martínez, 2014. evaluación del infiltrado inmunológico del tumor y su relación con el...

7/24/2019 Martnez, 2014. Evaluacin del infiltrado inmunolgico del tumor y su relacin con el pronstico de pacientes con

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Facultad de Biologa

Universidad de La Habana

Tesis de Diploma

Evaluacin del infiltrado inmunolgico del tumor y su

relacin con el pronstico de pacientes con cncer de

colon

Autor: Mileidy Martnez Ival

Tutores: Dra. Tania Lahera Snchez

Lic. Adanays Calvo Prez

Instituto de Oncologa y Radiobiologa

-2014 -


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Facultad de Biologa

Universidad de La Habana

Evaluacin del infiltrado inmunolgico del tumor y su relacin

con el pronstico de pacientes con cncer de colon

Tesis de Diploma

Autor:Mileidy Martnez Ival

Tutores: Dra. Tania Lahera Snchez

Lic. Adanays Calvo Prez

Instituto de Oncologa y Radiobiologa

La HabanaJunio, 2014


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A mi mam, por ser mi fuerza inspiradora


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Agradecimientos:

A los profesionales del Dpto. de Anatoma Patolgica del Instituto de Oncologa por permitirnosobtener las muestras tumorales y utilizar su microscopio para fotografiarlas.

A los investigadores del Dpto. de Biologa Celular y Banco de Muestras Biolgicas del Instituto de

Oncologa por acogerme de una manera muy especial en su laboratorio.

A mis tutoras por haber confiado en m y brindarme parte de sus conocimientos.

A todos los profesores de la carrera que, a travs de su ejemplo, han contribuido con mi

formacin acadmica; especialmente a los profesores Emir Prez y Javier Garca por ayudarme

cada vez que lo necesit.

A mis amigos, por compartir conmigo tantos aos.

A mi novio, por contagiarme con su alegra en los momentos difciles.

A mi familia por apoyarme en todos mis sueos, especialmente a mi hermanita, que con su corta

edad me gua por el camino correcto y a mi mam, que es un ejemplo de dedicacin y sacrificio

para m. Y que intentar, de ahora en adelante, seguir sus pasos.

A todos las personas que no he mencionado aqu y que han contribuido con la realizacin de este

trabajo. Gracias.


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Un problema no puede ser resuelto al mismo nivel de conciencia en que fue

creado, tenemos que aprender a ver el mundo de nuevo."

Albert Einstein


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Resumen

Resumen

El cncer de colon representa la tercera causa de muerte por tumores malignos en

nuestro pas. El limitado alcance de los factores pronsticos convencionales hace

necesaria la bsqueda de nuevos biomarcadores a nivel del sistema inmunolgico paraestablecer una mejor estratificacin de los pacientes y un tratamiento personalizado. Con

el objetivo de evaluar la relacin entre el infiltrado inmunolgico del tumor y el pronstico

del cncer de colon, se estudiaron 50 pacientes, operados en el Instituto de Oncologa

durante el perodo 2004-2008. A partir de las muestras parafinadas, se determin

mediante inmunohistoqumica, la expresin de los marcadores CD3, CD45RO, CD8,

granzima B y CD68. Los pacientes con tumores poco diferenciados, mucoproductores y

en estadio IV, mostraron menor infiltracin de clulas inmunolgicas. Las tasas desupervivencia a los 5 aos resultaron superiores en pacientes con alta densidad de

clulas, siendo significativas para las CD8+ intratumoral (p=0,035) y las CD3+, (p=0,001),

CD45RO+ (p=0,007), CD8+ (p=0,041) y CD68+ (p=0,041) a nivel del estroma. El anlisis

de la supervivencia global mostr ventajas significativas para los pacientes con alta

expresin intratumoral de clulas CD8+ (p=0,014), as como de CD3+ (p=0,006),

CD45RO+ (p=0,011) y CD68+ (p=0,042) a nivel del estroma. En el anlisis multivariado,

las clulas CD45RO+ en el estroma del tumor (p=0,004) y el estadio clnico TNM

(p=0,035) se comportaron como factores pronsticos independientes. El impacto favorable

de las clulas inmunolgicas, particularmente de las CD45RO+, en la supervivencia de los

pacientes con cncer de colon, denota su posible utilidad, como una herramienta

complementaria a la clasificacin TNM, en la estimacin del pronstico de la enfermedad.

Palabras clave: cncer de colon, infiltrado inmunolgico, variables clnico-patolgicas,

linfocitos T, macrfagos, inmunohistoqumica, pronstico, supervivencia.


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Glosario de abreviaturas

Glosario de Abreviaturas

ADN cido desoxirribonucleico

APC clulas presentadoras de antgeno, del ingls: antigen presenting cell

CD grupo de diferenciacin, del ingls: cluster of differentiation

cel clulas

DAMP patrones moleculares asociados a daos, del ingls damage-associated molecular

patterns

FOXP3 factor de transcripcin nuclear forkhead box P3

ICAM molcula de adhesin intracelular, del ingls: intracellular adhesion molecule

IFN interfern

Ig inmunoglobulina

IL interleuquina

INOR Instituto de Oncologa y Radiobiologa

ITAM secuencia tirosnica de activacin del inmunorreceptor transmembrana, del ingls:

immunoreceptor tyrosine-based activation motif

LTC linfocitos T citotxicos

MHC complejo principal de histocompatibilidad, del ingls: major histocompatibility complex

min minutos

NK clulas citolticas naturales, del ingls: natural killer

PAMP patrones moleculares asociados a patgenos, del ingls pathogen-associated

molecular patterns

SI sistema inmunolgico

TAM macrfagos asociados al tumor, del ingls tumor-associated macrophages

TCR receptor de clulas T, del ingls: T cell receptor

TGF- factor de crecimiento transformante-, del ingls transforming growth factor

Th linfocitos T cooperadores, , del ingls: T helper

TIL linfocitos infiltrantes del tumor, del ingls tumor-infiltrating lymphocytes

TNF factor de necrosis tumoral, del ingls: tumoral necrosis factor

TNM T: extensin del tumor, del ingls: tumor. N: presencia de metstasis en los ganglios

linfticos regionales, del ingls: node. M: presencia de metstasis, del ingls:

metstasis

Treg linfocitos T reguladores

VEGF factor de crecimiento del endotelio vascular, del ingls endothelial growth factor


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Tabla de contenidos

Tabla de Contenidos

I. Introduccin ................................................................................................................................... 1

II. Revisin bibliogrfica ..................................................................................................................... 4

II.1. Cncer de colon ........................................................................................................................... 4

II.2. Variables clnico-patolgicas del cncer de colon .......................................................................... 5

II.2.1. Edad ................................................................................................................................................ 5

II.2.2. Sexo ................................................................................................................................................. 5

II.2.3. Localizacin del tumor .................................................................................................................... 5

II.2.4. Grado de diferenciacin histolgica del tumor .............................................................................. 6

II.2.5. Estadio clnico segn la clasificacin TNM ...................................................................................... 6

II.2.6. Subtipo histolgico mucinoso ......................................................................................................... 6

II.2.7. Invasin linfovascular ..................................................................................................................... 7

II.3. Sistema inmunolgico (SI) ............................................................................................................ 7

II.3.1. Linfocitos T ...................................................................................................................................... 8

II.3.1.1. Linfocitos T citotxicos ............................................................................................................ 9

II.3.1.2. Linfocitos T de memoria ........................................................................................................ 10

II.3.2. Macrfagos ................................................................................................................................... 11

II.4. Relacin del sistema inmunolgico con el cncer ........................................................................ 12

II.4.1. Teora de la inmunoedicin tumoral ............................................................................................ 13

II.4.1.1. Fase de eliminacin ............................................................................................................... 13

II.4.1.2. Fase de equilibrio .................................................................................................................. 13

II.4.1.3. Fase de escape ....................................................................................................................... 14

II.4.2. Mecanismos de defensa contra el tumor ..................................................................................... 15

II.5. infiltrado inmunolgico en el pronstico del cncer de colon ...................................................... 16

II.5.1. Linfocitos infiltrantes del tumor ................................................................................................... 16

II.5.2. Macrfagos infiltrantes del tumor ................................................................................................ 17

III. Materiales y mtodos................................................................................................................... 19

III.1. Seleccin de los pacientes ......................................................................................................... 19

III.2. Obtencin de los datos clnico-patolgicos ................................................................................ 19

III.2.1. Evaluacin de las variables clnico-patolgicas ........................................................................... 19

III.3.Inmunohistoqumica ................................................................................................................. 19


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Tabla de contenidos

III.3.1. Muestras de tumores ................................................................................................................... 19

III.3.2. Anticuerpos primarios ................................................................................................................. 20

III.3.3. Descripcin de la tcnica inmunohistoqumica ........................................................................... 20

III.4. Determinacin de la densidad de clulas inmunolgicas infiltrantes del tumor .......................... 21III.4.1. Determinacin de la densidad de clulas CD3+, CD8+, CD45RO+ y granzima B+ intratumorales

................................................................................................................................................................ 21

III.4.2. Determinacin de la expresin de clulas CD3+, CD8+, CD45RO+ y granzima B+ estromales ... 22

III.4.3. Determinacin de la expresin de clulas CD68+ peritumorales ................................................ 22

III.5. Anlisis estadstico de los datos ................................................................................................ 22

IV. Resultados ................................................................................................................................... 24

IV.1. Caractersticas del infiltrado inmunolgico del tumor ................................................................ 25

IV.2. Relacin entre las clulas inmunolgicas infiltrantes del tumor ................................................. 27

IV.3. Relacin entre variables clnico-patolgicas y las clulas inmunolgicas infiltrantes del tumor ... 28

IV.4. Tasa de supervivencia a los 5 aos ............................................................................................ 31

IV.5. Estimacin de la supervivencia global ....................................................................................... 33

IV.6. Anlisis univariado y multivariado de la supervivencia global .................................................... 37

V. Discusin ..................................................................................................................................... 39

VI. Conclusiones ................................................................................................................................ 44

VII. Recomendaciones ........................................................................................................................ 45

Literatura citada .................................................................................................................................. 46

Anexos ................................................................................................................................................. 53


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Introduccin

1

I. Introduccin

El cncer es un enfermedad compleja por la amplia multicausalidad que incide en su

origen, la complejidad de sus mecanismos patognicos, biomoleculares y la variedad detipos que pueden originarse en los seres vivos (Schulz, 2005).

El cncer de colon constituye la tercera neoplasia ms frecuente a nivel mundial. En el

2008, se diagnosticaron 1,2 millones de pacientes con cncer de colon y se estima que

ocurrieron 608 700 muertes. En los pases occidentales, representa la segunda causa de

muerte por cncer, solo superada por el cncer de pulmn (Jemal et al., 2011).

En Cuba, el cncer de colon constituye un serio problema de salud. En el 2013, sereportaron 2 064 muertes por causa de esta enfermedad (tasa ajustada de 18,5 por

100 000 habitantes), representando la tercera causa de muerte por cncer, solo superado

por el cncer de pulmn y prstata en los hombres; y por el cncer de pulmn y mama en

las mujeres (Anuario Estadstico de Salud, 2013).

Los factores pronsticos establecidos para la estimacin de la supervivencia y la

racionalidad de la terapia adyuvante en los pacientes con cncer de colon, se basan en

caractersticas histopatolgicas del tumor, como el grado de diferenciacin y el estadio

(clasificacin TNM) segn la extensin del tumor (T), la presencia de metstasis en los

ganglios linfticos regionales (N) y de metstasis en otros rganos (M) (Sobin y Wittekind,

2002; Quirke et al., 2007).

Estos factores pronsticos convencionales proveen una limitada informacin sobre la

evolucin clnica de los pacientes (Galon et al., 2012). Se ha descrito que algunos

pacientes con tumores histopatolgicamente similares, difieren en el pronstico y la

respuesta al tratamiento (Baker et al., 2007), as como que la evolucin clnica de los

pacientes en un mismo estadio clnico puede variar significativamente (Mlecnik et al.,

2011). Una de las razones del limitado alcance de la clasificacin TNM es que asume la

progresin del tumor como un proceso determinado solo por la acumulacin de

alteraciones genticas en las clulas tumorales (Fearon y Vogelstein, 1990), sin

considerar otros componentes del microambiente tumoral (Bindea et al., 2011), como la

interaccin con las clulas inmunolgicas (Galon et al., 2006; McAllister y Weinberg,

2010).


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Introduccin

2

La respuesta inmune contra el tumor es un proceso complejo que involucra la interaccin

de diferentes clulas inmunolgicas con funciones diversas (Titu et al., 2002; Dalerbaet

al., 2003). De manera general, la presencia de los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) se

ha asociado con un buen pronstico en varios tipos de cncer incluyendo el cncer de

colon (Galon et al., 2006; Kawai et al., 2008; Menegaz et al., 2008). Los TIL son capaces

de destruir el tumor mediante el reconocimiento de los antgenos expresados en la

membrana de las clulas tumorales (Pages et al., 2005). En este sentido, Galon et al.

(2007) sugieren que la respuesta inmune adaptativa juega un papel fundamental en la

menor tasa de recurrencia y de metstasis del cncer de colon.

Las evidencias acerca de que la evolucin del cncer de colon puede estar influenciado

por el contexto inmunolgico, que se genera en el microambiente del tumor (Galon et al.,

2006), apuntan hacia la utilidad de la respuesta inmune local como un posible factor

pronstico de la enfermedad. La comprensin del rol del infiltrado inmunolgico en la

evolucin del cncer de colon permitira una mejor estratificacin de los pacientes y

avanzar en la personalizacin del tratamiento.

Desde el punto de vista teraputico, la interaccin entre las clulas inmunolgicas y las

clulas tumorales proveen un espectro de posibles blancos para el desarrollo deestrategias innovadoras en el tratamiento del cncer de colon. Las terapias

convencionales, incluyendo la quimioterapia y la radioterapia, dependen, al menos

parcialmente, de la activacin la respuesta inmune contra el cncer (Galluzzi et al., 2012);

por lo que la infiltracin del tumor por clulas inmunolgicas pudiera constituir, adems,

un marcador predictivo de la respuesta de los pacientes a terapias especficas.

A partir de las limitaciones de los factores convencionales en la prediccin de la evolucin

clnica del cncer de colon, y considerando que la caracterizacin del infiltrado

inmunolgico del tumor pudiera ser una herramienta til en la estimacin del pronstico de

la enfermedad, se plante el siguiente objetivogeneral:

Evaluar la relacin entre el infiltrado inmunolgico del tumor y el pronstico de pacientes

con cncer de colon.


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Introduccin

3

Para cumplimentar el objetivo propuesto se trazaron los siguientes objetivos

especficos:

1. Caracterizar el infiltrado inmunolgico del tumor en los pacientes estudiados.

2. Identificar la posible asociacin entre las clulas inmunolgicas infiltrantes del

tumor y las variables clnico-patolgicas.

3. Identificar la posible asociacin entre las clulas inmunolgicas infiltrantes del

tumor y la supervivencia de los pacientes.


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Revisin bibliogrfica

4

II. Revisin bibliogrfica

II.1. Cncer de colon

La formacin de un tumor es un proceso complejo que involucra mltiples mecanismos decarcinognesis, como la acumulacin de alteraciones genticas y oncognicas

(Cuatrecasas et al., 2005). Entre las principales caractersticas de las clulas tumorales se

encuentran la proliferacin celular descontrolada, las alteraciones en el metabolismo

celular, la inestabilidad gentica, la invasin local y la capacidad de metstasis (Hanahan

y Weinberg, 2011).

El cncer de colon constituye la neoplasia ms comn del tubo digestivo, representando

la mitad del total de los casos (Alves et al., 2005; Zinner y Ashley, 2007). Se han descrito

diversos factores de riesgo, tanto genticos como ambientales, que favorecen la aparicin

de la enfermedad, como la poliposis adenomatosa familiar, la colitis ulcerativa, la

enfermedad de Crohn (Kumar et al., 1999), el hbito de fumar, el sedentarismo y la dieta

pobre en fibras dietticas (Labianca, 2010).

La tasa de supervivencia a los cinco aos es del 80-90%, cuando se detecta

tempranamente la enfermedad (Libutti et al., 2005). Sin embargo, la evolucin clnica de

los pacientes con esta enfermedad es muy variable, independientemente del estadio

clnico (Dighe et al., 2008). Gonzlez et al. (2009) reportan que el cncer de colon

recurrente se presenta en el 10-30% de los pacientes operados, de los cuales la mayora

fallecen por complicaciones asociadas a la ciruga.

Ms del 90% de los tumores localizados en el colon son adenocarcinomas (Hamilton et

al., 2010). Este tipo de tumor se origina a partir de las clulas epiteliales que forman las

glndulas de Lieberkhn presentes en la lmina propia de la mucosa del intestino grueso(Grau y Piqu, 1990).

El cncer de colon es uno de los tumores mejor conocido a nivel molecular y gentico, por

lo que constituye un buen modelo de carcinognesis en el que se ha establecido una

secuencia de cambios genticos, correlacionados con etapas especficas de la progresin

tumoral (Fearon y Vogelstein, 1990). Las alteraciones genticas estn asociadas a la

prdida de la estabilidad genmica, mediada por la inestabilidad microsatelital o

microsomal y la hipermetilacin del genoma (Deschoolmeester et al., 2010). La


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acumulacin de alteraciones oncognicas se produce de manera progresiva, desde la

aparicin de lesiones iniciales, hasta la formacin de adenomas, de carcinomas

intraepiteliales, de carcinomas infiltrantes y finalmente, de metstasis ganglionares y a

distancia (Hernndez-Losa et al., 2012).

II.2. Variables clnico-patolgicas del cncer de colon

II.2.1. Edad

La mayor incidencia de la enfermedad se encuentra en pacientes entre los 60 y 79 aos

de edad, mientras que solo el 20% se reporta en personas menores de 50 aos

(Hechavarra et al., 2003). El incremento de la incidencia despus de los 60 aos se

asocia con la accin acumulativa de los productos carcinognicos sobre la mucosa del

colon, as como con la exposicin prolongada a los factores de riesgo, que provocan

defectos en los mecanismos celulares de reparacin gnica (Machado et al.,2011). La

edad inferior a 40 aos se ha asociado a un pronstico desfavorable; lo que se atribuye a

que entre el 60 y el 80% de estos pacientes son diagnosticados con invasin a los

ganglios linfticos y metstasis (Libutti et al., 2005; Tan et al., 2007).

II.2.2. Sexo

Aunque la mayora de los autores reportan una tasa de incidencia y mortalidad similar

para ambos sexos (Libutti et al.,2005; Visser et al., 2009), algunos estudios refieren una

mayor frecuencia de los tumores de colon ascendente en el sexo femenino (Zinner y

Asley, 2007).

II.2.3. Localizacin del tumor

La ubicacin topogrfica del tumor en el colon permite la distribucin de los pacientes

segn la divisin anatmica: colon ascendente, colon transverso, colon descendente y

colon sigmoides (Machado et al., 2011). Se ha referido que los pacientes con tumores del

colon ascendente alcanzan una mayor supervivencia global (5 aos), con respecto a los

que presentan tumores en el colon descendente (4 aos); y en el colon sigmoides y

transverso (3 aos) (Machado et al., 2011). El colon descendente tiene una mayor luz

intestinal y una pared ms delgada y distensible que el colon ascendente, por lo que en

este ltimo existen mayores complicaciones durante y despus de la reseccin quirrgicadel tumor (Machado et al., 2011). La menor supervivencia de los pacientes asociada a los


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tumores de colon sigmoides se asocia a la mayor frecuencia de complicaciones durante el

diagnstico, como obstruccin y perforacin intestinales. (Visser et al., 2009).

II.2.4. Grado de diferenciacin histolgica del tumor

El cncer de colon se ha clasificado en tres grados, segn la diferenciacin histolgica del

tumor (Anexo 1): grado I) bien diferenciado: el tejido tumoral tienen gran semejanza

estructural con el tejido glandular de origen; grado II) moderadamente diferenciado:

algunas clulas tumorales no forman una estructura glandular, por lo que el tejido tumoral

se asemeja menos al tejido glandular de origen; y grado III) poco diferenciado: las clulas

tumorales se encuentran dispersas y es difcil identificar alguna estructura glandular

(Kumaret al., 1999).

A pesar de que los tumores de colon bien diferenciados aparecen con mayor frecuencia

que los poco diferenciados, se ha descrito que estos ltimos tienen un peor pronstico

(Rodrguez et al., 2002).

II.2.5. Estadio clnico segn la clasificacin TNM

El estadio clnico de los pacientes se determina mediante un sistema de clasificacin

creado por la Unin internacional para el Control del Cncer (UICC, siglas en ingls). Esta

clasificacin tiene en cuenta la extensin anatmica del cncer y se establece a travs de

la medicin de los tres parmetros que definen su nombre, T: extensin del tumor, N:

presencia de metstasis en los ganglios linfticos regionales y M: presencia de metstasis

distantes (Sobin y Wittekind, 2002) (Anexo 2).

El anlisis de la supervivencia, segn el estadio clnico, refleja que los pacientes en

estadios menos avanzados de la enfermedad (I y II) muestran un mejor pronstico

(Machado et al., 2011). Los pacientes en estadio clnico IV tienen una menor

supervivencia debido a la presencia de metstasis a distancia, indicativa de diseminacin

de las clulas tumorales por el organismo (Bendardaf et al., 2008).

II.2.6. Subtipo histolgico mucinoso

El adenocarcinoma mucinoso se presenta de un 6 a un 20% de todos los tumores de

colon (Thomas y Sobin, 1995; Chew et al., 2010). Este subtipo histolgico se caracteriza


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por la sobreexpresin de glicoprotenas como las mucinas, que invaden el intersticio

celular generando lagunas mucinosas en el tejido (Kumar et al., 1999) (Anexo 3).

Los adenocarcinomas de mucinosos se asocian con un fenotipo tumoral ms agresivo, y

por tanto con un peor pronstico (Farhat et al., 2008). En este sentido, Maksimovic (2007)

reporta que los pacientes con tumores mucoproductores tienen una mayor presencia de

metstasis en los ganglios linfticos, una menor tasa de curacin y de supervivencia

despus del tratamiento quirrgico.

II.2.7. Invasin linfovascular

La invasin linftica y vascular constituyen pasos cruciales en la formacin de

micrometstasis y eventualmente, en el crecimiento de un tumor macroscpico en un sitio

secundario (Compton, 2000). Las clulas tumorales inducen la neoangiognesis, debido a

que los nutrientes y el oxgeno suministrado por los vasos sanguneos preexistentes,

generalmente, no son suficientes para sustentar el crecimiento del tumor, por lo que es

necesario la reconstruccin de esta vasculatura y la formacin de vasos nuevos (Schulz,

2005). Las clulas tumorales pueden invadir los ganglios linfticos locales, penetrar en los

vasos linfticos principales y por esta va, entrar en la sangre y formar una metstasis en

un sitio secundario (Schulz, 2005). En el adenocarcinoma de colon, la invasinlinfovascular es considerado un factor pronstico adverso (Compton, 1999; Compton et

al.,2000).

II.3. Sistema inmunolgico (SI)

La inmunidad innata constituye la primera lnea de defensa frente a patgenos y clulas

cancerosas. Los neutrfilos y los macrfagos son clulas fagocticas que presentan

receptores codificados en la lnea germinal que reconocen determinadas molculas, comolos patrones moleculares asociados a daos (DAMP) y los patrones moleculares

asociados a patgenos (PAMP) (Abbas et al., 2011).

Las clulas citolticas naturales (NK) reconocen las clulas infectadas o tumorales

mediante un conjunto de receptores activadores e inhibidores. Estas clulas, al igual que

los linfocitos T citotxicos (LTC), secretan grnulos citotxicos que inducen la apoptosis

en la clula diana. Secretan, adems, interfern- (IFN-) que activa a los macrfagos,

aumentando su capacidad para destruir las partculas fagocitadas (Abbas et al., 2011).


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Las clulas presentadoras de antgenos (APC), entre ellas, las clulas dendrticas,

reconocen una gran variedad de antgenos y son capaces de estimular la expansin de

linfocitos T especficos contra el antgeno reconocido, generando una respuesta inmune

especfica y una memoria inmunolgica, que permite la amplificacin de la respuesta

despus de la re-exposicin al mismo antgeno (Abbas et al.,2011).

Las poblaciones de linfocitos B y T son responsables de la inmunidad adaptativa. Los

linfocitos B reconocen los antgenos solubles y se diferencian en clulas secretoras de

anticuerpos. Los linfocitos T son un conjunto de clulas heterogneas con propiedades y

funciones diversas, que incluyen desde la cooperacin celular hasta la citotoxicidad

(Abbas et al., 2011).

II.3.1. Linfocitos T

Los linfocitos T constituyen un grupo diverso de clulas del SI, que comparten la

expresin de un receptor (TCR) capaz de reconocer pptidos unidos a molculas del

complejo principal de histocompatibilidad (MHC) presentes en varios tipos de clulas. Los

linfocitos T tienen funciones importantes en la respuesta inmune adaptativa contra

antgenos proteicos (Abbas et al, 2011).

Entre sus principales marcadores de superficie se encuentra la protena grupo de

diferenciacin (CD) 3, que se asocia de forma no covalente al TCR y participa en la

transduccin de seales que conlleva a la activacin y proliferacin de estos linfocitos.

CD3 constituye un dmero formado por las cadenas homologas invariables , o . La

regin extracelular amino-terminal contiene un dominio similar a las inmunoglobulinas (Ig),

y los segmentos transmembrana contienen un residuo de cido asprtico, que se une a

aminocidos bsicos de los dominios transmembrana de las cadenas del TCR. El dominio

citoplasmtico de CD3 contiene una secuencia conservada (secuencia tirosnica de

activacin del inmunorreceptor transmembrana (ITAM)) vinculada con la activacin

funcional de los linfocitos T (Abbas et al., 2011).

Las protenas de membrana se emplean como un marcador fenotpico para distinguir,

desde el punto de vista funcional, subpoblaciones de linfocitos T diferentes. Los linfocitos

T cooperadores (Th) CD4+ reconocen pptidos unidos a molculas MHC clase 2

presentes en las APC, mientras que los linfocitos T CD8+ reconocen pptidos unidos amolculas MHC clase 1 (Abbas et al., 2011).


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Las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ se distinguen por sus distintas funciones y por

los marcadores de superficie que expresan. Los linfocitos Th1 participan en la activacin

de macrfagos mediante la liberacin de IFN-, por lo que intervienen en la defensa

contra microbios intracelulares. Los linfocitos Th2 promueven la activacin de mastocitos

y eosinfilos mediante la liberacin de interleuquina (IL) 4, IL-5 e IL-13, participando en la

defensa contra parsitos helmintos. La subpoblacin de linfocitos Th17 activa a los

neutrfilos y los monocitos, a travs de la secrecin de IL-17 y favorece el establecimiento

de una inflamacin que protege contra los hongos y las bacterias extracelulares. Los

linfocitos T reguladores (Treg) expresan el factor de transcripcin nuclear forkhead box P3

(FOXP3) y tienen funciones moduladoras de la respuesta inmune (Abbas et al., 2011).

II.3.1.1. Linfocitos T citotxicos

Los LTC destruyen las clulas infectadas y las clulas tumorales que presentan antgenos

asociados al MHC clase 1. La glucoprotena transmembrana CD8 constituye el

correceptor de esta subpoblacin de linfocitos y generalmente, se encuentra presente

como heterodmero formado por dos cadenas unidas mediante puentes disulfuro (CD8 y

CD8). Las cadenas y poseen un nico dominio extracelular similar a Ig, a travs del

cual se une al MHC clase 1, y una regin citoplasmtica bsica, de aproximadamente 25

aminocidos, que al unirse a la tirosina quinasa Lck, promueve la activacin de estos

linfocitos (Abbas et al., 2011).

La diferenciacin de los linfocitos T CD8+ en LTC necesita, adems del reconocimiento

del complejo pptido-MHC clase 1 presentado por las APC, que exista una

co-estimulacin mediada por la unin de CD28 presente en los linfocitos T CD8+ y la

molcula B7 expresada en las APC activadas (Abbas et al., 2011).

La interaccin directa de los LTC con su clula diana, a travs de la fusin de las

membranas, estimula la exocitosis de molculas citotxicas, almacenadas dentro de

grnulos citoplasmticos de los LTC. Estas molculas, como la serglicina, las perforinas y

las granzimas, desencadenan mecanismos de apoptosis en las clulas diana. La

serglicina es un proteoglucano sulfatado que permite el ensamblaje del complejo

citotxico granzimas-perforinas. Las perforinas permiten la entrada de las granzimas,

mediante la formacin de poros acuosos en la membrana de la clula blanco. Las

granzimas son serin-proteasas que escinden protenas a partir de residuos de aspartato y


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al ser liberadas producen la apoptosis mediante la activacin de la va de las caspasas

(Abbas et al., 2011). La granzima B constituye una de las molculas con mayor capacidad

citotxica reconocida. Esta molcula promueve la activacin proteoltica de las caspasas,

provocando la ruptura proteoltica de ms de 300 protenas celulares, la fragmentacin del

cido desoxirribonucleico (ADN) por DNAsas, as como la redistribucin de protenas y

fosfolpidos en la membrana plasmtica que constituyen una seal para la posterior

fagocitosis de estas clulas por los macrfagos (Schulz, 2005).

Otro mecanismo de destruccin de los LTC es mediado por interacciones entre una de

sus protenas de membrana, denominada ligando de Fas (FasL) y el receptor de muerte

celular Fas presente en muchos tipos celulares. Esta interaccin promueve la activacin

de la va de las caspasas y la apoptosis de la clula diana (Abbas et al., 2011).

II.3.1.2. Linfocitos T de memoria

La respuesta inmune mediada por linfocitos T frente a un antgeno habitualmente genera

linfocitos T de memoria especficos, que pueden persistir durante aos. Los linfocitos T de

memoria son menos dependientes de la co-estimulacin mediada por la unin B7:CD28

que las clulas T vrgenes (Abbas et al., 2011). Esta caracterstica permite que los

linfocitos T de memoria sean capaces de generar respuestas ms rpidas y amplificadascuando entran en contacto, nuevamente, con el mismo antgeno (Farber et al., 2014).

Los linfocitos T de memoria pueden derivar de los linfocitos T CD4+ o CD8+ y expresan la

isoforma RO de la protena tirosina fosfatasa CD45 (CD45RO). CD45 es una glicoprotena

de membrana tipo I, con una regin citoplasmtica consistente de numerosos dominios

tirosina fosfatasa. La regin extracelular contiene tres dominios de fibronectina tipo III

altamente N-glicosilados y una regin rica en cistena (Dupere-Minier et al., 2010). CD45

puede encontrarse en mltiples isoformas resultantes del corte y empalme alternativo de

los exones que codifican para tres dominios O-glicosilados diferentes en la regin

extracelular (Holmes, 2010). CD45RO con un peso molecular de 180 kDa, no contiene

ningn dominio O-glicosilado (Holmes, 2010) y el nmero de N-glicosilaciones vara entre

las subpoblaciones de linfocitos en las distintas etapas de diferenciacin (Hernndez et

al., 2007). La isoforma RA de CD45 (CD45RA), con un peso molecular de 200 kD, est

presente en la mayora de las clulas T vrgenes, pero ausente en las clulas T de

memoria (Abbas et al., 2011).


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Los linfocitos T de memoria tienen una expresin elevada del receptor de la IL-7, debido a

que esta citoquina estimula una baja proliferacin de estas clulas e induce la expresin

de protenas antiapoptticas, como Bcl-2 y Bcl-XL, que permiten la supervivencia de estos

linfocitos, an despus de la eliminacin del antgeno (Abbas et al., 2011).

La poblacin de linfocitos T de memoria es heterognea y pueden distinguirse

subpoblaciones con propiedades y funciones diferentes (Sallusto et al., 1999). Las clulas

T de memoria centrales expresan L-selectinas y el receptor de quimoquinas CCR7, se

mantienen en los ganglios linfticos y tienen funciones efectoras limitadas, pero luego del

contacto con el antgeno adquieren gran capacidad proliferativa. Las clulas T de

memoria efectoras no expresan L-selectina y CCR7, permanecen en los sitios perifricos,

especialmente en las mucosas, producen citoquinas como IFN- y aunque tienen pocacapacidad proliferativa, son capaces de diferenciarse rpidamente en clulas efectoras

(Abbas et al., 2011).

II.3.2. Macrfagos

Los macrfagos representan la etapa final de la diferenciacin de los monocitos (Gordon,

1986). Los monocitos son fagocitos mononucleares que se desarrollan en la mdula sea,

circulan por la sangre y despus, al azar o por estmulos quimiotcticos, pasan a lostejidos donde pueden permanecer como macrfagos, durante 60 das o ms (Abbas et al.,

2011).

Algunos marcadores de superficie, como la protena CD68, se han reconocido tanto en los

monocitos circulantes en sangre como en los macrfagos (Knapp et al., 1991). CD68 es

una glicoprotena transmembrana tipo I altamente glicosilada que participa en la

endocitosis y el trfico lisosomal (Holness et al., 1993). Contiene varios sitios de N-

glicosilacin (Asn-X-Ser/Thr) y O-glicosilacin (Holness et al., 1993), este ltimo mediado

por residuos de serina, treonina y prolina presentes en la regin extracelular (Wilson et al.,

1991).

Los monocitos pueden originar dos tipos de macrfagos, de acuerdo a las diferentes vas

de activacin. La va clsica de activacin es mediada por el reconocimiento de productos

microbianos y citoquinas como el INF- que generan el subtipo M1 de macrfagos, los

cuales participan en la fagocitosis y tienen un efecto microbicida. La va alternativa deactivacin se favorece por la secrecin de la IL-4 y la IL-13 que producen los linfocitos


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Th2 y genera los macrfagos tipo M2, que participan en la reparacin de los tejidos y la

fibrosis (Abbas et al., 2011).

Los macrfagos M1 reconocen a los patgenos mediante la expresin en membrana de

receptores que reconocen los PAMP, como los receptores tipo-toll, los receptores para la

N-formil metionina y los receptores para la manosa. Estas clulas producen la IL-12 que

estimula a las clulas NK para la elaboracin del IFN-. Estos fagocitos actan como

APC, exponiendo los antgenos, en las molculas MHC clase 2, a los linfocitos T efectores

diferenciados, que tras el reconocimiento producen IFN-. El IFN-, secretado por las

clulas NK y los linfocitos T, activa a los macrfagos, aumentando su capacidad de

destruir a la clula fagocitada, mediante la accin de enzimas microbicidas, presentes en

los fagolisosomas (Abbas et al., 2011).

Los macrfagos M1 activados reducen el oxgeno molecular a especies reactivas del

oxgeno, como el radical superxido, mediante la oxidasa fagoctica, activada

fundamentalmente por el IFN- y las seales procedentes de los receptores tipo-toll. Estas

clulas producen intermediarios reactivos del nitrgeno, fundamentalmente xido ntrico,

por la accin de la sintasa inducible del xido ntrico, no presente en los macrfagos en

reposo (Abbaset al., 2011).

II.4. Relacin del sistema inmunolgico con el cncer

La primera aproximacin sobre la relacin del SI y el desarrollo del cncer se plantea por

Virchow (1863), al postular que en los sitios de inflamacin, la presencia de un infiltrado

linforreticular era sugestiva del inicio de cncer. Sin embargo, Coley (1893) utiliza un

extracto bacteriano para el tratamiento de pacientes con sarcoma, evento que marca el

inicio de la inmunoterapia contra el cncer. Posteriormente, Ehrlich (1909) plantea la

existencia de molculas capaces de reconocer y destruir tumores. Este estudio se

considera el antecedente de la hiptesis de la inmunovigilancia propuesta por Burnet

(1957) y Thomas (1959), la cual plantea que la inmunidad adaptativa es responsable de

prevenir el desarrollo del cncer en hospederos inmunocompetentes. Sin embargo,

Stutman (1974) encuentra que la susceptibilidad al cncer en ratones inmunocompetentes

(tumores espontneos e inducidos por carcingenos) era similar a la susceptibilidad de

ratones inmunodeficientes.


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En estudios posteriores, Shankaran et al.(2001) plantean que el SI es capaz de regular,

no solo el tamao del tumor, sino tambin su inmunogenicidad. Estos investigadores, al

observar que el SI de un animal inmunocompetente rechaza los tumores procedentes de

ratones inmunodeficientes con ms frecuencia que los procedentes de ratones

inmunocompetentes; sugieren que los tumores que aparecen en el contexto de un SI

normal se hacen menos inmunognicos con el paso del tiempo.

A partir de estos resultados, Dunn et al. (2002) propone la teora de la inmunoedicin

tumoral, que explica el proceso mediante el cual las clulas tumorales son capaces de

"escapar" del SI.

II.4.1. Teora de la inmunoedicin tumoral

La teora de la inmunoedicin tumoral se desarrolla en tres etapas secuenciales:

eliminacin, equilibrio y escape (Dunn et al., 2002; Dunn et al., 2004, Schreiber et al.,

2011).

II.4.1.1. Fase de eliminacin

En esta fase el SI detecta la presencia del tumor y lo elimina antes que sea clnicamente

visible (Guerra et al., 2008). Las clulas del SI innato se activan mediante el

reconocimiento de seales de peligro, como los DAMP, liberados tempranamente

durante el desarrollo del tumor (Abbas et al., 2011). La activacin del SI innato promueve

la liberacin de citoquinas inmunomoduladoras y proinflamatorias que facilitan el

desarrollo de una respuesta inmune adaptativa especfica contra tumores (Guerra et al.,

2008). Si el tumor se elimina en su totalidad, la fase de eliminacin representa el final del

proceso de inmunoedicin tumoral. Sin embargo, si determinadas clulas tumorales

sobreviven, se establece un estado de equilibrio entre ellas y el SI (Schreiber et al., 2011).

II.4.1.2. Fase de equilibrio

En la fase de equilibrio, el SI adaptativo previene el crecimiento tumoral y regula la

inmunogenicidad del tumor, manteniendo a las clulas tumorales en un estado de

inactividad funcional (Aguirre-Ghiso, 2007). La inmunidad adaptativa, fundamentalmente

los LTC CD8+ y los linfocitos T CD4+ y mediadores como la IL-12 y el IFN-, contribuyen

a mantener al tumor en equilibrio (Schreiber et al., 2011).


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Sin embargo, como consecuencia de la constante presin selectiva del SI sobre el tumor,

se favorece el crecimiento de determinadas variantes celulares que, debido a la

inestabilidad gentica caracterstica (Pages et al., 2010), adquieren mutaciones

inmunoevasivas (Schreiber et al., 2011). El proceso de edicin del tumor genera variantes

celulares tumorales capaces de escapar del reconocimiento o la accin citotxica del SI

(Schreiber et al., 2011).

II.4.1.3. Fase de escape

En esta fase, las clulas tumorales son capaces de evadir al SI mediante la seleccin de

variantes celulares del tumor menos inmunognicas (inmunoseleccin) o mediante la

supresin de la respuesta inmune (immunosupresin) (Zitvogel et al., 2006; Hanahan y

Weinberg, 2011).

Las evidencias clnicas de la inmunoedicin del tumor en humanos provienen de estudios

que asocian la presencia de linfocitos infiltrantes del tumor con la evolucin clnica de

pacientes con diferentes tipos de cncer (Pages et al., 2010).

Mecanismos de escape tumoral

Se han descrito diversos mecanismos mediante los cuales las clulas tumorales"escapan" del SI. Algunos de estos mecanismos inmunoevasivos son intrnsecos a las

clulas tumorales, mientras que otros, son mediados por diferentes clulas del

microambiente (Abbas et al., 2011):

Ausencia de expresin de antgenos tumorales especficos y mutacin de los genes

del MHC clase 1, de la 2-microglobulina o los genes necesarios para el procesamiento

de antgenos en las clulas tumorales (Abbas et al., 2011).

Enmascaramiento antignico de las clulas tumorales mediante la sobreexpresin

de molculas del glucoclix, como el cido silico, que impiden la accin del SI (Abbas et

al., 2011).

Induccin de mecanismos anti-apoptticos como la activacin de factores de

transcripcin pro-oncognicos como STAT3 o la expresin de molculas anti-apoptticas

efectoras como Bcl-2 que promueven el crecimiento del tumor (Loose y Wiele, 2009).

Activacin de la biosntesis de molculas inmunosupresoras en las clulas


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tumorales como las citoquinas (IL-10, IL-8, el factor de crecimiento transformante- (TGF-

)), las prostaglandinas y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Estas

molculas modulan la respuesta inmune favoreciendo un microambiente adecuado para el

crecimiento del tumor (Loose y Wiele, 2009; Sengupta et al., 2010).

Reclutamiento de clulas, como los macrfagos M2, mastocitos, granulocitos y

clulas supresoras de origen mieloide que favorecen el crecimiento del tumor mediante el

establecimiento de una inflamacin crnica. Los macrfagos M2 secretan prostaglandina

E2 y arginasa, que inhiben la activacin de los linfocitos T efectores y secretan TGF - y

VEGF que promueve la angiognesis y el crecimiento del tumor (Abbas et al., 2011).

Reclutamiento de clulas con funcin inmunosupresora como los linfocitos Treg(Vesely et al., 2011), los cuales contribuyen a crear un microambiente favorable para el

crecimiento del tumor; mediante diferentes mecanismos, como la produccin de la enzima

indolamina-2,3-dioxigenasa que, indirectamente, suprime los genes que codifican para la

IL-6 y el factor de necrosis tumoral (TNF) (Wing y Sakaguchi, 2010). Los Treg secretan

TGF- y IL-10 que interfieren con la activacin y las funciones efectoras de las clulas T

(Rochman et al., 2009; Ernst et al., 2010).

II.4.2. Mecanismos de defensa contra el tumor

Las clulas NK destruyen clulas tumorales con baja expresin de MHC clase 1, lo cual

constituye una seal activadora para las clulas NK. Algunas clulas tumorales expresan

antgenos, como MIC-A, MIC-B, y ULB, que son ligandos del receptor activador NKG2D

en las clulas NK. La activacin y la capacidad citotxica de estas clulas es potenciada

por citoquinas, como los IFN, la IL-15 y la IL-12 (Abbas et al., 2011).

Los macrfagos asociados al tumor (TAM) actan sobre las clulas tumorales por

diversos mecanismos, como la produccin de IL-1, xido ntrico, especies reactivas del

oxgeno y TNF; este ltimo mediante la induccin de trombosis en las vasos sanguneos

tumorales (Abbas et al., 2011). Los TAM se activan mediante el reconocimiento, por los

receptores tipo- toll, de los DAMP procedentes de clulas tumorales (protena nuclear

HMGB1) o de las clulas circundantes daadas (cido hialurnico) (Schreiber et al.,

2011). Por otra parte, se ha descrito que los TAM pueden promover la angiognesis y el

crecimiento del tumor mediante la secrecin de VEGF, TGF- y citoquinas como la IL-10(Abbas et al., 2011).


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A pesar de que las clulas NK y los TAM juegan un papel importante en la defensa

antitumoral, el principal mecanismo de destruccin de las clulas cancerosas es mediado

por los linfocitos LTC. Los LTC pueden establecer un estado de inmunovigilancia

mediante el reconocimiento y destruccin de las clulas potencialmente malignas que

expresan pptidos derivados de protenas mutantes o de virus oncgenos, que son

presentadas asociadas a molculas del MHC clase 1. Los LTC destruyen el tumor a

travs de la liberacin de molculas citotxicas o mediante el incremento de la expresin

de FasL (Abbas et al., 2011). La mayora de los LTC activados mueren por apoptosis

despus de la interaccin con la clula tumoral; sin embargo, algunos de ellos

permanecen como linfocitos T de memoria (Loose y Wiele, 2009).

II.5. infiltrado inmunolgico en el pronstico del cncer de colon

El crecimiento, la invasin y la metstasis de un tumor estn influenciados por la

interaccin de las clulas tumorales con su microambiente (McAllister y Weinberg, 2010).

El microambiente del tumor incluye, adems de las clulas tumorales, a otros

componentes del estroma, como las clulas inmunolgicas infiltrantes, adems de

citoquinas, quimoquinas y factores de crecimiento (Bonecchi et al., 2012).

El contexto inmunolgico en el tumor, definido por el tipo, la densidad, la orientacinfuncional y la localizacin de las clulas inmunes (Galon et al., 2006; Pages et al., 2008),

se genera a partir del reclutamiento de varias poblaciones, mediada por citoquinas y

quimoquinas secretadas en el microambiente tumoral (Fridman et al., 2012).

La respuesta inmune especifica que se establece en el microambiente tumoral (Galon et

al., 2006) puede ejercer una influencia positiva en la evolucin clnica de los pacientes

(Klintrup et al., 2005; Forssell et al., 2007) o asociarse a la progresin de la enfermedad y

al desarrollo de metstasis (Jedinak et al., 2010).

II.5.1. Linfocitos infiltrantes del tumor

La presencia de TIL se ha asociado con un buen pronstico en tumores de varias

localizaciones, como piel (Clemente et al., 1996), cabeza y cuello (Badoual et al., 2006),

mama (Menegaz et al., 2008), vejiga (Sharma et al., 2007), ovario (Sato et al., 2005),

esfago (Cho et al., 2003), colon (Page et al., 2005; Galon et al., 2006), rin (Nakano et

al., 2001), prstata (Richardsen et al., 2008) y pulmn (Kawai et al., 2008).


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Naito et al. (1998) reportan por primera vez, que la infiltracin de clulas T citotxicas

CD8+ en el tumor constituye un factor pronstico importante, al asociar una alta densidad

de TIL CD8+ intratumorales con una mayor supervivencia de pacientes con cncer de

colon (Naito et al., 1998). Este resultado constata la importancia de la actividad citotxica

de los linfocitos T CD8+ en la respuesta inmune contra el tumor (Titu et al., 2002; Prall et

al., 2004).

Chiba et al. (2004) proponen que la presencia de clulas T CD8+ en el tejido tumoral

promueve un estado de inmunovigilancia en el organismo que previene el desarrollo de

metstasis a distancia, basndose en la asociacin de una alta densidad de TIL CD8+

con una mayor supervivencia global.

Deschoolmeester et al. (2010) correlacionan la baja densidad de clulas CD3+, CD8+ y

granzima B+ con el bajo grado de diferenciacin y estadios clnicos ms avanzados en

pacientes con cncer de colon. Adems, reportan que la alta densidad de TIL CD3+ y

CD8+ a nivel intratumoral se asocia con una mayor supervivencia global.

La influencia de las clulas CD45RO+ en el pronstico del cncer de colon ha sido

evaluado con anterioridad. Oberg et al. (2002) refieren un pronstico favorable en los

pacientes con alta densidad de clulas CD45RO+ en los ganglios linfticos metastsicos.Pages et al.(2005) asocian una mayor infiltracin de CD45RO+ a nivel intratumoral con

estadios clnicos iniciales, menor invasin linfovascular y mayor supervivencia. Salama et

al.(2009) relacionan la ausencia de signos de metstasis temprana con la alta densidad

de estas clulas en el tumor primario y Lee et al.(2010) asocian una mayor infiltracin a

nivel estromal con una mayor supervivencia.

Camus et al., (2009) al evaluar la asociacin de las clulas CD3+, CD8+, CD45RO+ y

granzima B+ con la evolucin clnica de pacientes con cncer de colon, destacan como

factores pronsticos independientes a las CD8+ y CD45RO+. Sin embargo, Nosho et al.

(2010) reportan que solo las CD45RO+ se comportan como un factor pronstico

independiente de la densidad de otros TIL y de las variables cnico-patolgicas.

II.5.2. Macrfagos infiltrantes del tumor

Los TAM constituyen un porciento significativo de las clulas inmunolgicas presentes en

el microambiente del tumor (Pollard et al., 2004) y su papel en este contexto ha sido


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controversial. Se han asociado con un mal pronstico en tumores de varias localizaciones,

como mama (Leek y Harris, 2002), vejiga (Hanada et al., 2000), prstata (Lissbrant et al.,

2000), estmago (Kawahara et al., 2010) y el cncer crvico-uterino (Fujimoto et al.,

2000). Sin embargo, otros artculos asocian la infiltracin del tumor por macrfagos con un

buen pronstico en pacientes con cncer de prstata (Shimura et al., 2000) y cncer de

estmago (Migita et al., 1999).

En el cncer de colon, varios autores asocian la alta infiltracin de TAM con estadios

tempranos de la enfermedad (Nakayama et al., 2002; Sickert et al., 2005) y con un mejor

pronstico para los pacientes (Funada et al., 2003; Forssell et al., 2007; Zhou et al.,

2010). Sin embargo, otros investigadores han asociado la infiltracin de macrfagos en el

tumor, con una mayor invasin y capacidad de metstasis (Yuan et al., 2008; Pancione et

al., 2009; Jedinak et al., 2010; Kang et al., 2010).


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Materiales y mtodos

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III. Materiales y mtodos

III.1. Seleccin de los pacientes

Se incluyeron pacientes con diagnstico confirmado de adenocarcinoma de colon primarioy sin otra neoplasia concurrente, atendidos en el Instituto de Oncologa y Radiobiologa

(INOR) durante el perodo 2004-2008. Estos se sometieron a tratamiento quirrgico y no

haban recibido ningn tratamiento adyuvante previo.

III.2. Obtencin de los datos clnico-patolgicos

Se revisaron las historias clnicas de cada paciente para extraer las variables: edad, sexo,

localizacin del tumor, grado de diferenciacin histolgica, estadio clnico, invasin

linfovascular y subtipo histolgico mucinoso; as como la fecha de la intervencin

quirrgica y fecha de ltima noticia o muerte. En los casos en los que esta ltima

informacin no se refera en la historia clnica se consult el Registro Nacional del Cncer.

III.2.1. Evaluacin de las variables clnico-patolgicas

Se distribuyeron los pacientes de acuerdo al sexo y edad (se conformaron dos grupos

tomando como valor de corte 60 aos). El grado de diferenciacin histolgica del tumor se

analiz segn Kumar et al. (1999) como grado I: tumores bien diferenciados, grado II:

moderadamente diferenciados y grado III: poco diferenciados (Anexo 1). El estadio clnico

de los pacientes se evalu en I, II, III y IV, de acuerdo a la clasificacin TNM (Sobin y

Wittekind, 2002). El subtipo histolgico mucinoso (tumores mucoproductores) y la invasin

linfovascular se consideraron como presente o ausente, en cada muestra analizada.

La tasa de supervivencia se defini como la frecuencia relativa de pacientes que se

encontraban vivos 5 aos despus de la ciruga. El tiempo de supervivencia global sedefini en meses, desde de la fecha de la reseccin quirrgica hasta el fallecimiento o

ltima noticia.

III.3.Inmunohistoqumica

III.3.1. Muestras de tumores

Se estudiaron muestras de adenocarcinoma de colon fijadas en formol neutro tamponado

e incluidas en parafina, procedentes del departamento de Anatoma Patolgica del INOR.


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Materiales y mtodos

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Se seleccionaron los bloques de parafina con fragmentos representativos de tumor,

mediante la revisin por un patlogo, de las lminas de hematoxilina-eosina de cada

paciente.

III.3.2. Anticuerpos primarios

Anticuerpo policlonal de conejo anti-CD3 humano prediluido (Dako, Dinamarca).

Anticuerpo monoclonal de ratn anti-CD45RO humano (clon UCHL1) prediluido(Dako, Dinamarca).

Anticuerpo monoclonal de ratn anti-CD8 humano (clon C8/144B) prediluido (Dako,Dinamarca).

Anticuerpo policlonal de conejo anti-granzima B (Gennova Scientific, Sevilla,Espaa).

Anticuerpo monoclonal de ratn anti-CD68 humano (clon P6TM1) prediluido (Dako,

Dinamarca).

III.3.3. Descripcin de la tcnica inmunohistoqumica

A partir de los bloques de parafina, se realizaron cortes seriados de tejido de 4 m,

utilizando un micrtomo vertical RM2235 (Leica, Alemania). Los cortes se adhirieron alminas portaobjetos recubiertas con poli-L-lisina (Menzel GmbH and Co., Braunschweig,

Alemania) y se ubicaron dos tejidos en cada lmina.

Las lminas se mantuvieron durante 1 hora en la estufa (Memmert, Alemania) a 60oC,

para lograr una adecuada adhesin del tejido e iniciar el proceso de desparafinado. Los

tejidos se sumergieron 3 veces en xilol (10 min cada vez) para eliminar la parafina

excedente. Posteriormente, se sumergieron en concentraciones decrecientes de etanol

(100%, 85%, 75%) (5 min en cada uno) y finalmente en agua destilada para surehidratacin. Con el objetivo de desenmascarar el antgeno, las lminas se sumergieron

en una solucin de citrato de sodio (0,01 mol/L, pH=6,0) y se expusieron al calor en un

bao termostatado (Fisher Scientific, EUA), en un intervalo de temperatura entre 95o C y

100o C, durante 30 min.

Para bloquear la peroxidasa endgena del tejido, se incubaron las lminas, en una

cmara hmeda, con perxido de hidrgeno al 3% en metanol absoluto (1:10 v:v), durante

5 min. Se aplic el anticuerpo especfico para cada antgeno durante 30 min (epgrafe


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Materiales y mtodos

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III.3.2.) y posteriormente, el sistema de deteccin EnVisionTM (Dako, Dinamarca),

compuesto por un polmero de dextrn conjugado con anticuerpos anti-ratn y anti-conejo,

y peroxidasa de rbano picante. Entre cada incubacin, los tejidos se lavaron en una

solucin salina tamponada TBS (NaCl 145 mmol/L, Tris-HCl, 10 mmo/L, pH 7,4) + Tween

20 (Sigma, St. Louis, EUA) al 0,01%, para asegurar la adecuada eliminacin de residuos

de las soluciones aplicadas.

Se revel la reaccin con el cromgeno 3,3'-diaminobencidina tetrahidroclorhdrica (DAB)

(Dako, Dinamarca) hasta 10 min. La reaccin se contrast con hematoxilina de Mayer

(Dako, Dinamarca) durante 30 segundos y se sumergieron las lminas en una solucin de

carbonato de litio sobresaturada hasta azulear. Los tejidos fueron deshidratados en

concentraciones ascendentes de etanol (75%, 85%, 100%), 5 min en cada una y seaclararon 3 veces en xilol durante el mismo tiempo. Posteriormente, las lminas se

montaron con un medio permanente Eukitt (Kinder GmbH & Co., Alemania).

En cada experimento se utiliz, como control positivo, muestras de tejidos con expresin

previa conocida, recomendadas por el fabricante del anticuerpo. Como control negativo se

aplic la solucin salina tamponada TBS (NaCl 145 mmol/L, Tris-HCl, 10 mmo/L, pH 7,4)

+ Tween 20 (Sigma, St. Louis, EUA) al 0,01% en sustitucin del anticuerpo. Todo el

procedimiento se realiz a temperatura ambiente.

III.4. Determinacin de la densidad de clulas inmunolgicas infiltrantes del tumor

III.4.1. Determinacin de la densidad de clulas CD3+, CD8+, CD45RO+ y granzima B+

intratumorales

Se defini como clulas inmunolgicas intratumorales a aquellas localizadas dentro del

tejido tumoral. Se observ el rea total del tumor, con un aumento de 100x, en elmicroscopio de campo claro BX51 (Olympus, Tokio, Japn) y se seleccionaron las 3 reas

ms representativas del infiltrado inmunolgico. Se fotografi cada seccin seleccionada

con un aumento de 400x, usando la cmara digital DP70 (Olympus, Tokio, Japan)

acoplada al microscopio y se cont el nmero de clulas intratumorales en cada campo

visual, con el software ImageJ (versin 1.43 para Windows). La densidad de clulas

intratumorales se defini como el promedio del nmero de clulas contadas (cel/campo),

segn Lee et al.(2010).


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Materiales y mtodos

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Para su anlisis, la densidad de las clulas intratumorales se agrup en dos variables

(baja y alta densidad), tomando como valor de corte la mediana de la densidad para cada

marcador.

III.4.2. Determinacin de la expresin de clulas CD3+, CD8+, CD45RO+ y granzima B+

estromales

Se defini como clulas inmunolgicas estromales, aquellas localizadas en el estroma

adyacente al epitelio o en el margen invasivo del tumor. Este ltimo se correspondi con

la zona de transicin entre la periferia del tumor y el tejido epitelial normal. Se observaron

3 campos visuales por tejido, con un aumento de 200x en un microscopio de campo claro

BX51 (Olympus, Tokio, Japan). La densidad de clulas inmunolgicas a nivel del estroma

se evalu, en una escala semicuantitativa (expresin dbil, moderada e intensa), de

acuerdo a Naito et al. (1998).

III.4.3. Determinacin de la expresin de clulas CD68+ peritumorales

Para determinar la expresin de las clulas CD68+ se observaron 7 campos visuales por

tejido, con un aumento de 200x en un microscopio de campo claro BX51 (Olympus, Tokio,

Japan). La infiltracin promedio se clasific, semicuantitativamente, segn Forssell et al.

(2007), de acuerdo a la densidad de clulas observadas en la regin peritumoral en:

expresin nula o dbil (grado 1), expresin moderada (grado 2), expresin intensa (grado

3) y expresin masiva (grado 4) (Figura 2). Los tumores clasificados como grado 1

incluyeron todas las muestras negativas o con clulas CD68+ dispersas. Los tumores se

consideraron grado 2 cuando se observ una sola capa de clulas continuas como

promedio. El marcaje de CD68 que se extendi 2 o 3 capas de clulas, se clasific como

grado 3, mientras que el que se extendi en numerosas capas se consider grado 4.

La evaluacin de los marcadores inmunohistoqumicos se realiz por dos patlogos y en

caso de discordancia se incluy un tercero.

III.5. Anlisis estadstico de los datos

Se construy una matriz de correlacin entre las clulas CD3+, CD45RO+, CD8+ y

granzima B+ en ambas regiones del tumor, utilizando como estadgrafo el coeficiente de

correlacin de Spearman (Siegel, 1972), que define una correlacin escasa o nula para


32/66

Materiales y mtodos

23

los valores r=0-0,25; dbil para los valores r=0,51-0,75; moderada para los valores r=0,51-

0,75 y fuerte para los valores r=0,76-1,00.

La dependencia entre las variables histopatolgicas (grado de diferenciacin, estadio

clnico y produccin de mucinas) y la densidad de las clulas (CD3+, CD45RO+, CD8+,

granzima B+ y CD68+), se estim mediante la prueba de Chi-cuadrado (Sokal y Rohlf,

1981).

La asociacin entre la tasa de supervivencia a los 5 aos y la densidad de las clulas

inmunolgicas, se determin mediante la prueba de Chi-cuadrado (Sokal y Rohlf, 1981).

Se construyeron las curvas de supervivencia global segn la densidad de clulas

inmunolgicas, mediante el mtodo de Kaplan-Meier (Kaplan y Meier, 1958) y las

diferencias estadsticas, entre estas, se determinaron a travs de la prueba Log-rank

(Mantel, 1966).

En el anlisis univariado, para evaluar la influencia de las variables clnico-patolgicas en

la supervivencia global, se utiliz la prueba Log-rank. En el anlisis multivariado, para

identificar los factores pronsticos que influyeron de forma independiente en la

supervivencia, se utiliz la regresin de Cox (Cochran y Cox, 1957).

Para el procesamiento y anlisis estadstico de los datos se utiliz el paquete estadstico

SPSS (Statistical Program for the Social Sciences Inc., Chicago, IL), versin 20.0 para

Windows. Para todos los anlisis estadsticos se defini un nivel de significacin p


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Resultados

24

IV. Resultados

Se estudiaron 50 muestras de pacientes con adenocarcinoma de colon atendidos en el

INOR durante el perodo 2004-2008.

La edad promedio fue 63,011,3 aos, con un 59,6% mayor de 60 aos. Predominaron

los pacientes con tumores localizados en el colon sigmoides (44,9%) y grado de

diferenciacin moderado (60,0%). Se observ una mayor frecuencia de pacientes en

estadio clnico II (34,0%), con tumores no mucoproductores (74,0%) y sin invasin

linfovascular (90,0%) (Tabla 1).

Tabla 1. Caractersticas clnico-patolgicas de los pacientes en estudio.

Variables clnico-patolgicas No. de pacientes (%)

Edad, aos(n=47)

60 19 (40,4)>60 28 (59,6)

Sexo (n=50)

Femenino 25 (50,0)Masculino 25 (50,0)

Localizacin del tumor(n=49)

Colon ascendente 18 (36,7)Colon transverso 6 (12,2)Colon descendente 3 (6,1)Colon sigmoides 22 (44,9)

Grado de diferenciacin (n=50)

Bien diferenciado 12 (24,0)Moderadamente diferenciado 30 (60,0)Poco diferenciado 8 (16,0)

Estadio clnico segn TNM (n=50)

I 11 (22,0)

II 17 (34,0)III 7 (14,0)IV 15 (30,0)

Produccin de mucinas (n=50)

S 13 (26,0)No 37 (74,0)

Invasin linfovascular (n=50)

S 5 (10)No 45 (90)

TNM: extensin del tumor, metstasis a los ganglios linfticos y metstasis a distancia.


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Resultados

25

IV.1. Caractersticas del infiltrado inmunolgico del tumor

Se determin la densidad de clulas CD3+, CD45RO+, CD8+ y granzima B+ a nivel

intratumoral y estromal. La tincin inmunohistoqumica de las clulas CD3+, CD45RO+ y

CD8+ se observ principalmente a nivel de la membrana citoplasmtica, mientras que en

las clulas granzima B+ fue citoplasmtica con patrn granular. Las clulas CD68+ se

ubicaron en su mayora en el estroma, particularmente en la regin peritumoral, con un

marcaje a nivel del citoplasma.

Las clulas inmunolgicas intratumorales mostraron una densidad variable en las

muestras estudiadas (Figura 1). La mediana de las clulas CD3+ y CD45RO+

intratumorales fue 11,50 cel/campo (1-82 cel/campo) y 7 cel/campo (1-97 cel/campo),

respectivamente. Para las clulas CD8+ y granzima B+ se obtuvo una mediana de 3

cel/campo (1-47 cel/campo) y 8 cel/campo (1-84 cel/campo), respectivamente.

Figura 1.Niveles de expresin de clulas inmunolgicas intratumorales: (A) baja densidad de clulasCD45RO+ y (B) alta densidad de clulas CD45RO+. (400x).

Los niveles de expresin de las clulas inmunolgicas en el estroma del tumor se

muestran en la Figura 2 y 3. Se observ un predomino de pacientes con una expresin

dbil de clulas CD3+, CD8+ y granzima B+. Para las clulas CD45RO+, la distribucin

de los pacientes en los tres niveles de expresin fue similar. En el caso de las CD68+, se

apreci una mayor frecuencia de pacientes con expresin moderada (40%) (Figura 4).

A B


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Resultados

26

Figura 2. Niveles de expresin segn la densidad de clulas inmunolgicas en el estroma del tumor:(A) expresin dbil de clulas CD45RO+, (B) expresin moderada de clulas CD45RO+y (C) expresinintensa de clulas CD45RO+. (200x).

Figura 3. Niveles de expresin de las clulas CD68+, de acuerdo al grado de infiltracin en la reginperitumoral: (A) expresin dbil; (B) expresin moderada; (C) expresin intensa y (D) expresin masiva.(200x).

A B C

A B

C D


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Resultados

27

Figura 4. Distribucin de los pacientes segn la expresin de clulas en el estroma y en la reginperitumoral. Estroma: clulas CD3+, CD45RO+, CD8+, granzima B+. Regin peritumoral: clulas CD68+.

IV.2. Relacin entre las clulas inmunolgicas infiltrantes del tumor

Se realiz una matriz de correlacin entre las clulas inmunolgicas infiltrantes del tumor

(Anexo 4). Las correlaciones que resultaron significativas se muestran en la Tabla 2.

Se obtuvo una correlacin moderada entre las clulas CD3+ y CD45RO+ intratumorales;

as como entre las clulas CD3+ estromales y las clulas CD45RO+ y CD8+ estromales.

Adems, se encontr una correlacin moderada entre las clulas CD45RO+ y CD8+

intratumorales, al igual que entre las granzima B+ intratumorales y estromales (Tabla 2).

46,0%

36,0%

78,0%

74,0%

36,0%

28,0%30,0%

16,0%

12,0%

40,0%

26,0%

34,0%

6,0%

14,0%

18,0%

6,0%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

CD3 CD45RO CD8 granzima B CD68

Frecuencia

dep

acientess

dbil

moderado

intenso

masivo


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Resultados

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Tabla 2. Correlacin entre las clulas inmunolgicas en las diferentes regiones del tumor.

r p

Intratumorales CD45RO-CD3 0,519 (m) 0,001*

CD8-CD3 0,479 (d) 0,001*

CD8-CD45RO 0,559 (m) 0,001*

Estromales CD45RO-CD3 0,532 (m) 0,001*

CD8-CD3 0,581 (m) 0,001*

Intratumoral-Estromal CD3-CD3 0,375 (d) 0,007*

CD45RO-CD3 0,430 (d) 0,002*

CD45RO-CD45RO 0,406 (d) 0,003*

CD8-CD3 0,280 (d) 0,049*

CD8-CD45RO 0,310 (d) 0,028*

CD8-CD8 0,391 (d) 0,005*

Granzima B-CD3 0,310 (d) 0,029*

Granzima B-Granzima B 0,362 (m) 0,010*

Correlacin dbil (d), r= 0,26-0,50 y moderada (m), r=0,51-0,75. (*) Correlacin significativa para p


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Resultados

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Tabla 3. Distribucin de pacientes segn la densidad de clulas inmunolgicas y el grado de diferenciacindel tumor.

Grado de diferenciacin No. (%)

Bien (n=12) Moderado (n=30) Poco (n=8) p

CD3 Intratumoral 0,183

Baja 4 (33,3) 16 (53,3) 6 (75,0)

Alta 8 (66,7) 14 (46,7) 2 (25,0)

Estromal 0,601

Dbil 4 (33,3) 15 (50,0) 4 (50,0)

Moderado- Intenso 8 (66,7) 15 (50,0) 4 (50,0)

CD45RO Intratumoral 0,183

Baja 4(33,3) 16 (53,3) 6 (75,0)

Alta 8(66,7) 14 (46,7) 2 (25,0)Estromal 0,975

Dbil 4 (33,3) 11 (36,7) 3 (37,5)

Moderado- Intenso 8 (66,7) 19(63,3) 5 (62,5)


Baja 3(25,0) 18 (60,0) 6 (75,0)

Alta 9(75,0) 12 (40,0) 2 (25,0)

Estromal 0,499

Dbil 8 (66,7) 24 (80,0) 7 (87,5)


Granzima B Intratumoral 0,437

Baja 4 (33,3) 14 (46,7) 5 (62,5)

Alta 8 (66,7) 16 (53,3) 3 (37,5)

Estromal 0,981

Dbil 9 (75,0) 22 (73,3) 6 (75,0)


CD68 0,034*

Dbil-moderado 11 (91,7) 19 (63,3) 8 (100)

Intenso-masivo 1 (8,3) 11 (36,7) 0 (0,0)

(*) Asociacin estadstica para p


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Resultados

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Tabla 4. Distribucin de los pacientes segn la densidad de clulas inmunolgicas y el estadio clnico.

Estadio clnico segn TNM No. (%)

I (n=12) II (n=18) III (n=7) IV (n=13) p


Baja 6 (50,0) 9 (50,0) 4 (57,1) 7 (53,8)

Alta 6 (50,0) 9 (50,0) 3 (42,9) 6 (46,2)

Estromal 0,390

Dbil 4 (33,3) 9 (50,0) 2 (28,6) 8 (61,5)

Moderado-Intenso 8 (66,7) 9(50,0) 5 (71,5) 4 (38,5)


Baja 4 (33,3) 12 (66,7) 2 (28,6) 8 (61,5)

Alta 8 (66,7) 6 (33,3) 5(71,4) 5 (38,5)

Estromal 0,089Dbil 1 (8,3) 8 (44,4) 2 (28,6) 7 (53,8)

Moderado-Intenso 11 (91,6) 104 (55,5) 5 (71,4) 6 (46,2)


Baja 5 (41,7) 10 (55,6) 4 (57,1) 8 (61,5)

Alta 7 (58,3) 8 (44,4) 3 (42,9) 5 (38,5)

Estromal 0,804

Dbil 9 (75,0) 13 (72,2) 6 (85,7) 11 (84,6)

Moderado-Intenso 3 (25,0) 5 (27,8) 1 (14,3) 1(15,4)


Baja 4 (33,3) 8 (44,4) 2 (28,6) 9 (69,2)

Alta 8 (66,7) 10 (55,6) 5 (71,4) 4 (30,8)

Estromal 0,991

Dbil 9 (75,0) 10 (55,6) 6 (85,7) 12 (85,7)

Moderado 3 (25,0) 8 (44,4) 1 (14,3) 1 (7,7)

CD68 0,114

Dbil-moderado 8 (66,7) 14 (77,8) 4 (57,1) 12 (92,3)

Intenso-masivo 4 (33,3) 4(22,2) 3 (42,9) 1 (7,7)

TNM: extensin del tumor, metstasis en los ganglios linfticos y metstasis a distancia.

Asociacin estadstica para p


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Resultados

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Tabla 5. Distribucin de los pacientes segn la densidad de clulas inmunolgicas y los tumoresmucoproductores.

Tumores mucoproductores No. (%)

S (n=13) No (n=37) p


Baja 8 (61,5) 18 (48,6)

Alta 5 (38,5) 19 (51,4)

Estromal 0,021*

Dbil 10 (76,9) 13 (35,1)

Moderado-Intenso 3 (23,2) 24 (64,8)


Baja 7 (53,8) 19 (51,4)

Alta 6 (46,2) 18 (48,6)Estromal 0,119

Dbil 7 (58,3) 11 (29,7)



Baja 7 (53,8) 20 (54,1)

Alta 6 (46,2) 17 (45,9)

Estromal 0,148

Dbil 12 (92,3) 27 (73,0)



Baja 7 (53,8) 16 (43,2)

Alta 6 (46,2) 21 (56,7)

Estromal 0,649

Dbil 9 (69,2) 28 (75,6)


CD68 0,11

Dbil-moderado 12 (92,3) 26 (70,3)

Intenso-masivo 1 (7,7) 11 (29,7)

(*) Asociacin estadstica para p


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Resultados

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Figura 5. Tasa de supervivencia a los 5 aos segn densidad de clulas intratumorales. Las frecuenciasrelativas corresponden a los pacientes que sobrevivieron a los 5 aos de ciruga. (*) Diferenciassignificativas para p


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Resultados

33

Figura 6. Tasa de supervivencia a los 5 aos segn la expresin de clulas en el estroma del tumor. Lasfrecuencias relativas corresponden a los pacientes que sobrevivieron a los 5 aos de ciruga. (*) Diferenciassignificativas para p


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Resultados

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Figura 7. Curvas Kaplan-Meier de supervivencia global segn la densidad de clulas inmunolgicasintratumorales: (A) clulas CD3+ (B) clulas CD45RO+ (C) clulas CD8+ y (D) clulas granzima B+.(*) Diferencias significativas para p


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Resultados

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Tabla 6. Medias de supervivencia global segn la expresin de las clulas inmunolgicas infiltrantes deltumor.

Media de supervivencia p


Baja 65,00 10,00

Alta 75,76 9,11

Estromal 0,006*

Dbil 50,13 9,80

Moderado 66,62 13,29

Intenso 110,38 4,09


Baja 59,18 9,64

Alta 84,06 8,34Estromal 0,011*

Dbil 49,47 10,86


Intenso 102,52 6,96

CD8 Intratumoral 0,014*

Baja 55,41 9,15

Alta 89,45 9,26

Estromal 0,051

Granzima B Intratumoral 0,401Baja 65,17 10,50

Alta 76,31 9,13

Estromal 0,228

Dbil 65,07 8,23


Intenso 96,16 7,84

CD68 0,042*

Dbil-moderado 61,71 7,75

Intenso-masivo 97,90 11,31

(*) Diferencias significativas para p


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Resultados

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Figura 8.Curvas Kaplan-Meier de supervivencia global segn la expresin de las clulas inmunolgicas enel estroma del tumor: (A) clulas CD3+ (B) clulas CD45RO+ (C) clulas CD8+ (D) clulas granzima B+ y(E) clulas CD68+. (*) Diferencias significativas para p


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Resultados

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Se observ una separacin significativa de las curvas de supervivencia, a favor de los

pacientes con una expresin intensa de clulas CD3+ y CD45RO+ estromales (p=0,006 y

p=0,011 respectivamente) (Figura 7). La media de supervivencia de estos pacientes fue

mayor en relacin con los que mostraron una expresin moderada y dbil (110,38 contra

66,62 y 50,13 meses respectivamente). Un comportamiento similar se observ para las

clulas CD45RO+ (102,52 contra 60,17 y 49,47 meses respectivamente) (Tabla 6).

No se obtuvieron diferencias significativas entre los niveles de expresin de clulas CD8+

y la supervivencia global de los pacientes. No obstante, durante el perodo estudiado, no

se reportaron fallecimientos en los pacientes con una expresin intensa de este marcador

a nivel del estroma (n=3) (Figura 8C).

El anlisis de las curvas, segn la expresin de clulas CD68+, mostr que los pacientes

con expresin intensa-masiva tuvieron una media de supervivencia significativamente

mayor con respecto a los que presentaban expresin dbil-moderada (97,9 contra 61,71

meses; p=0,042) (Tabla 6).

IV.6. Anlisis univariado y multivariado de la supervivencia global

En el anlisis univariado, las variables clnico-patolgicas que afectaron significativamente

la supervivencia global fueron el estadio clnico y la invasin linfovascular (Tabla 7). Se

encontr que a medida que avanz el estadio clnico la supervivencia disminuy

significativamente (p=0,001) (Anexo 5). Por otra parte, aunque la invasin linfovascular se

present en pocos pacientes (n=5), estos tuvieron una supervivencia significativamente

menor con respecto a los que no presentaron esta condicin (p=0,013). Las clulas

inmunolgicas que tuvieron un impacto significativo en la supervivencia fueron las CD3+

(p=0,006), CD45RO+ (p=0,011) y CD68+ (p=0,042) presentes en el estroma y las CD8+ a

nivel intratumoral (p=0,014). El anlisis multivariado de las variables estudiadas reflej

que solo el estadio clnico (HR: 0,189; IC95%: 0,040-0,889; p=0,035) y la presencia de

clulas CD45RO+ en el estroma del tumor (HR: 0,187; IC95%: 0,060-0,578; p=0,004) se

comportaron como factores pronsticos independientes (Tabla 7).


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Resultados

38

Tabla 7.Anlisis univariado y multivariado dela supervivencia global.

Variables Univariado Multivariado

p HR 95%IC p

Edad 0,275

Sexo 0,605

Localizacin del tumor 0,444

Grado de diferenciacin 0,336

Estadio clnico segn TNM 0,001* 0,189 0,040 - 0,889 0,035*

Produccin de mucinas 0,935

Invasin linfovascular 0,013* 0,357 0,099 - 1,285 0,115

CD3 intratumoral 0,453

CD3 estromal 0,006* 0,164 0,019 - 1,399 0,098

CD45RO intratumoral 0,088

CD45RO estromal 0,011* 0,187 0,060 - 0,578 0,004*

CD8 intratumoral 0,014* 0,493 0,175 - 1,391 0,181

CD8 estromal 0,051

Granzima B intratumoral 0,401

Granzima B estromal 0,228

CD68 0,042* 0,530 0,106-2,648 0,439

(*) Diferencias significativas para p


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Discusin

39

V. Discusin

La evolucin del adenocarcinoma de colon est influenciada por la acumulacin de

alteraciones genticas y epigenticas (Fearon y Vogelstein, 1990), as como por el

contexto inmunolgico que se genera en el microambiente del tumor (Galon et al., 2006).

La respuesta inmune es uno de los mecanismos descritos ms importantes en la defensa

contra el cncer (Baker et al., 2007). En este sentido, Galon et al.(2007) sugieren que la

respuesta inmune adaptativa juega un papel fundamental en la menor tasa de recurrencia

y de metstasis del cncer de colon. Los linfocitos T presentes en el microambiente

pueden modificar la progresin del tumor, y de esta forma influir en la supervivencia de los

pacientes con esta enfermedad (Chiba et al., 2004; Camus et al., 2009).

El cncer de colon se considera una enfermedad de la tercera edad, debido a que la

mayor incidencia se reporta en personas entre 60 y 79 aos (Hechavarra et al., 2003;

Libutti et al., 2005). Nuestro estudio coincide con este criterio, ya que el 59,6% de los

pacientes fueron mayores de 60 aos.

En concordancia con nuestros hallazgos, se ha reportado que la localizacin del tumor en

el colon sigmoides (Rodrguez et al., 2002; Libutti et al., 2005) y el grado de diferenciacin

moderado (Tapia et al., 2010; Machado et al., 2011) predominan en los pacientes concncer de colon.

En sentido general, las variables clnico-patolgicas analizadas, en nuestro estudio, se

comportaron de manera similar a lo referido en otras investigaciones clnicas sobre el

tema (Libutti et al., 2005; Machado et al., 2011)

El estudio del infiltrado inmunolgico en el tumor muestra que la densidad de clulas a

nivel intratumoral, se asemej a lo reportado en otros estudios en cncer de colon

(Deschoolmeester et al., 2010; Lee et al., 2010). En relacin a la expresin de clulas

estromales, nuestros resultados coinciden con los de otros autores, para las clulas CD3,

CD45RO (Lee et al., 2010) y CD68+ (Forssell et al., 2007). Por otra parte, para las CD8+,

se encontr una mayor frecuencia de la expresin dbil, con respecto a lo indicado por

Deschoolmeester et al.(2010). Teniendo en cuenta que, previamente, se ha descrito una

correlacin inversa entre la densidad de clulas CD8+ estromales y el estadio clnico

(Ropponen et al., 1997), las divergencias en los resultados pudieran deberse a que, en


49/66

Discusin

40

nuestro estudio, se observ un predominio de pacientes en estadio clnico IV (30%) en

relacin al 9,2% reportado por Deschoolmeester et al.(2010).

En investigaciones previas, se han correlacionado positivamente las clulas

inmunolgicas entre ambas regiones tumorales (Menon et al., 2004; Deschoolmester et

al., 2010). Nuestros hallazgos confirman estos estudios y sugieren que la presencia de

clulas inmunolgicas intratumorales pudiera ser un reflejo de su

martínez, 2014. evaluación del infiltrado inmunológico del tumor y su relación con el...

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