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LUCIMÁRIO THIAGO FELIX DE ARAUJO

MAPEAMENTO DE NEURÔNIOS NITRÉRGICOS NO TRONCO

ENCEFÁLICO DO MOCÓ (Kerodon rupestris)

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do titulo de mestre.

Natal

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL

MAPEAMENTO DE NEURÔNIOS NITRÉRGICOS NO TRONCO

ENCEFÁLICO DO MOCÓ (Kerodon rupestris)

LUCIMÁRIO THIAGO FELIX DE ARAUJO

Orientador

Judney Cley Cavalcante

Natal

2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB

Araujo, Lucimário Thiago Felix de.

Mapeamento de neurônios nitrégicos no tronco encefálico do

Mocó (Kerodon rupestris) / Lucimário Thiago Felix de Araujo. - Natal, 2016.

92 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional.

Orientador: Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante.

1. Óxido nítrico - Dissertação. 2. Kerodon rupestris -

Dissertação. 3. Tronco encefálico - Dissertação. I. Cavalcante, Judney Cley. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 546.172.6

ARAUJO, L. T. F. Mapeamento de neurônios nitrérgicos no tronco encefálico do

mocó (Kerodon rupestris). Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio

Grande do Norte para obtenção do título de Mestre em Biologia Estrutural e

Funcional.

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante Instituição: UFRN

Julgamento: _________________________ Assinatura: ______________________

Prof. Dr. Vanessa de Paula Soares Rachetti Instituição: UFRN

Julgamento: _________________________ Assinatura: ______________________

Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior Instituição: UNESP

Julgamento:_________________________Assinatura:________________________

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por estar sempre me abençoando e me ajudando a alcançar

tantas coisas em minha vida, principalmente a acadêmica, toda honra e gloria a ele.

A toda minha família que sempre torceu junto nas minhas conquistas, meus irmãos

Lúcia, Luciana e Lucyelves, minha mãe Maria, e minha outra Lúcia, apesar de

pequena, não podia haver família melhor, amo a todos, principalmente minha vó

Maria (in memoriam) que nessa etapa não pode estar presente, mas sei que esta lá

em cima torcendo e me abençoando, obrigado “véia”, te amo, e a todos os amigos

de longas datas, do trabalho a todos meu muito obrigado.

A todos meus professores, os das disciplinas do mestrado, bem como os que

compõem o Labneuro (Expedito, Miriam, Ruthnaldo, Fernando, Aliandra), não posso

apontar qual destes foram os mais importantes, pois todos doaram um pouco do seu

saber, trabalho, tempo e paciência a mim, grato a todos.

Ao meu orientador Judney, que desde o inicio se prontificou em me orientar, sempre

com paciência e pensamento positivo que tudo daria certo, apesar dos percalços

que apareceram nessa caminhada, sempre solucionou os problemas e enfim, aqui

chegamos, sem sua valiosa ajuda, seria muito difícil, obrigado.

Aos meus grandes amigos (irmãos) de caminhada, se sem Profº Judney já seria

difícil, imagine sem Wilqui e Emanuela (Manu), seria impossível, Wilqui por toda sua

“sapiência” e Manu pela “paciência” em me orientar e ajudar nas mais diversas

dificuldades, do intelectual ao computacional, ambos nunca se negaram em ajudar e

sempre estiveram presente nos procedimentos, na elaboração e na descontração

que fez parte dessa caminhada acadêmica, agradeço e publicamente exponho que

os amo, contem comigo para o que precisar.

Pra finalizar, mas não menos importante a todos os amigos que fiz nessa jornada, os

de turma: Nayra, Jonas, Kadigna, Rodrigo, Dáfiny, Epifânio, Marília, Edson, Marden

e Natan, e os de Labneuro: Joacil, Melqui, Fladjany, Nelyane, Naryllenne, Nayana,

Hélder, Mayara, Brenna, Palôma, Ana, Daniel, e Paulo, cada um de vocês fazem

parte de quem sou agora, bem como Regina, sem ela, nem eu nem ninguém que

utiliza o Labneuro produziria nada, muito obrigado de coração a todos.

RESUMO

Óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa importante em processos intra e extracelular, está presente em vários tecidos, exercendo um papel importante no sistema imune, na regulação da pressão sanguínea, no relaxamento do músculo liso e na vasodilatação via nervos periféricos. Por ser um gás o NO atravessa livremente as membranas celulares. Portanto, na parte central do sistema nervoso age como um neurotransmissor em circuitos locais, distribuindo-se em curtas distâncias, difundindo-se de célula em célula participando de várias funções, como aprendizado e memória, podendo mediar respostas excitatórias a certos aminoácidos. O NO está presente em vários núcleos distribuídos por todo o sistema nervoso e tem sido descrito em diversas espécies animais através da expressão de sua enzima de síntese, a NOS. Utilizando as técnicas de imunoistoquímica contra NOS e de histoquímica para marcar a atividade enzimática da NADPH diaforase, a NADPHd, nós mapeamos a distribuição de NO no tronco encefálico de um roedor endêmico da caatinga brasileira que habita áreas rochosas e tem hábitos crepusculares, o mocó (Kerodon rupestris). Diversas regiões e núcleos do tronco encefálico apresentaram imunorreatividade ao NOS ou atividade NADPHd. O presente trabalho mostra que em mocó, entre outras regiões, NO está em núcleos do sistema visual primário como os núcleos pré-tectais e colículo superior; núcleos do sistema auditivo como o complexo olivar, colículo inferior e núcleo coclear; em diversas subdivisões da substância cinzenta periaquedutal, estrutura envolvida em comportamentos defensivos, nocicepção e ansiedade, assim como o locus cerúleos onde NO também foi encontrado; substância negra, onde NO está relacionado a encefalopatia hepática e com a doença de Parkinson em outros roedores. O grande número de núcleos nitrérgicos e seu padrão de distribuição no tronco encefálico de mocó foi semelhante ao observado em outras espécies de mamíferos, nos levando a concluir que a proximidade filogenética das espécies é mantida na distribuição de NO no tronco encefálico de mocó.

Palavras-chave: Óxido nítrico, Kerodon rupestris, Óxido nítrico sintase, Tronco

encefálico.

Title: Mapping the nitrergic neurons in the brainstem of the rock cavy (Kerodon

rupestris)

Nitric oxide (NO) is a gas very important in intra and extracellular process. It is present in many tissues, having an important role in the immunological system, regulation of blood pressure, relaxation of the smooth muscle and vasodilatation through peripheral nervous system. As a gas, NO can pass freely through cell membranes. Therefore, it acts as a neurotransmitter of local action in the central nervous system, reaching short distances, diffusing from cell to cell. It has many functions as learning and memory and modulation of excitatory responses to aminoacids. NO is present in many areas throughout the brain and has been described in many animal species by the expression of its enzyme of synthesis, the NOS. Using immunohistochemistry against NOS and NADPH diaphorase histochemistry we described the distribution of NO in the brainstem of a rodent typical from the Brazilian caatinga, that inhabits rocky areas and has crepuscular habits, the rock cavy (Kerodon rupestris). Several brainstem areas and nuclei presented immunorreactivity to NOS or NADPHd activity. Some of them showed a high density of immunostained neurons, for example the periaqueductal gray, the magnocellular nucleus of the posterior commissure and the interpeduncular nucleus. Others nuclei presented a moderated, as the posterior pretectal nucleus, olivary pretectal nucleus, layers of the superior colliculus and cuneate nucleus. Several showed a low density as the posterior commissure nuclei, paranigral nucleus external cortex of the inferior colliculus and the inferior oliva. Finally, there is nuclei with a very low density, for example the reticular part of the substantia nigra, the pararubral nucleus, the dorsal raphe nucleus, the gracile nucleus and interstitial nucleus of the medulla. The great number of nitrergic nuclei and its pattern of distribution in the rock cavy's brainstem is similar to the other mammals, leading us to conclude that the phylogenetic proximity between species is kept in the brainstem. The present work shows that among other regions the NO is in nuclei of the primary visual system as the pretectal nuclei and the superior coliculum; nuclei of the auditory system as the olivar complex, inferior coliculum and the coclear nuclei; it is in several divisions of the periaqueductal grey matter, strutucture involved in defensive behavior, nociception and anxiety, like the locus coeruleus, where NO also was find; the substantia nigra, where the NO has been related to hepatic encephalopatia and Parkinson's disease in other rodents.The great number of nitrergic nuclei and its pattern of distribution in the rock cavy's brainstem looked alike what is seen in other mammals, leading us to conclude that the philogenetic proximity of the species is mantained in the distribution of NO in the rock cavy's brainstem. Keywords: Nitric oxide, Kerodon rupestris, Nitric oxide sintase, Brainstem.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Isoformas da óxido nítrico sintase..........................................................................24

Figura 2- Síntese do NO........................................................................................................25

Figura 3- Esquema representando a biossíntese do óxido nítrico catalisada pela NOS. sGC

(guanilato ciclase solúvel), guanosina monofosfato cíclico (GMPc) CaM (calmodulina), PKA,

PKC (proteína quinase A e C)................................................................................................26

Figura 4- O mocó (Kerodon rupestris) em ambiente natural.................................................31

Figura 5- Encéfalo do mocó em vista ventral (A), lateral (B) e dorsal (C). Escala de régua

em centímetros.......................................................................................................................35

Figura 6- Exemplos das diferentes intensidades de marcação celular das células marcadas

por imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo........................................................38

Figura 7- Exemplos da diferente quantificação subjetiva da densidade das células marcadas

por imunoistoquímica para NOS.............................................................................................38

Figura 8- Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó ilustrando

a distribuição dos neurônios NOS-IR do tronco encefálico e de fotomicrografias de cortes

submetidos à coloração de Nissl no nível correspondente, distando uma secção do seu

subsequente por 270 µm........................................................................................................45

Figura 9- Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó

submetidas à imunoistoquímica para NOS. (A) Menor aumento do mesencéfalo com alguns

núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com

área correspondente ao núcleo pré-comissural (PrC). (C) Ampliação de caixa homônima em

A com área correspondente a substância cinzenta periaquedutal (PAG). (D) Ampliação de

caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo pré-tectal anterior

(APTD). (E) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventral

do núcleo pré-tectal anterior (APTV). 3V, terceiro ventrículo. Barra: 500 µm em A, 100 µm

em B, C, D e E........................................................................................................................49




área correspondente a substância cinzenta periaquedutal dorsomedial (DMPAG). (C)

Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a substância cinzenta

periaquedutal dorsolateral (DLPAG). Aq, aqueduto; SuG, camada cinza superficial do

colículo superior; Op, camada de nervo óptico do colículo superior; InG, camada

intermediária cinza do colículo superior; DpG, camada cinza profunda do coliculo superior.

Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C..................................................................................50




área correspondente a parte lateral da substância negra (SNL). (C) Ampliação de caixa

homônima em A com área correspondente a parte reticulada da substância negra (SNR). cp,

pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.................................................52




área correspondente ao núcleo do trato óptico (OT). (C) Ampliação de caixa homônima em

A com área correspondente ao núcleo magnocelular da comissura posterior (MCPC) e o

núcleo retroparafascicular (RPF). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área

correspondente ao núcleo de Darkschewitsch (DK). Aq, aqueduto; cp, pedúnculo cerebral.

Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.............................................................................53




área correspondente ao campo retrorubral (RRF). (C) Ampliação de caixa homônima em A

com área correspondente ao núcleo interpeduncularrostral (IPR), caudal (IPC), intermediário

(IPI) e lateral (IPL). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C..................................................55




área correspondente a parte lateral do núcleo dorsal da rafe (DRL), ao núcleo posterodorsal

da rafe (PDR), a parte dorsal do núcleo dorsal da rafe (DRD) e a parte ventral do núcleo

dorsal da rafe (DRV). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao

núcleo retrorubral (RR). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente

ao núcleo rabdoide (Rbd) e ao núcleo mediano da rafe (MnR). Barra: 500 µm em A, 100 µm

em B, C e D............................................................................................................................56


submetidas à imunoistoquímica para NOS. (A) Menor aumento da ponte com alguns núcleos

apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área

correspondente ao córtex externo do colículo inferior (ECIC). (C) Ampliação de caixa

homônima em A com área correspondente a parte lateral do núcleo dorsal da rafe (DRL).

(D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo tegmental

pedunculopontino (PTg). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.....................................58


submetidas à imunoistoquímica para NOS. (A) Menor aumento da ponte com alguns núcleos


correspondente ao locus cerúleos (LC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área

correspondente ao núcleo trigêminal mesencefálico (Me5). (D) Ampliação de caixa

homônima em A com área correspondente ao núcleo subceruleus, parte ventral (SubCV).

Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.............................................................................60


submetidas à imunoistoquímica para NOS. (A) Menor aumento do bulbo com alguns núcleos


correspondente a parte parvocelular do núcleo vestibular medial (MVePC). (C) Ampliação de

caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo preposito (Pr). (D) Ampliação de

caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo dorsal paragigantocelular

(DPGi). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D................................................................62




correspondente a parte lateral do núcleo cuneado externo (ECu). (C) Ampliação de caixa

homônima em A com área correspondente aos núcleos do trato solitário (Sol). (D)

Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo preposito, parte

magnocelular (PrMc). (E) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente

aos núcleos olivares inferiores (IO). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C, D e E...............63




correspondente ao núcleo grácil (Gr). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área

correspondente a camada gelatinosa do núcleo trigêminal espinal caudal, (Ge5) e ao núcleo

trigêminal espinal, parte caudal (Sp5C). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área

correspondente ao núcleo reticular lateral (LRt). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B,C e

D.............................................................................................................................................64


submetidas à histoquímica. (A,C,G,I) Menor aumento de cortes do tronco encefálico com

alguns núcleos apresentando neurônios corados para NADPHd. (B) Ampliação de caixa

homônima em A area correspondente ao núcleo interpeduncular rostral (IPR), e suas

divisões: caudal (IPC), intermediário (IPI) e lateral (IPL), (D) Ampliação de caixa homônima

em C area correspondente ao a camada zonal (Zo) da camada cinza superficial do colículo

superior (SuG) e suas divisões seguintes: camada de nervo óptico (Op), camada

intermediária cinza (InG), (E) camada cinza profunda (DpG), (F) núcleo tegmental

microcelular (MiTg), (H) Ampliação de caixa homônima em G área correspondente ao Locus

cerúleos (LC), núcleo trigeminal mesencefálico (Me5), (J) Ampliação de caixa homônima em

I área correspondente ao camada gelatinosa do núcleo trigeminal espinhal caudal (Ge5),

núcleo trigeminal espinhal, parte caudal (Sp5C)....................................................................66

LISTA DE QUADROS

Tabela 1- Densidade e intensidade dos núcleos imunorreativos a NOS...............................39

LISTA DE ABREVIATURAS

10N núcleo motor dorsal do vago

11N núcleo do nervo acessório

12N núcleo hipoglosso

3V terceiro ventrículo

4N núcleo troclear

4V quarto ventrículo

5Ma núcleo motor trigeminal, parte masseter

5N núcleo trigeminal

5Sol zona de transição trigeminal-solitário

5Te núcleo motor trigeminal, parte temporal

6N núcleo abducente

7N núcleo facial

7-NIO 7-nitroindazol

8vn raiz vestibular do nervo vestibulococlear

A1 A1células noradrenérgicas

A2 A2 células noradrenérgicas

AmbC núcleo ambíguo, parte compacta

APT núcleo pré-tectal anterior

APTD núcleo pré-tectal anterior, parte dorsal

APTV núcleo pré-tectal anterior, parte ventral

Aq aqueduto mesencefálico

BIC núcleo do braço do colículo inferior

bsc braço do colículo superior

Ca2+ ion cálcio

CaM calmodulina

CC canal central

CeCv núcleo cervical central da medula espinal

CEUA-UFRN Comitê de Ética em Uso Animal da Universidade Federal do RN

CGA cinza central, parte alfa

CGB cinza central, parte beta

CGG cinza central, parte gama

CGPn substancia cinzenta da ponte

ChAT colina acetil-transferase

cNOS óxido nítrico constitutiva

cp pedúnculo cerebral

Csc comissura do colículo superior

cu fascículo cuneado

Cu núcleo cuneado

CuR núcleo cuneado, parte rotunda

DAB diaminobenzidina

DCDp núcleo coclear dorsal, núcleo profundo

DCIC córtex dorsal do colículo inferior

dcs trato corticoespinal dorsal

Dk núcleo de Darkschewitsch

DLPAG substância cinzenta periaquedutal, porção dorsolateral

DMPAG substância cinzenta periaquedutal, porção dorsomedial

DMSp5 núcleo espinal trigeminal dorsomedial

DMTg área tegmental dorsomedial

DpG colículo superior, camada cinza profunda

DPGi núcleo paragigantocelular dorsal

DPO região periolivar dorsal

DR núcleo dorsal da rafe

DRD parte dorsal do núcleo dorsal da rafe

DRL parte lateral do núcleo dorsal da rafe

DRV parte ventral do núcleo dorsal da rafe

dsc/oc trato espinocerebelar dorsal e olivocerebelar

DT núcleo terminal dorsal do trato óptico acessório

ECIC córtex externo do colículo inferior

ECu núcleo cuneado externo, parte lateral

eNOS óxido nítrico endotelial

FAD dinucleótido de flavina-adenina

FMN mononucleótido de flavina

Fr fascículo retroflexo

FVe grupo de células do complexo vestibular

g7 genu do nervo facial

GC guanilato ciclase

GCs guanilato ciclase solúvel

Ge5 camada gelatinosa do núcleo trigeminal espinal caudal

Gi núcleo gigantocelular reticular

GiA núcleo gigantocelular reticular, parte alfa

GiV núcleo reticular gigantocelular, parte ventral

GMPc Monofosfato cíclico de guanosina

gr fascículo grácil

Gr núcleo grácil

GTP guanosina-5´-trifosfato

H2O2 peróxido de hidrogênio

HCT1026 [2-Fluoro-a-metil (1,1'-bifenil) -4-acético-4- (nitrooxi) butil éster]

I.C.V intracerebroventricular

IB núcleo intersticial da medula

icp pedúnculo cerebelar inferior

IF núcleo interfascicular

ILL núcleo intermediário do lemnisco lateral

InC núcleo intersticial de Cajal

InCSh concha do núcleo intersticial de Cajal

InG camada intermediária cinza do colículo superior

iNOS óxido nítrico induzível

IO oliva inferior

IOA oliva inferior, núcleo medial, subnúcleo A

IOB oliva inferior, núcleo medial, subnúcleo B

IOBe oliva inferior, subnúcleo beta

IOC oliva inferior, núcleo medial, subnúcleo C

IPC núcleo interpeduncular, subnúcleo caudal

IPDL núcleo interpeduncular, subnúcleo dorsolateral

IPI núcleo interpeduncular, subnúcleo intermediário

IPL núcleo interpeduncular, subnúcleo lateral

IPR núcleo interpeduncular, subnúcleo rostral

IRt núcleo reticular intermediário

IRtA núcleo reticular intermediário, parte alfa

IS núcleo salivatório inferior

isRt formação reticular ístmica

LC locus cerúleos

LDTg núcleo tegmental laterodorsal

LDTgV núcleo tegmental laterodorsal, parte ventral

lfp fascículo longitudinal da ponte

L-NOARG NG-nitro-L-arginina

LPAG substância cinzenta periaquedutal, porção lateral

LPB núcleo parabraquial lateral

LPBI núcleo parabraquial lateral, parte interna

LPBV núcleo parabraquial lateral, parte ventral

LPG núcleo paragigantocelular

LPGiA núcleo paragigantocelular lateral, parte alfa

LPGiE núcleo paragigantocelular lateral, parte externa

LRt núcleo reticular lateral

LRtS5 núcleo reticular lateral, parte subtrigeminal

LSO oliva superior lateral

LT núcleo terminal lateral do trato óptico acessório

Lth núcleo litóide

LVe núcleo vestibular lateral

LVPO núcleo periolivar lateroventral

MA3 núcleo medial acessório do oculomotor

macNOS óxido nítrico do macrófago

MCPC núcleo magnocelular da comissura posterior

MdD núcleo reticular medular, parte dorsal

MdV núcleo reticular medular, parte ventral

Me5 núcleo trigeminal mesencefálico

MHb núcleo habenular medial

MiTg núcleo tegmental microcelular

ml lemnisco medial

ML núcleo mamilar medial, parte lateral

Mlf fascículo media longitudinal

MnA núcleo acessório mediano da medula

MnR núcleo mediano da rafe

mp pedúnculo mamilar

MPB núcleo parabraquial medial

MPL núcleo medial paralemniscal

MPT núcleo pré-tectal medial

MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina

MSO oliva superior medial

MT núcleo terminal medial do trato óptico acessório

MVeMC núcleo vestibular medial, parte magnocelular

MVePC núcleo vestibular medial, parte parvocelular

MVPO núcleo periolivar medioventral

Mx região matriz da medula

N2O óxido nitroso

NaCl cloreto de sódio

NADPH nicotinamida adenina dinucleótideo fosfato

NADPHd nicotinamida adenina dinucleótideo fosfato diaforase

NMDA N-metil D-aspartato

nNOS óxido nítrico neuronal

No núcleo olivar

NO óxido nítrico

NOS óxido nítrico sintase

NOS-ir oxido nítrico imunoreativo

NPLA Nω-propil-L-arginina

O2 oxigénio

ocb feixe olivococlear

Op camada do nervo óptico do colículo superior

OPT núcleo olivar pré-tectal

opt trato óptico

OT núcleo do trato óptico

P1Rt formação reticular

P5 zona peritrigeminal

Pa6 núcleo parabducente

PaC núcleo paracomissural da comissura posterior

PAG substância cinzenta periaquedutal

PaR núcleo pararubral

PB tampão fosfato 0,1M

PBG núcleo parabigeminal

PBP núcleo parabraquial pigmentado do VTA

PCom núcleo da comissura posterior

PCR Reação em cadeia da polimerase

PCRt núcleo reticular parvocelular

PCRtA núcleo reticular parvocelular, parte alfa

PDR núcleo posterodorsal da rafe

PDTg núcleo tegmental posterodorsal

PHOX NADPH oxidase

PKA proteína quinase A

PKC proteína quinase C

PKG I proteína quinase G I

PKG II proteína quinase G II

PLV núcleo perilemniscal , parte ventral

PMnR núcleo paramediano da rafe

PN núcleo paranigral do VTA

Pn núcleo pontino

PnC parte caudal do núcleo reticular pontino

PnO parte oral do núcleo reticular pontino

PnV núcleo reticular pontino, parte ventral

PP núcleo peripeduncular

PPT núcleo pré-tectal posterior

PR campo pré-rubral

Pr núcleo prepósito

Pr5DM parte dorsomedial do núcleo principal sensorial do trigêmeo

Pr5VL parte ventrolateral do núcleo principal sensorial do trigêmeo

PrBo complexo pre-Botzinger

PrC núcleo pré-comissural

PrCnF área pré-cuneiforme

PrEW núcleo pre-Edinger-Westphal

PrMc núcleo prepósito, parte magnocelular

PTg núcleo tegmental pedunculopontino

pyx decussação piramidal

RAmb núcleo retroambíguo

Rbd núcleo rabdóide

RIP núcleo interpósito da rafe

RLi núcleo linear rostral da rafe

RMC parte magnocelular do núcleo rubro

RMg núcleo magno da rafe

Ro núcleo de Roller

ROb núcleo obscuro da rafe

RPa núcleo pálido da rafe

RPC parte parvocelular do núcleo rubro

RPF núcleo retroparafascicular

RR núcleo retrorrubral

RRF campo retrorrubral

RtTg núcleo reticulotegmental da ponte

RtTgL núcleo reticulotegmental da ponte, parte lateral

SARA sistema de ativação reticular ascendente

scp pedúnculo cerebelar superior

SNCD substância negra, parte compacta, camada dorsal

SNCM substância negra, parte compacta, camada medial

SNL substância negra, parte lateral

SNR substância negra, parte reticulada

Sol trato solitário

SolDM núcleo trato solitário, parte dorsomedial

SolIM núcleo trato solitário, parte intermediaria

SolL núcleo trato solitário, parte lateral

SolM núcleo trato solitário, parte medial

SolV núcleo trato solitário, parte ventral

Sp5 núcleo espinal trigeminal

sp5 trato espinal trigeminal

Sp5C núcleo espinal trigeminal, parte caudal

Sp5I núcleo espinal trigeminal, parte interpolar

Sp5O núcleo espinal trigeminal, parte oral

SPO núcleo paraolivar superior

SPTg núcleo tegmental subpeduncular

SpVe núcleo vestibular espinal

Su3 supraoculomotor

Su3C supraoculomotor cap

SubB núcleo sub-braquial

SubCA núcleo subceruleus, parte alfa

SubCD núcleo subceruleus, parte dorsal

SubCV núcleo subceruleus, parte ventral

SuG camada cinza superficial do colículo superior

SuS núcleo salivatório superior

SuVe núcleo vestibular superior

TH tirosina hidroxilase

TH-ir tirosina hidroxilase imunorreativo

TrLL núcleo triangular do lemnisco lateral

Ts trato tectoespinal

tth trato trigeminotalâmico

TXPB tampão fosfato com tampão Triton X-100 a 0,4%

Tz núcleo do corpo trapezóide

un fascículo uncinado do cerebelo

VCA núcleo coclear ventral, parte anterior

VCP núcleo coclear ventral, parte posterior

verme trato vestibulomesencefalico

vesp trato vestibuloespinal

VG núcleo geniculado ventral

VLL núcleo ventral do lemnisco lateral

VLPAG substância cinzenta periaquedutal ventrolateral

VTAR área tegmental ventral, parte rostral

VTg núcleo tegmental ventral

X núcleo x

Zo camada zonal do colículo superior

β-NADP Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato hidratado

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................21

1.1 ÓXIDO NÍTRICO.................................................................................................................21

1.1.1 O NO como neurotransmissor......................................................................................22

1.1.2 Funções do NO...............................................................................................................23

1.1.3 Óxido nítrico sintase (NOS)..........................................................................................24

1.1.4 Síntese do NO.................................................................................................................25

1.2 TRONCO ENCEFÁLICO.....................................................................................................27

1.2.1 Mesencéfalo...................................................................................................................27

1.2.2 Ponte...............................................................................................................................28

1.2.3 Bulbo...............................................................................................................................28

1.3 MODELO EXPERIMENTAL................................................................................................29

2. OBJETIVOS..........................................................................................................................32

2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................32

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...............................................................................................32

3. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................................33

3.1 ANIMAIS.............................................................................................................................33

3.2 PROCEDIMENTOS............................................................................................................33

3.2.1 Perfusão..........................................................................................................................33

3.2.2 Remoção do encéfalo e microtomia.............................................................................34

3.2.3 Imunoistoquímica..........................................................................................................35

3.2.4 Método de Nissl.............................................................................................................36

3.2.5 Histoquímica.................................................................................................................36

3.2.6 Análise das imagens....................................................................................................37

4. RESULTADOS.....................................................................................................................39

4.1 IMUNOISTOQUÍMICA........................................................................................................48

4.2 HISTOQUÍMICA.................................................................................................................65

5. DISCUSSÃO......................................................................................................................67

5.1 ASPECTOS NEUROANATÔMICOS E FUNCIONAIS DO ÓXIDO NÍTRICO NO TRONCO

ENCEFÁLICO DO MOCÓ......................................................................................................68

6. CONCLUSÃO....................................................................................................................75

REFERÊNCIAS..................................................................................................................76

ANEXOS.............................................................................................................................89

21

1. INTRODUÇÃO

1.1 ÓXIDO NÍTRICO

Uma das menores moléculas produzidas nos organismos vivos, dos peixes

aos mamíferos (Alonso et al., 2000), o óxido nítrico (NO) é um gás altamente

lipofílico que se difunde através das membranas celulares e tem como

características químicas: Massa molar: 30,01 g/mol; Densidade: 1,34 kg/m³; Ponto

de ebulição: -152 °C; e Ponto de fusão: -164 °C.

Encontrado no ar atmosférico em quantidades muito pequenas, o NO é um

gás muito difusível e tóxico, pois possui sete elétrons na molécula de nitrogênio e

oito na de oxigênio, tendo um elétron desemparelhado que o torna altamente reativo

(Snyder; Bredt, 1992). Porém, também pode ser redutor dependendo do meio em

que ele está e é rapidamente destruído pelo oxigênio (Archer, 1993). Sua oxidação

produz como subproduto nitrito e nitrato (Kiechle et al., 1993).

O início dos estudos com NO se deu em pesquisas de diferentes grupos

independentes e em períodos próximos. Furchgott e Zawadzki (1980) investigavam

um fator vasodilatador associado ao endotélio vascular, devido a sua ação relaxante

vascular, promovendo vasodilatação pela ativação de guanilato ciclase, portanto

produzindo um aumento de Monofosfato cíclico de guanosina (GMPc). Em 1981

estudos liderados por Green e colaboradores demonstraram a produção de nitrato

em camundongos germ-free.

Posteriormente Stuehr e Marletta (1985) demonstraram que macrófagos

ativados por lipopossacarideos bacterianos eram capazes de produzir nitritos e

nitratos. Hibbs e colaboradores (1987) descobriram que a L-arginina era o substrato

para a produção do NO, e a L-citrulina era formada como co-produto, e no mesmo

ano, Ignarro e colaboradores (1987) confirmam ser o NO a molécula responsável

pelo fator relaxante derivado do endotélio. Trabalhos seguintes feitos por Hibbs e

colaboradores (1988) e Marletta e colaboradores (1988) identificaram que o NO era

um importante mediador citotóxico de células imunes ativadas, agindo na destruição

de patógenos e células tumorais.

Os estudos com o NO com ação neurotransmissora começaram com

Ferrendelli e colaboradores (1974) demonstraram que o glutamato aumentou o

22

GMPc na parte central do sistema nervoso. Miki e colaboradores (1977)

demonstraram a ativação da guanilato ciclase cerebral pelo NO. Mais de uma

década depois, Garthwaite e seus colaboradores (1989), afirmaram que o glutamato

é o mediador da liberação de NO por receptores N-metil-d-aspartato (NMDA). Bredt

e Snyder (1989) e Knowles e colaboradores (1989) confirmaram a produção de NO

no sistema nervoso. Enquanto Schmidt e colaboradores (1991) isolaram e

purificaram no cerebelo de ratos e porcos uma isoforma da enzima responsável pela

formação de NO, a óxido nítrico sintase (NOS).

O desfecho dessas linhas de pesquisa fez com que o NO passasse da

condição de molécula sem importância biológica e pouco estudada para a de um

dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares.

1.1.1 O NO como neurotransmissor

Normalmente os neurotransmissores são moléculas fabricadas nos corpos

dos neurônios, empacotados em vesículas e liberados pelas terminações nervosas

de neurônios pré-sinápticos que tem por função promover a comunicação entre

células. Na célula pós-sináptica, o neurotransmissor ao alcançar seus receptores

estimula ou inibe essa segunda célula.

Atualmente a maioria dos neurotransmissores situa-se em uma de três

categorias: aminoácidos, aminas e peptídeos. Os neurotransmissores aminoácidos e

aminas são moléculas orgânicas pequenas com pelo menos um átomo de nitrogênio

e liberado pelas vesículas sinápticas. Os neurotransmissores peptídicos são grandes

moléculas formadas por múltiplos aminoácidos, comumente encontrados em

terminais axonais que contêm neurotransmissores aminas ou aminoácidos, e as

vezes dividem as mesmas vesículas (Bear, 2016).

O NO é diferente de todos os outros neurotransmissores clássicos, pois não

é armazenado em vesículas; não age em conjunto com mecanismos específicos de

liberação e captação; não necessita de receptores na membrana celular, pois

adentra a célula alvo por afinidade lipofílica; não há enzimas específicas para

metabolizá-lo, degradando-se espontaneamente por oxidação, por compostos tais

como superóxido ou oxihemoglobina (Ignarro et al., 1989).

23

1.1.2 Funções do NO

As funções do NO são descritas por diversos autores como complexas e

antagônicas, pois as mesmas podem ser benéficas ou tóxicas de acordo com a

concentração ou depuração no tecido; por isso Schmidt e colaboradores (1991)

chamaram o NO de "faca de dois gumes". De uma forma geral, devido à sua entrada

na célula sem carreadores, os organismos utilizam o NO em funções fisiológicas em

que é necessária uma resposta rápida (Ignarro et al., 1987).

O NO também é considerado uma das primeiras defesas do organismo

contra infecções por bactérias, parasitas e vírus (Drapier et al., 1988; Gazzinelli et

al.,1992; Feng e Walker 1993; Oswald et al., 1994; Lowenstein et al.,1996), está

envolvido na função plaquetária, na regulação do tônus vascular e também

modulando o sistema imunológico (Snyder e Bredt, 1992).

Atuando em concentrações superiores à de simples mensageiros, o NO é

tóxico aos microrganismos invasores, porém é tênue o limite de concentração

tissular entre a não toxicidade às células do hospedeiro e a toxicidade necessária

para ação de injurias intra e extracelulares, e nos casos de doenças autoimunes e

situações de extremo ataque ao organismo o NO irá se encontrar em concentrações

tóxicas para as células, mesmo as saudáveis, atuando na maioria dos processos

inflamatórios (Snyder e Bredt, 1992).

No encéfalo, o NO demonstrou estar envolvido numa grande variedade de

efeitos biológicos, como no controle do fluxo sanguíneo (Phillips et al., 1997), atua

na mediação da diferenciação celular (Ogura et al.,1996) e regula a sobrevivência e

a morte celular (Sparrow, 1994; Wink e Mitchell, 1998; Ikonomidou et al., 2001).

Nelson e colaboradores (1997) demonstraram atuar como neurotransmissor

com função organogênica, pois acredita-se que seus efeitos sobre a liberação de

neurotransmissores, como o glutamato, juntamente com o monóxido de carbono

possa ter um importante papel na formação da memória, no aprendizado, na

agressividade e sexualidade. NO também tem sido envolvido em doenças

psiquiátricas como a esquizofrenia (Nasyrova et al., 2015) e motoras como o

Parkinson (Ayton et al., 2015).

No tronco encefálico o NO atua na regulação cardiovascular em ratos

(Tseng et al., 1996). Atenua a rápida adaptação do sistema arterial no controle

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barorreflexo da atividade do nervo simpático em coelhos (Hironaga et al., 1998). Em

neurônios pré-ganglionares parassimpáticos em humano, NO está envolvido no

controle de lacrimação, salivação, secreção oral e nasofaríngea, e no controle da

dilatação de vasos sanguíneos extra e intracranianos (Gai e Blessing, 1996). NO

também participa da comunicação neuronal e da plasticidade sináptica, modulando a

resposta neuronal do sistema visual e durante o desenvolvimento embrionário

(Tenório et al., 1996).

1.1.3 Óxido nítrico sintase (NOS)

A NOS é a enzima de síntese de NO. Já foram isoladas três isoenzimas,

duas delas, chamadas de cNOS, são constitutivas, sendo elas: a nNOS (NOS

neuronal), isolado primeiramente nos cerebelos de porcos e camundongos (Schmidt

et al., 1991), está presente no encéfalo e leva a síntese do NO, que age como

neurotransmissor; eNOS (NOS endotelial), isolado de células endoteliais de

humano e bovinos, leva a síntese do NO, agindo basicamente como vasodilatador e

no controle de extravasamento tecidual (Pollock et al., 1991).

A terceira isoenzima é a iNOS, a única isoforma induzida, ou seja, só ocorre

nas células por fatores extrínsecos, e é representada pela macNOS (NOS do

macrófago) (Fig. 1). Descoberta no músculo liso (Teng et al., 1998) e hepatócitos de

camundongos a macNOS pode ser induzida em qualquer célula por meio de

lipopolisacarídeos bacterianos ou citocinas, sendo capaz de produzir o NO por um

longo período que o implica em processos patológicos (Stuehr et al., 1991). Como o

atual estudo é no sistema nervoso lidaremos apenas com nNOS e então o

chamaremos simplesmente de NOS.

Figura 1. Isoformas da óxido nítrico sintase (Adaptado de Dusse et al., 2003).

25

Diversos estudos demonstram a presença do NOS no encéfalo de diversas

espécies de vertebrados como peixes (Holmqvist et al., 2000; Masini et al., 2005),

salamandras (Moreno et al., 2002), lagartos (Smeets et al., 1997), pombos (Atoji et

al., 2001), camundongos ( Reuss e Riemann., 2000; Gotti et al., 2005), ratos (Hope

et al., 1991; Vincent e Kimura., 1992; Iwase et al., 1998; Freire et al., 2012), coelhos

(González-Soriano et al., 2002) e humanos (Egberongbe et al., 1994), sendo

particularmente abundante no tronco encefálico, com neurônios nitrérgicos

presentes desde o bulbo até a transição mesodiencefálica, o que denota uma

participação de NO em diversas funções bulbares, pontinas e mesencefálicas.

1.1.4 Síntese do NO

A produção do NO se dá quando a L-arginina é transformada em um

intermediário, a N-hidroxi-L-arginina, com a presença de nicotinamida-adenina

dinúcleotídeo-fostato-hidrogênio (NADPH) e Ca2+ sendo necessário mais NADPH e

O2, além de flavinas e biopterinas para a formação de L-citrulina e NO (Fig. 2).

Figura 2. Síntese do NO (Retirado de Dusse et al., 2003).

O mecanismo de ativação da produção do NO neuronal é iniciada pelo

glutamato, liberado de vesículas de neurônios pré-sinápticos, ligando-se a

receptores, principalmente do tipo NMDA, do neurônio pós-sináptico. Com isso

abrindo um canal fazendo com que o Ca2+ entre para o interior da célula, como

aumento na concentração desses íons no neurônio pós-sináptico ocorre a ativação

de uma proteína quinase dependente de cálcio, a calmodulina, uma proteína que

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age como uma subunidade para muitas enzimas dependentes de Ca2+. O complexo

Ca2+/calmodulina liga-se a enzima NOS, que catalisa a oxidação de L-arginina em

L-citrulina e NO (Fig. 3) (Saavedra et al.,1997).

Figura 3. Esquema representando a biossíntese do óxido nítrico catalisada pela NOS. sGC

(guanilato ciclase solúvel), GMPc (guanosina monofosfato cíclico), CaM (calmodulina), PKA

e PKC (proteína quinase A e C). (Modificado de Salum et al., 2008).

Depois de produzido e difundido nos tecidos o efeito do NO ocorre a partir

da ativação da enzima guanilato ciclase (GC) que por sua vez, quando ativada,

produz guanosina-3´,5´-monofosfato cíclico (GMPc) a partir da guanosina-5´-

trifosfato (GTP). O GMPc é um segundo mensageiro que ativa proteínas quinase G I

(PKG I), que responde pelo controle da quantidade de Ca2+ intracelular, e proteínas

quinase G II (PKG II), uma proteína de membrana que passa a controlar o fluxo de

ânions, principalmente de íons cloreto.

Um dos alvos do NO sintetizado no elemento pós-sináptico é o próprio

neurônio pré-sináptico, promovendo a liberação de mais glutamato neste neurônio,

realizando assim a regulação de potenciais de longa duração e reiniciando o ciclo

(Moncada e Higgs, 1993).

O NO difunde-se nas terminações nervosas formando ligações covalentes

com alvos potenciais, o qual inclui a guanilato ciclase solúvel. A ação do NO é então

finalizada com a sua difusão para outras áreas, onde será convertido em nitrito/

nitrato (Dawson e Snyder, 1994).

27

1.2 TRONCO ENCEFÁLICO

O tronco encefálico situa-se entre a medula e o diencéfalo, localizando-se no

humano ventralmente ao cerebelo, conectando a medula espinal com outras

estruturas encefálicas superiormente. Embriologicamente ele surge do

rombencéfalo, dando origem a duas vesículas: Mielencéfalo, que dará origem ao

bulbo e o Metencéfalo, no qual dará origem a ponte e o cerebelo.

Ele se divide rostrocaudamente em: mesencéfalo, ponte e bulbo. Os corpos

de neurônios se agrupam em núcleos e fibras nervosas se agrupam em feixes

denominados tratos, fascículos e lemniscos. Muitos dos núcleos do tronco encefálico

recebem ou emitem fibras nervosas que entram na constituição dos nervos

cranianos. Dos 12 pares de nervos cranianos, 10 fazem conexão no tronco

encefálico (Machado, 2005). Uma lesão no tronco encefálico é frequentemente

devastadora e letal, devido ao fato de que no tronco ficam centros de controle

cardíacos e respiratórios (Gray e Standring, 2008).

1.2.1 Mesencéfalo

Interposto entre a ponte e o diencéfalo, é “atravessado” por um estreito

canal: o aqueduto mesencefálico. O teto do mesencéfalo é situado dorsalmente ao

aqueduto. Ventralmente ao aqueduto ficam os dois pedúnculos cerebrais, que

dividem-se em parte dorsal,o tegmento, e outra ventral, a base do pedúnculo (Gray e

Standring, 2011).

Nele temos os centros dos reflexos visuais. Os circuitos neurais da retina

levam informação de imagens em movimento e parado para os colículos superiores

e destes para o nervo oculomotor. Nos colículos também estão o centro responsável

pelos reflexos de controle dos movimentos da cabeça e tronco em resposta aos

estímulos visuais. Os colículos inferiores, são parte da via auditiva, retransmitindo

impulsos do núcleo coclear para o diencéfalo, bem como os centros dos reflexos de

sobressalto. Também encontramos dois pares de nervos cranianos: oculomotor e

troclear (Machado, 2005).

A substância negra é um grande núcleo onde parte dos neurônios produz

dopamina, estendendo-se até os núcleos da base. Axônios vindos do cerebelo e do

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córtex cerebral formam sinapses nos núcleos rubros que ajudam a controlar

movimentos voluntários dos membros. Os neurônios dentro da formação reticular

têm funções ascendentes sensitivas e descendentes motoras, nela temos o sistema

de ativação reticular ascendente (SARA), axônios sensitivos que se projetam em

direção ao córtex cerebral, ajudando a manter a consciência, ativos durante o

despertar do sono, suas funções motoras vão ajudar a regular a postura e o tônus

muscular, o menor grau de contração nos músculos em repouso normal (Tortora e

Grabowski, 2010).

1.2.2 Ponte

Localizado entre o bulbo e o mesencéfalo, em humanos apresenta-se

ventralmente ao cerebelo e sobre a parte basilar do osso occipital e o dorso da sela

turca do osso esfenóide. A ponte apresenta na sua porção anteroinferior uma

estriação transversal devido a presença de numerosos feixes de fibras transversais

convergindo de cada lado para formar o pedúnculo cerebelar médio, que adentra no

hemisfério cerebelar correspondente (Tortora e Grabowski, 2010).

A ponte é formada por núcleos e tratos sensitivos e motores, contendo

núcleos vestibulares, componentes da via do equilíbrio, núcleos da área

pneumotáxica e a área apnêustica do centro respiratório, ajudando a controlar a

respiração e núcleos associados com os seguintes quatro pares de nervos

cranianos: trigêmeo, abducente, facial e vestibulococlear.

1.2.3 Bulbo

Também conhecido por medula oblonga, no homem tem o formato de cone

e sua extremidade inferior é continua com a medula espinal. Inferiormente o limite

entre medula e bulbo é o primeiro nervo cervical, ao nível do forame magno,

enquanto que superiormente o bulbo vai até o sulco bulbopontino (Gray e Standring,

2011).

No bulbo está o centro cardiovascular que regula a frequência e a

intensidade do batimento cardíaco e o diâmetro dos vasos; a área respiratória

rítmica, do centro respiratório, que ajusta o ritmo básico da respiração; o centro do

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vômito, que provoca a expulsão forçada pela boca do que estiver na parte superior

do trato gastrointestinal. No bulbo também estão estruturas que promovem a

deglutição, o espirro, a tosse e o soluço.

Na substância branca estão todos os tratos sensitivos e motores, que se

estendem entre a medula espinal e as outras partes do encéfalo. Nele estão duas

protrusões chamadas de pirâmides (Tortora e Grabowski, 2010). É devido à

decussação das pirâmides que o hemisfério cerebral direito controla o lado esquerdo

do corpo e o mesmo acontece no sentido contrário (Gray e Standring, 2011).

No bulbo fica o núcleo olivar inferior que instrui o cerebelo para fazer ajustes

na atividade muscular, desenvolvendo habilidades motoras. A via nervosa do tato

epicrítico, pressão, vibração e propriocepção consciente passam pelos núcleos

grácil e cuneiforme. Com parte no bulbo e parte na ponte existe o núcleo do trato

solitário que faz parte da via gustativa e sensorial visceral; os núcleos cocleares, que

fazem parte da via auditiva recebendo influxo proveniente da cóclea na orelha

interna; e parte dos núcleos vestibulares, componentes da via vestibular, recebendo

informação sensitiva associada com o equilíbrio proveniente também da orelha

interna. No bulbo estão os núcleos associados aos pares de nervos cranianos

vestibulococlear, glossofaríngeo, vago, acessório e hipoglosso (Tortora e Grabowski,

2010).

1.3 ANIMAL EXPERIMENTAL

Os roedores formam uma ordem animal que inclui uma grande quantidade

de espécies adaptados aos mais numerosos habitats e distribuídos por todo o

planeta, desenvolvendo as mais variadas formas anatômicas e funcionais (Lima et

al., 2008).

O Kerodon rupestris, conhecido popularmente como mocó, ocorre em todos

os estados do Nordeste, especialmente na caatinga do semiárido nordestino ate o

norte do estado de Minas Gerais, sendo restritos a áreas rochosas, especialmente

serrotes e serras, mas algumas vezes podem ser encontrados em lajeiros de

planícies (Fig. 4) (Streilein, 1982).

Este roedor, pertencente à família dos cavídeos e da subfamilia caviinae,

possui habitat mais especializado em relação às outras formas de caviinaes e ao

30

gênero Kerodon. No Brasil é representada basicamente pelos gêneros Kerodon,

Cavia e Gálea (Lima et al., 2008).

As características morfológicas são: pernas longas propulsoras e unhas

rombas sobre coxins espessos para que subam em pedras e arvores, não possuem

clavículas, os pés possuem apenas 3 dedos e cauda atrofiada, adulto mede por

volta de 410mm, pesa em torno de 800gr (Santana et al., 2003) e possuem hábito

crepuscular (Sousa e Menezes, 2006).

O mocó habita locais rochosos com diversas fendas para abrigar-se dos

predadores. São facilmente adaptáveis às condições dos locais onde vivem como:

calor, escassez de água e de alimentos, especialmente nos períodos de grandes

secas do semiárido nordestino. Sua alimentação vem de galhos de árvores,

principalmente, pois são excelentes saltadores e escaladores, e em cativeiro comem

de frutas a raízes.

Apresentam uma coloração cinza clara com pelos pretos, amarelos ou

esbranquiçados no dorso, e castanho ferruginoso na região da cauda, um

acastanhado nas patas e branco na região cervical (Moojen, 1952).

Os mocós apresentam inúmeras características biológicas desejáveis à

domesticação, tais como a reprodução em cativeiro, podendo viver até 11 anos,

hábito gregário, poligamia, alta taxa de fecundidade, sociedade e docilidade

(Lacerda et al., 2006).

Apesar dos poucos estudos sobre o mocó, nos últimos anos o Laboratório

de Neuroanatomia da UFRN tem feito um esforço para transformar esta espécie de

roedor em um modelo para estudos neurocientíficos e diversos trabalhos têm sido

publicados (Nascimento Junior et al., 2008, 2010a e 2010b; Cavalcante et al., 2008;

Soares et al., 2012; Cavalcanti et al., 2014; Silva et al., 2014; Morais et al., 2014;

Oliveira et al., 2014). Este esforço tem se baseado principalmente no fato deste

roedor ser animal crepuscular, uma característica interessante e distinta dos

roedores de laboratório como ratos, camundongos e hamsters, além de ser um

animal regional, o que pode trazer características próprias de um animal adaptado a

vida na caatinga brasileira.

O NO é uma substância que vem sendo amplamente estudado já a algumas

décadas. Sua distribuição no sistema nervoso foi estudada em diversas espécies

mostrando semelhanças e diferenças que denotam prováveis diferenças funcionais

31

interespecíficas. Isto nos estimula a estudar a distribuição de NO (mesmo que de

forma indireta) no tronco encefálico de mais uma espécie, principalmente por tal

espécie ter características tão peculiares como seu hábitat e hábitos.

Figura 4.O mocó (Kerodon rupestris) em ambiente natural.Fonte: foto de internet, disponível

em:http://www.flickr.com/photos/21182099@N05/16075565604

32

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Mapear os neurônios produtores de NO no tronco encefálico do mocó

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Delimitar, por imunoistoquímica contra NOS, e por histoquímica para

NADPHd os locais onde estão os neurônios que sintetizam NO no tronco

encefálico de mocó;

Qualificar os núcleos pela densidade e intensidade de marcação dos

neurônios imunorreativos ao NOS.

33

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS

Os animais utilizados neste projeto são os mesmos utilizados em outros

projetos previamente aprovados pelo IBAMA: licença SISBIO no. 42960-1 de

10/03/2014 e pelo Comitê de Ética em Uso Animal (CEUA-UFRN): protocolo no

004/2014 (Anexo).

Foram utilizados sete mocós adultos quatro machos e três fêmeas, que pela

pouca idade, não foi visualizado dimorfismo sexual, sendo feitas analises

histológicas, para posterior identificação dos sexos, foram capturados em cidades do

interior do Rio Grande do Norte e mantidos em quarentena na fazenda SAMISA de

propriedade da UFRN no município de Extremoz-RN. O espaço onde os animais

foram colocados consiste de uma sala ampla, com porta e janelas gradeadas,

permitindo o acesso a iluminação e ventilação natural. O piso é revestido com

vegetação rasteira e pedras, simulando o habitat natural do animal, com agua a

vontade, sendo alimentados com frutas e verduras.

Os encéfalos aqui estudados, bem como as demais partes dos animais,

serão também utilizados em outras pesquisas e no ensino.

3.2 PROCEDIMENTOS

Os animais foram submetidos às etapas de perfusão, remoção e microtomia

do encéfalo, além das técnicas de Nissl, imunoistoquímica e histoquímica.

3.2.1 Perfusão

Os sete animais utilizados neste trabalho foram anestesiados com ketamina

e xilazina via intramuscular na dosagem de 20mg/kg e 2mg/kg respectivamente. Ao

atingir o plano anestésico, cada animal foi submetido à perfusão transcardíaca, que

compreende os seguintes passos:

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1. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre uma tela de arame com

um ponto de água.

2. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes

removidos em bloco, para exposição do coração.

3. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de 17 mm x 1,5

mm, a qual é direcionada para a aorta, seguindo-se uma incisão no átrio

direito. A agulha é conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer),

passando-se 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4

com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000 ml de solução salina), seguido de

700 ml de solução paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7.4.

3.2.2 Remoção do encéfalo e microtomia

Após concluída a perfusão, os animais foram posicionados no aparelho

estereotáxico para roedores. Depois de fazer uma incisão longitudinal na pele e

rebatê-la lateralmente, foi feita a limpeza da superfície óssea, facilitando a

visualização do bregma e do lambda, os quais foram nivelados na mesma altura,

ajustando-se a barra dos incisivos, padronizando assim o plano de corte coronal

para todos os animais. Após anotação das coordenadas do bregma e lambda, o

osso da calota craniana foi removido com o uso de uma broca expondo-se o

encéfalo. Ainda no aparelho estereotáxico, o encéfalo foi seccionado em três blocos,

através de duas secções coronais: uma no nível do bregma e outra no nível do

lambda. Os blocos foram retirados delicadamente para evitar danos (Fig. 5) e em

seguida armazenados em uma solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M,

pH 7,4 a 4°C até serem submetidos a microtomia. Os encéfalos foram congelados

por gelo seco e seccionados em micrótomo de deslizamento, obtendo-se secções

coronais de 30 µm. Estas foram coletadas em um meio líquido de tampão fosfato

0,1M, pH 7,4 distribuídas sequencialmente em 6 compartimentos, de maneira cíclica

e sequenciada, de modo a manter a distância de aproximadamente 180 µm entre

uma secção e a outra imediatamente seguinte de um mesmo compartimento. Os

cortes de um compartimento foram imediatamente montados em lâminas de vidro

gelatinizadas e submetidas à coloração pelo método de Nissl para permitir uma

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melhor demarcação das estruturas. Os cortes dos demais compartimentos foram

transferidos para solução anticongelante e conservados a -20°C para utilização.

Figura 5. Encéfalo do mocó em vista ventral (A), lateral (B) e dorsal (C). Escala de régua em

centímetros. Fonte: arquivo pessoal

3.2.3 Imunoistoquímica

A técnica consistiu de uma imunoperoxidase padrão pelo método ABC, onde

após quatro lavagens com duração de dez minutos cada em tampão fosfato 0,1M

(PB), pH 7,4, os cortes free floating foram submetidos a um pré-tratamento com uma

solução de peróxido de hidrogênio a 0,03% em PB 0,1M durante 20 minutos em

agitador orbital para inativação da peroxidase endógena. Após mais quatro lavagens

de dez minutos, os cortes então foram incubados em tampão fosfato contendo

tampão Triton X-100 a 0,4% (TXPB) com anticorpo primário anti-NOS feito em

camundongo (1:1000, Sigma) e soro normal de cabra a 2% (Jackson Laboratories)

permanecendo em incubação por 16 a 24 horas em agitador orbital. No dia seguinte,

os cortes foram lavados em PB por quatro vezes e incubados em anticorpo

secundário biotilinado anti-camundongo (Jackson Laboratories) feito em cabra

diluído a 1:1000 e TXPB por 2 horas em agitador orbital. Os cortes foram novamente

36

lavados em PB e incubados em solução avidina-biotina-peroxidase (kit ABC, Vector,

1:100) diluídos em TXPB a 0,4% contendo cloreto de sódio (NaCl) por noventa

minutos. Em seguida, os cortes foram lavados e para a visualização da reação, as

secções foram postas em meio contendo PB e H2O2 0,03% como substrato e o

cromógeno diaminobenzidina (DAB) 0,05% por aproximadamente 10 minutos. A

reação foi parada com lavagens em PB em agitador orbital. Os cortes finalmente

foram montados em lâminas gelatinizadas, mergulhados em tetróxido de ósmio

0,05% para intensificar a reação, desidratadas em uma sequência crescente de

alcoóis e deslipidicados em xilol e cobertos com ERV-Mount e lamínula.

3.2.4 Método de Nissl

A coloração pelo método de Nissl é constituída por uma série de etapas que

se iniciam com a desidratação do tecido passando-o em concentrações crescentes

de alcoóis etílicos (70% - 1 vez, por 1h, 95% - 2 vezes, 3 minutos cada, 100% - 2

vezes, 3 minutos cada). Posteriormente são deslipidificados em dois recipientes com

xilol, por 3 e 30 minutos, nessa ordem. Na sequência, o tecido é reidratado em

concentrações decrescentes de alcoóis (mesmo processo anterior, mas no sentido

inverso), submergido em água destilada por 2 minutos, colocado 1 minuto na

solução tionina a 0,25%. Por fim os cortes foram rapidamente submergidos e

emergidos por 1 minuto em água destilada e novamente desidratados e

deslipidificados como descrito anteriormente, sendo acrescentada mais uma etapa

em álcool 95%. Os cortes foram deslipidificados em xilol em dois recipientes (2 e 4

minutos, respectivamente) e finalmente cobertos com lamínula utilizando como meio

de montagem o ERV-Mount.

3.2.5 Histoquímica

Foi utilizado o método histoquímico para marcação de NADPH-diaforase.

Esse processo iniciou-se diluindo 45 mg de azul de nitrotetrazólio em 1,5 ml de

dimetil sulfóxido, formando a solução I. Em seguida acrescentou-se 900 mg de ácido

málico em um béquer contendo 150 ml de tampão TRIS 0,05M, ajustando o pH da

solução resultante para 8,0. Após o ajuste do pH foi acrescentado 150 mg do

37

composto β-NADP e 60 mg de cloreto de manganês, formando a solução II. Após a

homogeinização desta última, as duas soluções foram misturadas, acrescentando

em seguida 4,5 ml de Triton-X100. Uma vez que a solução resultante é fotossensível

ela foi sempre protegida da luz. As secções foram imersas nessa solução e

colocadas para reagir sob agitação manual constante a 39°C em banho maria e

protegidos da luz. A duração tem uma alta variabilidade que depende da

temperatura e da iluminação passando aproximadamente quatro horas em reação.

No entanto, passado um período de 90 minutos os cortes foram observados em

microscópio óptico para verificação do grau de marcação em intervalos de 10

minutos. Após a reação foi feito 3 lavagens sucessivas em PB de 3 minutos cada e

por fim as lâminas foram cobertas com lamínula usando ERV-Mount.

3.2.6 Análise das imagens

As secções do tronco encefálico coradas pelo método de Nissl e as

submetidas à imunoistoquímica e histoquímica foram examinadas ao microscópio

óptico (Nikon eclipse Ci-L) em campo claro. As áreas que contem neurônios

imunorreativos a NOS foram mapeadas e classificadas qualitativamente em

densidade de neurônios imunorreativos e nível de intensidade de marcação de

acordo com as figuras 6 e 7 utilizando como base o atlas de Paxinos e Watson

(2007) de rato, Paxinos e colaboradores (2012) de sagui e Franklin e Paxinos (2008)

de camundongo para a correlação anatômica das estruturas do tronco encefálico do

mocó.

Imagens digitais foram obtidas de secções representativas usando uma

videocâmera digital (Nikon DS-Ri1). As imagens foram analisadas, corrigidas

minimamente para brilho, contraste e documentadas em fotomicrografias, charters

construídos utilizando Canvas (versão 12.0; ACD Systems of America, Inc.; 2010).

38

Figura 6. Exemplos das diferentes intensidades de marcação das células imunomarcadas

para NOS.

Figura 7. Exemplos de quantificação subjetiva da densidade das células imunomarcadas

para NOS dentro de cada núcleo.

39

4. RESULTADOS

No presente estudo a imunoistoquímica para NOS e a histoquímica para a

NADPH-diaforase (NADPHd) foram utilizadas. Encontramos neurônios

imunorreativos para NOS (NOS-IR) e marcadas com NADPHd ao longo de todo

tronco encefálico. A imunoistoquímica apresentou uma coloração castanha bem

definida onde neurônios NOS-IR apresentaram uma marcação que definiu bem o

citoplasma, assim como a NADPHd, que apresentou uma coloração azul com

intensidade que variaram dependendo da atividade da enzima.

O padrão de distribuição dos neurônios marcados pelas técnicas de

imunoistoquímica e histoquímica foi semelhante em todos os animais, como exposto

na seção 4.2 histoquímica. A descrição da distribuição baseia-se principalmente na

imunoistoquímica e como listada no quadro 1.

Quadro 1. Densidade e intensidade dos núcleos imunorreativos a NOS.

Núcleos e Regiões Densidade Intensidade

Núcleo pré-comissural +++ +++

Substância negra

- parte reticulada +/- +

- parte compacta, camada dorsal + +++

- parte lateral ++ ++

Núcleo magnocelular da comissura posterior +++ +++

Núcleo da comissura posterior + ++

Núcleo paracomissural da comissura posterior + +++

Núcleo retroparafascicular +++ +++

Núcleo intersticial de Cajal +/- ++

Substância cinzenta periaquedutal

- parte pleomórfica ++ ++

- lateral +++ ++

- ventrolateral +++ ++

- dorsolateral +++ +++

- dorsomedial ++ +++

- supraoculomotor +/- +++

40

- supraoculomotor cap +/- +++

Núcleo litóide + +++

Área tegmental ventral

- parte rostral ++ +++

- núcleo parabraquial pigmentado + +++

- núcleo paranigral + ++

Núcleo pré-tectal medial + +++

Núcleo pré-tectal anterior

- parte dorsal + ++

- parte ventral + ++

Núcleo pré-tectal posterior ++ ++

Núcleo pré-tectal olivar ++ ++

Núcleo do trato óptico + ++

Núcleo de Darkschewitsch ++ +++

Trato óptico acessório

- núcleo terminal medial +/- +++

- núcleo terminal dorsal + +++

- núcleo terminal lateral +/- +++

Campo pré-rubral + +++

Núcleo pararubral -/+ ++

Campo retrorubral + ++

Núcleo interfascicular + +++

Núcleo pré-Edinger-Westphal +/- ++

Núcleo acessório medial do nervo oculomotor +/- +++

Colículo superior

- camada zonal do colículo superior ++ +++

- camada intermediária cinza ++ ++

- camada do nervo óptico do colículo superior ++ ++

- camada cinza superficial ++ +++

- camada cinza profunda ++ +++

Núcleo peripeduncular +/- +++

Núcleo rubro

41

- parte parvocelular +/- ++

- parte magnocelular +/- ++

Núcleo interpeduncular

- subnúcleo rostral +++ +++

- subnúcleo caudal ++ +++

- subnúcleo intermediário ++ +++

- subnúcleo lateral ++ +++

- subnúcleo dorsolateral + ++

Núcleo sub-braquial +/- +++

Núcleo do braço do colículo inferior +++ ++

Córtex externo do colículo inferior + ++

Córtex dorsal do colículo inferior + ++

Núcleo linear rostral da rafe ++ +++

Núcleo dorsal da rafe +/- ++

- parte dorsal +/- ++

- parte ventral +/- ++

- parte lateral +++ +++

Núcleo mediano da rafe +/- ++

Núcleo posterodorsal da rafe ++ +++

Núcleo paramediano da rafe + +++

Núcleo magno da rafe + ++

Núcleo obscuro da rafe ++ +++

Núcleo troclear ++ +++

Núcleo tegmental pedunculopontino +++ +++

Núcleo retrorubral ++ ++

Núcleo rabdóide + +++

Núcleo pontino + ++

Núcleo reticular pontino, parte oral + ++

Núcleo reticular pontino, parte caudal + ++

Núcleo reticular pontino, parte ventral + ++

Núcleo parabigeminal + ++

Área pré-cuneiforme + +++

42

Núcleo reticulotegmental da ponte + ++

- parte lateral + +++

Núcleo tegmental subpeduncular + +++

Núcleo tegmental microcelular + +++

Núcleo tegmental posterodorsal + +

Núcleo triangular do lemnisco lateral + +

Núcleo intermediário do lemnisco lateral + +

Núcleo ventral do lemnisco lateral + ++

Núcleo medial paralemniscal + +++

Núcleo perilemniscal, parte ventral +/- ++

Núcleo parabraquial medial + ++

Núcleo parabraquial lateral + ++

- parte interna + ++


Núcleo periolivar

- medioventral +/- ++

- lateroventral +/- ++

Núcleo tegmental laterodorsal + +++

- parte ventral + +++

Área tegmental dorsomedial + ++

Núcleo principal sensorial do trigêmeo

- parte ventrolateral + ++

- parte dorsomedial + ++

Núcleo do corpo trapezóide +/- ++

Núcleo subcerúleus

- parte alfa + ++

- parte dorsal + ++


Núcleo coclear ventral

- parte anterior +/- ++

- parte posterior + +++

Locus cerúleos ++ +++

43

Núcleo trigêminal mesencefálico + +++

Substancia cinzenta central

- parte alfa + ++

- parte beta + ++

Núcleo vestibular superior + +++

Substância cinzenta da ponte +/- +

Núcleo parabducente ++ +++

Núcleo abducente ++ +++

Núcleo gigantocelular reticular + ++

- parte alfa ++ +++

Núcleo reticular intermediário + +++

- parte alfa + +++

Núcleo vestibular medial

- parte magnocelular + +++

- parte parvocelular + +++

Núcleo reticular parvocelular + ++

- parte alfa + ++

Núcleo prepósito ++ +++

-parte magnocelular ++ +++

Núcleo paragigantocelular dorsal ++ ++

Núcleo paragigantocelular lateral

- parte alfa ++ +++

- parte externa ++ +++

Núcleo vestibular lateral ++ ++

Núcleo vestibular espinal + +++

Núcleo X ++ +++

Núcleo salivatório inferior + ++

Região matriz da medula + +++

Núcleo espinal trigeminal

- parte dorsomedial + ++

- parte oral + ++

- parte interpolar + ++

44

- parte caudal ++ +++

- camada gelatinosa +++ +++

Zona de transição trigeminal-solitário + ++

Núcleo do trato solitário

- parte intermediaria + ++

- parte lateral + ++

- parte medial + +++


- parte dorsomedial + +++

Núcleo motor dorsal do vago +/- ++

Núcleo reticular lateral ++ +++

Núcleo reticular medular

- parte dorsal + +++

- parte ventral + +++

Núcleo cuneado ++ +++

- parte rotunda ++ +++

- parte externa ++ +++

Núcleo grácil +/- +++

Oliva inferior, núcleo medial

- subnúcleo A + +++

- subnúcleo B + +++

- subnúcleo C + +++

Núcleo retroambíguo + +++

Núcleo intersticial da medula +/- +++

Regiões marcadas com NOS-IR. Nível da densidade dos neurônios nos núcleos: +++ Alta,

++ Moderada, + Baixa, +/- Muito baixa; e da intensidade da marcação:+++ Forte, ++ Média,

+ Fraca (Baseado em padronização subjetiva de densidade e intensidade de neurônios

corados pelos métodos de imunoistoquímica em cada núcleo. Ver figuras 5 e 6).

45

Figura 08. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó ilustrando

a distribuição dos neurônios NOS-IR do tronco encefálico e de fotomicrografias de cortes

submetidos à coloração de Nissl no nível correspondente, distando uma secção do seu

subsequente por 1620 µm. Representação do nível mais rostral em (A) e do nível mais

caudal em (M). Cada ponto representa um neurônio. Para abreviações ver lista de

abreviações.

46

Figura 08. Continuação

47

Figura 08. Continuação

48

4.1 IMUNOISTOQUÍMICA

Cranialmente os primeiros neurônios NOS-IR surgiram no nível dos núcleos

mamilares mediais e lateral. Pela localização e relações, identificamos esse

grupamento como o núcleo pré-comissural (PrC) que apresentou neurônios

marcados em toda sua extensão, apresentando densidade alta e marcação forte

com uma neurópila pronunciada (Fig. 8 A; 9 A e B).

O núcleo pré-tectal medial (MPT) apresentou neurônios NOS-IR com

densidade baixa e forte marcação. O núcleo pré-tectal anterior (APT) e suas partes:

dorsal (APTD) e parte ventral (APTV) apresentaram neurônios NOS-IR com

densidade baixa das células e de marcação média (Fig. 8 A e B; 9 A,D-E). O núcleo

pré-tectal posterior (PPT) e o núcleo pré-tectal olivar (OPT) apresentaram densidade

de neurônios NOS-IR moderada e média marcação (Fig. 8 B).

A substância cinzenta periaquedutal, parte pleomórfica (PAG), apresentou

uma densidade moderada de neurônios NOS-IR e marcação média em todas as

células, que ficaram concentradas na região medial da PAG (Fig. 8 A; 9 A e C). Sua

parte lateral (LPAG) e ventrolateral (VLPAG) com densidade de neurônios NOS-IR

alta com marcação média (Fig. 8 B-D). A partedorsomedial (DMPAG) e dorsolateral

(DLPAG) teve densidade alta e marcação forte (Fig. 8 B-D; 10 A-C). As partes

supraoculomotor (Su3) e supraoculomotor cap (Su3C) exibiram neurônios NOS-IR

com muito baixa densidade e marcação forte.

No colículo superior, neurônios NOS-IR foram encontrados em diversas

regiões. Sendo divididas em 7 camadas, foram observados neurônios NOS-IR na:

camada zonal do colículo superior (Zo) que demonstrou uma densidade moderada e

uma intensidade forte de marcação. A camada cinza superficial (SuG) apresentou

neurônios NOS-IR de densidade moderada e com marcação média dessas células

(Fig. 8 B-D; 10 A).

A camada do nervo óptico do colículo superior (Op) mostrou um padrão de

densidade moderado e uma coloração média em todos os níveis visualizados. A

camada intermediária cinza (InG), camada extensa onde os neurônios NOS-IR

tiveram densidade moderada, com intensidade de coloração média. A camada cinza

profunda (DpG) apresentou densidade moderada de neurônios NOS-IR com

marcação forte com intensa neurópila (Fig. 8 C e D; 10 A).

49

Figura 9. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó



área correspondente ao núcleo pré-comissural (PrC). (C) Ampliação de caixa homônima em

A com área correspondente a substância cinzenta periaquedutal (PAG). (D) Ampliação de

caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo pré-tectal anterior

(APTD). (E) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventral

do núcleo pré-tectal anterior (APTV). 3V, terceiro ventrículo. Barra: 500 µm em A, 100 µm

em B, C, D e E.

50




área correspondente a substância cinzenta periaquedutal dorsomedial (DMPAG). (C)

Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a substância cinzenta

periaquedutal dorsolateral (DLPAG). Aq, aqueduto; SuG, camada cinza superficial do

colículo superior; Op, camada de nervo óptico do colículo superior; InG, camada

intermediária cinza do colículo superior; DpG, camada cinza profunda do colículo superior.

Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.

51

A parte reticulada da substância negra (SNR) apresentou neurônios NOS-IR

com densidade muito baixa em todos os níveis observados, sua marcação foi fraca

(Fig. 8 A-C; 11 A e C). A parte lateral da substância negra (SNL) apresentou

densidade moderada e intensidade média (Fig. 8 A-C; 11 A e B). A parte compacta,

camada dorsal (SNCD), mostrou uma densidade baixa e uma forte marcação (Fig. 8

B e C).

O núcleo do trato óptico (OT) mostrou densidade baixa de neurônios NOS-IR

e marcação média (Fig. 12 A e B). O núcleo magnocelular da comissura posterior

(MCPC) apresentou neurônios NOS-IR com alta densidade e com uma marcação

intensa desses neurônios (Fig. 12 A e C). As células NOS-IR do núcleo da

comissura posterior (PCom) demonstraram uma densidade baixa de neurônios NOS-

IR e de marcação média. O núcleo paracomissural da comissura posterior (PaC)

apresentou neurônios NOS-IR com densidade baixa e marcação forte.

O núcleo retroparafascicular (RPF) apresentou neurônios NOS-IR com

densidade alta e coloração forte (Fig. 12 A e C), O núcleo intersticial de Cajal (InC)

demonstrou uma densidade muito baixa de neurônios NOS-IR com marcação média

(Fig. 8 B e C). O núcleo litoide (Lth) apresentou neurônios NOS-IR com densidade

baixa e com forte marcação.

Na área tegmental ventral (VTA) encontramos neurônios NOS-IR no núcleo

parabraquial pigmentado (PBP) de densidade baixa e com coloração forte (Fig. 8 A-

B e E). Os núcleos: núcleo parabraquial medial (MPB); núcleo parabraquial lateral

(LPB); parte interna (LPBI) e parte ventral (LPBV) demonstraram o mesmo padrão

de densidade baixa e intensidade média. Na parte rostral (VTAR) com densidade

moderada e forte marcação das células. E o núcleo paranigral (PN) apresentou

neurônios com densidades baixas e com uma marcação média (Fig. 8 C).

O núcleo de Darkschewitsch (DK) apresentou neurônios NOS-IR com

densidade moderada, e com marcação forte das células (Fig. 8 B e C; 12 A e D). O

núcleo terminal medial do trato óptico acessório (MT) e terminal lateral do trato

óptico acessório (LT) apresentaram neurônios NOS-IR com densidade muito baixa

em toda sua extensão, com forte marcação celular (Fig. 8 A e B). O núcleo terminal

dorsal do trato óptico acessório (DT) apresentou neurônios NOS-IR de densidade

alta e marcação forte.

52




área correspondente a parte lateral da substância negra (SNL). (C) Ampliação de caixa

homônima em A com área correspondente a parte reticulada da substância negra (SNR).

cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.

53




área correspondente ao núcleo do trato óptico (OT). (C) Ampliação de caixa homônima em

A com área correspondente ao núcleo magnocelular da comissura posterior (MCPC) e o

núcleo retroparafascicular (RPF). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área

correspondente ao núcleo de Darkschewitsch (DK). Aq, aqueduto; cp, pedúnculo cerebral.

Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

O campo pré-rubral (PR), apresentou neurônios NOS-IR com densidade

baixa em toda a extensão do núcleo e com forte marcação celular (Fig. 8 G e H). O

núcleo pararubral (PaR) e o campo retrorubral (RRF) apresentaram intensidade

média e densidade muito baixa no PaR e baixa no RRF (Fig. 8 C; 13 A e B). O

núcleo interfascicular (IF) apresentou neurônios NOS-IR de densidade baixa com

marcação forte dessas células (Fig. 8 C). O núcleo Pré-Edinger-Westphal (PrEW)

demonstrou neurônios NOS-IR de densidade muito baixa e de marcação média. O

núcleo acessório medial do nervo oculomotor (MA3), demonstrou neurônios NOS-IR

de densidade muito baixa e de marcação forte (Fig. 8 C).

54

O núcleo peripeduncular (PP) demonstrou neurônios NOS-IR com densidade

muito baixa e uma marcação forte desses neurônios (Fig. 8 C). A parte parvocelular

do núcleo rubro (RPC) e a parte magnocelular (RMC) apresentaram neurônios NOS-

IR de densidade muito baixa em todas suas porções e intensidade média.O núcleo

interpeduncular (IP) em seu subnúcleo rostral (IPR) teve a maior densidade de

neurônios NOS-IR entre os núcleos mesencefálicos e todos com marcação alta. Já o

subnúcleo caudal (IPC) mostrou densidade moderada, permanecendo com o mesmo

padrão de coloração do subnúcleo rostral (Fig. 8 C). Os subnúcleos intermediário

(IPI) e lateral (IPL) mostraram densidade moderada e forte marcação (Fig. 8 C; 13 A

e C) já o subnúcleo dorsolateral (IPDL), o menor dos subnúcleos, demonstrou uma

baixa densidade e uma coloração média, nos encéfalos observados.

O núcleo sub-braquial (SubB) apresentou neurônios NOS-IR de densidade

muito baixa na porção cranial, com marcação forte. No núcleo do braço do colículo

inferior (BIC) foram encontrados neurônios NOS-IR com densidades altas e

coloração média (Fig. 8 D).

Neurônios NOS-IR foram encontrados em diversos núcleos da rafe. O

núcleo linear rostral da rafe (RLi) apresentou neurônios NOS-IR com densidade

moderada e com forte marcação das células (Fig. 8 A). O núcleo dorsal da rafe (DR)

demonstrou uma densidade muito baixa de neurônios NOS-IR com marcação média.

A parte lateral do núcleo dorsal da rafe (DRL) apresentou marcação forte

em todos os níveis e com alta densidade (Fig. 8 D; 14 A e B; 15 A e C). Assim como

o núcleo posterodorsal da rafe (PDR) (Fig. 8 D; 14 A e B). A parte dorsal do núcleo

dorsal da rafe (DRD) e a parte ventral do núcleo dorsal da rafe (DRV) mostraram

neurônios NOS-IR com densidade muito baixa e marcação média (Fig. 8 D; 14 A e

B).

55




área correspondente ao campo retrorubral (RRF). (C) Ampliação de caixa homônima em A

com área correspondente ao núcleo interpeduncular rostral (IPR), caudal (IPC),

intermediário (IPI) e lateral (IPL). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.

56




área correspondente a parte lateral do núcleo dorsal da rafe (DRL), ao núcleo posterodorsal

da rafe (PDR), a parte dorsal do núcleo dorsal da rafe (DRD) e a parte ventral do núcleo

dorsal da rafe (DRV). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao

núcleo retrorubral (RR). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente

ao núcleo rabdóide (Rbd) e ao núcleo mediano da rafe (MnR). Barra: 500 µm em A, 100 µm

em B, C e D.

O núcleo mediano da rafe (MnR) exibiu densidade de neurônios NOS-IR

muito baixa e marcação média (Fig. 8 D; 14 A e D). O núcleo paramediano da rafe

(PMnR) apresentou densidade de neurônios NOS-IR baixa e marcação forte. Por fim

os dois núcleos mais caudais da rafe, núcleo magno da rafe (RMg), apresentou

baixa densidade e uma marcação média (Fig. 8 H e E), enquanto o núcleo obscuro

da rafe (ROb) mostrou uma moderada densidade e uma forte marcação (Fig. 8 I e J).

O córtex externo (ECIC) e o córtex dorsal (DCIC) do colículo inferior

apresentaram neurônios NOS-IR com densidade baixa e com marcação de média

(Fig. 8 D; 15 A e B). O núcleo tegmental pedunculopontino (PTg) apresentou

57

densidade alta e um forte marcação (Fig. 8 D; 15 A e D). O núcleo retrorubral (RR)

com densidade moderada e marcação média (Fig. 15 A e C). O núcleo rabdóide

(Rbd) e o núcleo troclear (4N) mostraram densidade baixa e marcação forte (Fig. 8

D; 15 A e D).

O núcleo pontino (Pn), bem como o núcleo reticular pontino e suas divisões:

parte oral (PnO), parte ventral (PnV) e parte caudal (PnC), apresentaram uma

densidade baixa e uma intensidade média de marcação (Fig. 8 C-E). O núcleo

parabigeminal (PBG) apresentou baixa densidade e média marcação (Fig. 8 D), já a

área pré-cuneiforme (PrCnF) apresentou a mesma densidade do núcleo anterior

com uma forte intensidade de marcação (Fig. 8 D). O núcleo reticulotegmental da

ponte (RtTg) mostrou uma baixa densidade e uma média intensidade, a sua parte

lateral (RtTgL) mostrou o mesmo padrão de densidade, porém com uma intensidade

de marcação forte.

Os núcleos tegmental subpeduncular (SPTg) e o tegmental microcelular

(MiTg) apresentaram baixa densidade de neurônios e intensidade de marcação forte

(Fig. 8 D), diferindo do núcleo tegmental posterodorsal (PDTg) quanto a intensidade

que neste núcleo é fraca (Fig. 8 E). Densidade baixa e uma intensidade fraca de

marcação foi observada nos núcleos triangular do lemnisco lateral (TrLL) e

intermediário do lemnisco lateral (ILL). No núcleo ventral do lemnisco lateral (VLL) a

densidade foi idêntica aos anteriores com uma intensidade de marcação média. O

núcleo medial paralemniscal (MPL) apresentou a mesma densidade dos três núcleos

anteriores e uma intensidade de marcação forte. Por fim, o núcleo perilemniscal,

parte ventral (PLV) apareceu com uma densidade de neurônios NOS-IR muito baixa

e intensidade média.

58


submetidas à imunoistoquímica para NOS. (A) Menor aumento da ponte com alguns


área correspondente ao córtex externo do colículo inferior (ECIC). (C) Ampliação de caixa

homônima em A com área correspondente a parte lateral do núcleo dorsal da rafe (DRL).

(D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo tegmental

pedunculopontino (PTg). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

O núcleo periolivar em suas subdivisões medioventral (MVPO) e lateroventral

(LVPO) demonstraram uma densidade muito baixa e intensidade de marcação

média. O núcleo tegmental laterodorsal (LDTg) e a sua parte ventral (LDTgV)

demonstraram uma baixa densidade e uma marcação forte. A área tegmental

dorsomedial (DMTg) apresentou uma densidade baixa e uma intensidade média

(Fig. 8 E), o mesmo padrão visto no núcleo principal sensorial do trigêmeo em suas

partes dorsomedial (Pr5DM) e ventrolateral (Pr5VL). O núcleo do corpo trapezóide

(Tz) demonstrou uma muito baixa densidade e uma intensidade de marcação média

(Fig. 8 E).

O núcleo subceruleus em suas partes alfa (SubCA); dorsal (SubCD) e ventral

(SubCV) expressou uma densidade baixa devido a sua extensão nos cortes e uma

59

marcação média a forte (Fig. 8 E). Já o núcleo coclear ventral na parte anterior

(VCA), de densidade muito baixa e intensidade média, e a parte posterior (VCP),

com densidade baixa e intensidade de marcação forte. O locus cerúleos (LC)

mostrou uma densidade moderada, pois é um núcleo pequeno, com uma

intensidade forte. O núcleo do trato mesencefálico do trigêmeo (Me5) demonstrou

uma densidade baixa e uma intensidade forte (Fig. 8 E).

As partes alfa (CGA) e beta (CGB) da substância cinzenta central tiveram

densidade baixa e marcação média (Fig. 8 E). O núcleo vestibular superior (SuVe)

apresentou densidade baixa e intensidade de marcação forte (Fig. 8 F). A substância

cinzenta da ponte (CGPn) teve uma densidade muito baixa e uma marcação fraca

(Fig. 8 E). Os núcleos parabducente (Pa6) e abducente (6N) expressaram uma

densidade moderada e uma intensidade de marcação forte. Núcleo gigantocelular

reticular (Gi) apresentou um conjunto grande de neurônios espalhados em sua

extensão com marcação média no geral e marcação forte em sua parte alfa (GiA)

(Fig. 8 F - H e J).

O núcleo reticular intermediário (IRt) e sua parte alfa (IRtA), demonstraram

uma baixa densidade de neurônios e uma forte marcação (Fig. 8 F - J e L). O núcleo

vestibular medial em suas partes magnocelular (MVeMC) e parvocelular (MVePC),

com densidade baixa e uma marcação forte (Fig. 8 F - I; 17 A e B). O núcleo reticular

parvocelular (PCRt) bem como sua parte alpha (PCRtA), demonstraram densidade

baixa e uma intensidade média (Fig. 8 F - J). O núcleo preposito (Pr), bem como sua

parte magnocelular (PrMC) demonstrou uma densidade moderada e uma forte

intensidade de marcação (Fig. 8 F - I; 17 A e C; 18 A e D) respectivamente.

60


submetidas à imunoistoquímica para NOS. (A) Menor aumento da ponte com alguns


área correspondente ao locus cerúleos (LC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com

área correspondente ao núcleo trigeminal mesencefálico (Me5). (D) Ampliação de caixa

homônima em A com área correspondente ao núcleo subceruleos, parte ventral (SubCV).

Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

O núcleo paragigantocelular dorsal (DPGi), com densidade moderada e

intensidade média (Fig. 8 G e H; 17 A e D), é seguido pelo núcleo paragigantocelular

lateral (LPGi) e sua parte alfa (LPGiA) e externa (LPGiE) onde ambas monstram

uma densidade moderada e uma forte intensidade de marcação (Fig. 8 I). O núcleo

vestibular lateral (LVe) apresentou densidade moderada e média marcação (Fig. 8

G). Núcleo vestibular espinal (SpVe), com densidade baixa e forte marcação (Fig. 8

G-I). O núcleo X (X), com densidade moderada e marcação forte (Fig. 8 H e I). O

núcleo salivatório inferior (IS) mostrou densidade baixa e marcação média enquanto

a região matriz da medula (Mx) mostrou uma densidade idêntica ao núcleo anterior e

marcação forte (Fig. 8 H - K).

61

Núcleo espinal trigeminal (Sp5), e suas partes: dorsomedial (DMSp5), oral

(Sp5O) e parte interpolar (Sp5I), com características idênticas de densidade baixa e

média intensidade, variando apenas na sua parte caudal (Sp5C), com densidade

moderada e forte marcação (Fig. 8 F - M; 19 A e C). O núcleo do trato solitário (Sol)

é dividido em muitas partes: intermediária (SolIM), lateral (SolL), medial (SolM),

ventral (SolV) e dorsomedial (SolDM). Todas elas com densidades baixas e

marcação média, porém nas divisões mediais a intensidade alta (Fig. 8 H - M; 18 A e

C). Mesmo padrão para a zona de transição trigeminal-solitário (5Sol). Por fim a

camada gelatinosa do núcleo trigeminal espinal caudal (Ge5), com densidade alta e

forte marcação (Fig. 8 J - M; 19 A e C). O núcleo motor dorsal do vago (10N)

apresentou densidade baixa e coloração media (Fig. 8 J).

O núcleo reticular lateral (LRt), apresentou uma densidade moderada e uma

marcação forte (Fig. 8 J e K; 18 A e D). Núcleo reticular medular e suas partes dorsal

(MdD) e ventral (MdV), demonstraram uma densidade baixa e uma intensidade forte

(Fig. 8 K - M). Núcleo cuneado (Cu), e a sua divisão externa (ECu), expressaram

uma densidade moderada e uma forte intensidade de marcação (Fig. 8 I - M; 18 A e

B). Assim como sua parte rotunda (CuR). O núcleo grácil (Gr) mostrou uma

densidade muito baixa e uma forte marcação (Fig. 8 J - M; 19 A e B). Oliva inferior,

núcleo medial, e seus subnúcleos A (IOA), B (IOB) e C (IOC), com densidade de

marcação baixa e forte marcação (Fig. 8 J e K; 19 A e E). O núcleo retroambíguo

(RAmb), com densidade baixa e forte marcação (Fig. 8 K e L) e o núcleo intersticial

da medula (IB), com densidade muito baixa e marcação forte (Fig. 8 K e L).

62




correspondente a parte parvocelular do núcleo vestibular medial (MVePC). (C) Ampliação de

caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo prepósito (Pr). (D) Ampliação de

caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo dorsal paragigantocelular

(DPGi). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

63




correspondente a parte lateral do núcleo cuneado externo (ECu). (C) Ampliação de caixa

homônima em A com área correspondente aos núcleos do trato solitário (Sol). (D)

Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo prepósito, parte

magnocelular (PrMc). (E) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente

aos núcleos olivares inferiores (IO). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C, D e E.

64




correspondente ao núcleo grácil (Gr). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área

correspondente a camada gelatinosa do núcleo trigeminal espinal caudal (Ge5) e ao núcleo

trigeminal espinal, parte caudal (Sp5C). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área

correspondente ao núcleo reticular lateral (LRt). Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

65

4.2 HISTOQUÍMICA

Com técnica de NADPHd vimos padrões de marcações semelhantes ao

apresentados na técnica de imunoistoquímica, como nos diversos subnúcleos do

núcleo interpeduncular (IP) (Fig. 20 A e B).

O núcleo tegmental microcelular (MiTg), com neurônios densos e bem

esparsos, foi facilmente visualizado (Fig. 20 D e F). A parte lateral do núcleo dorsal

da rafe (DRL) e o núcleo posterodorsal da rafe (PDR) diferiram um pouco da

imunoistoquímica pela densidade de neurônios, porém tamanho e formato foram o

mesmo. O locus cerúleos (LC) e o núcleo trigêminal mesencéfalico (Me5)

apresentaram uma marcação NADPHd bem destacada e com neurônios grandes

(Fig. 20 G e H). Outros núcleos com marcação bem visível foram o núcleo grácil (Gr)

com neurônios pequenos e bem claros, a camada gelatinosa do núcleo trigêminal

espinal caudal (Ge5), bem delineado, e o núcleo espinal trigêminal, parte caudal

(Sp5C) com neurônios bem pequenos e mal visualizados devido ao Ge5 (Fig. 20 I e

J).

Em algumas áreas a reação enzimática da NADPH apresentou somente

uma marcação residual mais escuro que a marcação de fundo (background), como

uma neurópila marcada onde não se distinguem citoplasmas. Estas áreas

correspondem a núcleos cujos neurônios tem uma fraca marcação imunoistoquímica

contra NOS, como a parte reticulada da substância negra (SNR).

66


submetidas à histoquímica. (A, C, G, I) Menor aumento de cortes do tronco encefálico com

alguns núcleos apresentando neurônios corados para NADPHd. (B) Ampliação de caixa

homônima em A área correspondente ao núcleo interpeduncular rostral (IPR), e suas

divisões: caudal (IPC), intermediário (IPI) e lateral (IPL), (D) Ampliação de caixa homônima

em C área correspondente a camada zonal (Zo) da camada cinza superficial do colículo

superior (SuG) e suas divisões seguintes: camada de nervo óptico (Op), camada

intermediária cinza (InG), (E) camada cinza profunda (DpG), (F) núcleo tegmental

microcelular (MiTg), (H) Ampliação de caixa homônima em G área correspondente ao locus

cerúleos (LC), núcleo trigeminal mesencefálico (Me5), (J) Ampliação de caixa homônima em

I área correspondente a camada gelatinosa do núcleo trigeminal espinhal caudal (Ge5),

núcleo trigeminal espinhal, parte caudal (Sp5C). Barra: 500 µm em A-G e I-J, 166 µm em H.

67

5. DISCUSSÃO

A molécula do NO é sintetizada pela enzima NOS a partir do substrato L-

arginina, num processo que envolve transferências de elétrons do NADPH através

de flavinas FAD e FMN, para que no domínio redutase carboxi-terminal e para o

heme no domínio oxigenasse amino-terminal, possa transformar o substrato em L-

citrulina e a molécula NO, por meio de oxidação (Andrew e Mayer, 1999).

Com isso realizamos as duas técnicas de marcação (imunoistoquímica e

histoquímica) para que ambas uma complementasse a outra, possa corroborar os

achados. Porém, vale destacar que para a última técnica a marcação dos neurônios

dentro dos núcleos não apresentou a nitidez da imunoistoquímica, pois a marcação

positiva ocorre apenas em neurônios que estejam sintetizando o NO durante o

momento da perfusão. Enquanto que na imunoistoquímica irá ser positivo para todos

os neurónios que contêm NOS, de acordo com Hope e colaboradores (1991).

Além disso, Matsumoto e colaboradores (1993) sugerem que o pré-

tratamento dos tecidos com paraformaldeído dependente da dose (0.06 a 4%) altera

o padrão de distribuição da marcação com o NADPH, pois o mesmo relata que na

porção reticulada dos tecidos não houve qualquer atividade. Já na parte citosólica o

padrão de atividade da enzima permaneceu inalterada entre 40% a 60%, com o

resultado obtido por meio da mensuração de moléculas específicas para cada parte

celular e com resultados diferentes de acordo com o tecido investigado. Com isso

ele mostra que a maior parte da ação enzimática do NADPH se perde.

Além disso, Zhou e Zhu (2009), em seu artigo de revisão explicitam que a

localização subcelular do NOS na célula pode contribuir para a sua diversidade de

funções. De qualquer forma, a marcação por NADPHd serviu pra confirmar os

achados corroborando ainda mais as pequenas discrepâncias achadas entre as

técnicas realizadas aqui.

Foi possível analisar a distribuição dos núcleos com marcação positiva para o

NOS comparando o material analisado com seu análogo corado com a técnica de

Nissl. A partir daí foi possível verificar que a organização topográfica dos núcleos

cerebrais do mocó é muito semelhante a outros mamíferos. Em especial ao rato, do

qual foi utilizado em maior proporção para a comparação e identificação desses

68

núcleos, por meio do atlas de Paxinos e Watson (2007), sem esquecer também dos

demais atlas já citados no iten: 3.2.6 Análise das imagens.

5.1 ASPECTOS NEUROANATÔMICOS E FUNCIONAIS DO OXIDO NÍTRICO NO

TRONCO ENCEFÁLICO DO MOCÓ

O sistema visual primário é formado basicamente pelos núcleos pré-tectais,

colículo superior e o geniculado lateral no tálamo. Os núcleos pré-tectais estão

envolvidos nos reflexos pupilares e movimentos dos olhos (Scalia e Arango, 1979;

Klooster et al.,1995). Os núcleos pré-tectais no mocó, localizados no mesencéfalo

seguiu o mesmo padrão morfológico de rato e camundongo (Silva, 2009).

Os núcleos pré-tectais também estão envolvidos com a analgesia em ratos. L-

arginina quando injetado via intracerebroventricular (I.C.V.) no pré-tectal provocou

aumento da produção do NO, que por sua vez ativou o sistema de analgesia de

longa duração, envolvendo o GMP- cíclico (Kumar et al., 1993).

O colículo superior do mocó está subdividido em 7 camadas (Silva, 2009).

O colículo superior é responsável pela integralização de diversas informações

sensoriais como a visão e os sinais para que os olhos se movimentem (Werner et

al., 1997). A expressão de NOS por células coliculares aumentou a partir do final da

primeira semana pós-natal e atingindo um pico de expressão máximo por volta do

15º dia, e como o NO tem sido implicado na plasticidade das projeções durante o

desenvolvimento, o mesmo sugeriu que neurônios NO-IR estão envolvidos no

refinamento de projeções, retino-colicular e córtico-tectal (Tenório et al., 1996).

Corroborando ainda mais essa função organogênica do NO e sistema visual, a

síntese de NO ocorre em células microgliais como uma resposta à lesão do axônio,

enquanto que a expressão em astrócitos parece estar associada tanto a processos

normais em condições fisiológicas como a fase regenerativa após a lesão do nervo

optico em peixes tenca (Clemente et al., 2002). Chacur e colaboradores (2006)

demonstraram por meio de diversos métodos como imunoistoquímica e PCR em

tempo real, que a expressão da NOS no colículo superior do rato fica elevada após a

enucleação unilateral. Cramer e colaboradores (1998) fez uma grande revisão, sobre

a sua função, no desenvolvimento do sistema visual e suas interações em diferentes

áreas cerebrais.

69

Mocó é um roedor de hábitos crepusculares (Sousa e Menezes, 2006) e usam

bem sua visão. O olho é lateralizado, abrigado em uma órbita óssea, equipada por

duas dobras da pele superior e inferior. No pólo anterior do olho, a íris preta e a

pupila em forma de fenda vertical. O globo ocular tem forma elipsoidal (Oliveira et al.,

2014). Com todas as funções que NO tem no sistema visual faz sentido que NO

esteja de forma abundante no sistema visual de mocó.

Relacionando o NO com o sistema auditivo, as funções do complexo olivar

superior incluem a detecção de diferentes intensidades de som e o mapeamento

espacial, o controle de feedback dos mecanismos cocleares e o processamento de

sinais cocleares através de vias auditivas ascendente, sendo o colículo inferior o

primeiro local dessas conexões (Helfert et al., 1988). O NO pode estar envolvido no

processamento e transmissão da entrada acústica para o córtex auditivo, uma vez

que o tratamento de ratos com um inibidor de NOS reduziu a amplitude das

respostas auditivas de latência média (Grassi et al., 1995) e da dessincronização

eletrocortical evocada pelo som (Iannone et al., 1996).

Em estudos conduzidos, por Schaeffer e colaboradores (2003) no complexo

olivar superior, formado pela oliva superior lateral (LSO), núcleo paraolivar (SPO) e a

oliva superior medial (MSO), verificou que projeções ascendentes para o colículo

inferior eram nitrégicos, bem como é sabido que subpopulações de neurônios do

complexo olivar superior produz NOS (Riemann e Reuss, 1999). Alvarado e

colaboradores (2016) mostraram que um condicionamento apropriado à exposição

ao ruído pode reduzir os danos causados nas próximas exposições a ruídos

semelhantes, esse efeito protetor era sabido, mas não era ainda muito bem

compreendido, então eles mostraram que a exposição de ratos a sons de 118

decibéis por uma hora a cada 72 horas por 4 vezes, aumentou a concentração de

neurônios nitrérgicos no núcleo coclear, se estendendo a outros componentes do

sistema auditivo central. Este fenômeno pode estar em parte relacionado a uma

interação entre as vias de sinalização do núcleo coclear com o NO devido a um

aumento da capacidade tamponadora do cálcio citosólico induzido pelo protocolo de

condicionamento de ruído.

O habitat do mocó (caatinga) é um ambiente aberto de pouca vegetação,

beneficiando a detecção de sons a longa distância. A presença de NO no sistema

auditivo central de mocó mostra um papel importante dele na audição e outras

70

funções deste sistema, podendo beneficiar esta espécie na detecção de predadores

neste ambiente.

A substância cinzenta periaquedutal (PAG) e suas divisões são grandes

grupos de núcleos que circunda o aqueduto mesencefálico. É um importante sítio

neural para inúmeras funções incluindo a regulação cardiovascular, a modulação da

dor e atividades comportamentais (Xing et al, 2012). Quando a DPAG de ratos ou

camundongos é estimulada química ou eletricamente produz saltos e fugas, além de

comportamento de congelamento motor (Schenberg et al., 2005 e Miguel e Nunes-

de-Souza, 2006), comportamento bem semelhante aquele de fuga de predadores

naturais (Blanchard et al., 2001), o que também leva a um estado de antinocicepção.

Diversos neurotransmissores como a serotonina o ácido gama-aminobutírico

(GABA) e glutamato, quando aí injetados alteram esses comportamentos (Graeff,

2004 e Engin e Treit, 2008). Este último é expresso em grande quantidade em todo

a PAG e consequentemente sua ativação desencadeia a síntese do NO (Garthwaite

et al., 1989) e injeções de doadores de NO na DPAG provoca reações de luta e fuga

(Braga et al., 2009). Já os inibidores de NO, quando injetados na PAG, provocam

efeitos ansiolíticos em ratos, semelhantes aos expostos ao labirinto em cruz elevado

quando um potente inibidor do NOS, o Nω-propil-L-arginina (NPLA), é injetado

I.C.V., atenuando a defesa de ratos em testes de presa-predador (Carvalho-Netto,

2009). No camundongo a injeção de NMDA inverte o comportamento nociceptivo e

defensivo quando confrontado com um predador (Miguel e Nunes-de-Souza, 2006).

Emmanouil e colaboradores (2008) demonstraram que a antinocicepção

induzida pelo óxido nitroso (N2O) ocorria na PAG em camundongos que passavam

por teste de constrição abdominal, sugerindo que o N2O atua no PAG através de um

receptor mediado por receptores opióides dependentes de NO para induzir

antinocicepção.

Xing e colaboradores (2012) acharam alta co-localização da angiotensina e

NOS no DLPAG. A angiotensina é considerada um membro biologicamente ativo do

sistema renina-angiotensina, com propriedades vasodilatadoras e anti-proliferativas,

sendo assim foi visto que a angiotensina, desempenha um papel inibitório, através

de uma sinalização dependente de NO, o que pode oferecer uma base fisiológica

para entender a regulação de diversas funções na parte central do sistema nervoso

por parte da NO.

71

Ainda na PAG, Barbaresi e colaboradores (2013) identificaram calbindina em

neurônios NADPHd. A calbidina desempenha um papel na modulação da

excitabilidade neuronal e tem um efeito profundo na amplitude de picos transientes

de cálcio (Ca2+). Esta co-localização foi de 42% a 66%, sendo mais elevada nessa

região do tronco encefálico, o que pode sugerir uma elevada expressão por uma alta

demanda do NO. No nosso trabalho mostramos que na PAG como um todo os

neurônios NOS-IR são expressos em grande quantidade e intensamente corados,

corroborando achados prévios em roedores e humanos (Leigh et al., 1990; Vicent e

Kimura, 1992; Egberongbe et al., 1994; Gotti et al., 2005), e reforçando ainda mais

a intença relação da NO com a PAG nos mamíferos e em especial no mocó.

O locus cerúleos (LC) é um pequeno núcleo em forma de “vírgula” presente

de cada lado na porção superior da ponte, margeando o 4º ventrículo. É o principal

núcleo noradrenérgico do encéfalo e desempenha importantes papeis na parte

central do sistema nervoso como a regulação da excitação, vigília e o controle

autonômico (Samuels e Szabadi, 2008). Agamatina estimula a taxa de disparo dos

neurônios no LC através de um mecanismo dependente da síntese de NO (Ruiz-

Durantez et al., 2002). A agamatina é uma substância que produz inúmeros efeitos

na parte central do sistema nervoso, entre elas, potencializa a analgesia da morfina,

bloqueia o desenvolvimento de tolerância a opiáceos (Kolesnikov et al., 1996;

Aricioglu-Kartal e Uzbay, 1997) e estimula a liberação de hormônio pituitário (Kalra

et al., 1995). Estando NO também presente no LC de mocó, podemos inferir que o

mesmo deve influenciar as ações catecolaminérgicas do LC nesta espécie.

Karolewicz e colaboradores (2004) em pacientes humanos diagnosticados

com depressão visualizou uma baixa concentração de NOS no LC, com isso

refletindo uma transmissão excitatória alterada promovida pelo glutamato,

neurotransmissor este que tem o NO como mediador intracelular da ativação do seu

receptor. Com isso reforçando o argumento que desordens depressivas ocorrem por

interrupções da sinalização glutamatérgica.

NO também está envolvido diretamente em mecanismo patológicos cerebrais.

A cirrose hepática pode progredir para outros órgãos inclusive o sistema nervoso,

causando a encefalopatia hepática (Chen et al., 2007). Ela provoca alterações

motoras incluindo rigidez e tremor, refletindo em distúrbios dopaminérgicos

estriatais. Como a substância negra (SN) é uma importante produtora de dopamina,

72

os pesquisadores observaram que a concentração de NO está correlacionada com a

liberação endógena da dopamina. Então ratos com cirrose hepática apresentaram

uma quantidade reduzida de neurônios NADPHd na SN, seu soma neuronal

encolheu, bem como a quantidade de fibras. Reforçando o papel de NO na SN.

Matthews e colaboradores (1997) examinaram os efeitos da injeção estriatal de 1-

metil-4-fenilpiridinio (MPP+) na degeneração da SN em camundongos “knockout”

para o gene NOS com parkingson induzido por (MPTP). Tanto o volume da lesão

estriatal quanto a degeneração da SN foram significativamente atenuados nos

camundongos mutantes para NOS. L’Episcopo e colaboradores (2010)

demonstraram que um doador de NO, derivado do flurbiprofeno, o [2-Fluoro-a-metil

(1,1'-bifenil) -4-acético-4- (nitrooxi) butil éster], ou HCT1026, quando administrada

oralmente a ratos que apresentaram a doença de Parkinson induzida por MPTP, fez

com que houvesse uma diminuição significativa na expressão de iNOS (NOS

induzida), antígeno-1 do macrófago (Mac-1) e NADPH oxidase (PHOX) em células

microgliais dentro do estriado e do mesencéfalo ventral, diminuindo os efeitos

inflamatórios e neurotóxicos a essas células neuronais e prevenindo o aparecimento

de sintomas motores da doença.

Nosso trabalho mostra que o mocó apresenta neurônios nitrérgicos nos três

núcleos dopaminérgicos mesencefálicos (substância negra, área tegmental ventral e

região retrorubral), e mesmo sem um trabalho de co-localização podemos inferir uma

estreita relação do NO com a dopamina também em mocó. O NO comprovadamente

esta relacionado à modulação da atividade motora e em comportamentos

relacionados a ansiedade. Del Bel e colaboradores (2002) mostraram a redução da

atividade locomotora por inibidores de NOS o NG-nitro-L-arginina (L-NOARG) e o 7-

nitroindazol (7-NIO) em ratos expostos a campo aberto. Corroborando a modulação,

Carletti e colaboradores (2009) com testes em ratos vivos com inibidores e doadores

de NOS, além de testes eletrofisiológicos demonstraram a existência de um sistema

neuromodulatório intrínseco da ação exercida pelo NO em neurônios da parte

reticulada da SN, atraves de uma via de sinalização pelo cGMP.

A área tegmental ventral (VTA) possui neurônios dopaminérgicos que estão

dentro de núcleos como o interfascicular (IF), parabraquial (PBP) e linear rostral da

rafe (RLi). Estes neurônios estão envolvidos na regulação motora, comportamentos

motivacionais, revelam uma elevada plasticidade neuronal, colocalizam com NOS e

73

parecem interagir uns com outros pela presença de terminações NOS em neurônios

TH e vice-versa, com isso sugerindo que o NO está envolvido na modulação de

transmissão dopaminérgica (Klejbor et al., 2004). Em nossos achados, os 3 núcleos

apresentaram uma marcação forte, mostrando neurônios com uma grande produção

de NO apesar de uma densidade moderada, sugerindo sobre uma interação entre

NO e dopamina em mocó.

Com foco no desenvolvimento de terapias que previna ou retarde o

aparecimento de sintomas motores e cognitivos, Balez e Ooi (2015) apresentam um

amplo artigo de revisão, corroborando o papel neuroprotetor do NO protegendo as

sinapses e aumentando a excitabilidade neuronal. E o mecanismo potencial para

esse aumento da excitabilidade por NO é via modulação da atividade dos canais de

potássio dependentes de voltagem.

Volke e colaboradores (1997) mostraram uma clara ação do tipo ansiolítico do

inibidor da NOS (7-NIO) em quatro testes de ansiedades diferentes (campo aberto,

compartimento claro e escuro teste de interação social e labirinto em cruz elevado)

feitos em ratos e camundongos. Navabi e colaboradores (2016) demonstraram que a

administração aguda de cloreto de zinco leva a um comportamento ansiolítico com

uma possível via do NO, através da administração da L-arginina, um precursor do

NO, em ratos expostos a paradigmas de ansiedade, demonstrando o quão

importante é o envolvimento de NO nesses comportamentos, assim também deve

ser no mocó.

Os núcleos tegmental laterodorsal (LDT) e tegmental pedunculopontino (PPT)

apresentaram neurônios NOS-IR em mocó. Estes são núcleos classicamente

colinérgicos e em ratos há uma co-localização de aproximadamente 100% entre

ChAT, enzima de síntese de acetilcolina, e NOS (Veleanu et al., 2016). Estes

núcleos são componentes de suma importância para o sistema ativador reticular

ascendente (Moruzzi e Magoun, 1949), e apesar de não sabermos se em mocó há

co-localização entre NOS e ChAT, podemos pressupor um papel de NOS no

controle da ativação cortical também em mocó.

O papel regulatório do NO aparece ainda em outros núcleos do tronco

encefálico. Beltrán e colaboradores (1999) mostraram que neurônios nitrérgicos no

núcleo motor dorsal do vago inibem a liberação de ácido gástrico no estômago de

ratos, o que pode indicar ser esse mecanismo o responsável por alguns distúrbios

74

de secreção gástrica. No trabalho atual vimos alguns neurônios NOS-IR neste

núcleo, o que ainda assim pode indicar um papel de NO na secreção gástrica do

mocó.

75

6. CONCLUSÃO

Nossos achados sobre a distribuição de NOS no tronco encefálico de mocó

monstraram uma grande semelhança com os achados em outros mamíferos,

principalmente outros roedores. Através da imunistoquímica contra NOS vimos uma

grande distribuição de neurônios nitrérgicos por todas as estruturas que compõe o

tronco encefálico. Tal distribuição foi mais branda quando utilizamos a NADPHd,

demonstrando que a técnica de NADPHd utilizada aqui não é confiável para o

mapeamento de neurônios nitrérgicos em mocó, mas ao mesmo tempo revela a

atividade da enzima de síntese.

Esta semelhança entre a distribuição de NOS no mocó e outros mamíferos

mostra que a neuroanatomia do NO é filogeneticamente bem conservada e assim

também devem ser suas funções, não excluindo aqui a recomendação que mais

estudos, que estejam ligados ao comportamento devem ser realizados. Portanto,

acreditamos que no mocó NO tem um papel fundamental em diversas funções vitais

realizadas pelo tronco encefálico.

76

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