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Universitas Médica

ISSN: 0041-9095

[email protected]

Pontificia Universidad Javeriana

Colombia

GARCÍA, CLAUDIA MARÍA; LOZANO, PATRICIA; RIVERA, JOSÉ ANTONIO; GIONO, SILVIA;

MARTÍNEZ, YGNACIO; ROCHA-GRACIA, ROSA DEL CARMEN

Identificación y tipificación de Haemophilus influenzae mediante PCR múltiple

Universitas Médica, vol. 49, núm. 4, octubre-diciembre, 2008, pp. 436-452

Pontificia Universidad Javeriana

Bogotá, Colombia

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García C.M., Lozano P., Rivera J.A., Giono S., Martínez Y., Rocha-Gracia R., Identificación y tipificación de Haemophilus...

ARTÍCULOS ORIGINALES

Identificación y tipificación deHaemophilus influenzae mediante PCR

múltiple*

CLAUDIA MARÍA GARCÍA1

PATRICIA LOZANO1

JOSÉ ANTONIO RIVERA1

SILVIA GIONO2

YGNACIO MARTÍNEZ1

ROSA DEL CARMEN ROCHA-GRACIA1

* El presente trabajo es resultado de investigación realizada en el Centro de Investigaciones Microbioló-gicas, Instituto de Ciencias de la Benemérita.

1 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias de la Benemérita Univer-sidad Autónoma de Puebla, Puebla, México

2 Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN, México

Recibido: 27-02-2008 Revisado: 9-06-2008 Aceptado: 1-07-2008

Resumen

Se diseñó una estrategia metodológica para la detección simultánea entre Haemophilusinfluenzae serotipo b (Hib) y no tipificable (HiNT), así como para discriminar entre H.influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pneumoniae.

El estudio se realizó en una recolección de 64 cepas, las cuales se sometieron a amplifica-ción por PCR utilizando ADN genómico o directamente el cultivo bacteriano como plan-tilla. La PCR se realizó en dos fases: 1) PCR triple para discriminar entre H. influenzae yM. catarrhalis empleando oligonucleótidos específicos para los genes del ARNr 16S y dela neumolisina (Ply) para identificar S. pneumoniae; 2) PCR doble para la identificaciónsimultánea de Hib y HiNT, utilizando oligonucleótidos específicos de los genes cap yhmw. Se logró la amplificación del gen ARNr 16S en las 64 cepas de H. influenzae, sinobtenerse amplificación en las cepas control. La secuencia Bex A se amplificó en 29 de 32cepas de Hib, y la secuencia HMWA se amplificó en 29 de 30 cepas de HiNT. La ampli-ficación con los oligonucleótidos específicos para M. catarrhalis y S. pneumoniae nomostró productos con ninguna cepa de H. influenzae.

Estos resultados permiten proponer la aplicación de esta herramienta metodológica paradiscriminar entre M. catarrhalis y S. pneumoniae, e identificar H. influenzae directamentea partir de muestras clínicas.

Palabras clave: H. influenzae tipo b, H. influenzae no tipificable, PCR múltiple.

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Univ. Méd. Bogotá (Colombia), 49 (4): 436-452, octubre-diciembre de 2008

Introducción

Haemophilus influenzae es unabacteria Gram negativa que colonizanormalmente la nasofaringe humana,aunque también puede causar enfer-

Title:

Use of multiplex PCR for detection andidentification of Haemophilus influenzae

Abstract

A multiplex PCR assay was developed for thesimultaneous detection of type b (Hib) andnontypeable Haemophilus influenzae (NTHi), andto discriminate among H. influenzae, Moraxellacatarrhalis, and Streptococcus pneumoniae strains.

Sixty four strains were subjected to PCRamplification using either genomic DNA or directlythe bacterial culture as template. PCR wasperformed in two phases: 1) Triple PCR todiscriminate among H. influenzae, M. catarrhalis,employing the specific primers 16S rRNA for eachbacterial and S. pneumoniae using specific primerPly (pneumolysin); 2) Duplex PCR for thesimultaneous identification of Hib and NTHistrains, using specific primers BexA and HMWA.The 16S rRNA gene was amplified in 64 H.influenzae strains but not in control strains. TheBexA sequence was amplified in 29 of 32 Hibstrains; and HMWA sequence was amplified in 29of 30 NTHi strains. The amplification with M.catarrhalis, and S. pneumoniae specific primersdid not produce products with any H. influenzaestrain.

These data allow us to propose this methodologyas a diagnostic tool to discriminate among M.catarrhalis and S. pneumoniae and to identify H.influenzae directly from clinical samples.

Key words: type b H. influenzae, nontypeable H.influenzae, detection, multiplex PCR.

medades sistémicas y localizadas.Sus diferentes cepas pueden poseeren su superficie una cápsula o nohacerlo, por lo que se dividen en H.influenzae c encapsulada (tipificable)y no encapsulada (no tipificable)[1].

La bacteria encapsulada se puedeclasificar en seis serotipos designadoscon letras de la a hasta la f; el serotipob es el más importante desde el puntode vista epidemiológico[2,3]. H.influenzae tipo b (Hib) es responsablede enfermedades invasivas o sistémi-cas, tales como meningitis y sepsis, yel no tipificable, de infecciones loca-lizadas como otitis media supurativay serosa[4-6]. Las cepas no tipificablesse aíslan en 20% a 30% de los episo-dios de otitis media aguda y de episo-dios recurrentes, y existen estudiosque indican que este microorganismoes responsable de 40% de los casosde otitis media con secreción (otitismedia crónica), junto con otras dosbacterias frecuentemente aisladas porcultivo que son M. catarrhalis y S.pneumonia[7,8].

Sin embargo, en la otitis media cró-nica con duración mayor de tres me-ses, los cultivos de las secreciones deoído medio sólo resultan positivos en20% a 30% de los pacientes[9], a pe-sar de que la mayoría de las secrecionesmuestran leucocitos con la tinción deGiemsa, lo cual indica una reaccióninflamatoria provocada por la presen-cia de un agente infeccioso.

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Esto sugiere o demuestra que losmétodos de cultivo convencionales noson capaces de proporcionar un diag-nóstico fidedigno de la otitis mediacrónica[10]. La existencia de cepasmultirresistentes representa también ungrave problema de diagnóstico paralos laboratorios[11,12], debido a queel uso indiscriminado de los antibióti-cos predispone a la bacteria a sufrircambios genéticos y estructurales queimpiden su aislamiento en el labora-torio y que, además, la llevan a pre-sentar perfiles de multirresistencia ge-nerados por la misma presión selectivaa la que se somete[13].

El serotipo se identifica mediantecoaglutinación. Sin embargo, como H.influenzae sufre variación antigénica,pueden reportarse cepas encapsuladascon fenotipos no tipificables, debidoa que éstas pueden portar los genespara la expresión de la cápsula pero,bajo alguna presión ambiental selecti-va, este antígeno de superficie no seprocesa y no se detecta en la superfi-cie, escapando a su diagnósticoserológico[14].

Existen diferentes vacunas contraH. influenzae tipo b y su uso ha dis-minuido casi en 98% las infeccionesinvasivas provocadas por este serotipoen los países donde esta vacuna for-ma parte del esquema básico de vacu-nación, como los Estados Unidos, elReino Unido y Holanda[15,16]. Sinembargo, se especula que otros

serotipos de H. influenzae puedenemerger como patógenos importan-tes[17].

Por otro lado, recientemente se hareportado que en el Reino Unido yen Holanda, países en los que se apli-có por primera vez la vacuna contrael tipo b, un pequeño número de ni-ños han desarrollado enfermedadinvasiva por H. influenzae tipo b apesar de tener el esquema completode vacunación[18-22]. Igualmente,H. influenzae presenta una elevada he-terogeneidad interespecie e intraespe-cie de sus estructuras de superficie,que lo hacen un excelente coloniza-dor capaz de evadir el sistema inmu-ne y sobrevivir intracelularmente[23].

En las últimas décadas ha surgidoel interés por la aplicación de técnicasmoleculares, como apoyo para el diag-nóstico de enfermedades infeccio-sas[24,25] y la búsqueda de genes quecodifican para factores de virulencia.Se han utilizado métodos de identifi-cación basados en la reacción en ca-dena de la polimerasa (PCR) cuandoel tratamiento previo con antibióticosinhibe la detección bacteriana median-te cultivo. En la literatura se han re-portado genes específicos de especiepara S. pneumoniae y H. influenzaecomo blancos para amplificar porPCR, como por ejemplo, el gen lytA(autolisina) y ply (neumolisina) de vi-rulencia en S. pneumoniae[26], y par-te de la secuencia específica de 16S

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ARNr, así como el gen que codificapara la proteína P6 de membrana ex-terna de H. influenzae[27-29].

Es por ello que en este trabajo sepropuso buscar marcadores genéticosde virulencia para el diseño deoligonucleótidos específicos, con el finde desarrollar un sistema de PCR múl-tiple que sirviera como herramientamolecular que permitiera la deteccióny la diferenciación simultánea de ce-pas de H. influenzae, S. pneumoniaey de M. catarrhalis, causantes de oti-tis media supurativa pediátrica, asícomo una PCR doble para la tipifica-ción de H. influenzae tipo b y notipificable, con el fin de proporcionarun diagnóstico más rápido y, con ello,aplicar un tratamiento oportuno de lasinfecciones por estos dos últimos ti-pos de bacteria.

Materiales y métodos

Bacterias. En el estudio se incluye-ron 62 cepas de H. influenzae, quese identificaron por sus característi-cas biológicas: pequeños cocobaci-los de 1 x 0,3 µm, Gram negativos,que necesitan de los factores X(hemina) y V (NAD) para su creci-miento en agar de soya y tripticaseí-na (Bioxon de México, SA de CV).Los cultivos se incubaron a 37oCbajo tensión de 5% de CO

2. Todas

las cepas se sometieron a serotipifi-cación por un ensayo de coaglutina-

ción (Phadebact, Haemophilus TeS.Boule, Sweden) y se biotipificaron conbase en las pruebas bioquímicas deproducción de indol, actividad deureasa y actividad de ornitina descar-boxilasa[30].

En este estudio también se inclu-yeron tres cepas de M. catarrhalis ytres de S. pneumoniae; dos cepas decada una de los siguientes microorga-nismos: Staphylococcus aureus,Escherichia coli, Pastereulla multoci-da y Enterococcus faecalis; y, comocepas control para el género de Hae-mophilus, tres cepas de H. parain-fluenzae y dos de H. paragallinarum(tabla 1).

Cultivo de cepas. Las cepas de H.influenzae tipo b, H. influenzae notipificable, H. parainfluenzae, H.paragallinarum y M. catarrhalis secultivaron sobre un medio de agar deinfusión de cerebro y corazón (BHI)(Bioxon de México, SA de CV), enri-quecido al 5% con Fildes, que es undigerido de eritrocitos de carnero quele proporciona a H. influenzae los fac-tores X y V, y se incubaron a 37oCbajo tensión de 5% de CO

2[30]. Las

cepas de S. aureus, E. coli, P.multocida y E. faecalis se cultivaronen un medio de agar de soya ytripticaseína o agar BHI y se incuba-ron a 37oC. La cepa de S. pneumoniaese cultivó en un medio enriquecido deagar BHI[30,31].

440


Aislamiento de ADN genómico. ElADN genómico de H. influenzae tipoa, b, e, f y no tipificable, H. parain-fluenzae, H. paragallinarum, M.catarrhalis, P. multocida y E. coli, seaisló según el protocolo de purifica-ción a menor escala de Barcak et al. ySambrook y Russell[32,33]. El ADNgenómico de S. pneumoniae se aislósegún el protocolo de Vela-Coral etal.[31]. El ADN genómico de S. aureusy de E. faecalis se aisló mediante latécnica de aislamiento DNAzol (LifeTechnologies, GIBCO BRL).

Diseño de oligonucleótidos inicia-dores. Para el diseño de los iniciado-res, primero, se buscó la secuenciacompleta del genoma de H. influenzaeen el banco de datos (www.tigr.com),como base para corroborar que losiniciadores de H. influenzae fueran es-pecie específicos. Por un lado, se se-leccionaron los marcadores genéticosde virulencia candidatos para las ce-pas tipo de H. influenzae tipo b, H.influenzae no tipificable, M. catarrha-lis y S. pneumoniae (tabla 2). Por otrolado, se buscaron las secuencias de los

Tabla 1Cepas ensayadas

Cepas Número de Origenaislamientos

H. influenzae serotipo b 32 2 cepas ATCC 33930 y 4924722 cepas clínicas (LCF, conjuntiva)8 cepas de portadores de nasofaringe

H. influenzae serotipo a 1 Cepa donada por Elodia Sosa IglesiasH. influenzae serotipo e 1 Cepa donada por Elodia Sosa Iglesias,

12 cepas clínicas (oído, nariz)H. influenzae no tipificable 30 18 cepas de portadores de faringeMoraxella catarrhalis 3 1 cepa ATCC 25238

1 cepa clínica (oído)1 cepa de portador de faringe

Streptococcus pneumoniae 3 1 cepa clínica (oído)2 cepas de portadores de faringe

Staphylococcus aureus 2 1 cepa ATCC 292131 cepa clínica (sangre)

Escherichia coli 2 2 cepas clínicas (orina)Pateurella multocida 2 2 cepas clínicas (pollo)Enterococcus faecalis 2 1 cepa ATCC 29212

1 cepa clínicaH. parainfluenzae 3 3 cepas de portadores de faringeH. paragallinarum 2 2 cepas clínicas (pollo)

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marcadores seleccionados en el ban-co de datos GenBank, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/GenBankSearch.html), EMBL (www.ebi.ac.uk.embl/), DDBJ (www.ddbj.nig.ac.uk). Posteriormente, a partir deestas secuencias, se diseñaron inicia-dores para H. influenzae, H. influenzaetipo b, H. influenzae no tipificable, M.catarrhalis y S. pneumoniae.

Para el diseño de los iniciadores seconsideró que los productos de am-plificación por PCR de las secuenciasseleccionadas fueran lo suficientemen-te diferentes en tamaño, de tal maneraque pudieran distinguirse en el perfilelectroforético, que el contenido de GCestuviera entre 40% y 60%, que seevitara la autocomplementariedad en-tre ellos y que las temperaturas de fu-sión no difirieran por más de 5oC en-tre ellos. El propósito más importantebuscado en el diseño de los oligonu-cleótidos iniciadores fue la especifici-dad, la cual se corroboró mediante elprograma BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Se diseñó un par de iniciadores es-pecíficos para H. influenzae que fuedenominado 16S ARNr Hi, comúnpara H. influenzae tipo b y no tipifica-ble que generara un producto de 483pb; un par de iniciadores específicospara H. influenzae serotipo b (BexA)que generara un producto de 310 pb;dos pares de iniciadores específicospara H. influenzae no tipificable

(HMWA y Hia) para generar un pro-ducto de 610 pb (HMWA) y para am-plificar el gen de la adhesina Hia elcual generó un producto de 550 pb.Esto último, debido a que se reportaque 75% de cepas de H. influenzae notipificable expresan la adhesina HMWy el 25% restante expresan la adhesinaHia, y que las cepas que expresan laadhesina HMW no expresan la otraadhesina Hia, y viceversa [34]. Se di-señó un par de iniciadores específicospara M. catarrhalis llamado 16S ARNrMc que amplificara un producto de220 pb y un par de iniciadores especí-ficos para S. pneumoniae que deno-minamos Ply y que codifica parte delgen de la neumolisina de esta bacte-ria, el cual generó un producto de 156pb (tabla 2).

El análisis de la secuencia de losoligonucleótidos iniciadores diseñadosse realizó mediante los programasLasergene Sequence Analysis Soft-ware, DNASTAR, Inc., y OLIGO Pri-mer Analysis Software, MolecularBiology Insights, Inc. Los iniciadoresdiseñados fueron sintetizados por In-vitrogen Life Technologies (InvitrogenCorporation, California, USA).

Identificación y tipificación de H.influenzae. Una vez que se seleccio-naron los marcadores genéticos de vi-rulencia y se obtuvo el diseño de losoligonucleótidos, se procedió a laidentificación y tipificación de H. in-fluenzae en dos fases: la primera fue

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la identificación y diferenciación en-tre H. influenzae, M. catarrhalis y S.pneumoniae mediante una PCR tripleutilizando los pares de iniciadores 16SARNr Hi, 16S ARNr Mc y Ply. Lascepas identificadas como H. influen-zae, se sometieron a la segunda faseque consistió en la tipificación de Hiby HiNT mediante una PCR doble, uti-lizando los iniciadores BexA yHMWA, analizando 62 cepas de H.influenzae y 19 cepas de diferentesespecies y género, utilizando en lamezcla de reacción ADN total paraestablecer las condiciones de reaccióny, finalmente, bacterias completas apartir de un cultivo puro.

PCR múltiple. Inicialmente, las re-acciones de PCR se estandarizaron enforma individual para cada secuenciade ADN seleccionada como candida-to a marcador y, después, en formamúltiple; con un par de iniciadoresgénero específico para H. influenzae,16S ARNr Hi; otro para M. catarrha-lis, 16S ARNr Mc; y otro para S. pneu-moniae, Ply; e iniciadores específicospara H. influenzae tipo b, Bex A; ypara H. influenzae no tipificableHMWA.

La fidelidad de las PCR se estable-ció controlando las concentraciones yla calidad de los reactivos empleadosen las mezclas, así como las condicio-nes de reacción en cuanto a númerode ciclos, temperaturas y tiempos dedesnaturalización, de alineamiento y

de extensión. Las reacciones múltiplesde PCR se efectuaron a un volumenfinal de 25 µl de mezcla de reacciónque contenía 2,5 µl de solución tam-pón de reacción 200 mM de Tris-HClpH 8,4, 80 µM de MgCl

2, 200 µM de

dNTP’S, 1 mM de cada oligonucleóti-do, 100 ng de ADN total o 1 microco-lonia de 24 horas como ADN molde y0,125 U de Taq ADN polimerasa.

La PCR fue optimizada por la con-centración de oligonucleótidos y tem-peratura. La PCR se inició con un pe-ríodo de desnaturalización de 2minutos a 94ºC, seguida por 30 ciclosde desnaturalización (30 s a 94ºC),alineamiento (30 s a 55ºC), extensión(1 minuto a 69ºC) y una extensión fi-nal (10 minutos a 72ºC), utilizando untermociclador Bio-Rad (Bio-RadLaboratories, California, USA). Losproductos de PCR se analizaron porelectroforesis en geles de agarosa al2% (Sigma-Aldrich Co. Ltd. Dorset,UK) en tris-acetato-EDTA 1x (TAE)(Sigma-Aldrich Co. Ltd. Dorset, UK;J. T. Backer, Mallinckrodt Backer, Inc.New Jersey, USA), bajo un campoeléctrico de 80 voltios.

Los marcadores de tamaño en pa-res de bases empleados fueron elÖX174 RF/ Hae III y 1 Kb Plus DNALadder (Invitrogen Life Technologies,Invitrogen Corporation, California,USA). Cada gel fue teñido conbromuro de etidio (Life Technologies,GIBCO BRL) para su observación a

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través de un digitalizador de imáge-nes Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories,California, USA).

PCR a partir de cultivo puro. Una vezestandarizada la metodología a partir deADN total, se procedió a aplicar la PCRa partir de cultivos puros; para ello se uti-lizaron 81 cepas provenientes de unacolección de cepas clínicas del Labo-ratorio de Infecciones Intrahospitalariasdel Departamento de MicrobiologíaMédica del Centro de Investigacionesen Ciencias Microbiológicas del Insti-tuto de Ciencias de la Benemérita Uni-versidad Autónoma de Puebla.

La PCR se probó mezclando unacolonia bacteriana de 24 horas de cre-cimiento en lugar de ADN bacterianototal, con cada uno de los iniciadores,para evaluar, corroborar y optimizarlas concentraciones y las condicionesdispuestas previamente. Primero, cadauna de las cepas se sometió a PCR in-dividual para probar la especificidadde los iniciadores y su identificacióncon los marcadores respectivos,HMWA, 16S ARNr Hi, BexA, 16SARNr Mc, y Ply, y posteriormente, serealizó la PCR múltiple en dos fasescomo se describe anteriormente parala PCR con ADN total como molde.

Resultados

Al analizar los serotipos de las 64cepas de H. influenzae ensayadas se

obtuvieron 32 cepas de serotipo b, 30cepas de no tipificable, una cepa deserotipo a y una cepa de serotipo e,cuyo origen se describe en la tabla 1.Para realizar la identificación de H.influenzae, M. cataharralis y S. pneu-moniae, se estandarizó la técnica paracada par específico de oligonucleóti-dos por cada patógeno.

Los ensayos de la PCR simple conlos oligonucleótidos específicos 16SARNr Hi mostraron un producto deamplificación de 483 pb en las 32 ce-pas de H. influenzae tipo b y las 30cepas de H. influenzae no tipificable(figura 1, paneles A y B), los cualestambién amplificaron cuando se pro-baron con H. influenzae serotipo a y e(figura 1, panel A, carriles 23 y 24,respectivamente), no siendo así cuan-do se ensayaron bacterias de otra es-pecie, como H. parainfluenzae (figu-ra 1, panel B, carriles 5 y 7), y otrosgéneros, como P. multocida, E. coli yE. faecalis (figura 1, panel B, carriles10, 12 y 13, respectivamente).

Por otro lado, los ensayos de PCRsimple con los oligonucleótidos espe-cíficos 16S ARNr MC y Ply mostra-ron un amplificado de 220 pb en lastres cepas de M. catarrhalis (figura 1,panel B, carriles 1, 4, 8, 9 y 11) y otroproducto de amplificación de 156 pbcon dos cepas de S. penumoniae (fi-gura 1, panel B, carriles 3 y 6).

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Con esto se logró la identificaciónentre H. influenzae, M. catarrhalis yS. pneumoniae, las tres bacterias máscomunes en la etiología de la otitismedia pediátrica.

Por otro lado, en ensayos de PCRmúltiple con todas las cepas de H. in-fluenzae, utilizando en el mismo en-sayo los oligobucleótidos específicos16S ARNr Hi, 16S ARNr Mc y Ply,solamente observamos productos de

amplificación de 483 pb (figura 2,paneles A y B). Cuando realizamoslos ensayos de PCR múltiple con lascepas de M. catarrhalis y S. pneumo-niae, obtuvimos productos de am-plificación de 220 y 156 pb, respecti-vamente (figura 2, panel C). Estosresultados nos condujeron a discrimi-nar entre H. influenzae, M. catarrha-lis y S. pneumoniae, las tres bacteriasmás comúnmente aisladas en otitispediátrica.

Figura 1. Productos de amplificación de la PCR simple utilizando oligonucleótidosespecíficos para H. influenzae, M. catarrhalis y S. pneumoniae. Panel A: carriles 1, 12, 21,22: marcador de pb ADN digerido ØX174 HaeIII; carriles 2- 11: cepas de H. influenzaeserotipo b, carriles 13-20: cepas de H. influenzae no tipificable, carril 23: H. influenzaeserotipo a, carril 24: H. influenzae serotipo e, todas amplificaron un fragmento de 483 pb conlos oligonucleótidos 16S ARNr Hi. Panel B: carriles 1, 4, 8, 9, 11: cepas de M. catarrhalis ycarril 2 cepa de H. influenzae amplificadas con los oligonucleótidos 16S ARNr MC (productode 220 pb); carriles 3 y 6: cepas de S. pneumoniae amplificadas con los oligonucléotidos Ply(producto amplificado de 156 pb) y carriles 5 y 7 cepas de H. parainfluenzae, carril 10: P.multocida, carril 12: E. coli y carril 13: E. fecalis, amplificados con los oligonucleótidos 16SARNr Hi (producto de amplificación de 483 pb). Carril 14 marcador de pb ADN digeridoØX174 HaeIII.

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Igualmente, diseñamos una PCRdoble para la amplificación simultá-nea de fragmentos de los genes bexA y hmwa o hia, para tipificar las ce-pas de H. influenzae. En estos ensa-yos observamos un producto de am-plificación de 310 pb para 29 de 32cepas de H. influenzae serotipo b (fi-gura 3, panel A) y un producto de 610

pb para 29 de 30 cepas de H. influen-zae no tipificable (figura 3, panel B),incluyendo como cepas control H.influenzae tipo a, e y H. parainflue-zae, las cuales no amplificaron conninguno de estos marcadores (no sepresentan los datos). Ninguna cepaamplificó para la proteína Hia (no sepresentan los datos).

Figura 2. Ejemplos de los resultados obtenidos en los ensayos de PCR múltiple con cepas deH. influenzae, usando simultáneamente oligonucleótidos específicos de género paradiscriminar y detectar H. influenzae (amplificación de un producto de 483 pb), M. catarrhalis(220 pb), y S. pneumoniae (156 pb). Panel A: carril 1 marcador ADN digerido ØX174 HaeIII;carriles 2-14 cepas de H. influenzae serotipo b. Panel B: carril 1 marcador ADN digeridoØX174 HaeIII, carriles 2-12 cepas de H. influenzae no tipificable, carriles 13 y 14 cepas de H.influenzae serotipo a y e, respectivamente, amplificadas con el juego de oligonucleótidos16S ARNr Hi. Panel C: carril 1: M. catarrhalis (220 pb) y carril 3: S. pneumoniae (156 pb).

Figura 3. Productos de los ensayos de PCR doble para amplificar los genes bexA y hmwa apartir de las cepas de H. influenzae serotipo b y no tipificable. Los oligonucleótidos específicosBexA y HMWA se utilizaron simultáneamente para obtener ampliaciones de 310 y 610 pb apartir de H. influenzae serotipo b (panel A) y no tipificable (panel B), respectivamente. Elúltimo carril de cada panel contiene el marcador de ADN digerido ØX174 HaeIII.

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Con los resultados descritos se lo-gró establecer las condiciones meto-dológicas para realizar la tipificaciónde cepas encapsuladas tipo b y cepasno tipificables de H. influenzae.

Discusión

Los métodos de cultivo estándaresque actualmente se utilizan para diag-nosticar la otitis media pediátrica pre-sentan problemas al no obtener creci-miento de las bacterias involucradas,por lo que en este proyecto se planteóimplementar un método molecularcapaz de identificar incluso bacteriasno viables, basado en la detección porPCR del ADN bacteriano.

La confiabilidad de la serotipifica-ción empleada actualmente para laidentificación de H. influenzaeserotipo b es dudosa, porque H. in-fluenzae tipo b tiende a perder la ex-presión y exportación de la cápsula yla serotipificación no es útil para ladetección de H. influenzae no tipifi-cable. Cualquier método de subtipifi-cación debe tener un gran poderdiscriminatorio, capaz de diferenciarcepas no relacionadas y debe ser re-producible. La PCR es una de las téc-nicas más usadas en biología molecu-lar por ser rápida y específica, y pordetectar cantidades mínimas de mate-rial genético con fines de diagnóstico,medicina forense, taxonomía, epide-miología molecular, expresión génica,

secuenciación y clonación de genes,entre otras[35].

En este trabajo se consideró un di-seño de PCR múltiple como una al-ternativa para la identificación ydiscriminación entre H. influenzae, M.catarrhalis y S. pneumoniae, ya queestos son los patógenos más frecuen-tes encontrados en los casos de otitismedia en niños menores de 5 años[7].Además, se consideró que este siste-ma también sirviera para la tipificaciónde cepas de H. influenzae tipo b y ce-pas no tipificables, estas últimas invo-lucradas en otitis media supurativa yserosa[4]. Los serotipos de H. influen-zae pueden asignarse solamente si estápresente un marcador serológico enparticular y éste se realiza mediante lacoaglutinación; sin embargo, este mé-todo puede dar falsos negativos, so-bre todo para la presencia de la cáp-sula tipo b, debido a que esta bacteriapuede sufrir variación de fase[23]. Porotro lado, los cultivos bacterianos demuestras de otitis media con secreciónsólo dan resultados positivos en 20%a 30% de los pacientes[7].

El proceso de subtipificación esepidemiológicamente relevante parael reconocimiento de la infección, dela transmisión, del origen de los or-ganismos virulentos y del seguimien-to de programas de vacunación. Losmétodos moleculares para tipificarmicroorganismos deben cumplir di-

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ferentes criterios para considerarse úti-les; por ejemplo, el uso de la PCRpara amplificar una secuencia blan-co de un solo patógeno involucra mástiempo y hace al método imprácticopara utilizarse como diagnóstico derutina[35,36].

El desarrollo de una PCR múltiple,como la que aquí se plantea, permiteamplificar más de una secuenciablanco al incluir más de un par deiniciadores en la reacción[37]. Lascondiciones de la PCR, así como lacompatibilidad de iniciadores dentrode la mezcla de reacción, son muyimportantes, de modo que no existaninterferencias que conlleven a resul-tados falsos negativos o positivos[38].Esto puede lograrse empleando paresde oligonucelótidos que amplifiquenproductos de PCR que pueden ser se-parados y visualizados por electrofo-resis según su tamaño[39,40].

En este trabajo se diseñaron oligo-nucleótidos género específicos para H.influenzae (16S ARNr Hi), para M.catarrhalis (16S ARNr Mc) y para S.pneumoniae (Ply); igualmente, se di-señaron oligonucleótidos específi-cos para la detección de la cápsula(BexA) de H. influenzae tipo b y parala detección de la adhesina de altopeso molecular (HMWA) de H. in-fluenzae no tipificable[41]. Los resul-tados demostraron que todas las ce-pas de H. influenzae amplificaron con

el par de oligonucelótidos 16S ARNrHi, lo que indica la especificidad y eluso práctico de estos iniciadores. Elporcentaje de cepas que amplificaroncon los oligonucleótidos 16S ARNr Hicoincide con el porcentaje general-mente reportado para la amplificaciónde esta secuencia molecular en otrasbacterias[42,43].

El 90,6% de 32 cepas de H. influen-zae serotipo b amplificaron con el parde oligonucleótidos BexA y el 96,6%de 30 cepas de H. influenzae no tipifi-cable amplificaron con los oligonu-cleótidos HMWA. Las cepas que noamplificaron con los oligonucelótidosBexA, aun cuando fueron serotipifi-cadas como serotipo b, podrían sercepas de diferente serotipo que pre-sentaron una reacción cruzada con elreactivo de coaglutinación. Las cepasde serotipo b que no amplificaron lasecuencia del gen bexA tampoco am-plificaron el gen hmw y las cepas deH. influenzae NT que no amplificaronla secuencia de las proteínas de altopeso molecular (HMWA) tampocoamplificaron el gen bexA, lo que su-giere que sea un falso positivo obteni-do al realizar el fenotipo con elreactivo de coaglutinación. Esto haceproponer que sean cepas que han su-frido una deleción en algún segmentode ADN involucrado en la expresiónde la cápsula, por lo que los oligonu-cleótidos no se alinearon; lo anteriorhace sugerir que estas cepas sean so-

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metidas a estudios de genotipificaciónpara tratar de tipificarlas.

Con respecto a la amplificación delgen ply de S. pneumoniae, es consi-derable que en todas las cepas ensa-yadas se logró la amplificación delmismo, aunque creemos que es nece-sario ampliar el número de cepas enensayos posteriores.

Con los resultados obtenidos seconcluye que la amplificación de lassecuencias de los genes 16S ARNrde H. influenzae, 16S ARNr de M.catarrhalis y el determinante de vi-rulencia Ply (neumolisina) de S.pneumoniae, son buenos blancos parautilizarse en la PCR múltiple, ya quecontienen dominios conservados quepueden utilizarse como marcadoresmoleculares que nos permiten diferen-ciar e identificar a nivel de género en-tre H. influenzae, M. catarrhalis y S.pneumoniae.

De forma similar, los determinan-tes de virulencia codificados por losgenes hmw para la adhesina HMWAde H. influenzae no tipificable y bex Apara la cápsula tipo b de H. influenzaetipo b, son marcadores molecularesque nos hacen posible diferenciar,identificar y tipificar a nivel de intra-especie entre el tipo b y el no tipifica-ble, mediante una PCR dúplex y sonútiles como herramientas moleculares.Por esto, el uso de una PCR múltipleen dos fases (triple y doble) para la

amplificación de los marcadoresmoleculares y de virulencia ensayadosen este trabajo para la identificación ydiferenciación de H. influenzae, esconfiable bajo las condiciones estable-cidas a partir de ADN total y a partirde bacteria completa (cultivo de 24horas).

Debido a que el método es sensi-ble tanto para muestras de ADN comocon células bacterianas completas, pro-ponemos el uso de esta metodología apartir de muestras directas de líquidocefalorraquídeo, secreciones óticas yotros líquidos, estableciendo las con-diciones para cada una de éstas, y po-dríamos implementar el uso de otrosmarcadores genéticos de virulenciapara identificar otros serotipos de H.influenzae diferentes al b.

Esta herramienta molecular facili-tará establecer un diagnóstico más rá-pido y oportuno de patologías en lasque se encuentran involucrados estostres patógenos pediátricos, de maneraque favorecerá la toma de decisión enel tratamiento, lo cual redundará en laevolución favorable del paciente.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por elPrograma Institucional de Fomento alDesarrollo de la Investigación y a laFormación de Jóvenes Investigadoresen la Benemérita Universidad Autóno-ma de Puebla (IV 17 G02). Claudia

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García Zacarías fue apoyada con unabeca (No. 158110) por el ConsejoNacional de Ciencia y Tecnología paraobtener su grado de Maestra en Cien-cias.

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