887.

5. Максименко Л.А., Товкач Ф.И. Ассоциация пигментсодержащего липида и низкомолекулярного бактериоцина Erwinia carotovora // Мікробіол. журн. – 2009. – 71, № 5. – C. 51–57.

6. Товкач Ф.И. Соотношение между лизирующей активностью макромолекулярных каротоворицинов и бактериоциночувствительностью у E. carotovora // Микробиология. – 1998. – 67, № 6. – С. 775–781.

7. Товкач Ф.И., Мороз С.Н., Гвоздяк Р.И. Изучение адсорбционных рецепторов макромолекулярных бактериоцинов E. carotovora subsp. carotovora // Микробиол. журн. – 2001. – 63, № 1. – С. 23–33.

8. Товкач Ф.И. Дефектная лизогения E. carotovora // Микробиология. – 2002. – 71, № 3. – С. 359–367.9. Товкач Ф.И. Самосборка надмолекулярных структур in vitro после спонтанного разрушения

каротоворицинов // Там же. – 2002. – 71, № 4. – С. 467–474. 10. Товкач Ф.І., Максименко Л.О., Балко О.Б. Множинність бактеріоцинів Erwinia carotovora // Вісник ДАУ.

– 2005. – 2. – С. 163–168.11. Товкач Ф.И., Балко А.Б., Муквич Н.С. Особенности лизогенной индукции бактериоцинов у тиминовых

мутантов Erwinia carotovora // Мікробіол. журн. – 2006. – 68, № 3. – С. 33–46.12. Braun V., Patzer S.I., Hantke K. Ton-dependent colicins and microcins: modular design and evolution //

Biochimie. – 2002. – 84, N 5. – P. 365–380.13. Cao Z., Klebba P.E. Mechanisms of colicin binding and transport through outer membrane porins // Biochimie.

– 2002. – 84, N 5. – P. 399–412.14. Cascales E., Buchanan S.K., Duché D., Kleanthous C., Lloubès R., Postle K., Riley M., Slatin S., Cavard D.

Colicin biology // Microbiol. Mol. Biol Rev. – 2007. – 71, N 1. – P. 158–229. 15. Chuang D. Y., Kyeremeh A. G., Gunji Y. Identifi cation and cloning of an Erwinia carotovora subsp. carotovora

bacteriocin regulator gene by insertional mutagenesis // J. Bacteriol. – 1999. – 181, N 6. – P. 1953–1957.16. Coates A.R., Hu Y. Targeting non-multiplying organisms as a way to develop novel antimicrobials // Trends.

Pharmacol. Sci. – 2008. – 29, N 3. – P. 143–150. 17. Cornut G, Fortin C, Soulières D. Antineoplastic properties of bacteriocins: revisiting potential active agents //

Am. J. Clin. Oncol. – 2008. – 31, N 4. – P. 399–404.18. Cursino L., Smarda J., Chartone-Souza E., Nascimento A.M.A. Recent updated aspects of colicins of

Enterobacteriaceae // Braz. J. Microbiol. – 2002. – 33, N 3. – P. 185–195.19. Daw M.A., Falkiner F.R. Bacteriocins: Nature, Function and Structure // Micron. – 1996. – 27, N 6. – P. 467–

479.20. Desriac F., Defer D., Bourgougnon N., Brillet B., Le Chevalier P., Fleury Y. Bacteriocin as weapons in the

marine animal-associated bacteria warfare: inventory and potential applications as an aquaculture probiotic // Mar. Drugs. – 2010. – 8, N 4. – P. 1153–1177.

21. Destoumieux-Garzón D., Peduzzi J., Rebuffat S. Focus on modifi ed microcins: structural features and mechanisms of action // Biochimie. – 2002. – 84, N 6. – P. 511–519.

22. Frana T.S., Carlson S.A., Rauser D.C., Jones B.D., Fergen B.J., Griffi th R.W. Effects of microcin 24-producing Escherichia coli on shedding and multiple-antimicrobial resistance of Salmonella enterica serotype typhimurium in pigs // Am. J. Vet. Res. – 2004. – 65, N 12. – P. 1616–1620.

23. Gillor O., Nigro L.M., Riley M.A. Genetically engineered bacteriocins and their potential as the next generation of antimicrobials // Cur. Pharm. Des. – 2005. – 11, N 8. – P. 1067–1075.

24. Köhler T., Donner V., van Delden C. Lipopolysaccharide as shield and receptor for R-pyocin-mediated killing in Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. – 2010. – 192, N 7. – P. 1921–1928.

25. Ling H., Saeidi N., Rasouliha B.H., Chang M.W. A predicted S-type pyocin shows a bactericidal activity against clinical Pseudomonas aeruginosa isolates through membrane damage // FEBS Lett. – 2010. – 584, N 15. – P. 3354–3358.

26. Masaki H., Ogawa T. The modes of action of colicins E5 and D, and related cytotoxic tRNases // Biochimie. – 2002. – 84, N 5. – P. 433–438.

27. McGowan J.E.Jr. Resistance in nonfermenting gram-negative bacteria: multidrug resistance to the maximum // Am. J. Med. – 2006. – 6, N 1. – P. 29–36.

28. Michel-Briand Y., Baysse C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa // Biochimie. – 2002. – 84, N 5. – P. 499–510.

29. Moreno F., San Millan J.L., Hernández-Chico C., Kolter R. Microcins // Biotechnol. Ser. – 1995. – 28, N 1. – P. 307–321.

30. Moreno F., Gónzalez-Pastor J.E., Baquero M.-R. Bravo D. The regulation of microcin B, C and J operons // Biochimie. – 2002. – 84, N 6. – P. 521–529.


31. Nakayama K., Takashima K., Ishihara H., Shinomiya T., Kageyama M., Kanaya S., Ohnishi M., Murata T., Mori H., Hayashi T. The R – type pyocin of Pseudomonas aeruginosa is related to P2 phage, and the F – type is related to lambda phage // Mol. Microbiol. – 2000. – 38, N 2. – P. 213–231.

32. O’Fallon E., Pop-Vicas A., D’Agata E. The emerging threat of multidrug-resistant gram-negative organisms in long-term care facilities // J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. – 2009. – 64, N 1. – P. 138–141.

33. Papagianni M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications // Biotechnol. Adv. – 2003. – 21, N 6. – P. 465–499.

34. Pierrat O.A., Maxwell A. Evidence for the role of DNA strand passage in the mechanism of action of microcin B17 on DNA gyrase // Biochemistry. – 2005. – 44, N 11. – P. 4204–4215.

35. Pons A.-M., Lanneluc I., Cottenceau G., Sable S. New developments in non-post translationally modifi ed microcins // Biochimie. – 2002. – 84, N 6. – P. 531–537.

36. Riley M.A., Chavan M. Bacteriocins: ecology and evolution. – Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2007. – 154 p.

37. Saleem F., Ahmad S., Yaqoob Z., Rasool S.A. Comparative study of two bacteriocins produced by representative indigenous soil bacteria // Pak. J. Pharm. Sci. – 2009. – 22, N 3. – P. 252–258.

38. Sano Y., Matsui H., Kobayashi M., Kageyama M. Molecular structures and functions of pyocins S1 and S2 in Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. – 1993. – 175, N 10. – P. 2907–2916.

39. Sapatnekar N.M., Patil S.N., Aglave B.A. Extraction of bacteriocin and study of its antigonastic assay // Intern. J. Biotechnol. Biochem. – 2010. – 6, N 6. – P. 865–870.

40. Seo S.T., Furuya N., Iiyama K., Takeshita M., Takanami Y., Tsuchiya K., Lim C.-K. Characterization of an antibacterial substance produced by Erwinia carotovora subsp. carotovora Ecc 32 // J. Gen. Plant. Pathol. – 2004. – 70, N 5. – P. 273–277.

41. Smith H.W, Huggins M.B. Treatment of experimental Escherichia coli infection in mice with colicine V // J. Med. Microbiol. – 1977. – 10, N 4. – P. 479–482.

42. de Souza E.L., da Silva C.A., de Sousa C.P. Bacteriocins: molecules of fundamental impact on the microbial ecology and potential food biopreservatives // Braz. Arch. Biol. Technol. – 2005. – 48, N 4. – P. 559–566.

43. Wang C.Y., Jerng J.S., Cheng K.Y., Lee L.N., Yu C.J., Hsueh P.R., Yang P.C. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes // Clin. Microbiol. Infect. – 2006. –12, N 1. – P. 63–68.

44. Zakharova S.D., Cramer W.A. Colicin crystal structures: pathways and mechanisms for colicin insertion into membranes // Biochim. Biophys. Acta. – 2002. – 1565, N 2. – P. 333–346.

45. de Zamaroczy M., Buckingham R. H. Importation of nuclease colicins into E.coli cells: endoproteolytic cleavage and its prevention by the immunity protein // Biochimie. – 2002. – 84, N 5. – P. 423–432.



Þâ³ëå¿ ³ äàòè

КАТЕРИНА ІВАНІВНА АНДРЕЮК(до 85-річчя від дня народження)

27 листопада 2012 р. виповнюється 85 років з дня народження Катерини Іванівни Андреюк – видатного вченого у галузі загальної і ґрунтової мікробіології, екології мікро-організмів, біогеохімії.

У 1951 р. після закінчення Одеського державного університету ім. І.І. Мечнікова Катерина Іванівна вступила до аспірантури при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного, який став першим і єдиним науковим закладом на її трудовій ниві. Починаючи з аспірантури і протягом багатьох років діяльності доля поєднала її з членом-кореспондентом АН України, професором Л.О. Рубенчиком – видатним вченим в галузі фізіології мікроорганізмів і ґрунто-вої мікробіології. Цих талановитих людей поєднала любов до науки, музики, поезії, живопису та до рідної обом Одеси.

Л.О. Рубенчик і К.І. Андреюк разом із провідними науковцями відділу загальної і ґрунто-вої мікробіології О.І. Бершовою, Х.Г. Зіновьєвою, В.Т. Смалієм сформували вітчизняні нау-кові школи: еколого-фізіологічні дослідження ґрунтової мікрофлори та вивчення біогеохіміч-ної діяльності мікроорганізмів.

Широко відомі в Україні і за кордоном приоритетні роботи К.І. Андреюк, в яких визначені закономірності екології, фізіології, систематики стрептоміцетів – мало дослідженої на той час групи бактерій із міцеліальною будовою клітин. Катерина Іванівна та її колеги-однодумці створили унікальну колекцію стрептоміцетів, виділених із різних ґрунтів України, Росії, Біло-русі, Грузії, Вірменії, Азербайджану, яка нині поповнюється ізолятами з Німеччини, Болгарії і, навіть, з ґрунтосубстратів Антарктиди. Ця колекція, що нараховує більш як 2000 штамів, є джерелом для селекції стрептоміцетів – продуцентів широкого спектру біологічно активних сполук. Результати цих робіт узагальнені у монографіях «Актиномицеты почв юга Европейс-кой части СССР и их биологическая активность» і «Ґрунтові актиноміцети та вищі рослини» (премія ім. Д.К. Заболотного).

Дослідження, проведені К.І. Андреюк, стосуються взаємовідносин мікроорганізмів з ви-щими рослинами, визначення закономірностей функціонування окремих популяцій та мік-робних угруповань ґрунтів за різних систем землеробства. Особливу увагу було приділено вивченню закономірностей формування та підвищення активності симбіотичних систем ри-зобій із бобовими рослинами, селекції активних штамів азотфіксуючих, фосформобілізуючих мікроорганізмів як основи бактеріальних препаратів для рослинництва.


К.І. Андреюк вперше у дослідженнях ґрунтової мікробіоти застосувала новий методоло-гічний підхід, згідно з яким мікробне угруповання розглядається як складна ієрархічна сис-тема з певною просторовою, таксономічною і функціональною структурою, що діє за при-нципом саморегулювання і самовідновлення. Ця методологія, викладена у повному обсязі у монографії «Основы экологии почвенных микроорганизмов», продовжує плідно розвиватись і донині.

К.І. Андреюк створені наукові засади оптимізування функцій мікробних угруповань для поліпшення екологічного стану та підвищення родючості орних земель. В аспекті зазначених проблем розроблені принципи діючої системи мікробіологічного моніторингу ґрунтів, а та-кож вивчені питання охорони та меліорації ґрунтів, забруднених токсичними іонами важких металів. Результати цих досліджень висвітлені у монографії «Функціонування мікробних уг-руповань ґрунту в умовах антропогенного навантаження».

Наприкінці 60-х років минулого століття у відділі був започаткований новий напрямок – дослідження біогеохімічної діяльності мікроорганізмів. Наукові роботи розпочались із вирі-шення суто практичної проблеми. Будівельники київського метрополітену при прокладанні тунелів вперше у світовій практиці зустрілись з явищем утворення сірчаної кислоти на гли-бині більше 100 м. За постановою уряду для з’ясування причин цього феномену Академією наук УРСР був створений колектив, який склався з електрохіміків, хіміків, геологів, матеріа-лознавців і мікробіологів. Успішному розв’язанню поставленої задачі сприяло поєднання нау-кового підходу Л.Й. Рубенчика, як фахівця з геохімічної діяльності мікроорганізмів, з органі-заційним талантом К.І. Андреюк, її вмінням запалити співробітників-однодумців ідеєю такого незвичайного дослідження. Було встановлено, що причиною аварійно небезпечного явища є застосований кесонний метод проходки тунелів, унаслідок чого активізувався розвиток бак-терій циклу сірки. У результаті життєдіяльності цих мікроорганізмів утворювалась сірчана кислота. Були розроблені рекомендації для запобігання виникнення таких ситуацій, і кияни отримали нову лінію метрополітену. З того часу в інституті і згодом в Україні з’явився новий напрямок – вивчення біогеохімічної діяльності мікроорганізмів і мікробної корозії підзем-них споруд. У відділі і зараз вивчається корозійна активність ґрунтової мікрофлори в умовах техногенезу, який проявляється в прокладанні тисяч кілометрів магістральних газопроводів, кабелів зв’язку, будівництві підземних резервуарів, тунелів метрополітену тощо.

На підставі широких еколого-фізіологічних, мікробіологічних, біохімічних і електрохіміч-них досліджень були розроблені фундаментальні положення, на основі яких прогнозувались або ліквідувались корозійні ситуації на цих спорудах.

Вперше було виявлено специфічну зону підвищення біологічної активності мікроорганіз-мів (феросфера), що знаходяться в безпосередній близькості з металевою поверхнею. У фе-росфері на самій поверхні металу формується біоплівка, де відбуваються біоелектрохімічні процеси його руйнації.

Розроблено критерій агресивності ґрунтів, запропонований експрес-метод оцінки агресив-ності бактерій окремих груп на основі визначення їхньої метаболічної активності. Підсумки цих досліджень узагальнені у монографіях: «Литотрофные бактерии и микробиологическая коррозия» (1977), «Микробная коррозия и ее возбудители» (1980), «Мікробна корозія підзем-них споруд» (2005). Розроблено 2 державні стандарти України і державний стандарт для країн СНД.

Науковий доробок К.І. Андреюк складає більш ніж 270 статей, 15 монографій, багато авторських свідоцтв і патентів. Своїми знаннями, досвідом, науковою інтуїцією Катерина Іванівна ділиться зі своїми учнями, серед яких близько 20 докторів і кандидатів наук. Катери-на Іванівна опікується збереженням наукових традицій, у першу чергу, чесності і безкомпро-місності, вимогливого ставлення до себе і доброзичливості до колег.

Зі щирою любов’ю і повагою наукова громадськість, співробітники і учні вітають Катери-ну Іванівну Андреюк з ювілеєм, бажають міцного здоров’я, оптимізму, творчого натхнення.

Колектив Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Відділ загальної і ґрунтової мікробіології ІМВ НАН УкраїниТовариство мікробіологів України ім. С.М. Виноградського

Редколегія і редакція «Мікробіологічного журналу»

mb 6 2012library.nuft.edu.ua/ebook/file/mb_6_2012.pdf2 issn 0201-8462. Ì³êðîá³îë....

Documents