manual de laboratorio trichinellosis porcina · larvas 1 infectantes en el tejido muscular...

Riva, Eliana; Steffan, Pedro E. y Fiel, Cesar A.Riva, Eliana; Steffan, Pedro E. y Fiel, Cesar A.Riva, Eliana; Steffan, Pedro E. y Fiel, Cesar A.Riva, Eliana; Steffan, Pedro E. y Fiel, Cesar A.

AREA DE PARASITOLOGÍA Y ENFERMEDADES PARASITARIAS

Departamento de Sanidad Animal y Medicina Preventiva

Trichinellosis porcina

Manual de laboratorio

©2009 - UNCPBA Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires Área de Parasitología Pinto 399, Tandil (7000), Provincia de Buenos Aires Tel: 02293 439850 int.257 1ª edición: Noviembre 2009 Libro de edición Argentina Impreso por Gráfica Bossio Av. España 359, Tandil Hecho el depósito que marca la Ley 11723 ISBN 978-950 - 658 - 225 - 8

Riva, Eliana Trichinellosis porcina : manual de laboratorio / Eliana Riva ; Pedro E. Steffan ; César Fiel. - 1a ed. - Tandil : Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, 2009. 23 p. ; 28x20 cm.

ISBN 978-950-658-225-8

1. Ciencias Veterinarias. 2. Enfermedades Porcinas. I. Steffan, Pedro E. II. Fiel, César III. Título CDD 636.4

Introducción 1

Triquinoscopía 2

Digestión artificial 4

ELISA 8

Western Blot 12

Anexo I 17

Anexo II 19

Referencias bibliográficas 21

Contenido:

Trichinellosis porcina

MANUAL D E L A BORATOR I O

Manual de Laboratorio:Trichinellosis porcina

IntroducciónIntroducciónIntroducciónIntroducción

La trichinellosis es una enfermedad zoonótica cuyo diagnóstico precoz en animales infectados representa una de las etapas más importantes para evitar su transmisión al hombre y a los animales sanos. Los parásitos responsables de esta enfermedad son nematodos del genero Trichinella que cumplen un ciclo biológico directo íntegramente dentro del mismo hospedador (Figura 1). El producto de cada ciclo es el enquistamiento de larvas 1 infectantes en el tejido muscular esquelético del hospedador donde se mantienen latentes hasta que sean consumidas por un nuevo hospedador. En la epidemiología de la trichinellosis se distinguen tres ciclos entrelazados (doméstico, sinantrópico y silvestre) donde el parásito circula y mantiene su reservorio, involucrando un amplio rango de hospedadores, principalmente mamíferos.

El presente manual detalla las características, materiales y procedimientos de las principales técnicas directas e indirectas utilizadas en el diagnóstico del ganado porcino, incluyendo aquella de rutina para la certificación de carne libre de Trichinella spiralis en nuestro país. El objetivo del presente manual es servir de guía para un correcto desarrollo de las técnicas en el laboratorio, lo que garantiza la validez del diagnóstico de la trichinellosis.

Figura 1.Figura 1.Figura 1.Figura 1. Ciclo biológico de Trichinella sp.


Técnicas directasTécnicas directasTécnicas directasTécnicas directas

Estas técnicas comprenden la identificación del primer estadio larval del parásito (L1) enquistado en el músculo esquelético y en general están ligadas al análisis post mortem de los animales. Los sitios de predilección para la toma de muestras de tejido muscular son aquellos donde se albergan la mayoría de las larvas en un animal infectado, clave inicial para la correcta implementación de las técnicas. Además del cerdo, se debe tener en cuenta que tanto los caballos, como varias especies de animales de caza son fuente de infección de Trichinella para humanos, por lo que las carnes destinadas a consumo humano también deben ser verificadas.

En el siguiente cuadro se describe, para cada especie animal a analizar, los sitios de predilección recomendables ha ser muestreados:

Cuanto mayor sea la cantidad de material analizado, más elevada es la sensibilidad obtenida. Las técnicas directas son capaces de identificar animales infectados tan temprano como a los 17 días posteriores a la infección, coincidiendo con el momento en que la larva muscular adquiere infectividad. Estas técnicas mantienen su efectividad en tanto la larva muscular se mantenga viable, de modo que las muestras de tejido muscular no deben someterse a congelación ni mantenerse en freezer. En el caso de que las muestras no puedan ser analizadas en el momento de su obtención, pueden conservarse en heladera a 4ºC por 4 días hasta su análisis 7.

TRIQUINOSCOPÍATRIQUINOSCOPÍATRIQUINOSCOPÍATRIQUINOSCOPÍA

Este método se lleva a cabo por inspección visual de tejido muscular comprimido de manera

que permita visualizar la larva L1 in situ. Los materiales requeridos hacen poco costosa la

técnica pero requiere de un largo tiempo para realizar el procedimiento técnico y de

inspección. No es indicada para detectar especies no encapsuladas. Su principal desventaja

es la baja sensibilidad estimada en 3 larvas por gramo de tejido analizado, por lo que su su su su

utilización como única técnica para analizar carne destinada a consumo no es utilización como única técnica para analizar carne destinada a consumo no es utilización como única técnica para analizar carne destinada a consumo no es utilización como única técnica para analizar carne destinada a consumo no es

recomendada recomendada recomendada recomendada ya a que ese nivel de detección no alcanza el valor mínimo requerido para

evitar la infección en el hombre.

Cerdo / jabalíCerdo / jabalíCerdo / jabalíCerdo / jabalí Diafragma, músculos de la base de la lengua, masetero, intercostales y músculos del cuello.

CaballoCaballoCaballoCaballo Músculos de la base de la lengua y maseteros.

ZorroZorroZorroZorro Músculos de la base de la lengua, músculos de los miembros anteriores y diafragma.

PeludoPeludoPeludoPeludo Músculo de los miembros anteriores.


MaterialesMaterialesMaterialesMateriales

Tijera, bisturí, pinzas

Balanza

Placas de compresión: dos gruesas placas de vidrio que se unen mediante dos tornillos

Microscopio óptico con 15x a 40x de aumento / Triquinoscopio: microscopio especial que aumenta moderadamente el tamaño del campo microscópico y lo proyecta en una pantalla

Lavandina

Guantes

Recipiente para eliminar residuos

ProcedimientoProcedimientoProcedimientoProcedimiento

-Tomar un mínimo de 0,5 g de muestras de músculo esquelético de los sitios de predilección de cada animal.

-Cortar en 28 trozos de 2 x 10 mm de tamaño. Es recomendable que los cortes se realicen en forma longitudinal al haz muscular.

-Comprimir las muestras hasta que se vuelvan translúcidas entre los vidrios de la compresa.

-Se observa en el triquinoscopio (Foto 1) o en el microscopio óptico a 40 x de aumento (Foto 2) recorriendo todos los cortes. Las larvas aparecen enrolladas en la cápsula dentro de una célula muscular modificada, la cual es típicamente oval. En infecciones elevadas puede observarse más de una larva por cápsula.

-Cuantificar todos los quistes visualizados de manera de poder calcular el nº de larvas presente por gramo de tejido.

Foto 1Foto 1Foto 1Foto 1 Foto 2Foto 2Foto 2Foto 2


DIGESTIÓN ARTIFICIALDIGESTIÓN ARTIFICIALDIGESTIÓN ARTIFICIALDIGESTIÓN ARTIFICIAL

El principio de esta técnica se basa en la liberación de las larvas L1 enquistadas en el

músculo por acción de un líquido artificial de digestión y en su posterior cuantificación. Se

han desarrollado varias alternativas para el procesamiento en el laboratorio8 que incluyen:

Técnica del Stomacher, Técnica del agitador magnético, Digestión de pool de muestras

asistido por sedimentación mecánica y Digestión de pool de muestras asistido por filtración

mecánica.

La técnica de digestión artificial con agitador magnético es económica, fácil de desarrollar y

requiere un equipo mínimo para poder aplicarse tanto a muestras individuales o a un pool

de muestras. La sensibilidad obtenida para 5 g de muestras analizadas es de 1 larva por

gramo de tejido. Es la técnica aprobada y obligatoria para analizar carne destinada a Es la técnica aprobada y obligatoria para analizar carne destinada a Es la técnica aprobada y obligatoria para analizar carne destinada a Es la técnica aprobada y obligatoria para analizar carne destinada a

consumo.consumo.consumo.consumo.

Método de digestión artificial (SENASA decreto 740/99)Método de digestión artificial (SENASA decreto 740/99)Método de digestión artificial (SENASA decreto 740/99)Método de digestión artificial (SENASA decreto 740/99)

MaterialesMaterialesMaterialesMateriales

Tijera, bisturí, pinza, trituradora

Vaso de precipitados

Pipeta y propipeta

Timer

Agitador magnético con platina térmica

Magneto

Termómetro

Balanza

Papel aluminio

Cinta para medir pH

Colador 170 µ

Embudo

Ampolla Squib de decantación

Tubo cónico de 50 ml

Gradilla

Bomba de vacío


Microscopio con 15x a 40x de aumento

Recipiente para eliminar residuos

Cubeta acrílica cuadriculada para contar larvas (9 cm x 4,5 cm x 1 cm)

Ácido clorhídrico 37% fumante

Pepsina 1/10.000 NF

Agua destilada

Guantes

Lavandina


En el examen de rutina de animales mediante un pool de muestras, se recomienda un mínimo de 1 gramo de tejido muscular / animal para agrupamientos de 100 g. En áreas endémicas, el volumen mínimo de muestra requerido es de 5 g de tejido muscular / animal.

1) Preparación de las muestras1) Preparación de las muestras1) Preparación de las muestras1) Preparación de las muestras

-Eliminar la grasa, los tendones, las aponeurosis y cortar la carne en pequeños trozos con tijera o procesarla en la trituradora para facilitar la digestión.

2) Preparación de la solución de digestión2) Preparación de la solución de digestión2) Preparación de la solución de digestión2) Preparación de la solución de digestión

-Encender el agitador magnético.

-Se recomienda una relación g. muestra vs. solución digestora de 1:30 (1 g / 30 ml). El ácido clorhídrico y la pepsina se utilizan al 1%. La solución se prepara agregando al agua destilada precalentada (a 46ºC) primero el acido, asegurando que sea por las paredes del vaso de precipitados, luego la pepsina y finalmente la carne. El pH de la solución resultante debe ser de 1.5 – 2. - Agregar un magneto y agitar.

3) Ejecución de la técnica3) Ejecución de la técnica3) Ejecución de la técnica3) Ejecución de la técnica

-Agregar la carne procesada y digerir la muestra durante 30 a 45 .minutos a 42º – 46º C. Cubrir con papel aluminio para evitar salpicaduras

-Pasar la solución digerida por colador a una ampolla de decantación.


-No debe quedar tejido muscular sin digerir y en tal caso debe realizarse una nueva digestión para el material remanente.

-Dejar reposar 30 minutos y pasar al tubo cónico los primeros 50 ml.

-Dejar reposar 20 a 30 minutos

-Aspirar los 40 ml superiores sin remover el sedimento y reponer al volumen inicial con agua corriente

-Reposar 15 minutos, aspirar 40 ml y reponer al volumen inicial con agua corriente.

-Reposar 15 minutos y aspirar 40 ml.

-El sedimento restante de 10 ml se carga en una cámara cuenta-larvas cuadriculada y se efectúa el conteo de larvas en microscopio óptico a 10 x o lupa estereoscópica.

Las larvas de Trichinella se observan enrolladas en medio frío, móviles a temperaturas de 44º C y en forma de C para larvas muertas (Foto 3).

Si el número de larvas es muy elevado (Foto 4), deben realizarse diluciones apropiadas que permitan su individualización dentro de la cuadrícula para realizar correctamente el conteo.

El resultado final se expresa en número de larvas por gramo (LPG).

LPG= LPG= LPG= LPG= Número de larvas contadas Número de larvas contadas Número de larvas contadas Número de larvas contadas Peso de la muestra Peso de la muestra Peso de la muestra Peso de la muestra

Foto 3Foto 3Foto 3Foto 3 Foto 4Foto 4Foto 4Foto 4

Cuando se detectan larvas en una digestión de pool de muestras, la totalidad del procedimiento debe repetirse para pooles de menor tamaño hasta identificar la muestra individual infectada (Figura 2).

En el caso de analizar chacinados se prosigue en la misma forma que la descripta pero deben tomarse las siguientes precauciones:

- Desgrasar la muestra a analizar

-Pesar y rehidratar la muestra durante 4–6 horas con agua destilada (100 ml cada 20g)

-Para embutidos frescos y secos: se aconseja analizar 100 g dada la variabilidad de su composición.

-Para salazones y ahumados: se aconseja analizar 50 g de muestra.

Recordar que tanto las larvas 1 aisladas como el material de muestra de donde

provino deben eliminarse correctamente luego de finalizada la técnica, ya que

representan una fuente de infección:

-Utilizar el autoclave para el material de vidrio, metal y polipropileno.

-Se recomienda utilizar lavandina 10% dejando accionar por 24hs. para fluidos y para el

material que no pueda someterse al proceso anterior.

-El remanente sólido de descarte puede someterse a incineración.

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Si el pool resulta positivo

Si un pool o más resultan positivos

Figura 2. Figura 2. Figura 2. Figura 2.

Pasos a seguir durante la di-gestión de un pool de muestras

1 pool

20 cerdos x 5 gramos cada submuestra= 100 g

4 pooles

5 cerdos x 20 gramos cada submuestra= 100g

Cada cerdo individualmente 20 g de muestra


Técnicas indirectasTécnicas indirectasTécnicas indirectasTécnicas indirectas

Estas técnicas tienen por objetivo detectar la respuesta inmune del huésped frente a la presencia de antígenos extraños en su organismo. Tienen fundamental importancia para el diagnostico de las parasitosis en las que es imposible o muy difícil la visualización directa del parásito debido a su localización tisular, siendo la ventaja primordial el análisis in vivo, ya que se utiliza suero o sangre para llevar a cabo las pruebas.

Dentro de estas técnicas, los ensayos inmunoenzimáticos se caracterizan por la utilización de proteínas (antígenos o anticuerpos) marcadas con enzimas. La adición de un sustrato específico y la consecuente reacción enzima-sustrato amplifica la visualización de la reacción inmunológica a través del producto final cromogénico. El producto formado puede precipitar en fase sólida en el sitio de reacción o mantenerse en solución, siendo en ambos casos la intensidad del color de los productos directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos o antígenos existentes en el fluido testado. Si bien el resultado puede leerse visualmente, la interpretación del test es objetiva cuando se utiliza un espectrofotómetro.

ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

El fundamento de la técnica de ELISA es la adhesión de un antígeno o anticuerpo soluble a

una fase sólida insoluble de manera tal que la reactividad del componente inmunológico

sea retenida.

Un gran número de ELISA han sido desarrollados siendo las distintas modalidades (directo,

indirecto, sándwich) dependientes de qué componente es el fijado y cuál quiere ser

detectado en la muestra problema.

En el ELISA indirecto (Figura 3), cuya técnica se describe más adelante, el antígeno

específico fijado a la fase sólida reacciona con el anticuerpo no conocido presente en el

suero problema. Esta unión es detectada con un tercer anticuerpo específico anti-especie

que se encuentra conjugado con una enzima. La adición del sustrato específico y su

degradación resulta en un cambio de coloración que es valorizado por una lectora de

densidad óptica (OD). La calidad del antígeno utilizado es crítico para la especificidad y la

sensibilidad de la prueba.

La sensibilidad de la técnica ELISA en el diagnóstico de la trichinellosis porcina es de La sensibilidad de la técnica ELISA en el diagnóstico de la trichinellosis porcina es de La sensibilidad de la técnica ELISA en el diagnóstico de la trichinellosis porcina es de La sensibilidad de la técnica ELISA en el diagnóstico de la trichinellosis porcina es de 0,01 0,01 0,01 0,01

larvas por gramo larvas por gramo larvas por gramo larvas por gramo de tejido utilizando antígeno excretode tejido utilizando antígeno excretode tejido utilizando antígeno excretode tejido utilizando antígeno excreto————secretor de Trichinella spiralis secretor de Trichinella spiralis secretor de Trichinella spiralis secretor de Trichinella spiralis 2.


Figura 3Figura 3Figura 3Figura 3.

Guía simplificada de aplicación de la técnica de ELISA indirecto

Materiales Materiales Materiales Materiales

Microplacas Nunc MaxiSorp Micropipetas p10, p20, p100 Micropipeta multicanal p100, p200 Gradillas Eppendorf 1,5 ml Cámara húmeda Estufa de 37 ºC Heladera Timer Balanza Papel secante Papel film Pisetas Tips Recipiente para eliminar resíduos Cubetas Lectora de ELISA (tipo: ELx800, BioTek®, USA) Antígeno E/S de lavas de Trichinella spiralis Sueros problemas Sueros controles positivos y negativos

Sensibilizar las microplacas: Incubación con antígeno

Lavados: Eliminación de antígenos no fijados

Añadir suero problema e incubar

Añadir sustrato cromogénico

Lavados: Eliminación de anticuerpos no unidos

Añadir anticuerpo anti-especie marcado e incubar

Lavados: Eliminación de anticuerpos no unidos

Revelar las placas y leerlas con lectora de ELISA


Conjugado peroxidasa anti– IgG cerdo, titulado previamamente para dicho sistema Solución amortiguadora carbonato-bicarbonato Solución amortiguadora fosfato-citrato PBS leche 5% PBS-TWEEN 0,05% Pastillas de OPD Agua oxigenada de 30 volúmenes Acido sulfúrico 2.5 N


1) Pegado del antígeno1) Pegado del antígeno1) Pegado del antígeno1) Pegado del antígeno

-Atemperar las soluciones

-Se hierve el antígeno excreto-secretor durante 3 minutos

-Se diluye en solución amortiguadora carbonato-bicarbonato 0.5 µg/100 µl

-Se siembra 100 µl /pocillo y se dejan 2 pocillos sin sembrar para control de pegado

-Se incuba 24 horas a 4 ºC en cámara húmeda

-La placa sensibilizada se puede guardar a –20 ºC hasta un mes, tapada con film.

2) Sembrado de los sueros 2) Sembrado de los sueros 2) Sembrado de los sueros 2) Sembrado de los sueros

-Se hacen 3 lavados de 3 minutos cada uno con 200 µl /pocillo de PBS-TWEEN. Luego de los lavados los pocillos deben secarse

-Se bloquea con 200 µl PBS-leche 5% durante 1 hora a 37 ºC

-Se lava 3 veces con 200 µl de PBS-TWEEN

-Se hacen las diluciones de los sueros con PBS-leche 5%: Se utiliza dilución 1/100 para sueros porcinos y 1/50 para sueros equinos

-Se siembran 100 µl de suero / pocillo incluyendo: sueros controles positivos y negativos, sueros problema y blanco (solución PBS-leche 5%). En todos los casos por duplicado y con la misma dilución. Se destinan 2 pocillos para control de pegado (Fig. 4).

Fig. 4. Fig. 4. Fig. 4. Fig. 4. Gradilla de ubicación de las muestras y de los controles dentro de la microplaca.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A CP CP M1 M1

B B B M2 M2

C + + M3 M3

D - - M4 M4 E - - M5 M5

F - - M6 M6

G - - M7 M7

H - - M8 M8

CPCPCPCP: Control de pegado

B B B B : Blanco

++++ : Control positivo

---- : Control negativo

MMMM : Muestras problema

Manual de laboratorio:Trichinellosis porcina

-Se incuba 30 minutos a 37 ºC en cámara húmeda

-Se lava 3 veces con PBS-TWEEN 0,05%

-Se diluye el conjugado (1/2500) en PBS TWEEN-LECHE al 5%

-Se siembra el conjugado 100 µl / pocillo

-Se incuba 1 hora a 37 ºC en cámara húmeda

-Se hacen 3 lavados de 3 minutos cada uno con PBS-TWEEN 0,05%

2) Revelado2) Revelado2) Revelado2) Revelado

-Encender el lector de ELISA

-Se coloca 5 mg de OPD en 18 ml de buffer citrato y 12 µl de agua oxigenada de 30 volúmenes.

-Se siembra 100 µl / pocillo

-Incubar de 10 a 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente

-Detener la reacción con 50 µl / pocillo de acido sulfúrico 2,5N.

-Leer a 450 nm.

Manejo de datosManejo de datosManejo de datosManejo de datos

-Promediar los blancos y restar este promedio a la totalidad de los datos

-Calcular:

Cut off = promedio de muestras negativas + 3 Desvíos Standard (SD)

Intraensayo: Se utilizan 5 sueros de cerdos negativos con hpg elevados para cada ensayo realizado.

-Cotejar los datos contra el Cut off:

Los datos mayores al cut off son considerados positivos (+) y los menores al corte, negativos (-).

PM Ag E/S

Separación de proteínas por SDS PAGE y verificación por

coloreado del gel

Transferencia electroforética de las proteínas totales a la

membrana de nitrocelulosa y verificación por coloreado

Bloqueo de proteínas inespecíficas y lavado. Adición de suero

problema e incubación

Lavado, eliminando los anticuerpos no unidos y revelado.

Verificación de las bandas con marcadores de peso molecular

PM + - M?

WESTERN BLOTWESTERN BLOTWESTERN BLOTWESTERN BLOT

Esta técnica, también conocida como inmunoblot o inmunoelectrotransferencia, es utilizada

para el estudio y verificación de una proteína específica dentro de mezclas inmunogénicas

complejas.

Primeramente las proteínas desnaturalizadas se separan únicamente de acuerdo a su peso

molecular mediante migración a través de un gel de poliacrilamida o de agarosa - acrilami-

da donde la porosidad del gel formado actúa como un tamiz molecular. La presencia de un agente reductor, comúnmente betamercaptoetanol, y de un detergente cargado negativa-mente, sulfato dodecil de sodio (SDS), genera una ruptura de las uniones S-S intra e inter proteicas y carga en forma negativa las mismas, respectivamente. De esta manera, la aplica-ción de un campo eléctrico sobre un gel de separación proteica provoca la migración de los péptidos en una única dirección y en función del peso molecular.

Posteriormente las moléculas resueltas se transfieren e inmovilizan, mediante electroforesis

horizontal, en una membrana de nitrocelulosa o nylon (soporte). Los antígenos (proteínas)

se detectan utilizando anticuerpos específicos en un procedimiento similar al del ELISA. La

reacción antígeno-anticuerpo en forma de banda se visualiza mediante una reacción enzi-

mática cuyo producto es precipitante y cromogénico, o bien por autorradiografía. Esta técni-Esta técni-Esta técni-Esta técni-

ca, de alta especificidad, se utiliza como prueba confirmatoria del resultado positivo obteni-ca, de alta especificidad, se utiliza como prueba confirmatoria del resultado positivo obteni-ca, de alta especificidad, se utiliza como prueba confirmatoria del resultado positivo obteni-ca, de alta especificidad, se utiliza como prueba confirmatoria del resultado positivo obteni-

do por el test de ELISA.do por el test de ELISA.do por el test de ELISA.do por el test de ELISA.

Fig. 5. Fig. 5. Fig. 5. Fig. 5. Guía simplificada para la aplicación de la técnica de Western Blot

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Manual de Laboratorio: Trichinellosis porcina

Materiales Materiales Materiales Materiales

Micropipetas y tips Guantes Papel de filtro Recipiente para residuos Muestras problema, positivas y negativas Membrana de nitrocelulosa SDS 10 % APS 10 % TEMED Acri/ bis 30 % Buffer de muestra Buffer de corrida Buffer de transferencia Tris/ HCl 1,5 M pH 8.8 Tris / HCl 1,5 M pH 6.8 Azul de Coomasie (Soluciones de tinción en gel y membrana) Rojo Ponceau Marcadores estándar de peso molecular (ColorBurst) Antígeno E/S de lavas de Trichinella spiralis Conjugado peroxidasa anti– IgG cerdo, titulado previamente para dicho sistema PBS PBS-TWEEN PBS—TWEEN– leche 8% PBS- TWEEN– leche 2% Agar Papel de nitrocelulosa Agua destilada Cuba electroforética y accesorios Fuente de poder Shaker Placas de Petri Recipientes plásticos


Preparación del antígenoPreparación del antígenoPreparación del antígenoPreparación del antígeno

Se preparan por dilución en Buffer muestra (1: 5). Se hierve 3 minutos y pueden usarse en el momento o conservarse a –20ºC.

SDS SDS SDS SDS ----PAGE PAGE PAGE PAGE

-Se desengrasa las placas de vidrio con etanol, se arman y sellan por la base con agar 1,5%

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Manual de Laboratorio: Trichinellosis porcina

-Se prepara el gel de corrida inferior 12, 5% (ver Anexo 1)

-Verter la solución en el soporte hasta un nivel de 1 cm por debajo del peine, evitando la formación de burbujas. Agregar una capa de agua con micropipeta. Dejar gelificar por 30 minutos.

-Sacar el agua con papel de filtro

-Cargar el buffer de corrida en los reservorios inter-no y externo de la cuba hasta el tope.

-Preparar la solución superior (Anexo 1), cargar sobre el gel de corrida inferior e insertar el peine para formar los pocillos de siembra. Dejar gelifi-car 10 minutos.

-Quitar el peine y lavar con agua destilada los poci-llos. Secar con papel de filtro. El gel se puede guardar envuelto en papel film y papel húmedo por 24 hs.

-Armar la cuba electroforética.

-Sembrar 15 µl del antígeno preparado y 10 µl de marcador molecular.

-Tapar la cuba y correr a 200 V por una hora.

Coloreado del gelColoreado del gelColoreado del gelColoreado del gel

-Colocar el gel en Azul de Coomasie por una hora. Decolorar con solución decolorante por 24 horas.

-El gel se seca depositando papel celofán sobre el mismo por 48-72 hs. a temperatura am-biente.

Transferencia electroforéticaTransferencia electroforéticaTransferencia electroforéticaTransferencia electroforética

-Colocar el recipiente con agua en refrigerador

-Cortar una membrana de nitrocelulosa (0.22 µm) del tamaño del gel a transferir.

-Humedecer el gel con agua destilada por varios minutos.

-Sumergir la membrana en buffer de transferencia por 2 minutos. También sumergir dos hojas de papel filtro, el gel y las almohadillas de soporte.

-Ensamblar según figura y eliminar las burbujas que se formen.

-Colocar el recipiente con agua refrigerada en el tanque y colocar dentro del tanque el ensamblado.

-Llenar el tanque con buffer de transferencia.

-Colocar refrigerantes alrededor del tanque.

-Correr a 30 V toda la noche.

papel filtro

soportesoportesoportesoporte


Verificación de la transferenciaVerificación de la transferenciaVerificación de la transferenciaVerificación de la transferencia

-Colorear el gel nuevamente con azul de Coomasie para verificar la transferencia total.

-Colorear las proteínas totales adheridas a la membrana de nitrocelulosa con rojo Ponceau por 5 minutos. Decolorar con agua destilada.

Bloqueo y adición de las muestrasBloqueo y adición de las muestrasBloqueo y adición de las muestrasBloqueo y adición de las muestras

-Lavar la membrana 3 veces con PBS y cubrirla con bloqueante PBS –Tween leche 8%,

24 hs a 4ºC o 1 hora a 37ºC en agitación.

-Lavar la membrana quitando el bloqueante con PBS-TWEEN 3 veces.

-Cubrir con muestras (anticuerpos) de suero de porcino (problema, positivo y negativo)

diluido en PBS-TWEEN leche 2 % (400µl suero+ 19,6 ml de sc. de bloqueo)

-Incubar 1 hora a temperatura ambiente en agitación

-Lavar 3 veces rápidamente y 3 veces de 5 minutos en agitación con PBS-TWEEN

-Cubrir con Ac anti-pig conjugado peroxidasa en dilución 1:10.000 (2µl anti-pig + 20 ml

de PBS-TWEEN leche 2%)

-Se incuba una hora a temperatura ambiente en agitación

-Lavar 3 veces rápidamente y una vez de 5 minutos en agitación con PBS-TWEEN, luego

dos veces con PBS.

RRRReveladoeveladoeveladoevelado

-Se utiliza el kit AEC CHROMOGEN (nº 101, Sigma)

-Incubar 10-15 minutos en oscuridad y agitación

-Detener la reacción con PBS

-Visualizar las bandas

El WB es positivo para una muestra cuando se evidencian los grupos de antígenos

principales identificados por los pesos moleculares de 49, 52 y 54 KDa.


INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN DEDEDEDE RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS DEDEDEDE ELISAELISAELISAELISA++++WBWBWBWB

Considerando al test de ELISA como una prueba exploratoria antemortem de la trichinellosis en cerdos y a la técnica de Western Blot como prueba confirmatoria de la muestra positiva por ELISA, se pude establecer la siguiente estructura de interpretación:

TécnicaTécnicaTécnicaTécnica ELISAELISAELISAELISA Western Western Western Western

BlotBlotBlotBlot InterpretaciónInterpretaciónInterpretaciónInterpretación RecomendaciónRecomendaciónRecomendaciónRecomendación

ResultadosResultadosResultadosResultados

++++ ++++ Positivo confirmadoPositivo confirmadoPositivo confirmadoPositivo confirmado Alerta, decomiso y D.A

---- ---- Negativo confirmadoNegativo confirmadoNegativo confirmadoNegativo confirmado D.A. al momento de

faena

++++ ---- SospechosoSospechosoSospechosoSospechoso Seguimiento con

repetición de pruebas

---- ++++ SospechosoSospechosoSospechosoSospechoso Seguimiento con

repetición de pruebas


Anexo IAnexo IAnexo IAnexo I ----Soluciones ELISASoluciones ELISASoluciones ELISASoluciones ELISA----

PBS 10X (solución de uso 1X)PBS 10X (solución de uso 1X)PBS 10X (solución de uso 1X)PBS 10X (solución de uso 1X)

80 g de NaCl

11,5 g de Na2HPO4

2 g de KCl

2 g de KH2PO4

Disolver en ese orden en 800 ml de agua destilada. El pH debe ser 7-7,2. Llevar a 1000 ml con agua destilada. Conservar a temperatura ambiente.

PBS TWEEN 0,05%PBS TWEEN 0,05%PBS TWEEN 0,05%PBS TWEEN 0,05%

500 µl de Tween 20 en 1000 ml de PBS 1X

Las soluciones con Tween 20 no se autoclavan y no conviene usar después de 2 semanas de preparadas.

PBS TWEENPBS TWEENPBS TWEENPBS TWEEN---- leche 5% leche 5% leche 5% leche 5%

5 g de leche en polvo descremada en 95 ml de PBS TWEEN.

Llevar a 100 ml con agua destilada.

Solución amortiguadora carbonatoSolución amortiguadora carbonatoSolución amortiguadora carbonatoSolución amortiguadora carbonato----bicarbonato pH 9,6; 0,1Mbicarbonato pH 9,6; 0,1Mbicarbonato pH 9,6; 0,1Mbicarbonato pH 9,6; 0,1M

16 ml de carbonato de sodio 0,2M (2,12 g Na2Co3 en 100 ml de agua destilada).

34 ml de bicarbonato de sodio 0,2M (1,68 g NaHCo3 en 100 ml de agua destilada).

Llevar a 200 ml con agua destilada.

Solución amortiguadora fosfatoSolución amortiguadora fosfatoSolución amortiguadora fosfatoSolución amortiguadora fosfato----citrato pH 5; 0,1Mcitrato pH 5; 0,1Mcitrato pH 5; 0,1Mcitrato pH 5; 0,1M

24,3 ml de ácido cítrico 0,1M (19,2 g / litro).

25,7ml de Na2HPO4 0.2M (28,4 g / litro)

Llevar a 100 ml con agua destilada


---- Soluciones Western Blot Soluciones Western Blot Soluciones Western Blot Soluciones Western Blot ----

Tris/HCl 1.5 M pH 8.8Tris/HCl 1.5 M pH 8.8Tris/HCl 1.5 M pH 8.8Tris/HCl 1.5 M pH 8.8

18,15 g de Tris base en agua destilada

Ajustar a pH 8.8 con HCl concentrado y llevar a 100 ml con agua destilada

Tris/HCl 1.5 M pH 6.8Tris/HCl 1.5 M pH 6.8Tris/HCl 1.5 M pH 6.8Tris/HCl 1.5 M pH 6.8

12,1 g de Tris base en agua destilada

Ajustar a pH 6.8 con HCl concentrado y llevar a 100 ml con agua destilada

Congelar o esterilizar por autoclavado

SDS 10 %SDS 10 %SDS 10 %SDS 10 %

10 g de SDS en 100 ml de agua destilada. Mantener a temperatura ambiente

APS 10%APS 10%APS 10%APS 10%

0,5 g de persulfato de amonio en 5 ml de agua destilada. Conservar a —20ºC

Acri/bis 30%Acri/bis 30%Acri/bis 30%Acri/bis 30%

29,2 g de acrilamida

0,8 g de bisacrilamida

Llevar a 100 ml con agua destilada, almacenar a temperatura ambiente.

Buffer de corrida 10XBuffer de corrida 10XBuffer de corrida 10XBuffer de corrida 10X

30,3 g de tris base

144,3 g de glicina

10 g de SDS

Disolver en 800 ml de agua destilada. Verificar pH 8.3 y llevar a 1000 ml con agua destilada

Buffer de transferenciaBuffer de transferenciaBuffer de transferenciaBuffer de transferencia

2,9 g de tris base

14,5 g de glicina

150 ml de metanol

Llevar con agua destilada a 1000 ml. Verificar pH 8.5—8.6

El metanol es una variable a ajustar según el tamaño de proteína. Proteínas mas pequeñas llevan mayor concentración de metanol


Anexo II Anexo II Anexo II Anexo II ----Materiales y reactivos: Descripción y precaucionesMateriales y reactivos: Descripción y precaucionesMateriales y reactivos: Descripción y precaucionesMateriales y reactivos: Descripción y precauciones----

Microplacas Nunc Maxisorp Microplacas Nunc Maxisorp Microplacas Nunc Maxisorp Microplacas Nunc Maxisorp

Fondo plano

Antígeno de excreción/secreción de larvas L1 de Antígeno de excreción/secreción de larvas L1 de Antígeno de excreción/secreción de larvas L1 de Antígeno de excreción/secreción de larvas L1 de Trichinella spiralisTrichinella spiralisTrichinella spiralisTrichinella spiralis.

Producido por Inst. Patobiología, INTA Castelar.

Conjugado peroxidasa anti Conjugado peroxidasa anti Conjugado peroxidasa anti Conjugado peroxidasa anti –––– IgG cerdo IgG cerdo IgG cerdo IgG cerdo

Desarrollada en conejo, 1:40000, molécula entera.

Conservar en heladera

Leche en polvo descremada Molico® Leche en polvo descremada Molico® Leche en polvo descremada Molico® Leche en polvo descremada Molico®

OPDOPDOPDOPD: o-Phenylenediamine dihydrocloride

Fotosensible, mutagénico


Acido clorhídrico 37% fumanteAcido clorhídrico 37% fumanteAcido clorhídrico 37% fumanteAcido clorhídrico 37% fumante

Conservar a temperatura ambiente

Trabajar bajo campana

Pepsina 1/10.000 U.S. Nacional FormulaPepsina 1/10.000 U.S. Nacional FormulaPepsina 1/10.000 U.S. Nacional FormulaPepsina 1/10.000 U.S. Nacional Formula

Presenta fecha de vencimiento


Tween 20 monolaurato: Polyoxiethylenesorbitan

Acido cítrico (C6H8O7): Acido libre anhidro

Cloruro de potasio (KCl)

Cloruro de sodio (ClNa) Conservar a temperatura

Carbonato de sodio (Na2CO3) ambiente

Bicarbonato de sodio (NaHCO3)

Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)

Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)

AcAcAcAcrilamida y bisacrilamidarilamida y bisacrilamidarilamida y bisacrilamidarilamida y bisacrilamida

Neurotóxicos


ANOTACIONESANOTACIONESANOTACIONESANOTACIONES

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Referencias bibliográficasReferencias bibliográficasReferencias bibliográficasReferencias bibliográficas

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3. Gamble, H.R.; Bessonov A.S.; Cuperlovic K.; Gajadhar A.A.; van Knapene F.; Noeckler K.; Schenone H.; Zhuh X.2000. International Commission on Trichinellosis: Recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption. Veterinary Parasitology. 93: 393-408

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5. Pozio, E.; Sofronic-Milosavljevic, L.; Gomez Morales, M.A.; Boireau, P. and Nöckler, K. 2002. Evaluation of ELISA and Western Blot Analysis using three antigens anti-Trichinella IgG in horses. Veterinary Parasitology. 108: 163-178.

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9. Voller, A.; Bidwell, D. y Bartlett, A. 1979. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). 67 pp.

10. Sitios Web:

International Commission on Trichinellosis

http://monsite.wanadoo.fr/intcomtrichinellosis/index.jhtml

Figura 1

http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Image_Library.htm (Junio, 2007)

PROVISIÓN INTEGRAL DE LABORATORIOS J. HERNANDEZ 361 (7000) TANDIL

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