UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

JELENA J. ARSIĆ

Uticaj metanolnog ekstrata lišajske vrste Cladonia foliacea na

preţivljavanje i dinamiku razvića larvi Drosophila melanogaster

Master rad

Niš, 2015

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj metanolnog ekstrata lišajske vrste Cladonia foliacea na

preţivljavanje i dinamiku razvića larvi Drosophila melanogaster

Master rad

Kandidat Mentor

Arsić J. Jelena 86 Prof. dr Mitrović Lj. Tatjana

Niš 2015

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

The influence of the methanol extract of lichen species Cladonia foliacea

on the survival and dynamics of development of larvae Drosophola

melanogaster

Master thesis

Candidate Mentor

Arsić J. Jelena 86 Prof. dr Mitrović Lj. Tatjana

Niš 2015

4

Zahvalnica

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Tatjani Mitrović, na nesebičnoj

podršci, pomoći i sugestijama prilikom sticanja

profesionalnih znanja i iskustava tokom celog procesa studiranja a

posebno prilikom odabira teme, materijala i metoda i predstavljanja rezultata ovog

master rada.

Posebnu zahvalnost dugujem asistentu Vladimiru Cvetković koji je uložio veliki trud

i pružio mi ogromnu pomoć u izvođenju praktičnog dela rada i u tumačenju dobijenih

rezultata.

Naročitu zahvalnost dugujem svojoj porodici na neizmernoj

ljubavi, podršci i razumevanju koju su mi pružali tokom studiranja.

5

Sažetak

Ispitivan je uticaj metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia foliacea (Huds.)

Willd. na preţivljavanje i dinamiku razvića larvi Drosophila melanogaster. Ekstrakt je

rastvoren u DMSO-u i umešan u tretman podloge u konaĉnim koncentracijama 500

µg/ml, 125 µg/ml, 72.25 µg/ml, 36.25 µg/ml. Pored tretman podloga, postavljene su

negativna kontrola sa destilovanom vodom, kao i kontrola rastvaraĉa. Svi tretmani

ukljuĉujući i kontrole raĊeni su u triplikatu. Zapaţeno je da metanolni ekstrakt rastvoren

u DMSO-u ne utiĉe negativno na preţivljavanje larvi, izaziva brţe ulutkavanje za jedan

dan i usporava izleganje u pojedinim tretmanima sa zadrškom od jednog dana u odnosu

na vodenu kontrolu.

Kljuĉne reĉi: Cladonia foliacea, Drosophila melanogaster, toksiĉnost

6

Abstract

The influence of the methanol extract of lichen species Cladonia foliacea on the

survival and dynamics of Drosophila melanogaster larvae development is investigated.

The extract was dissolved in DMSO and was stirred into the treatment of the substrate in

the final concentrations 500 µg/ml, 250 µg/ml, 72.5 µg/ml, 36.25 µg/ml. In addition to

the treatment surfaces, negative control and distilled water were set as well as the solvent

control. All treatments, including controls are set out in triplicate. It was observed that the

methanol extract dissolved in DMSO does not adversely affect the survival of larvae,

causes faster pupation rate in one day and slows the hatching in individual treatments

with a setback of one day in comparison to the water control.

Key words: Cladonia foliacea, Drosophila melanogaster, toxicity

7

Biografija kandidata

Jelena Arsić je roĊena 13. maja 1988 godine u Nišu. Osnovnu školu „Kole Rašić”

završava 2003. godine. Iste godine upisuje gimnaziju „Svetozar Marković” u Nišu,

prirodno matematiĉki smer. Gimnaziju završava 2008. godine i upisuje Osnovne

akademske studije na Prirodno matematiĉkom fakultetu Univerzieta u Nišu, Departman

za Biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2012. godine sa prosekom

7. 22. Iste godine upisuje Master akademske studije, smer Biologija, koje završava 2015.

godine.

8

SADRŢAJ

1. Uvod ......................................................................................................................................... 9

1.1 Lišajevi kao izvori biomedicinskih agensa ........................................................................ 10

1.2 Sistematika i morfologija vrste Drosophila melanogaster ................................................ 12

1.3 Ciklus razvića..................................................................................................................... 15

1.4 Drosophila melanogaster kao model organizam ............................................................... 17

2. Cilj rada ................................................................................................................................ 19

3. Materijal i metode ............................................................................................................. 20

3.1. Materijal ............................................................................................................................ 20

3.2. Metode .............................................................................................................................. 20

3.2.1 Pripremanje i prikupljanje lišajskog materijala 20

3.2.2 Metode dobijanja ekstrakta iz lišajeva 20

3.2.3 Priprema supstrata ........................................................................................................ 21

3.2.4 Priprema serije tretman podloga sa rastvorom metanolnog ekstrakta lišajske vrste

Cladonia foliacea .......................................................................................................................... 21

3.2.5 Postupak dobijanja larvi Drosophila melanogaster starih 3 dana 22

3.2.6 Postavka eksperimenta 22

4. Rezultati ................................................................................................................................ 24

4.1. Ispitivanje uticaja razliĉitih koncentracija metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia

foliacea na konaĉan broj ulutkanih jedinki i adulta koji su se izlegli ........................................... 24

4.2. Ispitivanje uticaja razliĉitih koncentracija metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia

foliacea na dinamiku ulutkavanja i izleganja ................................................................................ 26

5. Diskusija ............................................................................................................................... 28

6. Zaključci ............................................................................................................................... 30

7. Literatura ............................................................................................................................. 31

9

1. Uvod

Lišajevi su simbiotski organizmi sastavljeni od gljiva - mikobiont i fotosintetskog

partnera - fitobiont, koji moţe biti zelena alga ili cijanobakterija. Dvojna priroda lišajeva je

opštepriznata, a takoĊe je poznato i da neki lišajevi u simbiozu ukljuĉuju dva ili više organizma

(Nash, 1996). Ova asocijacija nije jednostavna kombinacija dva organizma već simbioza u kojoj

gljiva ĉini talus ili telo, u kome su smešteni fitobionti (Ahmadijan, 1993). Iz genetiĉke i

evolucione perspektive lišajevi se mogu posmatrati kao individue i ta ĉinjenica ima velike

implikacije u mnogim oblastima istraţivanja, kao sto su razvojne i reproduktivne studije. Sa

ekološke taĉke gledišta lišajevi su jako sloţeni i neki autori smatraju da je lišaj minijaturni

ekosistem (Farrar, 1976).

Mnoga istraţivanja odnosa izmeĊu lišajeva navode se kao klasiĉan primer mutualizma, u

kojem svi partneri iz asocijacije imaju koristi. Alternativno, lišajevi se smatraju kao primer

kontrolisanog parazitizma, jer gljive dobijaju većinu prednosti i fitobionti rastu sporije u

lišajskom stanju nego kao slobodno ţiveći (Ahmadijan, 1993). Lišajska simbioza podrazumeva

blisku fiziološku integraciju. Obiĉno dominira mikobiont jer kao heterotrofni organizam ugljene

hidrate dobija iz fitobionta (Smith i Douglas, 1987).

Morfologija lišajskog talusa je pod snaţnim uticajem fitobionta i direktnog kontakta sa

mikobiontom. U prirodi postoje nekoliko sluĉaja u kojima je isti mikobiont u stanju da formira

dva veoma razliĉita tipa talusa zavisno da li stupa u kontakt sa cijanobakterijom ili zelenom

algom (Elix, 1996). Pojavu razliĉitih morfoloških tipova podrazumeva ontogenetsku kontrolu od

strane fitobionta. Kulture u kojima se nalaze samo mikobionti ostaju relativno amorfne i razvoj

talusa se javlja prvi put kad doĊu u kontakt sa svojim fitobiontom (Ahmajdan, 1933). Lišajska

simbioza je jako uspešna i nalazi se u skoro svim tresetnim staništima od tropskog do polarnog

regiona (Nash, 1996).

10

1.1 Lišajevi kao izvori biomedicinskih agensa

Neke vrste lišajeva se koriste kao hrana, izvor pigmenata (boja), u proizvodnji alkohola i

industriji parfema (Kirmizigül i sar., 2003). Pored toga ovi organizmi su korišćeni u

tradicionalnoj medicini u leĉenju bolesti (Malhotra i sar., 2008) . Lišajevi sintetišu razliĉite

sekundarne metabolite koji uglavnom potiĉu iz gljiva. Obiĉno se izoluju iz lišajeva organskim

putem zbog slabe rastvorljivosti u vodi (Otzurk i sar., 1999). Upotreba lišajeva u medicini se

zasniva na ĉinjenici da oni sadrţe biološki aktivne supstance. Ove supstance ispoljavaju širok

spektar bioloških radnji ukljuĉujući antibiotsko, antimikotiĉko, antivirusno, anti-inflamatorno,

analgetsko, antipiretsko, antiproliferativno i citotoksiĉno delovanje (Kosanić i sar., 2012;

Manojlović i sar., 2010).

Više od stotinu sekundarnih metabolita je otkriveno i izolovano iz lišajeva. To su

uglavnom monoaromatici, depsidi, depsidoni, pulvinati, dibenzofurani, antrahinonini i

ksantonini. Hemijska struktura klasa ovih jedinjenja je sliĉna pa je njihova identifikacija veoma

teška (Ranković i sar., 2012).

Priroda antioksidativnog delovanja lišajeva se tek rasvetljava. Antioksidativna aktivnost

vodenog ekstrakta Cladonia islandica je opisana od strane Gulcin i saradnika (2002). Na osnovu

ove informacije ispitani su ekstrati Cladonia foliacae, Dermatocarpon miniatum, Evernia

divaricata, Evernia prunastri, Neofuscella pulla (Aslan i sar., 2006). Metanolni ekstrakti

testiranih lišajeva nisu pokazali znaĉajnu antioksidativnu aktivnost i nijedan od njih nije bio

efikasan u inhibiciji oksidacije linolne kiseline, osim u sluĉaju Dermatocarpon miniatum.

UporeĊivanjem antioksidativnog kapaciteta ekstrakta i njegovog sadrţaja fenolnih jedinjenja

došlo se do zakljuĉka da antioksidativna priroda ekstrakta zavisi od fenola, naroĉito polifenola

(Behera i sar., 2005).

Aslan i saradnici (2006) su pokazali da ekstrati navedenih vrsta lišajeva imaju i

antibakterijsku aktivnost. Ekstrakt sa najvećom antibakterijskom aktivnošću dobijen je iz

Evernia divericata i on je izazvao inhibiciju rasta 20 bakterijskih vrsta od testiranih 35 vrsta.

Antibakterijska aktivnost ostalih vrsta lišajeva se po jaĉini moţe predstaviti na sledeći naĉin:

Cladonia foliacae > Neofuscelia pulla > Evernia prunastri > Dermatocarpon miniatum. Osim

Dermatocarpon miniatum, ostale ĉetiri lišajske vrste pokazale su i antifungalnu aktivnost ali

nijedna vrsta nije delovala na Candidu sp.

11

Studija Yilmaza i saradnika (2003) demonstrirala je antimikrobnu aktivnost ekstrakta

Cladonia foliacea protiv devet vrsta bakterija i devet vrsta patogenih gljiva. Acetonski ekstrakt

Cladonia foliacea inhibira rast bakterija Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus

subtilis, Proteus vulgaris, Aeromonas hydrophila, Streptococcus faecalis, Listeria

monocytogenes i kvasca Candida albicans, Candida glabrata. Na osnovu ovih rezultata moţe se

zakljuĉiti da ekstrakt Cladonia foliacea ne utiĉe na rast gram pozitivnih bakterija i filomentoznih

gljiva.

U drugim publikacijama o lišajskim vrstama (Perry i sar., 1999) otkriveno je da neki

pripadnici roda Cladonia sp. i Usnea sp. imaju vrlo aktivne sastojke. Dokazano je da dve vrste

Cladonia sadrţe frakcije koje deluju na tri vrste ćelijskih linija kancera (Bézivin i sar., 2002).

Proteklih godina sprovedena su mnoga istraţivanja kako bi se našli novi biološki insekticidi. U

tu svrhu korišćeni su razliĉiti organizmi kao što su biljke i bakterije kako bi se razvili novi

produkti (Mehlhom i sar., 2005). Samo nekoliko komponenti biološkog porekla je komercijalno

dostupno (Cetin i sar., 2004). Dokazano je da Cladonia foliacea ima veliku larvicidnu aktivost

na larve kućnog komarca Culex pipiens (Cetin i sar., 2008).

Sistematika vrste Cladonia foliacea

Carstvo: Fungi

Kolo: Ascomycota

Klasa: Lecanoromycetes

Red: Lecanorales

Familija: Cladoniaceae

Rod: Cladonia

Vrsta: Cladonia Foliacea

Slika 1. Cladonia foliacea (Preuzeto od Ballingeary, Co. Cork. 2009)

12

1.2 Sistematika i morfologija vrste Drosophila melanogaster

Ime Drosophila (ljubitelj „rose“, „teĉnosti“) potiĉe od švedskog entomologa Carl-a

Frederick-a Fallen-a. Drosophila melenogaster pripada familiji Drosophilidae, koja pripada rodu

Diptera (Markow i sar., 2005). Familija Drosphilidae je raspodeljena u 75 rodova, u okviru kojih

se nalazi veliki broj vrsta (Yassin, 2013).Vrsta Drosophila melanogaster pripada specijalnoj

grupi melanogaster iz podreda Sophophora, koji sadrţi oko 174 vrsta (Kopp i sar., 2002).

Sistematika vrste Drosophila melanogaster

Carstvo: Animalia

Kolo: Arthropoda

Klasa: Insecta

Red: Diptera

Familija: Drosophilidae

Rod: Drosophila

Vrsta: Drosophila melanogaster

Slika 2. Drosophila melanogaster (Preuzeto od Jan Polabinski i Stockphoto, 2013)

Drosophila melanogaster ili takozvana voćna mušica je omiljeni „model“ organizam za

genetska istraţivanja (Kimball, 2014). Drosophila melanogaster je sitan insekt, dugaĉak 3 mm i

širine 2 mm. Kao i svi insekti Drosophila je prekrivena hitinoznim egzoskeletom. Odrasla

jedinka je ţuto-braon boje (Miller, 2000). Telo voćne mušice se sastoji od glave, grudnog koša

(toraks) i abdomena. Grudni koš je sagraĊen od tri segmenta T1, T2, i T3. Svaki segment nosi

par nogu. Kod većine inskta segmenti T2 i T3 nose po jedan par krila. MeĊutim, muve pripadaju

rodu Diptera, koji imaju samo jedan par krila na T2 segmentu. Treći torakalni segment T3

umesto krila nosi organe za balansiranje, koji se zovu halteri (Kimball, 2014).

13

Slika 3. Drosophila melanogaster morfologija (Preuzeto od http://www.the-scientist.com)

Na glavi vrste Drosophila melanogaster se nalaze krupne i sloţene oĉi crvene boje

sastavljene od više omatida. Oĉni disk se moţe naći kod Drosophila larve ĉim se one pojave iz

jajeta (Kaliss, 1939) i poznato je da se njegova veliĉina povećava tokom larvenih stupnjeva

prvenstveno kroz ćelijske deobe (Hadorn, 1965). U kasnom larvenom stupnju i poĉetkom faze

pupa izdvaja se grupa ćelija koje će na kraju postati definitivne omatide (Chen, 1929; Shatoury i

Waddington, 1957). Na glavi su smeštene i kratke segmentisane antene koje se završavaju

ĉulnom ĉekinjom-aristom (Miller, 2000). Usni aparat je prilagoĊen za srkanje teĉne hrane

(Miller, 2000).

Slika 4. Drosophila melanogaster glava (Preuzeto od http://www.psmicrographs.co.uk)

14

Na ventralnoj strani grudnog koša Drosophila melanogaster ima tri para segmentisanih

nogu na kojima se razlikuju: kuk (coxa), trohanter, butni deo, tibija i tarsus (Markow i sar.,

2005). Jedna od morfoloških karakteristika Drosophilidae je polni ĉešalj koji se nalazi na

prvom tarzalnom zglobu protorakalne noge muţjaka, ali se nikada ne javlja kod ţenke. Muţjaci

Drosophila melanogaster imaju jedan "ĉešalj" od 10-12 morfološki razliĉitih ĉekinja na zadnjem

delu prvog tarzalnog segmenta. Povremeno se javlja kao anomalija jedna ili više ĉekinja na

drugim segmentima zgloba prvog ili drugog para nogu (Patterson i sar., 1943).

Determinacija pola kod Drosophila melanogaster je sliĉna kao i kod drugih organizma,

ukljuĉujući i ljude sa jednim velikim izuzetkom. Kod Drosophila melanogaster postoje ĉetiri

para hromozoma, tri autozomna para i jedan par polnih hromozoma. Kao i kod ljudi, muţjaci

Drosophila melanogaster su heterogameti i imaju X i Y hromozome, dok su ţenke homogameti

i imaju par X hromozoma. Za razliku od ljudi kod kojih prisustvo Y hromozoma odreĊuje muški

pol, kod Drosophila melanogaster prisustvo X hromozoma odredjuje pol. Dakle XY i XO su

fenotipski muţjaci, dok su XX i XX fenotipski ţenke.

Postoji još nekoliko vidljivih kriterijuma koji se koriste za identifikaciju pola odrasle

Drosophila melanogaster. Najbrţi i najpouzdaniji kriterijum za odreĊivanje pola odrasle muve je

prisustvo polnog ĉešlja koji se nalazi na prvom segmentu zgloba prednjih nogu muţjaka. Polni

ĉešalj je odsutan kod ţenke. U principu, ţenke su veće od muţjaka, abdomen ţenka je ĉesto

oteĉen zbog sazrevanja jaja. Muţjaci imaju tamniji pigment na zadnjem delu dorzalne strane

stomaka. Ove razlike podleţu starosti i varijaciji i samim tim su manje pouzdane za utvrĊivaje

pola (http://www.vanderbilt.edu/).

Slika 5. Drosophila melanogaster

izgled muţjaka i ţenke (Preuzeto od

http://www.savoirs.essonne.fr )

♀

♂

15

1.3 Ciklus razvića

Drosophila melanogaster je holometabolni insekt tj. insekt koji ima stadijum larve i lutke

pre odraslog stupnja. Odrasle jedinke Drosophila melanogaster mogu ţiveti više od 10 nedelja i

u toku ovog vremena odvija se parenje. Ţenke Drosophila melanogaster dostiţu vrhunac

proizvodnje jajnih ćelija izmeĊu ĉetvrtog i sedmog dana nakon njihovog pojavljivanja. Oplodnja

je unutrašnja. Ţenke legu od 50-70 jaja na dan ( http://www.d.umn.edu ).

Drosophila melanogaster se uzgaja na hranljivoj podlozi koja joj omogućava kompletni

ţivotni ciklus i razvoj od oploĊenog jajeta do odrasle jedinke. Odrasle jedinke Drosophila

melanogaster imaju visoku reproduktivnu sposobnost. Ţenka moţe da proizvede 3000

potomaĉkih jedinki tokom svog ţivota i ima posebne organe za skladištenje sperme ("spermateke

i semene posude") koje joj omogućavaju da proizvede nekoliko stotine potomaĉkih jedinki

nakon jednog parenja. (http://www.mheducation.com/). Jaja su pribliţno pola milimetra, bela,

ovalna i izgledaju kao jezgro pirinĉa (http://www.d.umn.edu). Ona su dobro snabdevena

ţumancem koje omogućava embrionalni razvoj (http://www.mheducation.com/).

Embrion završava svoj razvoj u roku od 24 h, neki rani dogaĊaji se dešavaju brzo tako da

se lako mogu pratiti. U ranoj fazi razvoja embriona jezgro zigota se deli svakih 10 minuta.

Embriogeneza se završava pojavom larve prvog stupnja koja je specijalizovana za ishranu i

dramatiĉno raste. Larva kreće sa rastom nakon 24 h i 48 h nakon izleganja prelazeći u larve

drugog i trećeg stupnja. Oko šestog dana larva trećeg stupnja završava rast, izlazi iz podloge i

uĉauri se (stadijum pupe). Vreme svakog presvlaĉenja inicirano je od strane hormona-egdizona.

U stadijumu pupe, larve prolaze kroz metamorfozu i dolazi do reorganizacije tela. Ova

reorganizacija traje oko 4 dana. Većina larvenih tkiva se zamenjuje srtukturama koje odlikuju

odrasle jedinke, putem proliferacije i diferencijacije ćelija. Javljaju se oĉi, noge, krila i genitalije

koje se transformišu iz imaginarnih diskova. Jedinke polno sazrevaju dva dana nakon napuštanja

ĉaure. Nakon sazrevanja, jedinke ostaju fertilne do kraja svog ţivota (Flagg, 1988).

16

Slika 6. Ţivotni ciklus Drosophila melanogaster (http://www.easternct.edu)

17

1.4 Drosophila melanogaster kao model organizam

Drosophila sp. se uspešno koristi više od jednog veka za studiju širokog spektra bioloških

procesa, ukljuĉujući genetiku i nasleĊivanje, embrionalni razvoj, uĉenje, ponašanje i starenje.

Iako ljudi i voćne mušice ne izgledaju sliĉno, poznato je da je većina osnovnih bioloških

mehanizma i puteva koji kontrolišu rast i opstanak konzervisano tokom evolucije ovih vrsta

( http://www.sciencedirect.com).

Od 1910. do 1920. skoro svi znaĉajni radovi vezani za Drosophila melanogaster

sprovedeni su u laboratoriji Thomas-a Hunt-a Morgan-a. Morgan je ubrizgavanjem soli u

reproduktivne ćelije lutaka pokušavao da izazove mutacije kod insekta s nadom da će izazvati

reproduktivne promene u narednoj generaciji. 1911. godine Morgan je prijavio devet mutacija

kod vrste Drosophila melanogaster (Roberts, 2006). On je osmislio imenovanje mutacija na

osnovu uoĉljivog fenotipa. Jedna od prvih mutacija koju je izazvao Morgan je poznata pod

imenom ’white’ i u ovom sluĉaju mutirane mušice imaju bele oĉi umesto crvenih.

1920. godine Muller je otkrio da X zraci mogu izazvati povećanje stope mutacija gena

kod Drosophila melanogaster. Iako su ozraĉene muve izgledale normalno, njihovi potomci su

ĉesto ispoljavali mutirani fenotip. To je dovelo do zakljuĉka da zraĉenje izaziva štetne genetske

efekte i kod potomaka ozraĉenih ljudi (http://www.sciencedirect.com).

1999. godine Craig Venter i njegove kolege su sekvencirali genom Drosophila

melanogaster kao predhodnicu sekvenciranju humanog genoma. PoreĊenje sekvenci genoma

Drosophila i Homo sapiensa otkrilo je da se 75% poznatih gena koji utiĉu na ljudske bolesti

nalaze i kod Drosophila. Od tada je Drosophila melanogaster priznata kao model organizam za

medicinska istraţivanja (http://www.sciencedirect.com).

Drosophila melanogaster se koristi kao model sistem za ispitivanje razliĉitih bolesti koje

se javljaju kod ljudi, kao i terapeutskih tretmana namenjenih njihovom leĉenju

(http://pharmrev.aspetjournals.org).

Drosophila melanogaster je svestran model organizam koji se koristi u biomedicinskim

istraţivanjima više od jednog veka. Postoje brojne tehniĉke prednosti korišćenja Drosophila

melanogaster kao modela nad ostalim kiĉmenjacima. Kulture Drosophila melanogaster se

jednostavno i jeftino odrţavaju u laboratorijskim uslovima. Voćne mušice imaju kratak ţivotni

ciklus što je zgodno za istraţivanja. Eksperimenti na Drosophila melanogaster su doprineli

18

razumevanju regenerativne biologije i nema sumnje da će u budućnosti doprineti razvoju

regenerativne medicine (http://www.sciencedirect.com).

19

2. Cilj rada

Cilj ovog rada bio je ispitivanje uticaja metanolnog ekstrata lišajske vrste Cladonia

foliacea na preţivljavanje i dinamiku razvića larvi Drosophila melanogaster.

20

3. Materijal i metode

3.1 Materijal

-U eksperimentu su korišćene larve vrste Drosophila melanogaster soja Oregon-RC

(Wild-type Stock No. 5, Bloomington, Indiana, USA), stare 3 dana;

-Metanolni ekstrakt lišajske vrste Cladonia foliacea

-Organski rastvaraĉ dimetil sulfoksid (DMSO) u konaĉnoj koncentraciji u podlozi od

0.3% (Carl Roth)

3.2 Metode

3.2.1 Pripremanje i prikupljanje lišajskog materijala

Lišajski uzorak Cladonia foliacea je sakupljen u Jelašniĉkoj klisuri, u Srbiji. Uzorci se

ĉuvaju u herbarijumu Departmana za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematiĉkog fakulteta u

Nišu. Determinacija lišajske vrste uraĊena je uz upotrebu standardnih kljuĉeva (Purvis i sar.,

1992; Wirth 1995).

3.2.2 Metode dobijanja ekstrakta iz lišajeva

Lišajevi su ĉuvani u papirnoj kesi na sobnoj temperaturi i tamnom mestu. Zatim se

lišajski materijal sitni elektriĉnim mlinom. 50gr. usitnjenog uzorka je estrahovano metanolom i

vodom. Ekstrakti su filtrirani i koncentrovani u rotacionom evaporatoru. Suvi ekstrakti su ĉuvani

na -18oC. Za potrebe testiranja ekstrakti su rastvoreni u koncentrovanom DMSO-u (Kosanić i

sar., 2010).

21

3.2.3 Priprema supstrata

Za pripremu supstrata potrebno je :

Kukuruzno brašno (10%)

Šećer (9%)

Kvasac (2%)

Agar (2%)

Nipagina®

(fungicid)

96% etanol

Destilovana voda

Od laboratorijskog materijala se koristi :

Menzura (250 ml)

Laboratorijska staklena ĉaša (250ml)

Stakleni štapić

Termometar

Rešo

Analitiĉka vaga

Supstrat se priprema tako što se šećer, kukuruzni griz, kvasac i agar odmere na analitiĉkoj

vagi i zatim prebace u laboratorijsku staklenu ĉašu. Supstance se prelivaju destilovanom vodom i

kuvaju odreĊeno vreme uz povremeno mešanje staklenim štapićem. U meĊuvremenu se odmeri

Nipagina®

i prelije 96% etanolom. Rastvor Nipagina®

se pomeša sa supstratom nakon njegove

pripreme.

3.2.4 Priprema serije tretman podloga sa rastvorom metanolnog ekstrakta lišajske vrste

Cladonia foliacea

Od laboratorijskog posuĊa potrebno je:

-Epruvete od 1,5 ml (Eppendorf, Germany)

-Automatske pipete (Eppendorf, Germany) od 200 µl i 1000 µl

-Nastavci za pipete

22

Koncentrovani rastvor metanolnog ekstrakta u DMSO-u dodavan je u podlogama koje su

prohlaĊene do temperature od 45oC nakon ĉega je izvršena homogenizacija na magnetnoj

mešalici. Na ovaj naĉin pripremljene su tretman podloge sa finalnim koncentracijama

metanolnog ekstrakta od 500 µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 72.5 µg/ml; 36.25 µg/ml i dve

kontrole, negativna - vodena i pozitivna - DMSO. Svaki tretman je uraĊen u triplikatu.

3.2.5 Postupak dobijanja larvi Drosophila melanogaster starih 3 dana

Da bi se dobile larve vrste Drosophila melanogaster stare 3 dana, muţjaci i ţenke stare 5

dana se izoluju iz kulture i prebacuju u teglicu na odreĊenom supstratu da se pare. Nakon dva

dana ţenke se prebacuju u Petri šolje sa supstratom i polaţu jaja narednih 8 sati. Potom se ţenke

izbacuju iz Petri šolje, a na supstratu ostaju jaja iz kojih će se izleći larve.

Prilikom izraĉunavanja starosti larvi treba imati na umu, da je polovina intervala od

ukupnog intervala poleganja larvi, ustvari nulto vreme od kog se kreće sa raĉunanjem starosti

larvi.

3.2.6 Postavka eksperimenta

Za izvodjenje eksperimenta potrebno je:

-Plastiĉni flakoni;

-Larve vrste Drosophila melanogaster;

-Rastvori ekstrakta lišaja Cladonia foliacea (razliĉite koncentracije);

-Eza;

-Binokularna lupa;

-Ependorf pipete-pipetmani (200µl; 1000 µl);

-Nastavci za pipetman;

-Magnetna mešalica;

-Makaze;

-Vata;

-Plastificirana folija;

-Marker.

23

Kada se pripremljena tretman-podloga ohladi sledi prebacivanje larvi. Larve se prebacuju

pomoću eze pod binokularnom lupom. U svaku koncetraciju stavlja se po 20 larvi nakon ĉega se

flakoni zatvaraju tuferima od vate. Na svakom flakonu se zabeleţi koncetracija rastvora, datum

postavljenja eksperimenta i soj mušice koji je korišćen u testiranju i broj replikata. Ovako

obeleţeni flakoni su prebaĉeni u inkubator sa temperaturom od 25±1 Co i vlaţnošću od 60% i

dnevno noćnim reţimom 12/12h.

Svakog dana praćene su promene u flakonima. Od momenta pojave prvih lutki i adulta

(7-og dana od polaganja jaja) beleţi se broj ulutkanih jedinki svakog dana kao i broj izleglih

jedinki do završetka razvića svih jedinki.

24

4. Rezultati

Od prvog dana postavke eksperimenta sve do završetka ţivotnog ciklusa larvi beleţen je

broj ţivih i mrtvih larvi, broj ulutkanih larvi i broj izleglih adulta. Na osnovu ovih rezultata

izraĉunate su srednje vrednosti broja ulutkanih jedinki i adulta koji su se izlegli sa standardnim

devijacijama, kao i dinamika ulutkavanja i izleganja.

4.1. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija metanolnog ekstrakta lišajske

vrste Cladonia foliacea na konačan broj ulutkanih jedinki i adulta koji su se

izlegli

Grafik 1. Konaĉan broj ulutkanih jedinki. Legenda prikazuje koncentracije rastvorenog metanolnog ekstrakta

Cladonia foliacea u tretman podlogama kao i kontrole.

Na Grafiku 1. prikazane su srednje vrednosti broja ulutkanih jedinki sa standardnom

devijacijom. Na grafiku se vidi da povećanje koncentracije metanolnog ekstrakta lišajske vrste

Cladonia foliacea izaziva blago smanjenje konaĉnog broja ulutkanih jedinki ali ne znaĉajno.

Tretman podloga gde je koncentracija 250 µg/ml je najpribliţnija kontroli i blago odstupa od

ostalih vrednosti ali takoĊe beznaĉajno.

25

Grafik 2. Konaĉan broj adulta koji su se izlegli. Legenda prikazuje koncentracije rastvorenog metanolnog ekstrakta

Cladonia foliacea u tretman podlagama kao i kontrole.

Na osnovu broja izleglih adulta na razliĉitim tretman podlogama konstruisan je Grafik 2.

Kao i na prethodnom grafiku moţe se videti da razliĉite koncentracije metanolnog ekstrakta

lišajske vrste Cladonia foliacea u podlogama ne utiĉu znaĉajno na konaĉan broj izleglih adulta.

Pri tom u tretman podlozi sa koncentracijom od 250 µg/ml broj izleglih adulta je najpribliţniji

kontroli kao i u sluĉaju broja ulutkanih jedinki u poreĊenju sa ostalim grupama.

26

4.2. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija metanolnog ekstrakta lišajske

vrste Cladonia foliacea na dinamiku ulutkavanja i izleganja

Grafik 3. Dinamika ulutkavanja. Legenda prikazuje koncentracije rastvorenog metanolnog ekstrakta Cladonia

foliacea u tretman podlogama kao i kontrole.

Na Grafiku 3. su predstavljani rezultati dinamike ulutkavanja u tretman podlogama i

kontrolama. Na X osi su prikazani dani posmatranja od momenta prvog ulutkavanja, dok je na Y

osi predstavljen broj jedinki. Na grafiku se jasno vidi da u tretman podlogama sa razliĉitim

koncentracijama metanolnog ekstrakta Cladonia foliacea, Drosophila ne kasni sa ulutkavanjem

u odnosu na kontrolu sa rastvaraĉem (DMSO-om). U poreĊenju sa vodenom kontrolom

ulutkavanje kod svih tretman podloga metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia foliacea se

odigrava dan ranije.

27

Grafik 4. Dinamika izleganja. Legenda prikazuje koncentracije rastvorenog metanolnog ekstrakta Cladonia foliacea

u tretman podlogama kao i kontrole.

Na osnovu grafiĉkog prikaza (Grafik 4.) se vidi da u tretman podlogama gde je

koncentracija metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia foliacea 72.5 µg/ml, 125 µg/ml i 500

µg/ml vrhunac izleganja jedan dan kasniji u odnosu na vodenu kontrolu, dok se poklapa sa

vrhuncem izleganja u kontroli sa rastvaraĉem (DMSO). Izuzetak je tretman podloga sa

koncentracijom metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia foliace od 250 µg/ml u kojoj se

vrhunac izleganja poklapa sa vodenom kontrolom.

28

5. Diskusija

Cilj ovog rada bio je ispitivanje uticaja metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia

foliacea na preţivljavanje i razvoj larvi Drosophila melanogaster.

Kao rastvaraĉ metanolnog ekstrakta je DMSO u finalnoj koncentraciji od 0.32% za

koji se iz prethodnog istraţivanja zna da je to maksimalna koncentracija koju larve tolerišu

(Todorović, M., 2014). Na osnovu dobijenih rezultata moţe se zakljuĉiti da razliĉite

koncentracije metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia foliacea ne utiĉu znaĉajno na

ulutkavanje i izleganje larvi Drosophile melanogaster. Primećeno je da je na tretman podlogama

sa koncentracijama metanolnog ekstrakta od 36.35 µg/ml, 72.5 µg/ml, 125 µg/ml i 500 µg/ml

broj ulutkanih i izleglih jedinki neznatno niţi nego u kontrolama. Na tretman podlozi sa

koncentracijom metanolnog ekstrakta od 250 µg/ml broj ulutkanih i izleglih larvi najpribliţniji

broju dobijenom u kontrolama. TakoĊe nije zapaţena povećana smrtnost larvi Drosophila

melanogaster na nivou lutki već je broj ulutkanih i izleglih jedinki skoro potpuno isti.

Što se tiĉe dinamike ulutkavanja na Grafiku 3. se jasno moţe uoĉiti da jedinke vrste

Drosophila melanogaster ne kasne sa ulutkavanjem, pa samim tim ni sa izleganjem (Grafik 4.) u

odnosu na kontrolu sa rastvaraĉem (DMSO). MeĊutim, u poreĊenju sa vodenom kontrolom,

vrhunac ulutkavanja kod svih tretman podloga je dan ranije, sa izuzetkom tretman podloge gde je

koncentracija metanolnog ekstrakta 250 µg/ml ĉiji se vrhunac izleganja poklapa sa vrhuncem

izleganja u vodenoj kontroli. Kada je u pitanju dinamika izleganja u tretman podlogama gde je

koncentracija metanolnog ekstrakta lišajske vrste Cladonia foliacae 72.5 µg/ml, 125 µg/ml i 500

µg/ml vrhunac izleganja je dan kasnije u odnosu na vodenu kontrolu, a istog dana kada i u

kontroli sa rastvaraĉem (DMSO).

Na osnovu svih rezultata utvrĊeno je da metanolni ekstrakt lišajske vrste Cladonia

foliacea u koncentracijama do 500 µg/ml ne deluje štetno na preţivljavanje i dinamiku razvića

larvi Drosophila melanogaster. Mala odstupanja koja se javljaju u dinamici izleganja i

ulutkavanja najverovatnije potiĉu od dejstva rastvaraĉa (DMSO), jer se ta odstupanja mogu

uoĉiti u kontrolama sa DMSO-om. Zato bi ipak trebalo da se koriste malo niţe koncentracije od

0.32% kao finalne koncentracije u tretman supstratu.

29

Postoji nekoliko radova u kojim je ispitivano antioksidativno i antimikrobno dejstvo

ekstrakta lišajske vrste Cladonia foliacea. Jedan od radova svedoĉi o antioksidativnom i

antimikrobnom dejstvu vrste Cladonia foliacea gde je utvrĊeno jako antimikrobno dejstvo

ekstrakta lišajske vrste Cladona foliacea na neke patogene sojeve bakterija (Aslan i sar., 2006).

U radu C.Bézivin-a i saradnika (2003) utvrĊeno je da lišajska vrsta Cladonia foliacea ima

citotoksiĉno delovanje na odreĊenoj liniji humanih ćelija kancera. Imajući sve ove podatke u

vidu i to da metanolni ekstrakt lišajske vrste Cladonia foliacea nije toksiĉan u koncetracijama do

500 µg/ml, mogu se preporuĉiti dalja istraţivanja na drugim model-organizmima kako bi se

došlo do novih saznanja o potencijalu za leĉenje odreĊenih patoloških stanja uz pomoć ovog

ekstrakta. Pošto sam ekstrakt predstavlja smešu razliĉitih jedinjenja trebalo bi raditi i na izolaciji

i preĉišćavanju aktivnih komponenti i njihovom daljem ispitivanju.

30

6. Zaključci

-Metanolni ekstrakt lišajske vrste Cladonia foliacea ne utiĉe štetno na preţivljavanje larvi

Drosophila melanogaster do finalne koncentracije od 500 µg/ml.

-Nema zabeleţene znaĉajne smrtnosti kako na larvenom tako i na pupalnom nivou.

-Na osnovu dobijenih rezultata preporuĉuju se dalja istraţivanja bioloških efekata samog

metanolnog ekstrakt lišajske vrste Cladonia foliacea ili njegovih preĉišćenih komponenti na

drugim višim model organizmima.

31

7. Literatura

Agar, G., i sar., 2011: Protective activity of the methanol extract of Usnea longissima against

oxidative damage and genotoxicity coused by aflatoxin B1 in vitro. –Turkish Journal of Medical

Sciences 41 (6): 1043-1049.

Altun, D., i sar., 2010: Drosophila melanogaster ’de Certaria islandica (L.) Ach. Likeninin

Koruyu Etkisinin Belirlenmesi. – Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi 1: 26-33.

Aslan, A., i sar., 2006: Antioxidant and Antimicrobial Properties of the Lichens Cladonia

foliacea, Dermatocarpon miniatum, Evernia diviaricata, Evernia prunastri, and Neotuscella

pulla. - Journal of Pharmaceutical Biology 44: 247-252.

Beckingham, K., i sar., 2005: Drosophila melanogaster- the model organism of choice for the

complex biology of multi-cellular organisms. Gravitational and Space Research 18 (2): 17-30.

Bézivin, C., i sar., 2003: Cytotoxic activity of some lichen extracts on murine and human cancer

cell lines. – Phytomedicine 10: 499-503.

Brehme, K. S. 1938: A study of the effect on development of "minute" mutations in Drosophila

melanogaster. – Genetics 24: 131-161.

Coyne, J. A. & Oyama, R. 1995: Localization of pheromonal sexual dimorphisam in Drosophila

melanogaster and its effect on sexual isolation. – Proceedings of the National Academy of

Sciences 92: 9505-9509.

Demerec, M. & Kaufman, B. P. 1996: Drosophila Guide. – Carnegie Institution of Washington,

Washington.

Hanly, E. W. & Hemmert, W. H. 1967: Morphology and development of the Drosophila eye. –

Journal of Embryology and Experimental Morphology 17(3): 501-511.

Hannah-Alava, A., 1958: Developmental Genetics of the Posterior legs in Drosophila

melanogaster. - Genetics 43 (5): 878-905.

Kosanić, M., i sar., 2012: Antioxidant, antimicrobial and anticancer activities of three Parmelia

Species. – Journal of the Science of Food and Agriculture 92: 1815-2016.

Kosanić, M., i sar., 2012: Antioxidant, Antimicrobial, and Anticancer Activity of 3 Umbilicaria

Species. – Journal of Food Science 71: 20-25.

Kosanić, M., i sar., 2013: Evernia prunastri and Pseudoevernia furfuraceae lichens and their

major metabolites as antioxidant, antimicrobial and anticancer agents. – Food and Chemical

Toxicology 53: 112-118.

32

Kosanić, M., Ranković, B., 2010: Screening of antimicrobial activity of some lichen Species in

vitro. – Kragujevac Journal of Science 32: 65-75.

Liu, X., i sar., 2009: Differential Toxicity of Carbon Nanomaterials in Drosophila: Larval

Dietary Uptake is Benign, but Adult Exposure Causes Locomotor Impairment and Mortality. –

Environmental Science & Technology 43 (16): 6357-6363.

Malhotra, S., Subban, R., & Singh, A. 2008: Lichens-role in traditional medicine and drug

discovery. The Internet Journal of Alternative Medicine, 5 (2).

Manojlović, N., i sar., 2012: Chemical composition of three Parmelia lichens and antioxidant,

antimicrobial and cytotoxic activites of some their major metabolites. – Phytomedicine 19: 1166-

1172.

Mitrović, T., i sar., 2011: Antioxidant, Antimicrobial and Antiproliterative Activities of Five

lichen Species. – International Journal of Molecular Sciences 12: 5428-5448.

Mitrović, T., i sar., 2011: Lichens as source of versatile biactive compounds. – The Journal

Biologica Nyssana 2 (1): 1-6.

Miyazawa, M., i sar., 1998: Insecticidial Alkaloids against Drosophila melanogaster from

Nuphar japonicum D. C. – Journal of Agricultural and Food Chemistry 46: 1059-1063.

Miyazawa, M., i sar., 1998: Insecticidial Alkaloids from Corydialis bulbosa against Drosophila

melanogaster. – Journal of Agricultural and Food Chemistry 46: 1914-1919.

Miyazawa, M., i sar., 2000: Insectidial Sesquiterpene from Alpinia oxyphylla against Drosophila

melanogaster. - Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 3639-3641.

Nash, T., 1996: Lichen biology. – The press syndicate of the University of Cambridge, United

Kingdom.

Nigel B. PERRY., i sar., 1999: Antimicrobial, antiviral and cytotoxic activity of new Zealand

lichens. – Lichenologist 31(6): 627–636 (1999)

Osyczka, P., i sar., 2001: Note on Cladonia species (lichenized Ascomycota) from Ardahan

province (Tyrkey). – Acta Societatis Botanicorum Poloniae 80 (1): 59-62.

Ranković, B., i sar., 2011: Antioxidant, antimicrobial and anticancer activity of the lichens

Cladonia furcata, Lecanora atra and Lecanora muralis. – BMC Complementary and Alternative

Medicine 11: 97.

Ranković, B., i sar., 2012: Biological Activities of Taninia candida and Usnea barbata Together

with Their Norstictic Acid and Usnic Acid Constituents. – International Journal of Molecular

Sciences 13: 14707-14722.

33

Ranković, B., Mišić, M., Sukdolak, S., 2008: The antimicrobial activity of substances derived

from the lichens Physcia aipolia, Umbilicaria polyphylla, Parmelia caperata and Hypogimnia

physodes. – World Journal of Microbiology and Biotechnology 24: 1239-1242.

Roberts, D., 2006: Drosophila melanogaster: The model organism. – Entomologia

Experimentalis et Applicata 121 (2): 93-103.

Sandhu, A. A., Lone, K. P. 2004: Effect of Diethylstilbestrol on the Development of Drosophila

melanogaster: Studies on Nucleic Acids and Proteins. – Pakistan Journal of Zoology 36 (4):

313-317.

Smith, D. C., Douglas, A. E., 1987: The biology of symbiosis. – Edward Arnold, London.

Srivastava, P., i sar., 2013: In vitro evaluation of some Indian lichens against human pathogenic

bacteria. – Mycosphere 4: 734-743.

Todorović, Miljana 2014: Uticaj dimetil sulfoksida (DMSO) na razvoj larvi vrste Drosophile

melanogaster, Master thesis, - Prirodno matematiĉki fakultet, Niš.

Yilmazª, M., i sar., 2004: The Antimicrobial Activity of Extracts of the lichen Cladonia foliacea

its (-) – Usnic Acid ,Atranorin, and Fumarprotocetraric Acid Constituens. – Z. Naturforsch 59c:

249-254.

http://www.vanderbilt.edu

http://www.d.umn.edu

http://www.mheducation.com

http://www.sciencedirect.com

http://pharmrev.aspetjournals.org

www.kat-chem.hu/en/prod-bulletins

34

Образац Q4.09.13 - Издање 1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Aрсић

Ментор, МН: Татјана Митровић

Наслов рада, НР: Утицај метанолног екстракта лишајске врсте Cladonia foliacea на

преживљавање и динамику развића ларви Drosophila melanogaster.

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2015

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО:

(поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

33 стр.; 6 слика; 4графика

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: токсикологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Cladonia foliacea, Drosophila melanogaster, токсичност

УДК 582. 28 : 595.773

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Испитиван је утицај метанолног екстракта лишајске врсте Cladonia foliacea

(Huds.) Willd. На преживљавање и динамику развића ларви Drosophila

melanogaster. Екстракт је растворен у DMSO-у и умешан у третман подлоге у

коначним концентрацијама 500 µg/ml, 125 µg/ml, 72.25 µg/ml, 36.25 µg/ml.

Поред третман подлога, поставлјене су негативна контрола са дестилованом

водом, као и контрола растварача. Сви ттретмани укључујући и контроле

рађени су трипликату. нЗапажено је да метанолни екстрактн у DMSO-у не

утиче негативно на преживљавање ларви, изазива брже улуткавање за један

дан и успорава излеганје у појединим третманима са задршком од једног дана у

односу на водену контролу.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО: 26.02.2015 Чланови комисије, КО: Председник: Члан:

Члан,

ментор:

Проф. Др. Митровић Љ.Татјана

35

Образац Q4.09.13 - Издање 1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Jelena Arsić

Mentor, MN: Tatjana Mitrović

Title, TI: The influence of the methanol extract of lichen species Cladonia foliacea on the

survival and dynamics of development of larvae Drosophola melanogaster

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2015

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD:

(chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appen

dixes)

33 p. ; 6 pictures; 4 graphics

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: toxicology

Subject/Key words, S/KW: Cladonia foliacea, Drosophila melanogaster, toxicity

UC 582. 28 : 595.773

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: The influence of the methanol extract of lichen species Cladonia foliacea on the

survival and dynamics of Drosophila melanogaster larvae development is

investigated. The extract was dissolved in DMSO and was stirred into the treatment

of the substrate in the final concentrations 500 µg/ml, 250 µg/ml, 72.5 µg/ml, 36.25

µg/ml. In addition to the treatment surfaces, negative control and distilled water

were set as well as the solvent control. All treatments, including controls are set out

in triplicate. It was observed that the methanol extract dissolved in DMSO does not

adversely affect the survival of larvae, causes faster pupation rate in one day and

slows the hatching in individual treatments with a setback of one day in comparison

to the water control.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE: 26.02.2015

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor: Prof. Dr. Tatjana Mitrović