PILON Rémi Juin - Août 2006 Master 1 de Biologie des Populations Université Blaise Pascal et des Ecosystèmes Clermont-Ferrand

Détermination de marqueurs biologique pour identifier des microbes de type r et K du « priming effect » dans

les sols de prairie – approche isotopique a l’aide de cellulose marquée en 13C

Responsable de stage : FONTAINE Sébastien

SOMMAIRE

INTRODUCTION………………...…………..…...………………………………..1

ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE.......................................... 2

Priming effect .....................................................................2 Communautés bactériennes et PLFA..................................4

MATERIEL ET METHODE ................................................... 5

Protocole expérimental .......................................................5 Extraction des PLFA...........................................................6

RESULTATS ET DISCUSSION............................................. 8

Biomasse microbienne et « priming effect » ......................8 Marqueurs PLFA et isotopie 13C.........................................9 Quantification du Carbone et des PLFA.............................9 Isotopie..............................................................................11 Diversité microbienne.......................................................11 Discussion sur les systèmes de recherche.........................15

PERSPECTIVES ................................................................... 16 BIBLIOGRAHIE ................................................................... 17 TABLE DES FIGURES......................................................... 20 ANNEXE ............................................................................... 21

Le 20ème et le début du 21ème siècle ont été marqués par une augmentation alarmante des

impacts de l´activité humaine sur la biosphère (Vitousek et al. 1997; Mann et al. 1999). Par

exemple, la combustion d’énergie fossile et l’utilisation des sols (p.e. labour) ont libéré de grande

quantité de CO2 dans l’atmosphère (120 Giga tonnes de Carbone (C) depuis 1850, Houghton et

Skole, 1990). Cette pollution carbonée influence le climat terrestre au travers de l’effet de serre.

En moyenne, la température à la surface du globe a augmenté de 0,6°C depuis la fin du 19ème

siècle. La température moyenne en 1998 dans l’hémisphère nord n’a jamais été aussi élevée

depuis un millénaire (Mann et al., 1999).

Les plantes fixent le CO2 atmosphérique par photosynthèse et alimentent le sol en matières

organiques (MO). Les microbes du sol décomposent ces MO pour en tirer l’énergie et les

nutriments nécessaires à leur activité et produisent du CO2 et des déchets organiques récalcitrants

qui en s’accumulant forment ce qu’on appelle l’humus des sols. L’équilibre entre ces acteurs

déterminent donc l’accumulation de carbone dans les écosystèmes (stockage de C) et le recyclage

des nutriments essentiels au maintien des écosystèmes. Une modification de cet équilibre dans le

sens d’un stockage net de Carbone sous forme de MO est considérée comme un moyen de réduire

le réchauffement climatique (Kyoto 1997).

La composition et l´activité des communautés microbiennes des sols sont les facteurs

primordiaux des cycles biogéochimiques, du recyclage (turnover) de la MO, de la fertilité et de la

qualité des sols. Avec ces 1,5 millions d’espèces estimées, le compartiment « sol » est

l’écosystème le plus riche de la planète. Mais il est aussi le plus méconnu (Hawksworth, 1992).

On estime que les espèces recensées actuellement représentent à peine 5% de la diversité totale.

Longtemps négligée et considérée comme “boîte noire”, l´étude du compartiment microbien et

son rôle fonctionnel s´avère actuellement l´un des enjeux de l´écologie microbienne. Aucun des

modèles actuels utilisés pour prédire la réponse des écosystèmes face au réchauffement global ne

prend en compte cette diversité.

Le but de ce travail est de déterminer quel est le rôle fonctionnel des communautés

microbiennes dans la décomposition des MO récalcitrantes afin de mieux comprendre la

dynamique du carbone et des nutriments dans le sol.

1

ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE

Priming effect La minéralisation de la MO est dépendante de la nature biochimique de la MO qui est

apportée aux communautés microbiennes (Zyakun et al. 2005). Les différents éléments des

débris végétaux (sucres solubles, cellulose, lignine…) ne se décomposent pas à la même

vitesse (Tate 1995). Des composés vite métabolisables (sucres solubles, cellulose) apportent

une grande quantité d´énergie aux microbes. En revanche certains composés très polymérisés

(p.e. la lignine des végétaux) requièrent une production importante d’enzymes extracellulaires

(Tate 1995). Dans ce cas, l’énergie gagnée (absorption et respiration des catabolites) ne

compense pas ou peu l’énergie dépensée (fabrication des enzymes extracellulaires). Ces

composés sont dits récalcitrants et ne se décomposent pas ou très lentement. L’accumulation

de ces MO récalcitrantes d’origine végétale ou microbienne, pendant des millénaires, forme

l’humus des sols.

La faible qualité chimique et énergétique des éléments carbonés de la MO récalcitrante

limite fortement les activités microbiennes et donc la décomposition du carbone récalcitrant

du sol. Cependant, les décomposeurs seraient capables de dégrader le carbone récalcitrant du

sol en utilisant les substrats énergétiques contenus dans les MO fraîches (litière végétale)

(Lohnis 1926 ; Wu et al. 1993). En effet, il a été montré que l’apport de litière végétale

accélère la décomposition des MO du sol. Ce phénomène, communément appelé « priming

effect », n´a été que récemment démontré en microcosme (Wu et al. 1993 ; Kuzyakov et al.

1999, 2001 ; Fontaine et al. 2004a, 2004b).

Il a été proposé (Lundquist et al. 1999 ; Fontaine et al. 2003 ; Zyakun et al.2005) que

ce phénomène est modélisable par la présence de deux communautés microbiennes différentes

r et K. Les décomposeurs de type K seraient des microbes actifs mais lents capables de

minéraliser à la fois la MO récalcitrante et la MO fraîche. Les décomposeurs de type r en

revanche seraient capables de s’activer et de croître rapidement en présence de MO fraîche.

2

Ces microbes entrent en dormance ou meurent lorsque la MO fraîche est épuisée car ils ne

sont pas capables de dégrader les MO récalcitrantes des sols.

L’hypothèse (Fontaine et al. 2003) propose que la compétition pour l’acquisition de

substrat frais entre deux types microbiens distincts (r et K), détermine la vitesse de décomposition

des matières organiques récalcitrantes du sol et que les microbes r et K ont des dynamiques

différentes (cf. figure 1). Les r et les K augmentent leur biomasse pendant la décomposition

de la cellulose qui libère des substrats riches en énergie. Après épuisement de la MO fraîche,

les r s’effondrent et les K subsistent car ils sont capables d’utiliser les MO récalcitrantes en

attendant un nouvel apport de carbone frais.

0 20 160 80 jours

Biomasse microbienne

Stratégie K

Stratégie r

MO fraîche décomposée

Figure 1 : Modèle de Fontaine expliquant les dynamiques des microbes r et K suite à un ajout de matière organique fraîche au jour 0 (cellulose) pendant 160 jours. K : croissance lente ; r : croissance rapide. (Source : schéma personnel)

3

Communautés bactériennes et PLFA L’étude du compartiment microbien est complexe et fait face à de nombreux

problèmes techniques. 80 à 99% des microorganismes ne peuvent être caractérisés par des

techniques de cultures classiques (Amann et al. 1995).

Actuellement deux méthodes permettent d’évaluer précisément la biodiversité

microbienne. L’une s’appuie sur l’analyse de l’ADN ou de l’ARN ribosomal et l’autre sur les

acides gras phospholipidiques (PhosphoLipid Fatty Acid : PLFA) (Findlay et al. 1993, 1996).

L´analyse des PLFA semble être une méthode fiable pour la détection de rapides changements

dans les communautés microbiennes (Albers 1994 ; Albers et al. 1994). Toutefois ces

techniques ne seraient pas suffisantes sans l´utilisation des isotopes stables pour étudier le

transfert du carbone et des nutriments dans le compartiment microbien. Elles permettent ainsi

de déterminer le rôle fonctionnel de chaque communauté (Arao 1999 ; Zhang 2002).

Les phospholipides sont des composants essentiels des membranes de toutes cellules

vivantes. On ne les trouve ni dans les produits de stockage et ni dans les cellules mortes (vite

dégradées). De par leur constante proportion (30 à 40% des membranes), les phospholipides

apparaissent être de bons marqueurs de la biomasse et de la diversité des organismes

(Lechevalier 1989).

Des expériences réalisées avec les PLFA comme marqueurs montrent que l’apport de

MO fraîche a un impact sur la biomasse (Malosso et al. 2004) et enfin d’autres sur la diversité

et l’activité microbienne (Lu et al. 2004).

Cette étude prétend enrichir nos connaissances sur les communautés microbiennes qui

contrôlent le « priming effect » en utilisant les PLFA comme marqueurs des communautés

microbiennes. On devrait retrouver les dynamiques distinctes des microbes de type r et des

microbes de type K lors de l’analyse des PLFA. Pour cela, il a été mis en place une

expérimentation en conditions contrôlées avec apport de substrat frais (cellulose marquée) où

les populations microbiennes (biomasse et diversité) et leur activité sont contrôlées grâce à

l’analyse des PLFA microbiens et au marquage au 13C de la cellulose.

4

MATERIEL ET METHODE

Protocole expérimental Il s’agit d’une incubation contrôlée en laboratoire de 160 jours, de sols prélevés en

surface (5-20 cm de profondeur) avec un modèle de litière végétale marquée. Les échantillons

de sol à analyser proviennent de prairies permanentes du Massif Central mises en place à

l’INRA de Clermont-Theix dans l’Observatoire de Recherche en Environnement (ORE). Le

composant essentiel des litières est la cellulose. C´est pourquoi le modèle de litière choisie est

de la cellulose marquée au 13C à 2000‰ et au 14C. Elle est extraite à partir de paille de blé

d’après la méthode de Wise (1944). La quantité apportée est de 1g C.kg-1 de sol. Dans ce

protocole, deux traitements sont effectués : un sol témoin (T) et un sol amendé en cellulose

(C) et ayant chacun 2 répétitions (T1, T2 et C1, C2).

Une période de préincubation de 15 jours. Des mesures de température (20°C) et

d’humidité de sol (35%) sont effectuées tout au long de l´incubation. 7 récoltes destructives

sont effectuées (J=Jour) (cf. figure 2) afin d’analyser la biomasse microbienne, le carbone

total, le pH, l’humidité, la composition isotopique…

préincubation incubation

-15j 0j 10j 20j 40j 80j 160j

Ajout de la cellulose marquée au 13C et au 14C dans les flacons

concernés Figure 2 : Schéma de l´incubation des sols (j=jours). (Source : Bdioui Nadia)

Les mesures des PLFA combinées aux mesures de 13C effectuées à l´Institut Max

Planck de biogéochimie de Jena ne portent que sur les échantillons de sol de surface, sans

fertilisation et aux dates 0, 22, 79 et 160 jours.

5

Les mesures physico-chimiques réalisées sont le pH de l’eau du sol (utilisation d’une

suspension d’eau et de sol) ainsi que l’humidité pondérale des sols. Elles sont effectuées à

chaque série de prélèvement.

Les mesures de la décomposition du carbone de la litière et du carbone du sol effectuées sont :

- la quantification et la composition isotopique (13C/12C) du CO2 produit par la respiration du

sol. Ce CO2 est prélevé à l’aide d’un piégeage dans de la soude (cf. figure 3).

- la fumigation extraction au chloroforme (Vance et al. 1987) pour mesurer la biomasse

microbienne du sol et son δ 13C.

CO2, 13C et 14C produit par respiration

C microbien et δ13C PLFA

Tube rempli de soude (NaOH)

Flacon hermétique + Sol

Figure 3 : Schéma représentant le piège à carbone produit par respiration et installé dans des flacons hermétiques d’incubation réalisés pour chaque échantillon.

Extraction des PLFA L´extraction est basée sur la méthode de Bligh and Dyer (1959) modifiée par White et

al. 1979 qui permet d´obtenir les acides gras à partir des phospholipides. Environ 50 grammes

de sol sec sont utilisés par échantillon. Le sol est mélangé et secoué pendant plus de 2 heures

à une solution tampon de K2HPO4, de méthanol, et de chloroforme (1 : 2 : 1, v/v/v). Ensuite

du chloroforme et de l´eau distillée sont ajoutés en proportion égale et le mélange est laissé

décanter pendant 24 heures. Les 2 phases se séparent pendant ce temps. Puis la phase

supérieure (eau et méthanol) sont enlevées et le volume de chloroforme contenant les lipides

est réduit à quelques ml par évaporation sous vide (Büchi Rotavapor R-114) et stocké à

-20°C. Les lipides passent ensuite dans une colonne de Silice et sont séparés respectivement

en phospholipides, glycolipides et lipides neutres grâce à des élutions successives de

méthanol, acétone et chloroforme (Frostegard et al. 1993, 1995).

6

Puis une hydrolyse alcaline suivi d´une méthylation des phospholipides permet d´obtenir

les FAMEs (Fatty Acids Methyl Esterlinked). Ils sont ensuite dissous dans de l´hexane. Enfin une

nouvelle série d´élutions et de filtration au travers différentes colonnes sépare les lipides non

saponifiés. Les lipides restant sont séparés en acides gras saturés (SATFA), mono insaturés

(MUFA), poly insaturés (PUFA) et les acides gras hydroxygénés (PLOH) (Zelles et al. 1992,

1994, 1995, 1997 et 1999).

La diversité microbienne et l’abondance isotopique sont estimées dans cette étude grâce

aux acides gras SATFA, MUFA, PUFA, et PLOH. La quantification est mesurée sur le mélange

total des FAMEs. La nomenclature des acides gras utilisée est de type « A:BωC » comme défini

par Steenwerth et al. (2003) et par Joergensen and Potthoff (2005). Cette abréviation inclue le

nombre d’atomes de carbone dans la molécule (A), suivi du degré d’insaturation (B : nombre de

doubles liaisons). Le chiffre C ne sera pas donné mais il indique la situation de ces insaturations.

Les préfixes i, a, n et cy représentent les différents branchements et se réfèrent respectivement à

iso, anteiso, chaîne de carbone droite sans branchement et cyclopropyl. Les PLFA sont exprimés

en mg de PLFA.kg-1 sol sec ou en mg de C des PLFA.kg-1 sol sec.

Les phospholipides sont tous quantifiés par Atomic Emission Detection Gas

Chromatography (AED-GC gas chromatograph HP 6890 series). Les étalons utilisés sont les

standards n15 :0, n18 :0, n20 :0 et n22 :0. Un mélange homogène est réalisé aux concentrations

suivantes 50, 100, 150, 250 ng.µl-1. Le standard interne qui permet de connaître la quantité est le

n19 :0 (C19H38O2, 100 ng.µl-1ou 76,79 % de C). 50 à 300 µl de standard sont ajoutés (50 pour les

FAMEs, 200 pour toutes les fractions sauf pour les PLOH 300) à chaque échantillon après les

avoir tous évaporés sous vapeur de diazote. Ceci permet de calibrer correctement le Gas

Chromatography Mass Spectrometre (GCQ-GC-IRMS gas chromatograph HP 5890 couplé à un

detecteur HP 5971) et l’AED-GC afin d´obtenir l´abondance relative de chaque acide gras

représenté par un pic sur les chromatogrammes. Le GCQ-GC-IRMS ou GC-MS permet aussi de

connaître la teneur isotopique de chacun des acides gras. Elle est exprimée en δ 13C/12C ‰. Les

paramètres de mesures des deux appareils se trouvent en Annexe.

7

RESULTATS ET DISCUSSION

Biomasse microbienne et « priming effect » Le pH de l’eau du sol de surface est optimal pour les activités microbiennes (pH =

6,1). L’humidité pondérale du sol est de 25%. C’est aussi favorable aux microbes. Les

conditions physico-chimiques permettent un développement des communautés (Rumpel et

al. 2002). Le C total (humus, continuum=frais et récalcitrant, biomasse microbienne) est de

40 000 mg de C kg-1 de sol sec. L’apport de cellulose ne représente que 1000 mg de C kg-1

de sol sec. Le sol de surface est naturellement riche en C (apport constant de litière dans les

prairies). Le C de surface est âgé de moins de 50 ans (C sol profond 1985 ± 35 ans à plusieurs

millénaires, Paul et al. 1997) et est déterminé par l’analyse du 14C.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 40 79 161

Durée de l'incubation (Jours)

Bio

mas

se n

on m

arqu

éem

g C

/kg

sol

sol témoin sol+cellulose

0

100

200

300

10 20 40 79 161

Durée de l'incubation (Jours)

Bio

mas

se m

arqu

éem

g C

/kg

sol

Figure 4 : Graphiques : (Gauche) Biomasse microbienne non marquée en mg C/kg sol sec extraite par fumigation dans les sols témoins et amendés pour les jours 0, 10, 20, 40, 79, 161. (Droite) Biomasse microbienne marquée extraite par fumigation des sols amendés en cellulose pour les jours 10, 20, 40, 79, 161. (Source : Fontaine Sébastien)

D’après la figure 4, la biomasse non marquée contenant des microbes en dormance et

des microbes actifs représente en moyenne 850 mg C/kg de sol sec pour les différents

traitements et à chaque date (Joergensen et al. 2005). En théorie cette valeur doit décroître

légèrement avec le temps puisque les substrats carbonés du sol incubé s’épuisent avec le

temps (pas de nouvel apport par des plantes). La biomasse marquée augmente

8

considérablement jusqu’à 200 mg C/kg de sol sec au jour 40. Elle diminue ensuite du fait de

l’épuisement de la cellulose apportée.

En figure 5, le sol témoin respire et produit du CO2. Le sol amendé en cellulose en

produit plus ; la différence mesurée entre les deux correspond à une surproduction de C

provenant des MO récalcitrantes du sol. Ce phénomène est le « priming effect ». L’apport de

cellulose a stimulé la minéralisation de MO récalcitrantes. Cette minéralisation est causée par

des microbes de type K.

Respiration SOM

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 50 100 150

Durée de l'incubation (Jours)

mg

C k

g-1

sol s

ec

Sol témoin N-

Sol + cellulose N-

Priming

Figure 5 : Graphique montrant le C minéralisé produit par la respiration dans les différents sols pour toutes les dates de prélèvement. C minéralisé dans sol témoin = C produit, C minéralisé dans sol amendé = C produit par respiration total - C cellulose dégradée et priming = C minéralisé dans sol amendé – C minéralisé sol témoin. (Source : Fontaine Sébastien)

Ces résultats prouvent l’existence du phénomène de « priming effect » mais ne

permettent pas de distinguer les deux types de communautés.

Marqueurs PLFA et isotopie 13C

Quantification du Carbone et des PLFA Les quantifications sont réalisées grâce à l’AED mais pas sur les échantillons FAMEs

prévu à cet effet par manque de temps. Il a été décidé de quantifier les échantillons de chaque

fractions destinés aussi au GC-MS. Le GC-MS peut aussi quantifier. Pour exprimer les

données en mg de C.kg-1 de sol sec, il est nécessaire de prendre en compte les différentes

9

étapes de dilution dans l’extraction ainsi que le poids du sol sec dont chaque échantillon

dépend. Les appareils donnent des chromatogrammes (intensité des pics en fonctions du

temps de rétention de la molécule) dont les aires des différents pics correspondent aux

différentes molécules. La quantité de C dans chaque molécule est estimée grâce au standard

interne par un simple rapport de surface.

Figure 6 : Tableau représentant les quantités totales de PLFA mesurées par AED (SATFA et PLOH) pour les sols T et C pour les jours 0, 22, 79 et 160. (moyenne ± erreur standard ; test t entre traitement T et C avec n=2 et *, **, ***, rien : p<0.05, <0.01, <0.001, n.s.) .

AED SATFA (mg C.kg-1 sol sec) PLOH (mg C.kg-1 sol sec) Traitement Cellulose Témoin Cellulose Témoin

Jour 0 18,13 ± 0,45 18,13 ± 0,45 1,78 ± 1,02 1,78 ± 1,02 Jour 22 7,04 ± 3,21 ** 17,24 ± 0,72 4,70 ± 4,70 27,32 ± 25,83 Jour 79 9,07 ± 4,44 12,11 ± 0,31 3,92 ± 2,03 * 9,31 ± 1,46

Jour 160 6,42 ± 1,01 12,96 ± 7,05 0,37 ± 0,15 1,05 ± 0,88 Ces résultats (cf. figure 6) ne peuvent être commentés car les répétitions ne

fonctionnent pas. Pour les SATFA J79 et J160 et PLOH J22 les répétitions sont erronées. Lors

de l’alignement des temps de rétention des échantillons, des molécules apparaissent ou

disparaissent. Ces problèmes proviennent des étapes d’extraction ou des appareils de mesure.

Figure 7 : Tableau représentant les quantités totales de PLFA mesurées par AED (SATFA et PLOH) pour les sols T et C pour les jours 0, 22, 79 et 160. (moyenne ± erreur standard ; test t entre traitement T et C avec n=2 et *, **, ***, rien : p<0.05, <0.01, <0.001, n.s.) .

GC-MS SATFA (mg C.kg-1 sol sec) PLOH (mg C.kg-1 sol sec) Traitement Cellulose Témoin Cellulose Témoin

Jour 0 11,27 ± 0,25 11,27 ± 0,25 4,20 ± 0,98 4,20 ± 0,98 Jour 22 6,67 ± 2,66 ** 11,48 ± 0,70 18,47 ± 17,34 3,46 ± 2,03 Jour 79 7,13 ± 2,78 9,08 ± 0,05 23,99 ± 4,26 29,50 ± 5,33

Jour 160 4,00 ± 0,18 10,45 ± 5,69 2,81 ± 0,60 5,90 ± 3,61 Les résultats trouvés (cf. figure 7) sont de même ordre de grandeur que ceux trouvés

par AED mais les mêmes problèmes sont retrouvés. Ils sont atténués par le fait que l’appareil

a détecté plus de molécules mais dont les temps de rétention correspondent à des artéfacts

(Comm. perso. Fornaçon Carolin). De plus, des différences significatives sont trouvées entre

traitements. La biomasse dans les témoins est plus importante que celle des sols amendés. Ce

n’est pas normal car la cellulose doit permettre une augmentation de biomasse (cf. figure 4

droite).

10

La somme des différents PLFA doit permettre de retrouver la valeur de la biomasse

microbienne trouvée par fumigation soit 800 mg C.kg-1 sol sec en multipliant le total des

PLFA par un ratio (Biomasse microbienne/Total PLFA). Ce ratio est d’environ 7 dans un sol

de prairie (Joergensen et al. 2005).

Isotopie Les variations du δ 13C/12C en fonction du temps permettent d’observer si le marquage

effectué par l’incorporation de la cellulose marquée a fonctionné. Dans les témoins PLOH et

SATFA, l’isotopie est constante aux alentours respectivement de -35‰ à -25‰ (cf. figure 8). A

l’inverse dans les sols amendés (cf. figure 8), cette valeur augmente pendant l’incubation pour

atteindre 100‰ au jour 160 pour les PLOH et 80‰ pour les SATFA. Ces résultats indiquent

l’efficacité du marquage et la rapidité d’incorporation de la cellulose par la biomasse microbienne.

Marquage moyen 13C/12C des PLOH

-40

-20

0

20

40

60

80

100

0 22 79 160

Témoins

Cellulose

Marquage moyen 13C/12C des SATFA

-40

-20

0

20

40

60

80

100

0 22 79 160

Témoins

Cellulose

Figure 8 : Graphiques représentant l'isotopie moyenne des sols amendés et témoins pour les fractions PLOH (gauche) et SATFA (droite) aux jours 0, 22, 79 et 160 mesurée par GC-IRMS (δ 13C/12C ‰ moyenne ± erreur standard) .

En revanche, ceci ne permet toujours pas de dire quelles sont les communautés

présentes et responsables du « priming effect ».

Diversité microbienne Comme chaque PLFA correspond à un type microbien, il est aussi possible de savoir

quels sont les microbes r et K grâce au GC-MS. En quantité, la biomasse de chaque pic est

identique au cours du temps et en varie en fonction des traitements (biomasse totale égale ou

inférieure pour les C mais nombre de pics plus importants). En figure 9, dans les sols témoins

pour les fractions SATFA et PLOH, le delta 13C est aux alentours de -25 à -35‰ et est

11

constant sur les 160 jours (seul J0T est montré). 20 SATFA et 30 PLOH ont pu être distingués

par leur temps de rétention variant de 20 à 50 minutes. L’identification des molécules n’est

pas possible par manque des temps. Dans les sols amendés, leur nombre est identique pour les

SATFA et 18 nouveaux sont apparus dans les PLOH. Il peut s’agir d’artéfacts ou de PLFA.

Mais le δ varie beaucoup entre chaque PLFA. Certains restent proche des témoins. Ce sont

des microbes en dormance. D’autres augmentent un peu. Ce sont des microbes K qui utilisent

la MO fraîche (riche en 13C) pour ensuite dégrader la MO récalcitrante (pauvre en 13C). Enfin

quelques uns voient leur delta atteindre rapidement 200 à 800‰. Ce sont les stratèges r qui

utilisent vite la MO fraîche.

-60

-10

40

90

140

190

19,23 21,66 24,81 26,60 27,83 30,70 33,32 35,86

SATFA J0T

SATFA J22C

SATFA J79C

SATFA J160C

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

20,32 23,47 24,69 26,22 27,31 29,96 30,41 30,91 32,15 35,08 36,41 38,39 41,07 49,37

PLOH J0T

PLOH J22C

PLOH J79C

PLOH J160C

Figure 9 : Graphiques représentant les δ 13C/12C ‰ (ordonnée) de chaque PLFA en fonction de leur temps de rétention (abscisse) (moyenne ± erreur standard) des fractions SATFA (haut) et PLOH (bas) pour les sols amendés aux jours 22, 79 et 160 et le jour 0 (témoin)

Les problèmes de répétition sont toujours visibles. Ceci laisse présumer que les

problèmes sont survenus dans les étapes d’extraction (cf. Discussion système de Recherche).

Il est possible que ce soit des erreurs de manipulations mais il faudrait que ce soit les mêmes

erreurs sur 6 à 12 échantillons sur les 14 au total. La quantification n’est pas analysable et le

13C l’est difficilement. En théorie, les grands pics des jours 22 et 79 des fractions SATFA et

PLOH serait des microbes de type r (communautés bactériennes). Les pics qui restent élevés

12

jusqu’au jour 160 pourraient être des microbes de type K car la cellulose est épuisé au jour 40

(cf. figure 1).

La diversité microbienne dans ce sol de surface est assez importante mais correspond à

ce qui est généralement trouvée (Zelles et al. 1995).

L´ajout de la cellulose a eu pour effet d’augmenter de 80% la diversité microbienne

dans les catégories des PLOH. La qualité du C a donc un effet sur la diversité (Fierer et al.

2002). La dynamique et l’activité microbienne devait changer avec la qualité du C (Williams

et al. 2005).

La cellulose devait augmenter la biomasse microbienne. En ce qui concerne les PLOH

et les SATFA, ce n’est pas le cas. L’activité microbienne des r et K. a sans doute été promu

mais les résultats de biomasse des communautés microbiennes sont trop variables.

Le 13C et les PLFA auraient permis d´identifier les r et les K et de savoir quels étaient

les types de microbes acteurs du Priming effect comme dans le modèle de Kuzyakov et al.

2001. Mais cette méthode possède des biais comme la confusion entre pic de PLFA et surtout

la perte de PLFA lors des extractions (Treonis et al. 2003). Puis lors de la croissance des

microbes, leur activité fait l’objet d’une discrimination isotopique (Santruckova et al. 2000).

Comme dans toutes les expérimentations, l’utilisation de plusieurs techniques

combinées est plus précises (Hill et al. 2000). C’est pourquoi des analyses de biologie

moléculaire sont en cours pour identifier des marqueurs r et K par l’utilisation de sonde

d’ADN ribosomal ainsi que d’autres extractions de PLFA. Les résultats de l’INRA de Dijon

sont encourageant car un marqueur d’une communautés a été identifié il s’agit de l’acide

linoléique (18 :2ω6) représentant les champignons.

13

14

Discussion sur les systèmes de recherche Le système de la recherche dans les instituts Max Planck semble être efficace en terme

de rendements en écriture d’articles. Il est basé sur un système de plusieurs projets de courtes

à moyennes durées dont la grande partie du travail est effectuée par de nombreux thésards

dont les contrats durent plus longtemps qu’en France (jusqu’à 5 ans). Ces thésards mettent en

place les expérimentations, obtiennent des données, les analysent et écrivent leurs articles.

Toutefois leur contrat fini, les thésards ne restent pas car les propositions de post-

doctorants sont extrêmement rares en Allemagne, tout comme les postes de chercheurs. Les

instituts sont dirigés par quelques chefs d’équipe dont le rôle est surtout basée sur du

management à échelle locale ou internationale. Le travail scientifique est effectué par les

thésards et les nombreux stagiaires de niveau équivalent au baccalauréat à la licence. Les

quelques techniciens sont là surtout pour préparer le matériel et le réparer (très efficace). Une

fois partie, les thésards emportent leurs connaissances et ce savoir est difficilement transmis.

En effet, la thésarde qui m’a encadré a dû apprendre toute seule la technique

d’extraction en lisant la thèse de l’ancienne thésarde partie en post-doc aux Etats-Unis.

Comme cela ne faisait que quelques mois qu’elle était en poste, elle ne connaissait pas encore

toutes les étapes ainsi que les moyens d’analyses des données.

En France, le système basé sur plusieurs projets est aussi en place mais la présence de

plus nombreux chercheurs en position permanente permet de gagner énormément de temps

lors de la mise en route d’un projet car les connaissances scientifiques ne sont pas perdues.

Toutefois la complexité de la hiérarchie du système français est un frein important dans la

recherche qui n’existe pratiquement pas dans les instituts Max Planck.

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PERSPECTIVES

La qualité nutritionnelle d’un sol et notamment sa teneur en azote ont un effet sur le

« priming effect » (rappel : minéralisation de la MO récalcitrante par les K). Dans une

situation de sol enrichi en azote, la compétition entre r et K est favorable aux r qui ont besoin

d’azote pour leur croissance (dépendant de l’azote). Au contraire dans un sol sans

amendement, les K sont favorisés car ils sont plus généralistes. Dans ce cas, il est normal de

trouver un « priming effect » plus important dans les sols sans apport d’azote. Les marqueurs

PLFA qui auraient pu être trouvés, auraient permis de confirmer ces résultats (Fontaine et al.

2005).

Ultérieurement, ces données pourraient être améliorées et permettraient de compléter

les connaissances du fonctionnement du compartiment microbiens des sols et d’enrichir le

modèle de Fontaine pour son rôle dans la compréhension des cycles biogéochimiques.

Il serait tout aussi intéressant d’étudier les microbes qui captent ou produisent les

différents gaz à effet de serre comme le CH4, le N2O et les NOx.

Plus « sols à sols », l’application directe serait de rendre efficace la création de puits

de carbone afin de lutter contre le réchauffement climatique.

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TABLE DES FIGURES Figure 1 : Modèle de Fontaine expliquant les dynamiques des microbes r et K suite à un ajout de matière organique fraîche au jour 0 (cellulose) pendant 160 jours. K : croissance lente ; r : croissance rapide. ....................................................................................................................... 3 Figure 2 : Schéma de l´incubation des sols (j=jours). ................................................................ 5 Figure 3 : Schéma représentant le piège à carbone produit par respiration et installé dans des flacons hermétiques d’incubation réalisés pour chaque échantillon. ......................................... 6 Figure 4 : Graphiques : (Gauche) Biomasse microbienne non marquée en mg C/kg sol sec extraite par fumigation dans les sols témoins et amendés pour les jours 0, 10, 20, 40, 79, 161. (Droite) Biomasse microbienne marquée extraite par fumigation des sols amendés en cellulose pour les jours 10, 20, 40, 79, 161................................................................................ 8 Figure 5 : Graphique montrant le C minéralisé produit par la respiration dans les différents sols pour toutes les dates de prélèvement. C minéralisé dans sol témoin = C produit, C minéralisé dans sol amendé = C produit par respiration total - C cellulose dégradée et priming = C minéralisé dans sol amendé – C minéralisé sol témoin....................................................... 9 Figure 6 : Tableau représentant les quantités totales de PLFA mesurées par AED (SATFA et PLOH) pour les sols T et C pour les jours 0, 22, 79 et 160. (moyenne ± erreur standard ; test t entre traitement T et C avec n=2 et *, **, ***, rien : p<0.05, <0.01, <0.001, n.s.) . ............. 10 Figure 7 : Tableau représentant les quantités totales de PLFA mesurées par AED (SATFA et PLOH) pour les sols T et C pour les jours 0, 22, 79 et 160. (moyenne ± erreur standard ; test t entre traitement T et C avec n=2 et *, **, ***, rien : p<0.05, <0.01, <0.001, n.s.) . ............. 10 Figure 8 : Graphiques représentant l'isotopie moyenne des sols amendés et témoins pour les fractions PLOH (gauche) et SATFA (droite) aux jours 0, 22, 79 et 160 mesurée par GC-IRMS (δ 13C/12C ‰ moyenne ± erreur standard) .............................................................................. 11 Figure 9 : Graphiques représentant les δ 13C/12C ‰ (ordonnée) de chaque PLFA en fonction de leur temps de rétention (abscisse) (moyenne ± erreur standard) des fractions SATFA (haut) et PLOH (bas) pour les sols amendés aux jours 22, 79 et 160 et le jour 0 (témoin) ..... 12

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ANNEXE GC-AED-parameters:

Injection: 1 µl Split: 10:1 (only 10% is used for the measurement) Gas: Helium Flow: 1.3 ml/min Columns: ID-BPX 70 Length: 50 m Film Thickness: 0.25 µm Column-ID: 320 µm Modelnumber.: SGE 054607 Oven: Rate °C/min Next °C Hold time minutes Retention Time Initial 100 1.00 1.00 4.00 135 0.00 9.75 2.00 230 0.00 57.25 30.00 260 1.00 59.25

GCQ-GC-IRMS-parameter: Injection: 1 µl Splitless Gas: Helium Flow: 2.2 ml/min Columns: Ultra 2 Length: 50 m Film Thickness: 0.52 µm Column-ID: 320 µm Company: Hewlett Packard Oven: Rate °C/min Next °C Hold time minutes Retention Time Initial 140 1.00 1.00 3.00 300 15.00 15.00 320 0.00 0.00 320 0.00 70.67 GC is online coupled on Ion Trap Mass Spectrometer (GCQ) and on Isotope Ratio Mass Spectrometer (IRMS) After GC 90 % of the sample goes in GCQ (ThermoQuest) and 10 % goes in IRMS (Thermo Finnigan MAT DeltaPlus XL)

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Les écosystèmes terrestres et en particulier les sols profonds constituent un réservoir de carbone important. Ce stock est constitué de MO récalcitrante dont l’accumulation dépend de deux facteurs : L´apport de MO fraîche et la minéralisation de la MO.

Le C de la MO de surface (0-20cm) est datée pour la plupart des sols à environ quelques années (<50ans). Tandis que les horizons profonds (>60cm) sont datés à plusieurs milliers d´années (Paul et al.1997). Cette différence extrême s´explique par l´arrêt de minéralisation de la MO. Les facteurs abiotiques (température, humidité) varient peu le long d’un profil de sol et sont favorables à une activité microbienne (Rumpel et al. 2002). Seul la fertilité (Hatch et al. 2002) et la qualité chimiques des éléments carbonés peuvent changer avec la profondeur (Fierer et al. 2002). Ces différents résultats montrent le manque de connaissances de l´activité microbienne impliquée dans la minéralisation de la MO des sols.

Des expériences sur des plants de riz marqués au 13C ont montré que l´apport de MO fraîche ainsi que les rhyzodépositions n´ont pas fait que promouvoir l´activité et la croissance microbienne mais ils ont aussi changé les communautés. Ceci serait dû à un gradient de distribution des produits de photosynthèses pour les populations microbiennes. Ceci montre aussi que l´interaction plante/microorganisme joue un rôle central dans cycle du C et des nutriments dans le système plante/sol (Lu et al. 2004). hors sujet Toutefois, un apport de MO de plantes cultivées en atmosphère saturée en 13 C sur un sol arctique, n´a pas d´effet sur les communautés en fonction de profondeur. Seul une augmentation de la biomasse des champignons a été observée (Malosso et al. 2004). hors sujet

L’expérimentation a pour objectif de déterminer quelles sont les communautés microbiennes responsable du « priming effect » dans un sol de surface après un apport de cellulose marquée en 13C après 160 jours d´incubation. Bossio, D. A., K. M. Scow, N. Gunapala, and K. J. Graham. 1998. Determinants of

soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecology 36:1-12

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