UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS

DE TOURS

ÉCOLE DOCTORALE SSBCV

UMR INSERM U930 Equipe 2

THÈSE présentée par : Julie Tastet

soutenue le : 26 juin 2012

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais

Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie et de la Santé

Etude des gènes LIMK2 et RNF135, impliqués dans les mécanismes moléculaires

de la neurofibromatose de type 1, dans l'autisme et la déficience mentale

THÈSE dirigée par :

M. ANDRES Christian PU-PH, Université François-Rabelais, Tours Mme BENEDETTI Hélène CR CNRS, Centre de Biophysique Moléculaire, Orléans

RAPPORTEURS : M. BARNIER Jean-Vianney DR CNRS, Centre de neuroscience Paris Sud M. STURTZ Franck PU-PH, Université de Limoges

JURY : M. BARNIER Jean-Vianney DR CNRS, Centre de neuroscience Paris Sud M. STURTZ Franck PU-PH, Université de Limoges Mme TOUTAIN Annick PU-PH, Université François-Rabelais, Tours M HANAUER André MCU-PH, Institut de la génétique et de la biologie moléculaire et cellulaire, Strasbourg M. ANDRES Christian PU-PH, Université François-Rabelais, Tours Mme BENEDETTI Hélène CR CNRS, Centre de Biophysique Moléculaire, Orléans M. VOURC’H Patrick MCU-PH, Université François-Rabelais, Tours (membre invité)

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Remerciements

Je tiens à exprimer tout d’abord mes remerciements aux membres du jury, qui ont accepté

d’évaluer mon travail de thèse.

Merci au Docteur Jean-Vianney Barnier, du Centre de Neuroscience Paris Sud, et au

Professeur Franck Sturtz, de l’Université de Limoges, d’avoir accepté d’être les rapporteurs

de ce manuscrit.

Merci également au Docteur André Hanauer de l’IGBMC de Strasbourg et au Professeur

Annick Toutain, de l’Université de Tours pour avoir accepté d’examiner mon mémoire et de

faire partie de mon jury de thèse.

Merci au Professeur Christian Andres, pour avoir accepté de diriger cette thèse et dont les

conseils m’ont aidé à avancer.

Merci au Docteur Hélène Bénédetti pour avoir dirigé ma thèse et accueillie chaleureusement

dans son laboratoire. Je tiens également à te remercier pour tes conseils et nos discussions qui

m’ont vraiment permis de mener à bien cette thèse.

Merci également au Professeur Denis Guilloteau, directeur de l’unité INSERM 930, pour

m’avoir accueillie dans son Unité.

Je voudrais ensuite remercier tous les membres du laboratoire Signalisation cellulaire et

Neurofibromatose du Centre de Biophysique Moléculaire : Fabienne, Béatrice, Séverine,

Michel, Laetitia, Ludivine et Thibault pour leur gentillesse, leur accueil et leur disponibilité.

Ainsi que tous les membres de l’équipe 2 de l’Unité UMRU930. J’avais un peu peur de

changer de laboratoire après mon Master 2 mais mes craintes se sont vite envolées quand je

suis arrivée dans l’équipe. Grâce à vous, ces trois années (enfin presque quatre) ont été aussi

enrichissantes professionellement qu’humainement. Je tiens aussi à remercier les membres du

service de génétique pour leur disponibilité.

Je voudrais commencer par mes colocataires actuels : François, Audrey, Charlotte, Amélie,

Stéphanie, Servane et Hélène. Nos conversations et nos fous rires me manqueront. Hélène, je

n’ai qu’une chose à te dire pour te souhaiter le meilleur : chaussette. Audrey, tache de

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ménager Patrick un peu plus que ce que je n’ai fait. Sans oublier ceux qui les ont précédés :

Julie et Thomas. Je voudrais également faire un clin d’oeil particulier à mes stagiaires :

Clémentine, Laura, Aurore, Maëlle et Marine. Je ne peux oublier de remercier également

Caroline et Loïc pour m’avoir beaucoup aidé lors de cette thèse. Je voudrais aussi faire une

dédicace particulière à Edouard, perdu au milieu des filles du labo.

Merci également à David pour son efficacité et sa bonne humeur.

Je voudrais remercier mes voisins : Frédéric, Cinzia, Sylvie et surtout Patrick pour avoir su

garder son calme pendant mes tempêtes.

Il me faut également remercier :

Fred, pour les échanges formateurs que j’ai eu avec toi, ton soutien et ta disponibilité.

Agathe, ta joie de vivre et tes qualités humaines et professionnelles m’ont beaucoup apportées

au cours de ces années.

Cathy, merci pour tout. Entre carpicornes, on se comprend.

Rose-Anne, je n’aurais pas assez de quelques lignes pour te dire à quel point ta présence et

ton aide m’ont été précieux.

Sylviane, tu as su me montrer la voie. Ta bonne humeur et ton courage m’ont guidé tout au

long de ma thèse.

Patrick, je ne sais comment te remercier pour tout le temps que tu m’as consacré et ta patience

sans faille que j’ai mis à rude épreuve plus d’une fois. J’ai beaucoup appris grâce à toi, par tes

conseils et nos conversations scientifiques et personnelles. J’espère pouvoir retravailler avec

toi dans le futur et transmettre à mon tour les valeurs que tu m’as enseignées.

Je n’oublie pas les membres de mon ancien labo : le formidable N2C. C’est vous qui m’avez

transmis le virus de la recherche et pour cela je vous en suis reconnaissante. Je tiens

particulièrement à exprimer ma gratitude au Professeur Philippe Bougnoux pour m’avoir

permis d’effectuer mes premiers pas dans la recherche ; à Jean-Yves qui m’a guidé tout au

long de mes études et continuera à me guider dans ma vie professionnelle ; à Aurélia, qui a su

me transmettre sa passion pour la recherche, pour sa disponibilité, sa gentillesse et sa grande

pédagogie ; à Alban, pour ses précieux conseils et son soutien tout au long du Master 2 et plus

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particulièrement pendant les moments de doute qui ont été nombreux. Je pense également à

mes collègues de Master 2 : Mimsy, Clément, Olivia, Noémie et Sophie pour les bons

moments qu’on a passés ensemble. Je souhaite également remercier Christophe et Germain du

GICC pour leur bonne humeur et les moments passés à supporter le TVB.

J’aimerais également remercier les enseignants qui m’ont encadré lors du monitorat : Mme

Charles, pour sa rigueur et la qualité de son enseignement ; M. Kalmes pour sa confiance et

son aide ; Mme Renault, pour le temps important consacré à faire de nous des bons

moniteurs ; Franck pour sa bonne humeur, sa disponibilité, ses anecdotes de plongée et le

partage de ses lectures de Fantasy ; Mme Bonin ainsi que tous mes collègues qui ont partagé

les joies et les infortunes inhérentes au statut de novice de l’enseignement.

Ces remerciements seraient incomplets si j’omettais de remercier mes amis qui m’ont

soutenue et m’ont offert des moments de détente sans lesquels j’aurais eu du mal à avancer.

A Kristell, la plus valeureuse des Bushi que je connaisse. Nous avons partagé tant d’aventures

à Rokugan ou à Tours que je ne saurais envisager mon futur sans ton amitié.

A Hélène, la petite soeur de Kristell et qui est devenue une véritable amie malgré sa

sympathie pour le clan du Scorpion. Ton naturel et ta joie de vivre sans faille m’ont souvent

réconfortée et redonné du courage.

A Thomas, mon maître du jeu et cousin des deux soeurs précédentes. Décidément, cette

famille est formidable.

A Mathieu, pour les futurs combats à mener contre les Sbires de l’Inquisition.

A Marie-Amélie, le chevalier au grand coeur. Les soirées passées avec toi sont de très

moments mais malheureusement trop rares.

A Delphine, qui a aussi subi les affres de la thèse, du monitorat et du fabuleux projet de

vulgarisation scientifique, une personne qui mérite que l’on fasse l’effort de la connaître.

A Romain, pour ce qu’on a vécu et pour cette solide amitié qui nous lie.

A Marion, la scribe du groupe et qui n’hésite pas à se sacrifier pour nous sauver.

A Anselme, mon érudit préféré. Ton calme et ton humour font de toi un vrai sage.

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A Anthony, qui est devenu un véritable ami au cours de ces trois années. Je te souhaite tout le

bonheur du monde avec Cécile et Swiffer.

A Jean-Michel, qui est bien plus qu’un ami pour moi. Tu n’imagines pas à quel point ta

présence m’a réconfortée dans les moments difficiles. Merci pour les longues discussions

scientifiques que l’on a eu ensemble et pour toutes ces sorties.

Pour finir, je souhaite tirer mon chapeau à toute ma famille qui m’a soutenue et supportée

sans broncher tout au long de mes études et plus particulièrement au cours de ces trois

dernières années.

A toute ma belle famille qui m’a accueillie les bras ouverts.

A ma marraine, mon guide depuis toujours. Chaque moment passé avec toi est un moment

important de ma vie.

A mon frère que j’aime. Je ne te vois pas souvent mais tu es là quand j’ai besoin de toi.

A Marion et Vincent, les plus adorables des neuveux et filleule. Ne croyez pas échapper à mes

câlins en grandissant.

A mes parents. Comment vous dire à quel point je vous aime et à quel point vous comptez

pour moi. C’est grâce à vous que je peux réaliser mes rêves. Vous m’avez toujours soutenue,

vous êtes des parents formidables. J’espère que je pourrais transmettre à mes enfants l’amour

et les valeurs que vous m’avez donnés.

A mon mari. Les mots me manquent pour te dire à quel point tu comptes pour moi. Ton

amour indéfectible me permet de surmonter n’importe quelle épreuve. L’idée de fonder une

famille et de veillir à tes côtés suffisent à me combler de bonheur.

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Résumé

L'autisme et la déficience mentale (DM) sont des pathologies neurodéveloppementales

fréquentes qui partagent des facteurs génétiques communs. Afin de mieux comprendre leur

étiologie, nous avons étudié les mécanismes moléculaires de la neurofibromatose de type 1

(NF1), qui est souvent associée à l'autisme et à la DM.

La neurofibromine, dont le gène est muté dans la NF1, interagit avec LIMK2. Cette

protéine fait partie de la voie des Rho-GTPases dont plusieurs membres ont été trouvés mutés

dans des cas de DM. Chez le rat, nous avons montré que l’expression de Limk2d, une

isoforme sans domaine kinase, augmente la croissance des neurites des cellules neuronales

NSC-34. Chez l'homme, LIMK2-1 est la seule isoforme qui comporte un domaine inhibiteur

de la phosphatase 1 (PP1i). Nous avons montré que l’expression de cette protéine diminue la

longueur des neurites des cellules NSC-34 in vitro. Nous avons observé qu'une variation

située dans le domaine PP1i était associée à la DM (p.S668P, rs151191437) (p=0,04, test de

Fisher, OR = 3,29). Elle abolit l’effet inhibiteur de croissance des neurites de l'isoforme

LIMK2-1 et diminue l'interaction de LIMK2-1 avec la neurofibromine.

La fréquence de l'autisme est plus élevée chez les patients ayant des délétions de 14

gènes du locus du gène NF1. Nous avons observé une association entre la variation R115K

(rs111902263) du gène RNF135 de ce locus et l'autisme (p=0,00014, test de Fisher) ainsi

qu’une anomalie du nombre de copies (CNV) dans l'intron 2 de ce gène chez un patient

autiste.

Ce travail souligne la spécificité de deux isoformes de LIMK2 sur la croissance des

neurites. Il renforce l’intérêt d’étudier l’implication du gène RNF135 dans l’autisme. Des

études fonctionnelles seront entreprises afin de confirmer le rôle de LIMK2 et de RNF135

dans l'étiologie de l'autisme et de la DM.

Mots clés : autisme, déficience mentale, neurofibromatose de type 1, LIMK2, isoformes,

neuritogenèse, RNF135

7

Résumé en anglais

Autism and mental deficiency (MD) are two neurodevelopemental diseases which

share genetic factors in common. To better understand their etiologies, we studied the

molecular mechanisms of neurofibromatosis type 1, a pathology frequently associated with

autism and MD.

Neurofibromatosis type 1 is due to deletions or mutations of the NF1 gene which

encodes neurofibromin. This protein interacts with several proteins such as LIMK2. This

protein belongs to the Rho-GTPases pathway in which mutations of numerous members have

been associated with autism and MD. In our study, we showed that LIMK2 isoforms do not

only have important structural differencies but have also functional specificities. Limk2d,

which lacks the kinase domain, promotes neurite outgrowth of NSC-34 cells. On the contrary,

LIMK2-1, which is primate specific and has a C-terminal PP1i domain, inhibits neurite

outgrowth. Analysis of the LIMK2-1 coding sequence, revealed the association between MD

and a variation located in the PP1i domain, S668P (rs151191437) (p=0.04, Fisher test, OR =

3.29). This variation abrogated the LIMK2-1 effect on neurite outgrowth and inhibited

LIMK2-1 interaction with neurofibromin.

Deletions occuring in neurofibromatosis type 1 which include the NF1 gene and 13

others are associated with a higher frequency of autism. Mutations of one of them, RNF135,

have been identified in patients with MD and overgrowth syndrome. Two of these patients

also presented autistic features. By analysing RNF135 gene in autistic patients, we showed the

association of the the variation R115K (rs111902263) with autism. We also identified a

duplication of a region located in RNF135 gene intron 2 in one patient presenting autism and

MD.

Our results highlight the importance and specificity of LIMK2 isoforms on neurite

outgrowth and strengthen the importance to analyze both the sequence and copy-number of

RNF135 gene. Further functional experiments will be undertaken to confirm the implication

of LIMK2 and RNF135 in autism and MD etiology.

Key words: autism, mental deficiency, neurofibromatosis type 1, LIMK2, isoforms,

neuritogenesis, RNF135

8

Table des matières

Remerciements ........................................................................................................................... 2

Résumé....................................................................................................................................... 6

Résumé en anglais...................................................................................................................... 7

Table des matières...................................................................................................................... 8

Liste des tableaux ..................................................................................................................... 13

Liste des figures ....................................................................................................................... 14

Liste des annexes...................................................................................................................... 17

Liste des abréviations ............................................................................................................... 18

Introduction .............................................................................................................................. 25

Première partie Autisme et déficience mentale........................................................................ 27

1. Autisme ............................................................................................................................ 28

1.1. Définition ................................................................................................................. 28

1.2. Diagnostic................................................................................................................. 28

2. Déficience mentale........................................................................................................... 33

2.1. Définition ................................................................................................................. 33

2.2. Classification............................................................................................................ 34

2.3. Diagnostic................................................................................................................. 34

3. Etiologie de l'autisme et de la déficience mentale............................................................ 35

3.1. Etiologie environnementale...................................................................................... 35

3.2. Etiologie génétique................................................................................................... 36

3.2.1. Anomalies chromosomiques ............................................................................ 36

3.2.2. Maladies monogéniques................................................................................... 38

3.3. Processus cellulaires impliqués dans l'autisme et la DM, implication des voies Rho

et Ras ...................................................................................................................................40

3.3.1. L’actine............................................................................................................. 40

3.3.2. Régulation du cytosquelette d’actine ............................................................... 41

3.3.3. Prolifération et migration neuronales............................................................... 45

3.3.4. Différenciation neuronale................................................................................. 50

3.3.5. Voies de signalisation synaptiques................................................................... 60

Deuxième partie La neurofibromatose de type 1 ..................................................................... 68

1.Définition .............................................................................................................................. 69

2.Diagnostic.............................................................................................................................. 69

9

3.Clinique ................................................................................................................................. 70

3.4. Signes dermatologiques............................................................................................ 70

3.4.1. Taches café-au-lait ........................................................................................... 70

3.4.2. Ephélides intertrigineux ou lentigines.............................................................. 71

3.5. Tumeurs.................................................................................................................... 72

3.5.1. Nodules de Lisch ou hamartomes iriens .......................................................... 72

3.5.2. Gliomes des nerfs optiques .............................................................................. 72

3.5.3. Neurofibromes.................................................................................................. 72

3.5.4. Autres types de tumeurs ................................................................................... 73

3.6. Problèmes osseux ..................................................................................................... 74

3.7. Problèmes neurologiques ......................................................................................... 74

4. Les traitements de la neurofibromatose de type 1............................................................ 76

4.1. Traitements des MPNST .......................................................................................... 76

4.1.1. Les inhibiteurs de Ras ...................................................................................... 77

4.1.2. La rapamycine .................................................................................................. 77

4.1.3. Autres traitements ............................................................................................ 77

4.2. Traitements des troubles cognitifs............................................................................ 78

5. Génétique de la neurofibromatose de type 1.................................................................... 78

5.1. Découverte du gène responsable de la maladie........................................................ 78

5.2. Description du gène.................................................................................................. 79

5.2.1. La région 17q11.2 ............................................................................................ 79

5.2.2. Le gène NF1..................................................................................................... 80

5.3. Mutation du gène NF1.............................................................................................. 80

5.3.1. Mutations retrouvées chez les patients............................................................. 83

5.3.2. Corrélation génotype/phénotype ...................................................................... 83

Troisième partie Neurofibromine et LIMK2............................................................................ 92

1. La neurofibromine............................................................................................................ 93

1.1. Description ............................................................................................................... 93

1.2. Isoformes.................................................................................................................. 94

1.3. Expression au cours du développement ................................................................. 100

1.4. Localisation cellulaire ............................................................................................ 100

1.5. Régulation de l'activité de la neurofibromine ........................................................ 101

1.5.1. Phosphorylation.............................................................................................. 101

1.5.2. Ubiquitinylation ............................................................................................. 101

10

1.6. Fonctions de la neurofibromine.............................................................................. 102

1.6.1. Dans la tumorigenèse ..................................................................................... 102

1.6.2. Dans le système nerveux central .................................................................... 105

2. Lim kinase 2 ................................................................................................................... 108

2.1. Description du gène................................................................................................ 108

2.1.1. Localisation .................................................................................................... 108

2.1.2. Carte physique du gène .................................................................................. 108

2.2. Description de la protéine ...................................................................................... 109

2.3. Expression .............................................................................................................. 109

2.4. Régulation de LIMK2 ............................................................................................ 110

2.4.1. Régulation de l’expression ............................................................................. 110

2.4.2. Régulation de l’activité .................................................................................. 111

2.4.3. Ubiquitinylation ............................................................................................. 113

2.4.4. Régulation de la localisation subcellulaire..................................................... 113

2.5. Fonctions ................................................................................................................ 114

2.5.1. Phosphorylation de l'ADF/cofiline................................................................. 114

2.5.2. Formation des fibres de stress ........................................................................119

2.5.3. Rôle de LIMK2 dans la tumorigenèse............................................................ 120

2.5.4. Rôle de LIMK2 dans le système nerveux central .......................................... 126

Objectifs ................................................................................................................................. 134

Matériel et méthodes .............................................................................................................. 137

1. Analyse in silico des isoformes de LIMK2.................................................................... 138

1.1. Identification des isoformes ................................................................................... 138

1.2. Analyse phylogénétique ......................................................................................... 138

1.2.1. Algorithmes de phylogenèse .......................................................................... 138

1.2.2. Obtention de l'arbre phylogénétique de LIMK2 ............................................ 139

1.3. Calcul du pourcentage de conservation de chaque acide aminé des isoformes ..... 141

2. Tissus et cultures cellulaires........................................................................................... 141

2.1. Tissus cérébraux de rat adulte ................................................................................ 141

2.2. Cultures cellulaires................................................................................................. 142

2.2.1. Cellules souches neurales............................................................................... 142

2.2.2. Neurones d’hippocampes d’embryons de rats ............................................... 143

2.2.3. Cellules NIH/3T3, HeLa, SH-SY5Y et HEK................................................. 143

2.2.4. Cellules NSC-34............................................................................................. 144

11

2.2.5. Cellules de lignées lymphoblastoïdes de patients atteints d'autisme.............. 144

3. RT-PCR quantitative...................................................................................................... 145

3.1. Extraction des ARN totaux .................................................................................... 145

3.2. Traitement à la Dnase I et transcription inverse..................................................... 145

3.3. PCR quantitative .................................................................................................... 146

3.3.1. Principe et méthode........................................................................................ 146

3.3.2. Interprétation des résultats ............................................................................. 146

3.4. PCR semi-quantitative............................................................................................ 149

4. RT-PCR de l'isoforme LIMK2-1 humaine..................................................................... 150

4.1. Traitement à la DNase I et RT ............................................................................... 150

4.2. PCR ........................................................................................................................ 150

5. Clonage des isoformes de LIMK2 ................................................................................. 151

5.1. Clonage de l'isoforme Limk2d de rat ..................................................................... 151

5.2. Clonage des isoformes humaines ........................................................................... 152

5.2.1. Isoforme LIMK2-1......................................................................................... 152

5.2.2. Isoforme LIMK2b .......................................................................................... 152

6. Clonage du domaine SecPH de la neurofibromine ........................................................ 153

7. Transfection des cellules ................................................................................................ 153

8. Mesure de la phosphorylation de la cofiline par western blot........................................ 154

8.1. Lyse des cellules..................................................................................................... 154

8.2. Dosage des protéines.............................................................................................. 155

8.3. Migration et transfert des protéines........................................................................ 155

8.4. Immunomarquage................................................................................................... 155

8.5. Quantification de l'expression des protéines ..........................................................156

9. Analyse de l'interaction de la protéine GFP-LIMK2d avec l'actine et de LIMK2-1 avec le

domaine SecPH ...................................................................................................................... 157

9.1. Lyse des cellules..................................................................................................... 157

9.2. Immunoprécipitation .............................................................................................. 157

9.3. Migration et transfert des protéines........................................................................ 158

9.4. Immunomarquage................................................................................................... 158

10. Etude de l'expression protéique de LIMK2d.............................................................. 158

10.1. Immunoprécipitation .............................................................................................. 158

10.2. Western blot ........................................................................................................... 159

11. Immunocytochimie..................................................................................................... 159

12

12. Mesure de la longueur des neurites ............................................................................ 160

13. Analyse des gènes RNF135 et LIMK2 ...................................................................... 160

13.1. Populations étudiées............................................................................................... 160

13.2. Analyse par HRM................................................................................................... 161

13.2.1. Principe........................................................................................................... 161

13.2.2. Méthode.......................................................................................................... 162

13.3. Analyse par séquençage ......................................................................................... 164

13.4. Mesure du nombre de copie du gène RNF135....................................................... 166

Résultats ................................................................................................................................. 167

1. Etude de LIMK2............................................................................................................. 168

1.1. Etude phylogénétique de LIMK2........................................................................... 168

1.2. Etude des isoformes de LIMK2 ............................................................................. 172

1.2.1. Etude des isoformes LIMK2a, b, c et d.......................................................... 175

1.2.2. Etude de l'isoforme LIMK2-1 humaine ......................................................... 183

2. Recherche de mutations et de variations du nombre de copies du gène RNF135 dans

l'autisme et la déficience mentale........................................................................................... 191

Discussion .............................................................................................................................. 207

1. Etude des isoformes LIMK2a, b, c et d.......................................................................... 209

2. Etude de l'isoforme LIMK2-1 humaine ......................................................................... 213

3. Recherche de mutations et de variations du nombre de copies du gène RNF135 dans

l'autisme et la déficience mentale........................................................................................... 219

Conclusion.............................................................................................................................. 223

Annexes.................................................................................................................................. 269

13

Liste des tableaux

Tableau I : Facteurs environnementaux in utero de l’autisme et de la DM............................. 35

Tableau II : Principales caractéristiques et prévalence des maladies monogéniques associées à

l’autisme et à la DM. ................................................................................................................ 38

Tableau III : Effets des sémaphorines, slits, éphrines et nétrines sur le cône de croissance lors

du guidage axonal..................................................................................................................... 55

Tableau V : Localisation de LIMK1 et LIMK2 au cours du cycle cellulaire ........................ 122

Tableau VI : Variations identifiées chez les patients atteints de DM de notre cohorte. ........ 185

Tableau VII : Expression relative de différents transcrits de la neurofibromine dans des tissus

adultes humains. ..................................................................................................................... 274

Tableau VIII : Expression des isoformes 9br, 10a-2, de type I, de type II et 48a de la

neurofibromine. ...................................................................................................................... 275

14

Liste des figures

Figure 1 : Localisation des CNV associés à la DM.................................................................. 37

Figure 2 : Localisation des CNV associés à l’autisme d’après Marshall et al., 2008. ............. 38

Figure 3 : Les différents modes de nucléation de l’actine par les protéines ADF/cofiline,

Apr2/3, formines et spir ........................................................................................................... 43

Figure 4 : Voies de signalisation activées par Rac1 (A), Cdc42 (B) et Rho (C)...................... 45

Figure 5 : Migration des cellules souches neurales embryonnaires ......................................... 47

Figure 6 : Structures d’actine présentes dans le cône de croissance ........................................ 51

Figure 7 : Régulation de la formation et de la croissance des neurites par le facteur de

croissance des nerfs (NGF). ..................................................................................................... 53

Figure 8 : Morphologie des épines dendritiques ...................................................................... 60

Figure 9 : Principales voies de signalisation impliquées dans la morphologie et le

fonctionnement des synapses ................................................................................................... 62

Figure 10 : Protéines présentes au niveau des zones pré et post-synaptiques.......................... 63

Figure 11 : Schéma des mécanismes d'ubiquitinylation .......................................................... 67

Figure 12 : Taches café-au-lait (A), lentigines axillaires (B), nodules de Lish (C) ................. 71

Figure 13 : Neurofibromes sous-cutanés (A), cutanés (B) et plexiformes (C) ........................ 73

Figure 14 : Schéma de la région chromosomique située entre les 2 sites de recombinaison

NF1-REP-a et NF1-REP-c ....................................................................................................... 80

Figure 15 : Schéma du gène NF1 et des gènes situés dans l’exon 27b de ce gène .................. 80

Figure 16 : Mécanisme d’une recombinaison homologue non allélique (NAHR) .................. 82

Figure 17 : Transcrits alternatifs de RNF135 prédits dans les bases de données Ensembl,

NCBI et Uniprot ....................................................................................................................... 86

Figure 18 : Isoformes humaines de RNF135 prédites dans les bases de données Ensembl,

NCBI et Uniprot ....................................................................................................................... 87

Figure 19 : Schéma de la plus grande isoforme humaine de la neurofibromine (isoforme 1). 93

Figure 20 : Schéma des isoformes de la neurofibromine étudiées dans la littérature. ............. 99

Figure 21 : Mécanisme de formation des neurofibromes....................................................... 104

Figure 22 : Schéma du gène codant la protéine LIMK2 humaine ......................................... 109

Figure 23 : Schéma des isoformes LIMK2a et LIMK2b humaines. ...................................... 109

Figure 24 : Mode de régulation de la dépolymérisation de l'actine par LIMK2 .................... 114

Figure 25 : Séquences de l’ADF, de la cofiline-1 et de la cofiline-2 humaines..................... 115

15

Figure 26 : Coupe sagittale d’un cerveau de rat..................................................................... 142

Figure 27 : Courbe de fusion des produits obtenus après l'amplification par PCR des transcrits

de la Gapdh............................................................................................................................ 147

Figure 28 : Exemples de courbes d'amplification obtenue lors de la PCR quantitative du

transcrit de la Gapdh pour deux échantillons......................................................................... 147

Figure 29 : Droite obtenue après amplification de la Gapdh à partir de produits de RT à des

concentrations croissantes ...................................................................................................... 148

Figure 30 : Exemple d'un signal non saturé, quantifiable (A) et d'un signal saturé, non

quantifiable (B). ..................................................................................................................... 156

Figure 31 : Courbes représentant la mesure de l'intensité de fluorescence pendant la phase de

fusion des produits de PCR de plusieurs échantillons............................................................ 162

Figure 32 : Courbes représentant la dérivée de l’intensité de la fluorescence en fonction de la

température lors de la dénaturation de plusieurs échantillons................................................ 164

Figure 33 : Courbes représentant la dérivée de l'intensité de la fluorescence pendant la phase

de dénaturation normalisées par rapport à un échantillon témoin.......................................... 164

Figure 34 : Arbres phylogénétiques représentant l'évolution de la séquence primaire de la

protéine LIMK2...................................................................................................................... 169

Figure 35 : Arbre phylogénétique consensus de LIMK2....................................................... 170

Figure 36 : Conservation de la séquence protéique de LIMK2a............................................ 171

Figure 37 : Conservation des domaines (A), des sites de régulation (B) et des signaux d’export

et de localisation nucléaire dans LIMK2a (C et D)................................................................ 172

Figure 38 : Isoformes de LIMK2 exprimées chez l'homme (H), le rat (R) et la souris (S).... 174

Figure 39 : Mécanisme d'épissage permettant la production de LIMK2c et LIMK2e chez

l'homme (H), le rat (R) et la souris (S)................................................................................... 175

Figure 40 : Mécanisme d'épissage alternatif permettant la formation de l'isoforme LIMK2d

chez le rat (R) et l’homme (H). .............................................................................................. 175

Figure 41 : Expression de LIMK2-1 dans les cellules des lignées cellulaires SH-SY5Y et

HeLa ....................................................................................................................................... 184

Figure 42 : Conservation du domaine PP1i de LIMK2 chez les primates ............................. 186

Figure 43 : Conservation de la sérine 668 de LIMK2-1 humain chez les homologues de PHI-1

................................................................................................................................................ 187

Figure 44 : Modélisation du domaine PP1i de LIMK2-1 natif (A) et comportant la variation

p.S668P (B) ............................................................................................................................ 187

16

Figure 45 : Effet de l’expression de LIMK2b, LIMK2-1 et de LIMK2-1 S668P sur la longueur

du plus grande neurite des cellules NSC-34........................................................................... 189

Figure 46 : Effet de l'expression de LIMK2b, LIMK2-1 et de LIMK2-1 S668P sur la

neuritogenèse des cellules NSC-34........................................................................................ 189

Figure 47 : Interaction entre le domaine SecPH de la neurofibromine couplé à flag et les

protéines de fusion HA-LIMK2-1 et HA-LIMK2-1 S668P................................................... 190

Figure 48 : Expression du transcrit 1 de RNF135 dans le cortex frontal (FC), le cervelet

(CEB), le cortex temporal (TC), le foie, le coeur et les reins de souris adultes. .................... 193

Figure 49 : Schéma du mécanisme potentiel de régulation de la croissance des neurites par

LIMK2b et LIMK2d............................................................................................................... 213

Figure 50 : Mécanisme proposé pour la régulation de la croissance des neurites par LIMK2-1.

................................................................................................................................................ 217

Figure 51 : Exemple de dessins montré au patient lors du test du jugement de l’orientation de

la ligne. ................................................................................................................................... 270

Figure 52 : Exemple de dispositif utilisé lors du test de finger tapping................................. 270

Figure 53 : Exemple de la première partie (A) et de la deuxième partie (B) du test des tracés.

................................................................................................................................................ 271

Figure 54 : Dispositif utilisé lors du test du grooved pegboard. ............................................ 271

Figure 55 : Schéma des isoformes de la neurofibromine répertoriées par l’étude de

Vandenbroucke et ses collaborateurs ..................................................................................... 274

Figure 56 : Courbes de fusion des produits de PCR obtenus avec les amorces gapdh. ......... 279

Figure 57 : Courbes de fusion des produits de PCR obtenus avec les amorces limk2a. ........ 279

Figure 58 : Courbes de fusion des produits de PCR obtenus avec les amorces limk2d. ........ 279

Figure 59 : Courbes de fusion des produits de PCR obtenus avec les amorces RNF135. ..... 280

Figure 60 : Courbe d'efficacité des amorces amplifiant le transcrit de la Gapdh à partir d'ARN

extraits de cortex frontal de rat adulte. ................................................................................... 280

Figure 61 : Courbe d'efficacité des amorces amplifiant le transcrit de l'isoforme Limk2a à

partir d'ARN extraits de cortex frontal de rat adulte. ............................................................. 280

Figure 62 : Courbe d'efficacité des amorces amplifiant le transcrit de l'isoforme Limk2d à

partir d'ARN extraits de cortex frontal de rat adulte. ............................................................. 281

17

Liste des annexes

Annexe 1 : Tests neuropsychologiques.................................................................................. 270

Annexe 2 : Expression des isoformes de la neurofibromine.................................................. 273

Annexe 3 : Caractéristiques des amorces utilisées pour l'étude des isoformes de LIMK2 de rat

et de l'expression de RNF135................................................................................................. 278

Annexe 4 : Courbes de fusion des produits obtenus par RT-PCR quantitative ..................... 279

Annexe 5 : Courbes des efficacités des amorces utilisées en PCR quantitative .................... 280

Annexe 6 : Caractéristiques des amorces utlisées pour l'étude des isoformes humaines de

LIMK2.................................................................................................................................... 281

Annexe 7 : Carte du plasmide pcDNA6.2/N-EmGFP-GW/TOPO fourni par Invitrogen

................................................................................................................................................ 282

Annexe 8 : Carte du plasmide pcDNA3................................................................................. 282

Annexe 9 : Caractéristiques des amorces utilisées pour l'étude du gène RNF135................. 283

Annexe 10 : Caractéristiques des amorces utlisées pour l'étude du gène LIMK2 .................. 283

Annexe 11 : Séquences des exons du gène NF1 humain ....................................................... 285

Annexe 12 : Classification des espèces inclues lors de l’analyse phylogénétique de LIMK2

................................................................................................................................................ 291

18

Liste des abréviations

ADF : Actin Depolymerization Factor

ADHD : Attention Deficit Hyperactivity Disorder

ADI-R : Autism Diagnostic Interview Revised

ADOS : Autism Diagnostic Observation Schedule

ADP : Adénosine Di-Phosphate

AEP : Aire entopédonculaire

AMPA : Acide alpha-amino-3-hydroxy-5-méthylisoxazole-4-propionique

AMPc : Adénosine Monophosphate Cyclique

Arp2/3 : Actin-Related Protein 2/3

ATAD5 : ATPase family AAA domain-containing protein 5

ATCC : American Type Culture Collection

ATP : Adénosine Tri-Phosphate

Bcl-2 : B-cell lymphoma 2

BDNF : Brain-Derived Neurotrophic Factor

bFGF : Basique Fibroblast Growth Factor

BI : Bayesian Inference

BMPRII : Bone Morphogenic Protein Receptor de type 2

BRCA1 : Breast cancer type 1 susceptibility protein

CAMK : Calcium/calmodulin-dependent protein kinase

bFGF : Basic Fibroblast Growth Factor

CASK : Calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase

CARS : Childhood Autism Rating Scale

Cdc42 : Cell Division Control protein 42 homolog

CELF : CUGBP Elav-like family

CFTMEA-R-2000 : Classification française des troubles mentaux de l’enfant et de l’adolescent révisée en 2000

19

CGNL1 : Cinguline 1

CNV : Copy Number Variant

CPG15 : GPI-linked candidate plasticity gene 15

CPI-17 : Protein kinase C-potentiated inhibitor protein of 17 kDa

CREB : Cyclic AMP-responsive element-binding protein

CREBBP : CREB Binding protein

CRMP2 : Collapsin response mediator protein 2

CS : Cellules de Schwann

CSRD : Cystein/serin rich domain

CTD : C-terminal domain

CUGBP : CUG binding protein

CYFIP1 : Cytoplasmic FMR1-interacting protein 1

DCC : Deleted in Colorectal Cancer

DM : Déficience mentale

Dia : Diaphanous

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DOPA : Dihydroxyphénylalanine

DSM-IV-TR : Diagnostic and Statistical Manual of mental disorders, forth edition text revision

Dvl-1 : Dishevelled-1

EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétraacétique

EGF : Epidermal Growth Factor

EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor

Ena/VASP : Protein enabled homolog/Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein

Erk : Extracellular signal-Regulated Kinase

EVI2A : Ecotropic Viral Integration site 2A protein homolog

EVI2B : Ecotropic viral Integration site 2B protein homolog

FAK : Focal Adhesion Kinase

20

FGF : Fibroblast Growth Factor

FMR1 : Fragile X Mental Retardation 1

FRAG1 : FGF Receptor Activating protein 1

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer

GABA : Acide γ-aminobutyrique

GAP : GTPase Activating Protein

GAPDH : Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

GBD : Bpb Binding Domain

GDI : Rho GDP-Dissociation Inhibitor

GDP : Guanosine Di-Phosphate

GEF : Guanine Exchange Factor

GFP : Green Fluorescent Protein

GRD : GAP-Related Domain

GSK3β : Glycogen Synthase Kinase-3 beta

GTP : Guanosine Tri-Phosphate

HRM : High Resolution Melting

Hsp90 : Heat Shock protein

ICD-10 : International Classification of Diseases, tenth revision

IGF-1 : Insulin Growth Factor 1

IL1RAPL : Interleukin-1-receptor accessory protein like 1

IP : Immunoprécipitation

IRA1 : Inhibitory Regulator protein 1

IRSp53 : Insulin Receptor Substrate p53

JAK : Janus kinase

KALRN : Kalirin

LCR : Low-repeat-copy

LGE : Eminence latérale ganglionnaire

21

LIM : Linl1, Isl1, Mec-3

LIMK : Lim kinase

Lis1 : Protéine Lissencephaly-1

LPA : Acide lysophsosphatidique

LRRC37B : Leucin Rich Repeat Containing Ortein 37B

LTD : Long Term Depression

LTP : Long Term Potentiation

MAF : Major Allele Frequency

MAP2 : Microtubule-Associated Protein 2

Mb : Méga-base

MECP2 : Methyl CpG binding protein 2

MGE : Eminence ganglionnaire médiane

ML : Maximum likelyhood

MLC : Myosin regulatory Light Chain

MLCP : Myosin Light Chain Phosphatase

NMDA : Acide N-méthyl-D-Aspartique

MP : Maximum Parcimony

MPNST : Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

MRCKα : Myotonic dystrophy kinase Related Cdc42-binding Kinase α

mTOR : Mammalian Target Of Rapamycine

MZF-1 : Myeloid zinc finger 1

NAHR : Non Allelic Homologous Recombination

NCAM : Neural Cell Adhesion Molecule

ND : Non Déterminé

NeuroD : Neurogenic Differentiation factor

NF1 : Neurofibromatose de type 1

NGF : Nerve Growth Factor

22

NJ : Neighbor-Joining

NOGO : Neurite outgrowth inhibitor

NRP2 : Neuropilin-2

NSC : Neural Stem Cell

N-WASP : Neural-Wiskott-Aldrich Syndrome Protein

OMGP : Oligodendrocyte-Myeline Glycoprotein

OP-1 : Osteogenic Protein 1

PACAP : Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide

PAK1 : p21-Activated Kinase 1

PARK2 : Parkinson protein 2

PBS : Phosphate Buffered Saline

PDGF : Platelet-Derived Growth Factor

PDZ : PSD-95, DigA, ZO-1

PHI-1 : Phosphatase Holoenzyme Inhibitor 1

PIP2 : Phosphatidylinositol 4,5-phosphate

PIP5K : Phosphatidylinositol 5-phosphate kinase

PI3K : Phosphatidylinositol 3 kinase

PlGF : Placenta Growth Factor

PLXDC2 : Plexin Domain Containing 2

PNBM : Primary Neuron Basal Medium

PREX-1 : Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 1 protein

Porf-2 : Preoptic Regulatory Factor 2

PP1 : Phosphatase 1

PP1i : Inhibiteur de la phosphatase 1

pRB : Retinoblastoma-associated protein

PTEN : Phosphatase and Tensin homolog

PVDF : Polyvinylidène di-fuoride

23

QI : Quotient intellectuel

Rac : Ras-related C3 botulinum toxin substrate

RAI1 : Retinoic Acid Induced gene 1

RAN : Rapid automatized naming

Rap1B : Ras-related protein

RFWD2 : RING finger and WD repeat domain protein 2

RING : Really Interesting New Gene

RGMA : Repulsive Guidance Molecule A

Rho : Ras homolog

RNF135 : Ring finger protein 135

Robo : Roundabout

ROCK : Rho associated kinase

RPMI : Roswell Park Memorial Institute

SDF1 : Stromal cell-Derived Factor 1

SecPH : Sec14 Pleckstrin Homology

Smurf1 : SMAD Ubiquitination Regulatory Factor 1

SNC : Système Nerveux Central

SPRED1 : Sprouty-related, EVH1 domain containing 1

srGAP3 : SLIT-ROBO Rho GTPase-activating protein 3

STAT : Signal Transducer and Activator of Transcription

SUZ12 : Suppressor of Zeste 12 protein homolog

SVF : Sérum de Veau Foetal

TBST : Tris-Buffered Saline Tween-20

TED : Troubles Envahissants du Développement

TEFM : Transcription Elongator Factor Mitochondrial

TIA-1 : T-cell-restricted Intracellular Antigen-1

Tiam-1 : T-lymphoma Invasion And Metastasis-inducing protein 1

24

TIAR : TIA-1-Related protein

TNF : Tumor Necrosis Factor

TrkA : Récepteur Tyrosine Kinase A

TRPC : Transient Receptor Protein 1

Tsc1 et 2 : Tuberous Sclerosis proteins

UBO : Unidentified Bright Objects

UTP6 : U3 small nucleolar RNA-associated protein 6 homolog

VABS-II : Vineland Adaptive Behavior Scales, Second Edition

VEGF : Vascular endothelial growth factor

VMI : Beery developmental test of Visual Motor Integration

WAIS : Wechsler Intelligence Scale for adult

WASP : Wiskott-Aldrich syndrome protein homolog

WAVE : WASP family verprolin-homologous protein

WB : Western blot

WIP : WASP-Interacting Protein

WISC : Wechsler Intelligence Scale for children

WPPSI : Wechsler Preschool and Primary Scale of Intelligence

25

Introduction

26

L'autisme et la déficience mentale (DM) sont des pathologies fréquentes du

développement du système nerveux central qui touchent respectivement 0,6 % et 2 % de la

population. L'autisme est caractérisé par des troubles des interactions sociales, de la

communication et des comportements répétitifs et des intérêts restreints. La DM est définie

par un quotient intellectuel inférieur à 70. Ces deux pathologies sont très souvent associées et

pourraient avoir une étiologie commune (Volkmar et al., 2003). Malgré de nombreuses

études, leur physiopathologie reste bien souvent inconnue. La neurofibromatose de type 1

(NF1) compte parmi les pathologies les plus fréquemment associées à l'autisme (Gillberg et

Forsell, 1984 ; Lenoir, 1989). L’incidence de la déficience mentale chez les patients atteints

de neurofibromatose de type 1 est le double de celle rencontrée dans la population générale

(North et al., 1997). Le gène impliqué dans cette maladie est le gène NF1. De nombreuses

mutations de ce gène ont été identifiées. Cependant, aucune corrélation génotype/phénotype

n’a pu être établie tant sur le risque de tumorigenèse que sur la présence et la sévérité des

troubles cognitifs. La neurofibromine, codée par ce gène, interagit avec de nombreuses

protéines qui pourraient réguler son activité et participer à la diversité des symptômes

observés. Parmi ces protéines, la protéine Lim kinase 2 nous a paru un bon candidat pour

expliquer l’augmentation de la fréquence de l’autisme et de la déficience mentale chez les

patients atteints de NF1. En effet, cette protéine est une sérine/thréonine kinase qui régule la

polymérisation de l’actine, protéine particulièrement exprimée dans les neurones. LIMK2 fait

également partie de la voie des Rho-GTPases dont des mutations de plusieurs membres ont

été associées à l’autisme et à la DM.

L’introduction de ce manuscrit est composée de trois parties :

- La première décrit les symptômes, la prévalence et les outils permettant de

diagnostiquer l’autisme et la DM ainsi que leur étiologie environnementale et

génétique.

- La deuxième s’intéresse aux symptômes de la neurofibromatose de type 1 ainsi

qu’à son étiologie génétique.

- La troisième est consacrée aux fonctions de la neurofibromine et de LIMK2

principalement au niveau du système nerveux central.

27

Première partie

Autisme et déficience mentale

28

1. Autisme

1.1. Définition

Selon la quatrième édition du manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux

(DSM-IV-TR ; APA, 2000), la 10ème édition de la classification internationale des maladies

(ICD-10 ; WHO, 1992) et la Classification française des troubles mentaux de l’enfant et de

l’adolescent révisée en 2000 (CFTMEA-R-2000), l'autisme fait partie des troubles

envahissants du développement (TED). Ces troubles regroupent l'autisme de Kanner, le

syndrome de Rett, le syndrome d'Asperger, les troubles désintégratifs de l'enfance et les

troubles envahissants du développement non spécifiés. Le terme autisme peut désigner soit

l'autisme de Kanner, soit les troubles du spectre autistique qui comprennent les troubles

envahissants du développement à l'exception du syndrome de Rett. Les symptômes des

troubles du spectre autistique sont variables mais sont caractérisés par trois critères communs

qui apparaissent avant l'âge de 3 ans : des déficits de communication, des troubles de

l'interaction sociale ainsi que des intérêts restreints et des comportements stéréotypés. Ces

TED sont fréquents et touchent 0,6 % de la population générale dont 0,2 % sont atteints

d'autisme de Kanner (Fombonne, 2009). Parmi ces patients, 70 % présentent également une

DM associée (Fombonne, 2003). L'autisme est majoritairement présent chez les garçons. On

compte 4 garçons atteints pour 1 fille.

1.2. Diagnostic

L'autisme peut être évalué par plusieurs outils diagnostiques. L'échelle d'observation

CARS (Childhood Autism Rating Scale, Schopler et al., 1980) permet de déterminer la

sévérité des symptômes autistiques chez des patients âgés de plus de 24 mois. L'ADOS (Lord

et al., 1989) est également constituée d'une observation interactive avec les patients et détecte

la présence de troubles du spectre autistique chez les patients âgés de plus de 24 mois. L'ADI-

R (Autism Diagnostic Interview revised) est un entretien semi-structuré avec les parents

évaluant la présence des troubles du spectre autistique chez des patients âgés de plus de 18

mois. L'équipe 1 de l'Unité UMR INSERM U930 à Tours a également développé un outil

d'évaluation des comportements autistiques (Behavioral Summarized Evaluation, Barthélémy

29

et al., 1997). La revue concernant les découvertes récentes sur l'autisme, que nous avons

publiée dans Epilepsies, est présentée ci-dessous.

30

31

32

33

2. Déficience mentale

2.1. Définition

Selon la quatrième édition du manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux

(DSM-IV-TR ; APA, 2000) et la 10ème édition de la classification internationale des maladies

(ICD-10 ; WHO, 1992), la déficience mentale (DM) est définie par trois critères :

- un quotient intellectuel (QI) inférieur à 70, soit deux déviations standards en dessous du QI

de la population générale (moyenne égale à 100 avec un écart-type de 15) ;

- des difficultés d'adaptation touchant au moins deux des domaines suivants : la

communication, les relations sociales, l'autonomie, la sécurité, la santé, les loisirs, l'utilisation

des apprentissages scolaires et le travail ;

- l'apparition avant l'âge de 18 ans

Cette pathologie touche 1 à 3 % de la population générale et plus particulièrement les garçons

(1,2 garçons pour 1 fille) (McLaren et Bryson, 1987 ; Chelly et al., 2006).

34

2.2. Classification

La déficience mentale est classée en quatre catégories en fonction de la valeur du QI :

- DM légère : le QI est compris entre 50 et 69 ce qui correspond à l'âge mental d'un enfant de

9 à 12 ans. Les patients présentent des difficultés d'apprentissage scolaire mais peuvent avoir

un travail à l'âge adulte et de bonnes relations sociales. 85 % des patients déficients mentaux

ont une DM légère (Chiurazzi et Oostra, 2000).

- DM modérée : le QI est compris entre 35 et 49 ce qui équivaut à l'âge mental d'un enfant

âgé de 6 à 9 ans. Les patients ont généralement des retards de développement durant

l'enfance. Ils peuvent acquérir une certaine autonomie et de bonnes relations sociales. Ils

peuvent également travailler à condition de bénéficier d'une aide adéquate. Cette catégorie

regroupe 10 % des patients atteints de DM.

- DM sévère : le QI est compris entre 20 et 34 soit l'équivalent d'un enfant âgé de 3 à 6 ans.

Les patients n'acquièrent que peu d'autonomie et doivent bénéficier d'une aide constante. 4 %

des patients sont atteints de DM sévère.

- DM profonde : le QI est inférieur à 20 ce qui correspond à l'âge mental d'un enfant âgé de

moins de 3 ans. Le patient présente de graves difficultés de communication et de mobilité.

1 % des patients atteints de DM ont une DM profonde.

2.3. Diagnostic

Le QI est généralement évalué par l'échelle de l'intelligence de Wechsler. Elle est

déclinée en trois versions : pour les enfants âgés de 3 à 6 ans (Wechsler Preschool and

Primary Scale of Intelligence, WPPSI), pour les enfants âgés de 6 à 17 ans (Wechsler

Intelligence Scale for Children, WISC) et pour les adultes (Wechsler Adult Intelligence Scale,

WAIS). Le score obtenu à ce test est le résultat de l'évaluation de la compréhension verbale,

de la mémoire de travail, de la perception et de la vitesse de traitement de l'information. Les

informations obtenues permettent de mesurer un QI verbal et un QI de performance. Le test

de Brunet Lezine révisé permet l'évaluation des enfants de moins de 30 mois. Il mesure le

développement moteur et postural, la coordination oculomotrice, le langage et les relations

sociales.

35

Les difficultés d'adaptation peuvent être mesurées par l'échelle de comportements

adaptatifs de Vineland (Vineland Adaptive Behavior Scales, Second Edition, VABS-II). Ce

test évalue les capacités d'adaptation dans les domaines de la communication, la gestion de la

vie quotidienne, la socialisation et la motricité.

3. Etiologie de l'autisme et de la déficience mentale

La variabilité de la sévérité des symptômes, la contribution de nombreux loci, et

l’interaction gènes/environnement, font de l’autisme et de la déficience mentale, deux

pathologies complexes et multifactorielles. Ces deux maladies présentent une forte héritabilité

soulignant l'implication de facteurs génétiques. L’influence de facteurs environnementaux,

notamment in utero, a également été identifiée.

3.1. Etiologie environnementale

L’influence des facteurs environnementaux a lieu principalement in utero entre le

20ème et le 40ème jour après fécondation (Miller et al., 2005 ; Ploeger et al., 2010). Le moment

d’exposition à ces facteurs au cours de la grossesse est déterminant dans la survenue de ces

pathologies. Ces facteurs peuvent être regroupés en 3 catégories : les intoxications, les

facteurs immunologiques et les infections (Tableau I ; Dufour-Rainfray et al., 2011).

L’ischémie cérébrale lors de l’accouchement et la prématurité sont également des facteurs de

risque.

Tableau I : Facteurs environnementaux in utero de l’autisme et de la DM

Pathologie RéférenceAnxiolytique Thalidomide Autisme Stromlandet al., 1994

Acide valproïque AutismeCarbamazépine Autisme et DM

Phénytoïne Autisme et DMAnti-ulcéreux Misoprostol Autisme Bandimet al., 2003

Ashwoodet al., 2006Singh et Rivas, 2004

Autisme et DMFombonne, 2003 Boweret al., 2000

DM Boweret al., 2000

DM Boweret al., 2000

Virus de la rubéole

Cytomégalovirus

Virus de la toxoplasmose

Infections

Facteurs immunologiques

Anomalies de l'immunité maternellePerturbations auto-immune

Autisme

Rodier et al., 1996 Moore et al., 2000

Syndrome de l’alcool foetal Autisme et DMNansonet al., 1992 Aronsonet al., 1997

IntoxicationsAnti-convulsifs

Pathologie RéférenceAnxiolytique Thalidomide Autisme Stromlandet al., 1994

Acide valproïque AutismeCarbamazépine Autisme et DM

Phénytoïne Autisme et DMAnti-ulcéreux Misoprostol Autisme Bandimet al., 2003

Ashwoodet al., 2006Singh et Rivas, 2004

Autisme et DMFombonne, 2003 Boweret al., 2000

DM Boweret al., 2000

DM Boweret al., 2000

Virus de la rubéole

Cytomégalovirus

Virus de la toxoplasmose

Infections

Facteurs immunologiques

Anomalies de l'immunité maternellePerturbations auto-immune

Autisme

Rodier et al., 1996 Moore et al., 2000

Syndrome de l’alcool foetal Autisme et DMNansonet al., 1992 Aronsonet al., 1997

IntoxicationsAnti-convulsifs

36

3.2. Etiologie génétique

L’autisme et la DM sont souvent associés. 70 % des autistes ont une déficience

mentale dont 30 % ont une DM légère ou modérée et 40 % une DM sévère ou profonde

(Fombonne, 2003).

3.2.1. Anomalies chromosomiques

Les anomalies chromosomiques seraient responsables de 5 à 10 % des cas d’autisme

(Vorstman et al., 2006) et de 11 % des cas de DM (Stevenson et al., 2003). Elles regroupent

les anomalies de nombre et les anomalies de structure.

Les anomalies de nombre correspondent à un excès ou à l’absence de chromosomes.

La trisomie 21 dont la prévalence est de 0,12 % est la plus fréquente. Elle est la cause de 8 %

des cas de DM (Stevenson et al., 2003). D’autre part, 7 % des personnes atteintes de trisomie

21 sont également autistes et 18 % présentent des troubles du spectre autistique (DiGuiseppi

et al., 2010).

Les anomalies de structures correspondent à des translocations, des insertions ou des

duplications de fragments de chromosomes. Leur taille est variable (de quelques paires de

bases à plusieurs mégabases). Parmi celles-ci, les variations du nombre de copies (CNV) sont

caractérisées par une insertion ou une délétion de quelques paires de bases à plusieurs

mégabases d’ADN. Les anomalies de structures ont une part importante dans l’étiologie de

l’autisme et de la DM. 5 à 7 % des cas de DM sont expliqués par des anomalies

subtélomériques (De Vries et al., 2003). D’autre part, le nombre de CNV est plus important

chez les personnes atteintes d’autisme (2 à 3 % chez les familles multiplexes et 7 à 10 % chez

les familles simplexes) que dans la population générale (1%) (Sebat et al., 2007 ; Marshall et

al., 2008). Ces variations sont réparties sur la quasi-totalité des chromosomes (Figures 1 et 2).

37

Figure 1 : Localisation des CNV associés à la DM (Stankiewicz et Lupski, 2010). Les régions

dupliquées sont représentées en rouge. Les régions délétées sont représentées en bleu.

38

Figure 2 : Localisation des CNV associés à l’autisme d’après Marshall et al., 2008.

3.2.2. Maladies monogéniques

L’autisme (10 % des cas) et la DM peuvent être associées à des maladies

monogéniques. Leurs caractéristiques ainsi que leur prévalence dans l’autisme et la DM sont

indiquées dans le tableau II.

Tableau II : Principales caractéristiques et prévalence des maladies monogéniques associées à

l’autisme et à la DM.

Maladies monogéniques

Caractéristiques Prévalence dans l’autisme Prévalence dans la

DM

X fragile

• 1/4000 chez les garçons et 1/7000 chez les filles (Crawford et al., 2001) • Mutations du gène FMR1 • Epines dendritiques immatures et plus nombreuses (Hinton et al., 1991 ; Kaufmann et Moser, 2000) • Anomalies de la potentialisation à long terme (Godfraind et al., 1996)

2 à 3 % (Jacquemont et al., 2003 et 2004)

1,7 % (Stevenson et al., 2003)

39

Sclérose tubéreuse de Bourneville

• 1/10 000 • Mutations des gènes TSC1 et TSC2 (van Slegtenhorst et al., 1997) • Dérégulation de la prolifération (Curatolo et al., 2008) • Présence d’hamartomes et d’astrocytomes

0,9 % (Wong et al., 2006) 0,4 % (Stevenson et

al., 2003)

Neurofibromatose de type 1

• 1/3000 (Lammert et al. , 2005) • Mutations du gène NF1 • Dérégulation de la prolifération • Taches café-au-lait multiples • Neurofibromes • Astrocytomes

0 à 1,4 % (Fombonne, 2003) 0,2 % (Stevenson et

al., 2003)

Syndrome d’Angelman

• 1/12000 (Steffenburg et al., 1996) • Délétion de la région PW/AS du chromosome 15 maternel • Mutation du gène UBE3A • Retard sévère du développement • Déficit du langage • Ataxie (Cassidy et al., 2000)

1 à 2 % 0,3 % (Stevenson et

al., 2003)

Syndrome de Rett

• 1/10 000 filles (Neul et al., 2010) • Mutations du gène MECP2 dans 90 % des cas (Amir et al., 2000) • Développement normal de 6 à 18 mois puis régression • Perte des capacités de communication et de motricité fine • Microcéphalie

Présence de traits autistiques plus fréquente dans les formes

modérées du syndrome de Rett (Kaufmann et al., 2011)

0,2 % (Stevenson et al., 2003)

Syndrome de Rubinstein Taybi

• 1/125 000 à 1/100 000 (Hennekam et al., 1990) • Microdélétion de la région 16p13.3 ou mutations du gène CREBBP ou p300 • Microcéphalie • Dysmorphie

-

ND QI généralement

compris entre 35 et 50 (Hennekam et al.,

1992)

Syndrome de Smith-Magenis

• 1/25 000 à 1/15 000 (Greenberg et al., 1991) • Mutations du gène RAI1 • Anomalies crânio-faciales • Retard moteur et du langage • Troubles cognitifs • Troubles du comportement (Smith et al., 1986)

-

ND QI généralement

compris entre 20 et 78 (Greenberg et al.,

1996)

40

3.3. Processus cellulaires impliqués dans l'autisme et la DM,

implication des voies Rho et Ras

De nombreux gènes ou régions chromosomiques ont été associés à l’autisme et à la

DM. Dans la plupart des cas, chacune des mutations ou anomalies chromosomiques

retrouvées chez les patients est un phénomène rare qui ne permet d’expliquer qu’une petite

partie de ces pathologies. Par ailleurs, le tableau clinique peut être très différent d’un patient à

l’autre, même s’ils sont porteurs de la même mutation. La compréhension des mécanismes

biologiques responsables de ces pathologies est dès lors difficile. Néanmoins, une ébauche

des voies de signalisation potentiellement dérégulées dans l’autisme et la DM a été

déterminée par l’étude de la fonction des protéines codées par les gènes déjà impliqués dans

ces maladies. Elles participent à toutes les étapes du développement du système nerveux

central (prolifération, migration, développement des neurites (axones et dendrites),

synaptogenèse, morphologie et fonctionnement des synapses). La régulation du cytosquelette

d'actine est primordiale dans toutes ces étapes (Pinto et al., 2010 ; Gilman et al., 2011).

3.3.1. L’actine

Il existe 6 isoformes d'actine regroupées en trois classes : α, β et γ. Les trois isoformes

de type α sont exprimées dans les cellules musculaires, l’isoforme de type β et les deux de

type γ sont principalement exprimées dans les cellules non musculaires. L’isoforme de type β

est préférentiellement localisée au niveau de la membrane plasmique alors que les isoformes

de type γ constituent essentiellement les fibres de stress. Les isoformes β et γ sont exprimées

dans les neurones mais semblent être impliquées dans des processus différents (paragraphe

3.3.4.1). La polymérisation de l'actine n'est possible qu'après une étape de nucléation de trois

monomères d'actine. C'est une étape limitante (Sept et McCammon, 2001) qui est régulée par

plusieurs protéines de liaison à l’actine (paragraphe 3.3.2.1). Lors de la polymérisation, les

monomères asymétriques d'actine (actine G) liés à l'ATP s'assemblent tous dans le même

sens, ce qui détermine la polarité du filament d’actine. Les filaments d’actine ainsi obtenus

forment une hélice dont une extrémité est dite "barbue" ou "en brosse" et l’autre "en pointe".

Ces dénominations proviennent de la forme des extrémités observée lorsque la myosine est

fixée sur les filaments d’actine. Une fois les monomères assemblés en filaments d’actine,

l'ATP est hydrolysé de façon aléatoire en ADP et Pi. Le Pi se dissocie ensuite lentement (la

vitesse de dissocation est de 0,006 Pi par seconde à 25 °C, Carlier, 1987). La polymérisation

41

des monomères d’actine est plus rapide à l’extrémité en brosse. La polymérisation de l’actine

est étroitement régulée par un ensemble de protéines dont certaines assurent plusieurs

fonctions.

3.3.2. Régulation du cytosquelette d’actine

3.3.2.1.Les protéines se liant à l'actine

Les protéines régulant le cytosquelette d'actine sont divisées en 7 groupes. Certaines protéines

ont plusieurs fonctions et appartiennent donc à plusieurs groupes.

1) Les protéines favorisant la nucléation sont au nombre de 4 : l'ADF/cofiline, les

protéines du complexe Arp2/3, les formines et les protéines Spir (Mullins et al., 1998 ;

Pruyne et al., 2002 ; Quinian et al., 2005 ; Andrianantoandro et Pollard, 2006). Elles

ont chacune un mécanisme d'action différent (Figure 3). L'ADF/cofiline favorise la

nucléation des monomères d'actine G à une forte concentration. Les protéines Arp2/3

se fixent sur l'extrémité en pointe d'un filament d'actine déjà existant. Elles agissent

comme un dimère d'actine de sorte que l'association d'un seul monomère d'actine G est

suffisante pour induire la formation d'un nouveau filament d'actine. Celui-ci est orienté

à 70 ° par rapport au filament principal. Les formines stabilisent les dimères d'actine

G puis restent fixées à l'extrémité en brosse du filament d'actine nouvellement formé.

Elles favorisent également l'association des sous-unités d'actine à cette extrémité en

interagissant avec le complexe profiline-actine-G. Les protéines Spir interagissent

avec un tétramère d'actine G et permettent sa fixation à un autre tétramère formant

ainsi un octamère. Elles restent ensuite fixées à l'extrémité en pointe du filament.

2) Les protéines se liant aux monomères d’actine parmi lesquelles les thymosines β et les

protéines de la famille de l’ADF/cofiline inhibent la polymérisation de l’actine en

séquestrant les monomères. Les protéines de la famille de la profiline se lient

également aux monomères d'actine G mais favorisent la polymérisation de l’actine. Le

complexe profiline-actine-ATP se fixe à l’extrémité en brosse du filament au

détriment des autres protéines fixées à cette extrémité et qui inhibent la polymérisation

de l’actine. Une fois ce complexe fixé à l’actine, la profiline se détache et le

monomère d’actine-ATP est ajouté au filament.

42

3) Les protéines de coiffe des filaments d’actine se lient avec l’une ou l’autre des

extrémités du filament d’actine et empêchent l’association ou la dissociation des sous-

unités d’actine ou favorisent la formation de nouveaux filaments. La gelsoline, la

fragmine, la séverine, les protéines de coiffe hétérodimériques et les protéines du

complexe Arp2/3 font partie de cette catégorie de protéines.

4) Les protéines de réticulation des filaments d’actine relient les filaments d’actine les

uns aux autres, stabilisent les structures complexes d’actine et ancrent le cytosquelette

d’actine à la membrane plasmique. Parmi ces protéines, on peut citer l’α-actinine, la

fimbrine , la villine , la filamine, la spectrine et la dystrophine.

5) Les protéines de stabilisation des filaments d’actine, parmi lesquelles la tropomyosine,

la nébuline et la caldesmone, ont un rôle prépondérant dans les muscles striés et

régulent l’interaction de l’actine avec la myosine.

6) Les protéines de fragmentation des filaments d’actine, dont la plupart se lient

également aux extrémités des filaments d’actine, comprennent la gelsoline, la

fragmine, la séverine et l’ADF/cofiline.

7) Les protéines adaptatrices se fixent aux autres protéines régulatrices de l’actine. Les

protéines radixine et moésine font partie de cette catégorie. Elles permettent la

transduction du signal de la membrane jusqu’au cytosquelette d’actine notamment

grâce à leurs interactions avec les protéines de la famille Rho, qui constituent un des

mécanismes majeurs de régulation du cytosquelette d'actine.

43

Arp2/3

Formines

Protéines Spir

ADF/cofiline

Arp2/3

Formines

Protéines Spir

ADF/cofiline

Figure 3 : Les différents modes de nucléation de l’actine par les protéines ADF/cofiline,

Apr2/3, formines et spir, d’après Pak et al., 2008.

3.3.2.2.La famille des Rho-GTPases

La famille des Rho-GTPases comprend les protéines Rho (RhoA, RhoB, RhoC, RhoD

et RhoT), Rac (Rac 1-3), Cdc42, Rnd (Rnd1-3), TC10, TCC, Wrch1, Chp/Wrch2, RhoG et

RhoH/TTF (Van Aelst et D'Souza-Schorey, 1997 ; Burridge et Wennenberg, 2004). Sous leur

forme inactive, ces protéines sont liées au GDP. L’activation de ces protéines est régulée par

le ratio entre la quantité de GTP et de GDP et par les protéines GEF (guanine exchange

factor) qui permettent l’échange du GDP par du GTP et l’interaction des Rho-GTPases avec

leurs effecteurs (Schmidt et Hall, 2002). L’activité intrinsèque des Rho-GTPases hydrolyse

ensuite le GTP en GDP ce qui les inactive. Leur inactivation est également étroitement

contrôlée. Les protéines GAP (GTPases activating protein) augmentent l’activité GTPase

intrinsèque des Rho-GTPases et favorisent ainsi leur inactivation (Bernards, 2003 ; Bernards

et Settlemann, 2004). Les protéines GDI empêchent l'échange entre le GDP et le GTP et

inhibent l’activité GTPase intrinsèque des Rho-GTPases (Hoffman et al., 2000). La spécificité

des Rho-GTPases vis-à-vis de leurs effecteurs est contrôlée d’une part par la liaison des

44

protéines GEF à des protéines d’échafaudage (Buchsbaum et al., 2003 ; Jaffe et al., 2004) et

d’autre part, par la régulation spatio-temporelle des protéines GEF et des effecteurs des Rho-

GTPases (expression, dégradation, localisation subcellulaire) (Aoki et al., 2004 ; Pertz et

Hahn, 2004). Les trois protéines les plus étudiées sont les protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. La

polymérisation du cytosquelette d’actine est principalement contrôlée par ces trois protéines

(Figure 4). Elles activent de nombreuses voies de signalisation qui régulent les protéines de

liaison de l'actine.

Les Rho-GTPases régulent de nombreux processus cellulaires et sont donc importantes

pour le bon fonctionnement des cellules (Luo et al., 1994) et notamment des neurones. Leurs

rôles au cours du développement neuronal est développé dans les paragraphes suivants. De

nombreux gènes de ces voies sont dérégulés chez des patients atteints de DM (Ramakers,

2002) et présentent de nombreux CNV chez des patients atteints d'autisme (Hussman et al.,

2011). D’autres voies de signalisation telles que la voie Ras et celle de l’ubiquitinylation,

également importantes au cours du développement neuronal, ont été impliquées dans

l’autisme et la DM et seront décrites par la suite.

45

RhoA

ROCK

LIMK

cofiline

MLCmyosine

Stabilisation des filaments

d’actine

Augmentation de la

contractilitéde

l’actomyosine

MLCP

PIP5K

PIP2

P

Rac1

IRSp53

LIMK

cofiline

WAVE

Arp2/3

Stabilisation des filaments

d’actine Nucléation et formation de

nouveaux filaments d’actine

PIP5K

PIP2

Activation de protéines de

réticulation et inhibition de protéines de

fragmentation de l’actine

PAK1

MLC

MLCK

Augmentation de la

contractilitéde

l’actomyosine

P

Cdc42

IRSp53

LIMK

cofiline

WIP

Stabilisation des filaments

d’actine

N-WASP

PIP2

PAK1

Arp2/3

Nucléation et formation de

nouveaux filaments d’actine

MLC

MLCK

Augmentation de la

contractilitéde

l’actomyosine

A B

CArp 2/3 : actin related 2/3 complexIRSp53 : insulin receptor substrate p53LIM : LIM kinaseMLC : myosin regulatory light chainMLCP : myosin light chain phosphataseN-WASP : neural-Wiskott-Aldrich syndrome proteinPAK1 : p21-activated kinase 1PIP5K : phosphatidylinositol 5-phosphate kinasePIP2 : phosphatidylinositol 4,5-phosphateROCK : Rho associated kinaseWAVE : WASP family verprolin-homologous proteinWIP : WASP-interacting protein

Activation de protéines de

réticulation et inhibition de protéines de

fragmentation de l’actine

RhoARhoA

ROCKROCK

LIMKLIMK

cofilinecofiline

MLCMLCmyosinemyosine

Stabilisation des filaments

d’actine

Augmentation de la

contractilitéde

l’actomyosine

MLCPMLCP

PIP5KPIP5K

PIP2PIP2

P

Rac1

IRSp53

LIMKLIMK

cofilinecofiline

WAVE

Arp2/3Arp2/3

Stabilisation des filaments

d’actine Nucléation et formation de

nouveaux filaments d’actine

PIP5KPIP5K

PIP2PIP2

Activation de protéines de

réticulation et inhibition de protéines de

fragmentation de l’actine

PAK1PAK1

MLCMLC

MLCKMLCK

Augmentation de la

contractilitéde

l’actomyosine

P

Cdc42

IRSp53

LIMKLIMK

cofilinecofiline

WIPWIP

Stabilisation des filaments

d’actine

N-WASPN-WASP

PIP2PIP2

PAK1PAK1

Arp2/3

Nucléation et formation de

nouveaux filaments d’actine

Arp2/3

Nucléation et formation de

nouveaux filaments d’actine

MLCMLC

MLCKMLCK

Augmentation de la

contractilitéde

l’actomyosine

A B

CArp 2/3 : actin related 2/3 complexIRSp53 : insulin receptor substrate p53LIM : LIM kinaseMLC : myosin regulatory light chainMLCP : myosin light chain phosphataseN-WASP : neural-Wiskott-Aldrich syndrome proteinPAK1 : p21-activated kinase 1PIP5K : phosphatidylinositol 5-phosphate kinasePIP2 : phosphatidylinositol 4,5-phosphateROCK : Rho associated kinaseWAVE : WASP family verprolin-homologous proteinWIP : WASP-interacting protein

Arp 2/3 : actin related 2/3 complexIRSp53 : insulin receptor substrate p53LIM : LIM kinaseMLC : myosin regulatory light chainMLCP : myosin light chain phosphataseN-WASP : neural-Wiskott-Aldrich syndrome proteinPAK1 : p21-activated kinase 1PIP5K : phosphatidylinositol 5-phosphate kinasePIP2 : phosphatidylinositol 4,5-phosphateROCK : Rho associated kinaseWAVE : WASP family verprolin-homologous proteinWIP : WASP-interacting protein

A