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Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata

MANUAL DE INMUNODIAGNÓSTICO

Inmunobiología Animal Básica

FCV, UNLP.

Venturini M.C., Bacigalupe D., Miceli G., Larsen A., Rambeaud M., Pardini L., Dellarupe A., Serena S., Campero L. M., Gos M. L., Bernstein M.

AÑO 2013

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INMUNODIAGNÓSTICO Consideraciones Generales En medicina veterinaria se utilizan diferentes pruebas de inmunodiagnóstico con el fin de detectar antígenos o anticuerpos in vitro. La sensibilidad y la especificidad son dos atributos de las pruebas de inmunodiagnóstico. Desde el punto de vista inmunológico la sensibilidad se refiere a la capacidad que posee la prueba para detectar pequeñas cantidades de antígeno o de anticuerpo. La especificidad por su parte, se refiere a la interacción entre los epitopes de un antígeno y sus anticuerpos específicos. Desde el punto de vista epidemiológico la sensibilidad de las pruebas se refiere a la capacidad de las mismas para detectar a los verdaderos positivos y la especificidad, a la capacidad para detectar los verdaderos negativos. En la medida que aumenta la sensibilidad lo hace en detrimento de la especificidad y viceversa. Más adelante nos referiremos a estos conceptos con mayor detalle. Existen numerosos sistemas de detección de antígenos y anticuerpos, siendo en algunas ocasiones la elección de los mismos, dependientes de factores tales como la disponibilidad, el tiempo que insume la realización del mismo, los requerimientos de bioseguridad, los costos, etc. Por eso en algunos casos, las pruebas que son empleadas por algunos laboratorios no son necesariamente las más sensibles o las más específicas. Cuando se interpreten los resultados, por lo tanto, habrá que tener en cuenta estas consideraciones. Para evitar errores en la interpretación de las pruebas empleadas se debe considerar que:

- Las pruebas serológicas miden anticuerpos circulantes - Estos son de tipo IgM e IgG - La IgM aparece inicialmente ante el primer contacto con un agente

infeccioso o un antígeno vacunal y declina relativamente rápido. La Ig G hace su pico posteriormente pero permanece durante más tiempo Ante un segundo contacto con el Ag, resulta una respuesta rápida a IgG con niveles basales de IgM (Respuesta secundaria). Fig 1

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- No todas las pruebas de diagnóstico miden IgM e IgG con igual eficiencia.

- La detección de IgM está relacionada con una primo infección o primo- vacunación reciente. La IgG indica estadíos crónicos.

- Es importante determinar la seroconversión en muestras pareadas con

intervalo de por lo menos 21 días. Fig 2

Título de Ac

Días

IIggMM

IIggGG

4

16

64

256

7 14 21 28

Muestras pareadas

1ra extracción

2da extracción

Primera inoculación

Semanas

Infección

4

- Cuando las muestras de suero de una población deben compararse es importante tener en cuenta la variación biológica en la respuesta inmune en cada individuo y considerar que las mismas deben realizarse en las mismas condiciones, en el mismo día, es decir bajo las mismas variables.

- Los resultados positivos a una prueba indican la detección de anticuerpos específicos y sugieren la exposición a un agente infeccioso (previa o actual), una vacunación previa, una reacción inespecífica (falso positivo) o una reacción cruzada con microorganismos antigénicamente relacionados.

- Los resultados negativos a una prueba pueden indicar un titulo de anticuerpos específicos por debajo de los detectables de acuerdo a la sensibilidad de la prueba, entonces no siempre un resultado negativo indica ausencia de infección, ya que por ejemplo puede ocurrir que los animales se hayan infectado recientemente y no den resultados positivos porque no se produjo la seroconversión.

- Algunos animales portadores pueden ser seronegativos, por ejemplo en el caso de infecciones bacterianas de las mucosas puede no producirse una respuesta sistémica.

- Si se realiza una prueba de inmunodiagnóstico es importante determinar si animales nacidos de madres vacunadas han disminuido los títulos de anticuerpos adquiridos pasivamente.

- Los animales de una población que presenten signos clínicos deberían controlarse serológicamente, pero en otros casos las muestras deben tomarse al azar y representar significativamente a la población. La cantidad de muestras depende de la prevalencia estimada para la enfermedad.

- Si se está haciendo el seguimiento de animales vacunados, se debe considerar que la prueba sea capaz de detectar anticuerpos vacunales con adecuada sensibilidad.

- Finalmente, tener en cuenta que el diagnóstico serológico es una herramienta que colabora con el diagnóstico definitivo.

CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS

DE INMUNODIAGNÓSTICO

μg proteína /ml Pruebas primarias: IFI 0.0005

Inmunoenzimáticas: ELISA 0.0005 IHQ WB

Pruebas secundarias: Aglutinación 0.05

Aglutinación indirecta 0.01 Precipitación 30 Fijación de complemento 0.05

• Pruebas terciarias: Anafilaxia cutánea pasiva 0.02

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Sueros hiperinmunes producidos en diferentes especies utilizados para el diagnóstico

Day M. y Schultz R. (modificado)

Inmunizar con: 1- Inmunoglobulina de una especie (conejo) 2- Obtener anti-Ig anti especie (en caballo)

Inmunizar con Ig G, Ig M, etc de 1 especie

Determinar Acs. anti- Ig

Purificar

Por ejemplo: Anti IgG de conejo Preparado en caballo

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Son necesarios para realizar las pruebas de inmunodiagnóstico: Antígenos de diagnóstico producidos en Laboratorios (se adquieren) Sueros provenientes de animales de los que se sospecha una determinada enfermedad Antígenos presentes en muestras (órganos, líquidos, etc) provenientes de animales de los que se sospecha una determinada enfermedad

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Suero del animal sospechoso de padecer la enfermedad: ddiilluucciioonneess

 

   

  

  

  

  

8 μl

 

1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800

100 µl 

 

100 µl

 

100 µl

 

100 µl

 

100 µl

 

Suero Buffer (PBS)

192 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl

DILUCIÓN

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PRUEBAS PRIMARIAS

INMUNOFLUORESCENCIA Fundamento: Ciertas sustancias llamadas fluorocromos (Isotiocianato de fluoresceína y rodamina), al ser excitadas por luz ultravioleta, emiten un haz de luz de mayor longitud de onda, que se visualizan con un microscopio de fluorescencia. Cuando estas sustancias se conjugan con inmunoglobulinas (anticuerpos) permiten detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en una muestra problema. Conjugado o anticuerpo marcado: denominamos conjugado, anticuerpo marcado o anticuerpo secundario a la inmunoglobulina (puede ser contra la fracción gamma total, anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, etc.) unida con la sustancia fluorescente. Este anticuerpo se produce en una especie distinta (por ejemplo cabra, oveja, conejo) a la que pertenece el suero problema.

Microscopio de inmunofluorescencia

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA: permite la detección de antígenos, usando anticuerpos conocidos conjugados con sustancias fluorescentes. 1- Muestra Problema (adecuadamente procesada) 2- Fijar 3- Añadir conjugado específico 4- Incubar

8

5- Lavar con buffer de fosfatos (PBS) o SF 6- Secar 7- Montar el preparado 8- Observar en el microscopio de Fluorescencia INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) Permite la detección de anticuerpos, utilizando antígenos conocidos y conjugados específicos anti - especie . 1 - Portaobjetos con antígeno conocido 2 - Suero problema diluido en PBS o SF 3 - Colocar las diluciones del suero en los pocillos del portaobjetos 4 - Incubar 5 - Lavar con PBS o SF 6 - Agregar el conjugado anti-especie y anti-isotipo de anticuerpo a detectar 7- Incubar 8 - Lavar con PBS o SF 9 - Secar 10 - Montar el preparado 11- Realizar la lectura en microscopio de fluorescencia Lectura: se relaciona con la observación de fluorescencia (color verde manzana por el isotiocianato de fluoresceína) y con la morfología que debe corresponderse con lo investigado (morfología bacteriana, parasitaria, cuerpos de inclusión, etc.).

IF Directa

Antígeno problema

Conjugado Conjugado

Antígeno conocido

Portaobjeto

Anticuerpo especifico en suero problema

IF Indirecta

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PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA). OBJETIVO: Conocer, realizar e interpretar las pruebas inmunoenzimáticas aplicadas al diagnóstico. FUNDAMENTO La prueba de ELISA permite detectar la unión antígeno-anticuerpo en su fase primaria. El revelado de esa reacción tiene lugar por que los anticuerpos se han conjugado (unido) a una enzima que al reaccionar con su sustrato específico, en presencia de un cromógeno, da una reacción coloreada. Como es una prueba de alta sensibilidad cuantitativa, permite la detección de cantidades pequeñas de complejos antígeno-anticuerpo. La lectura de la reacción se hace con un espectrofotómetro (lector de ELISA). MATERIALES: Fase sólida: Necesaria para la fijación de los reactantes, pueden utilizarse tubos, perlas de látex o especialmente para las reacciones serológicas, policubetas.

Conjugado: Se denomina así a la unión de la inmunoglobulina (anti IgG, anti IgM o anti Ig total) y la enzima seleccionada. Existen dos métodos de conjugación: a) Química y b) Inmunológica. Enzimas: Para ser utilizadas deben reunir una serie de requisitos, a saber

• Solubles • Estables • Específicas con relación al sustrato • Elevada pureza • Bajo costo

Las más utilizadas son: peroxidasa, fosfatasa alcalina, galactosidasa y ureasa. Sustrato: Está en directa relación con la enzima seleccionada, debe reunir ciertas condiciones:

• soluble • incoloro antes de la acción de la enzima

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• producir cromógenos estables después de la degradación • no tóxico • no mutagénico

Inmunoglobulinas: Se conjugan con la enzima, dependen del tipo de ensayo a ejecutar, por ejemplo, si deseamos detectar un antígeno en una muestra, conjugaremos un suero anti antígeno específico. Si por el contrario queremos titular anticuerpos, conjugaremos un suero anti inmunoglobulina. Muestras: Antígenos: muestras de materia fecal, extractos tisulares, alimentos, etc Anticuerpos: muestras de suero, leche, secreciones corporales, líquido cefalorraquídeo. Lectura: Puede realizarse en forma cualitativa, a ojo desnudo o cuantitativamente por espectrofotometría. Enzima Obtención Sustrato cromógeno Fosfatasa alcalina intestino bovino para-nitrofenilfosfato(p-NPP) Peroxidasa rábano picante H2O2 / ABTS Ureasa judía urea (lectura a ojo desnudo) Bloqueantes: Albúmina bovina o leche descremada. Solución de lavado: Solución buffer de fosfatos (PBS) con tween 20. Clasificación

• ELISA directo • ELISA indirecto • ELISA de Captura • ELISA de Competición

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ELISA Directo ELISA Indirecto

H2O2

O2+H2O

Cromógeno coloreado Cromógeno

incoloro

E

H2O2

O2+H2O

Cromógeno coloreado

Cromógeno incoloro

E

Muestra con Ag desconocido

Conjugado

Conjugado

Ac específico en Suero problema

Ag conocido

Bloqueo

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ELISA de competición

1. Antígeno que se adsorbe a la placa 2. Proteína bloqueante que cubre espacios libres sin recubrir por el antígeno 3. Incubación de una mezcla de suero problema y Acs monoclonales anti-epitope

específico. En esta etapa el Ac problema compite con el Ac monoclonal para unirse al antígeno,

4. Incubación con conjugado anti-Ac monoclonal 5. Revelado. 6. Lectura. Resultado positivo: el Ac problema se une con el antígeno. No se

observa color. Resultado negativo: al no haber Ac problema, el Ac monoclonal se une con el antígeno. Se observa color.

O2+H2O

Cromógeno coloreado

H2O2

Cromógeno incoloro

12)

3)

4) 5)

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INMUNOHISTOQUÍMICA

Las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) permiten detectar antígenos en tejidos, células o estructuras subcelulares. Se fundamenta en el uso de sueros primarios monoclonales o policlonales conocidos, dirigidos contra el agente o estructura a identificar. Los anticuerpos (Ac) secundarios (anti-especie del Ac primario) están conjugados con enzimas que reaccionan con un sustrato, en presencia de un cromógeno, dando como resultado una reacción coloreada persistente que permite la identificación del antígeno. Las enzimas que se utilizan con mayor frecuencia son la peroxidasa (horseradish preoxidase) y la fosfatasa alcalina. Para la identificación de antígenos (protozoarios, hongos, bacterias, virus, enzimas, hormonas, proteínas etc.) se pueden utilizar extendidos y cultivos celulares tratados con acetona en frío y conservados a –20º C hasta su utilización, cortes por congelación o bien de tejidos fijados en formol neutro al 10% e incluidos en parafina. Las técnicas de IHQ se utilizan con frecuencia sobre muestras de tejidos como complemento del estudio histopatológico, con la finalidad de un diagnóstico más preciso (relación agente etiológico-lesión). Si se conserva material exclusivamente para IHQ, pueden compararse distintos fijadores hasta encontrar el más adecuado. Sin embargo, siendo el formol neutro el fijador que se utiliza comúnmente para las muestras de histopatología, éste es el de uso más frecuente. Se considera que el formol puede enmascarar o alterar antígenos, ya que se une a proteínas (aminoácido lisina). Es conveniente no extender la fijación en formol si se conoce que un tejido será usado para IHQ. En algunos casos para “desenmascarar” el material antigénico se utilizan enzimas (tripsina, pepsina, etc), debiendo evaluarse el daño que pudieran producir al tejido. Con el mismo fin también se utilizan el horno a microondas y el ultrasonido. En la técnica de IHQ, los cortes fijados al portaobjeto se pasan por un tren de xiloles y alcoholes hasta hidratar el tejido. Se bloquea la peroxidasa endógena y luego se inicia la técnica inmunológica sobre el corte. Existen métodos directos e indirectos. Con el fin de lograr una mayor sensibilidad de la prueba, se emplean técnicas que amplifican la reacción como el PAP (peroxidasa anti peroxidasa) y la de ABC (complejo de avidina-biotina). En este ejemplo se indican los pasos de la técnica de ABC.

1- Bloquear la peroxidasa endógena sumergiendo los portaobjetos con las muestras fijadas, en una solución de agua oxigenada.

2- Tratar con enzimas, microondas o ultrasonido (si corresponde). 3- Bloquear con un suero de la misma especie en la que se produjo el

anticuerpo secundario (por ej: cabra). 4- Colocar el anticuerpo primario (contenido en un suero hiperinmune

contra el Ag problema, por ej: hecho en conejo). Incubar. Lavar. 5- Colocar el anticuerpo secundario, biotinilado, anti-conejo preparado en

cabra. 6- Agregar la avidina peroxidizada. Amplificar.

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7- Se utiliza como cromógeno DAB (diaminobenzidina) en presencia de agua oxigenada.

8- Se realiza una coloración de contraste con hematoxilina. 9- Se deshidrata, se monta y se observa. 10- La coloración marrón indica la presencia del antígeno. Se debe tener en

cuenta la morfología ya que puede haber coloraciones inespecíficas.

Fig1: Técnica ABC

IMMUNOBLOTTING O INMUNOTRANSFERENCIA

Fundamento: Una vez realizada la corrida electroforética, en gel de poliacrilamida (PAGE), es posible transferir las proteínas de la muestra a una membrana de nitrocelulosa. Este procedimiento se hace utilizando un aparato para inmunotransferencia. Las diferentes porciones antigénicas de la muestra, se enfrentan luego con los sueros problema. Si éstos reaccionan con una o varias porciones podremos observarlo al revelar la reacción. Para eso se utiliza un suero conjugado con peroxidasa, anti-especie, en presencia de un cromógeno y de un sustrato. Este procedimiento es similar a una prueba de ELISA indirecta, pero realizado sobre la membrana que recibió las proteínas. De esta manera es posible identificar contra qué porción del antígeno reacciona el suero, identificándolo de acuero a su peso molecular.

5.Colocar avidina biotina + peroxidasa .

6.Solución reveladora (H2O2 + DAB)

1.Portaobjeto con corte 2.Inactivar la peroxidasa

3.Agregar anticuerpo primario(suero hiperinmune).

4. Lavar y agregar anticuerpo 2ª biotinilado (anti especie) I b l

DDAABB

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Westernblot o inmunotransferencia (Fig.3)

Regueiro González

Fig.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida e Inmunotrasferencia. Si en el suero problema hay anticuerpos específicos para alguna de las fracciones antigénicas, se unirán a estas últimas. Esta unión se pondrá en evidencia con un conjugado anti- especie marcado con una enzima, que actúa sobre un sustrato, en presencia de un cromógeno, dando como resultado bandas coloreadas.

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PRUEBAS SECUNDARIAS

AGLUTINACIÓN Objetivos: - Conocer el fundamento y los diferentes tipos de pruebas de aglutinación - Identificar los materiales y reactivos - Interpretar los resultados Fundamento La aglutinación es una prueba secundaria que se produce cuando el antígeno particulado o forme (bacterias, glóbulos rojos, etc) interactúa con el anticuerpo específico, con la consiguiente formación de un grumo o aglutinado, que representa la segunda fase de la unión Ag-Ac (enrejado de Marrack). Clasificación - Aglutinación directa: el antígeno es naturalmente particulado. - Aglutinación indirecta o pasiva: el antígeno, originalmente soluble, está unido a un soporte (orgánico o inorgánico) para hacerlo particulado. Otra clasificación - Cualitativas: cuando el resultado se expresa como positivo o negativo. - Cuantitativas: cuando el resultado de la prueba se expresa como título de

anticuerpos. - Lectura rápida - Lectura lenta - Macrométodos: se realizan en tubos - Micrométodos: se realizan en microplacas Las denominadas pruebas tamiz: son pruebas de alta sensibilidad, económicas, rápidas. Debido a su alta sensibilidad y baja especificidad, estas pruebas pueden dar resultados falsos positivos. Por eso los animales positivos se deben re-evaluar con otras pruebas más específicas (pruebas complementarias). Ejemplos: • Aglutinación directa: para el diagnóstico de micoplasmosis, pullorosis, salmonelosis, brucelosis , bordetelosis, pleuroneumonías producidas por Haemophilus, toxoplasmosis, leptospirosis, serotipificación bacteriana, etc. • Aglutinación indirecta: para el diagnóstico de toxoplasmosis, pasteurelosis, tripanosomiasis, leishmaniasis, sarcocistosis, trichinelosis, etc. • Ejemplos de pruebas de aglutinación directas, rápidas en placa. Cualitativas Prueba de Angus y Barton (BPA) para brucelosis bovina

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Es una prueba tamiz, cuyo antígeno es producido con la cepa 1119/3 de Brucella abortus. Se lee rotando la placa para ver la presencia o no de grumos. Lectura Positivo: Presencia de grumos Negativo: ausencia de grumos • Pruebas de aglutinación directa lentas en tubo. Cuantitativas: Son pruebas complementarias, con las que se evalúan los sueros que dieron positivos por la prueba tamiz de BPA. -Prueba de Wright para el diagnóstico de la Brucelosis - Prueba de 2 Mercaptoetanol para Brucelosis. • Ejemplo de prueba de aglutinación indirecta. Cuantitativa. Micrométodo Prueba para el diagnóstico de la toxoplasmosis animal El antígeno de T. gondii, que es soluble (taquizoítos fragmentados), se adsorbe a partículas de Látex, conviertiéndose así en un antígeno particulado. Se considera que el suero es positivo, cuando en el fondo del pocillo se ve un entramado, que es el enrejado de Marrack, que indica la reacción Ag-Ac. Se considera negativo (sin anticuerpos específicos) cuando se ve un botón, que es el antígeno sin aglutinar, que sedimentó en el fondo del pocillo. POSITIVO: NEGATIVO:

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PRECIPITACIÓN OBJETIVOS : - Conocer el fundamento de las pruebas de precipitación. - Interpretar resultados. Fundamento: Es una prueba de fijación secundaria en la cual el antígeno se encuentra en estado soluble y al unirse al anticuerpo específico se forma un precipitado que se observa como una banda en los medios semisólidos. Clasificación de las pruebas de precipitación según el soporte 1.Precipitación en medios líquidos: 1.1. Cualitativos: Prueba de Ascoli-Valente. 1.2. Cuantitativos: Titulación de sueros. 2.Precipitación en medios semisólidos o gelificados: Pruebas de Inmunodifusión en agar gel 2. 1. Cualitativos: En Tubo: Prueba de OUDIN o Monodireccional. Prueba de OAKLEY-FULLTHORPPE o Bidireccional. En placa: Prueba de OUCHTERLONY o Doble Difusión Bidireccional. Prueba de COGGINS- NORCROSS. 2.2. Cuantitativa: En placa: Prueba de MANCINI- CARBONARA o Inmunodifusión radial en placa. INMUNODIFUSION EN AGAR GEL Las diferentes pruebas de Precipitación en medios gelificados, o pruebas de inmunodifusión se fundamentan en las características de los reactantes, el soporte y las leyes que rigen este fenómeno. Reactantes: Anticuerpos: la Ig más activa en esta prueba es la IgG. Antígenos: deben ser solubles, con un PM capaz de permitir la migración por el medio semisólido. Ejemplos proteínas (toxinas, proteínas séricas, proteínas cárnicas, proteínas citoplasmáticas bacterianas, proteínas virales estructurales y no estructurales, etc.), polisacáridos, polímeros de ácidos nucleicos.

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Soporte: el medio semisólido se logra utilizando medios gelificados. Los soportes más usados son geles de agar altamente purificado o agarosa, y para pruebas más específicas, poliacrilamida, tiras de acetato de celulosa gelificados, etc. En todos los casos el antígeno y el anticuerpo difunden en la matriz gelificada, el uno hacia el otro y se unen formando inmunocomplejos Ag.-Ac, que en la zona de equivalencia producen un precipitado que se visualiza como una simple línea blanca o banda de precipitado. Este fenómeno se encuentra regido por las leyes generales de la inmunodifusión: -La difusión se produce de gradientes de mayor concentración a los de menor concentración. -La velocidad de difusión es directamente proporcional a la cantidad del reactante e inversamente proporcional al tamaño del mismo. -La velocidad de difusión está condicionada por el tamaño de las moléculas del medio de soporte y por la concentración del mismo. La velocidad de difusión es inversamente proporcional a la concentración del gel. Interpretación de resultados en la prueba de OUCHTERLONY o Doble Difusión Bidireccional: 1) IDENTIDAD TOTAL 2) NO IDENTIDAD 3) IDENTIDAD PARCIAL 1) coalescencia de los arcos: significa identidad inmunológica entre las muestras. 2) arcos que se cruzan: falta total de identidad entre las muestras. 3) espolón: significa identidad parcial entre las muestras. Ejemplo de pruebas de inmunodifusión: Test de Coggins. Prueba de inmunodifusión doble bidireccional en placa para diagnóstico de Anemia infecciosa equina. Se realiza en placas de Petri de plástico o vidrio, en las que se coloca el soporte (agar). Se perfora el agar con el sacabocado. Se llenan con el antígeno el pocillo central y con los sueros problemas y controles los pocillos de la periferia. Se incuba a temperatura ambiente en cámara húmeda por un período de 24-48hs. Se realiza la lectura e interpretación de las bandas de precipitación

Ag A

Ac anti A

Ag A Ag A Ag B Ag A Ag A y Ag B

Ac anti A

Ac anti A

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Ejemplos de enfermedades diagnosticadas por esta prueba: Titulación de sueros hiperinmunes. Diagnóstico de Brucelosis ovina y canina Leucosis bovina Aftosa (VIAA) Gumboro Marek Identificación antigénica (alimentos, tipificación de virus).

PRUEBA DE FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

Definición: La prueba de Fijación de Complemento (FC) es la prueba secundaria de mayor sensibilidad. La prueba se fundamenta en dos propiedades del complemento: 1) la capacidad del complemento para unirse a complejos antígeno-anticuerpo, independientemente de su especificidad, 2) la lisis de los eritrocitos sensibilizados del sistema hemolítico revelador. La reacción puede utilizarse tanto para detectar antígenos como anticuerpos problema.

Reactivos Complemento: Es una mezcla de suero de cobayos sanos. Luego de obtener el suero, la cantidad de complemento debe ser titulada. La dosis de complemento se especifica en términos unidad fijadora de complemento UFC50%, que se define como la cantidad de complemento necesaria para lisar el 50% de los eritrocitos sensibilizados. Sistema Hemolítico:

CC+

C

+ -

-

Ag

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-Glóbulos rojos: se obtiene en forma aséptica de carneros. Se resuspenden entre el 2 y el 5% según protocolo, de este modo se conservan a 4°C entre 5 días a 6 semanas. -Anticuerpos anti-glóbulos rojos de carnero, o Hemolisina: se denomina hemolisina a un suero que contiene un alto título de anticuerpos contra los glóbulos rojos de carnero. La hemolisina suele prepararse en conejo con un protocolo de hiperinmunización (sensibilización e inmunización). El Sistema hemolítico se logra combinando los glóbulos rojos de carnero con la hemolisina, como resultado obtenemos hematíes sensibilizados. Tanto la hemolisina como el sistema hemolítico deben ser perfectamente titulados. La unidad de medida del sistema hemolítico son las Unidades Hemolíticas 50%, UH50%, que es la máxima dilución del suero hemolítico a partir de la cual se obtiene una hemólisis constante aumentando la concentración del mismo. Antígeno conocido: en esta prueba se pueden emplear tanto antígenos solubles como particulados. Ejemplo de antígeno soluble es el que se usa en FC para Aftosa, un ejemplo de antígeno particulado es la prueba de FC para brucelosis. El antígeno debe estar debidamente titulado. Sueros controles: para toda prueba se deben emplear sueros controles positivos y negativos. Soporte: como soporte se pueden utilizar microplacas de 96 pocillos o tubos, según protocolo. Diluyentes: se utilizan soluciones amortiguadas. Muestras: sueros problemas. Actividad anticomplementaria: los sueros con actividad anticomplementaria son aquéllos con la capacidad de fijar el complemento aún en ausencia de antígeno. Ciertas condiciones, en particular la contaminación bacteriana, puede aumentar la actividad anticomplementaria natural del suero. Los sueros deben descomplementarse a 56°C durante 30 minutos. Lector: espectrofotómetro, determina densidades ópticas (DO) de hemoglobina libre en el sistema.

Reacción de Fijación de Complemento La reacción se lleva a cabo en dos etapas 1era Etapa El suero problema se enfrenta con el antígeno conocido en presencia de complemento. Incubar. 2da Etapa Se agrega el sistema hemolítico. Incubar.

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Lectura: se realiza por medio de espectrofotómetro. Determina las DO de hemoglobina libre estableciendo la presencia o no de hemólisis. Interpretación: NO HAY HEMOLISIS, indica presencia de anticuerpos específicos, prueba POSITIVA HAY HEMOLISIS, indica ausencia de anticuerpos específicos, prueba NEGATIVA Gráfico: C: complemento, SH: sistema hemolítico, GR: glóbulos rojos, H: hemolisina POSITIVO NEGATIVO

Ejemplos de enfermedades que se pueden diagnosticar por fijación de complemento: Aftosa Estomatitis vesicular Pleuroneumonía contagiosa bovina Brucelosis bovina, ovina y caprina Anaplasmosis bovina Pleuroneumonía contagiosa caprina Piroplasmosis equina Encefalitis equina venezolana Mixomatosis

HEMOAGLUTINACIÓN – INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN

Objetivos: - Conocer el fundamento de la prueba de HA y de HI - Establecer la diferencia entre ambas pruebas - Interpretar resultados Introducción:

Ag

Ac C H

Ag

Ac C H

No hay HEMOLISIS HEMOLISIS

GR GR

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Se denomina hemoaglutinación a la capacidad que presentan algunas familias de virus de aglutinar los glóbulos rojos de diversas especies de animales formando en suspensión un enrejado de glóbulos rojos-virus. Por lo tanto, la hemoaglutinación (HA) NO es una prueba inmunoserológica. La hemoaglutinación se produce debido a la presencia de glicoproteínas de superficie con capacidad de aglutinar glóbulos rojos denominadas hemoaglutininas (HA). Estas glicoproteínas pueden estar presentes en las espículas del envelope (Familia Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae), en proyecciones de la cápside (Familia Adenoviridae) o constituir una fracción lipoproteica soluble, separable de la partícula viral, que se forma durante la replicación (Poxviridae). Las moléculas de HA se unen a receptores glicoproteicos de los glóbulos rojos que contienen ácido siálico con residuos terminales de ácido N-acetil-neuramínico (NANA). Estos receptores también se encuentran en otros tipos celulares como las células del tracto respiratorio y son los que permiten la adsorción de los Orthomyxovirus y Paramyxovirus para su posterior penetración. Las hemoaglutininas participan en la adsorción y penetración del virus a la célula hospedadora, estimulan la fusión entre la membrana celular y la envoltura viral, aglutinan glóbulos rojos, son las responsables del fenómeno de hemoadsorción e inducen la formación de anticuerpos. Al enfrentar al virus hemoaglutinante con los anticuerpos específicos, se produce una inhibición de la capacidad hemoaglutinante del mismo. Este fenómeno es el fundamento de la prueba de inhibición de la hemoaglutinación (HI). Algunos grupos de virus (Orthomyxovirus y Paramyxovirus) poseen una enzima denominada neuraminidasa (NA) que se encuentra como proteína estructural y actúa separando al virus del glóbulo rojo, clivando al NANA. Este fenómeno se denomina elución. La función principal de la NA es facilitar la movilidad del virus hacia y desde el sitio de infección. Permite el pasaje del virus a través del mucus, destruye el receptor para la HA sobre la célula hospedadora permitiendo la elución de la progenie viral de la célula infectada. En los Orthomyxovirus la NA se encuentra en espículas independientes de las HA, mientras que los Paramyxovirus poseen espículas con actividad de HA y NA. Hay grupos de virus hemoaglutinantes que carecen de neuraminidasa (Adenoviridae), en estos casos la hemoaglutinación es irreversible.

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Virus Hemoaglutinantes Familia Orthomyxoviridae Género Influenza, tipo A (humana, equina, porcina, aviar) tipo B, C (humanos) Familia Paramyxoviridae Género: Paramyxovirus Especie: Virus Parainfluenza (bovina, canina) Virus de New Castle Virus de la Parotiditis humana Género: Morbilivirus Especie Virus de Distemper Virus del Sarampión Virus de la Peste bovina Familia Adenoviridae Género: Adenovirus Especie: Virus del Síndrome de caída de postura Familia Parvoviridae Género: Parovirus (canino, porcino) Familia Togaviridae Género: Alfavirus Especie: Virus de la encefalomielitis equina Familia Reoviridae Género: Reovirus, Rotavirus VIRUS Glóbulos rojos que son aglutinados Influenza Pollo, Bovino, Cobayo

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Paramyxovirus Pollo, Cobayo Parainfluenza Bovino Parvovirus Cerdo, Cobayo Adenovirus (SCP) Pollo, Pato Técnica de HA para titulación viral Objetivo: Determinar el título de la suspensión viral para la posterior realización de la prueba de HI 1- Colocar 50 µl de PBS en cada pocillo 2- Agregar 50 µl de virus puro y efectuar las diluciones en base 2 3- Agregar µl de GR lavados al 1% 4- Efectuar la lectura a los 30-60 minutos a temperatura ambiente 5- Determinar las unidades de HA (UHA) Interpretación del resultado:

Prueba de HI para titulación de un suero problema Objetivo: determinar el título de anticuerpos séricos para un virus hemaglutinante, por ejemplo el virus de New Castle Para la prueba de Inhibición de hemoaglutinación se usa como antígeno una concentración viral que varía entre 4 y 8 UHA, según el protocolo diseñado para cada virus. En el ejemplo anterior, si utilizáramos 8 UHA, una vez realizada la titulación viral debemos hacer una dilución 1/64 de la suspensión viral original. 1- Colocar 50 µl de la dilución viral correspondiente a 8 UHA en cada pocillo de la microplaca 2- Colocar 50 µl de suero problema en el primer pocillo y efectuar diluciones en base 2 3- Incubar 30-60 minutos a temperatura ambiente. 4- Colocar 25 µl de glóbulos rojos lavados al 1 % en cada pocillo 5- Incubar 30-60 minutos a temperatura ambiente

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 8UHA 4UHA 2UHA

1/512 es la última dilución de virus capaz de producir hemoaglutinación completa.

Se considera que esta dilución corresponde a 1 Unidad Hemoaglutinante

1 UHA

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6- Efectuar la lectura. Interpretación del resultado

El título de anticuerpos de un suero se expresa multiplicando las UHI por las UHA utilizadas. En este ejemplo es: Título: 64 UHI x 8 UHA = 512

1/2 1/4 1/8 16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096

1/64 es la última dilución del suero capaz de inhibir el fenómeno de HA. La inversa de la dilución corresponde a 64 Unidades de inhibición de la hemoaglutinación o 64 UHI

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PRUEBAS TERCIARIAS Definición: Pruebas que detectan la unión antígeno anticuerpo en un sistema vivo, ya sea animales de laboratorio o cultivos celulares.

SERONEUTRALIZACIÓN La prueba se fundamenta en la pérdida de la infectividad de un microorganismo (virus o bacterias) o de la toxicidad (toxinas), por la acción de anticuerpos específicos presentes en el suero, que los neutralizan. Metodología: Existen dos técnicas: a) suero constante- antígeno variable b) suero variable- antígeno constante: más utilizada, donde se diluye el suero problema y se enfrenta a una cantidad constante de antígeno. En ambas pruebas siempre deben incluirse sueros controles positivos y negativos. Los sueros deben descomplementarse a 56°C durante 30 minutos. Técnica, por ejemplo para seroneutralización de virus: Se realizan diluciones del suero problema con solución salina tamponada. Se le agrega a cada tubo una solución constante de virus, para que se produzca la reacción antígeno anticuerpo se lleva a una hora a 37°C, esta mezcla se inocula en un sistema sensible que puede ser: un animal de laboratorio, (ratón, hámster), o un cultivo celular (primario o de línea). La lectura se realiza por observación al microscopio de los cultivos celulares, teniendo en cuenta el efecto citopatogénico producido por el virus o si se realizan en animales, se evalúan los que sobreviven y los que mueren, indicando en el primer caso que el virus fue neutralizado y en el segundo no, produciendo la muerte de los animales susceptibles. Los cálculos de los títulos se efectúan por el método de Reed-Muench o Sperman Karber. Los efectos citopatogénicos (ECP) se deben a cambios morfológicos inducidos por ciertos virus, alteraciones que se manifiestan en la capa de células adheridas al soporte de la prueba. Estos cambios morfológicos van desde cambios sutiles en la estructura de la célula a la destrucción total de la monocapa celular. Estos cambios no son reacciones inmunológicas, la inhibición de los ECP por anticuerpos específicos sí es una reacción inmunológica. Los tipos de ECP básicos son:

1- Efecto lítico 2- Cuerpos de inclusión 3- Sincitios 4- Vacuolización 5- Bridas

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SEROPROTECCIÓN Es similar a la prueba de seroneutralización, pero la diferencia la marca el hecho de que los animales a utilizar están previamente inoculados con el anticuerpo y luego se los desafía con el agente infeccioso. El cálculo se realiza también teniendo en cuenta los animales que sobreviven y los que mueren y se determinan los títulos por los mismos métodos de Reed-Muench o Sperman Karber. ANAFILAXIA CUTÁNEA PASIVA (APC) Es una prueba que se utiliza para determinar si un individuo es alérgico a determinado antígeno, por lo que posee anticuerpos específicos de isotipo Ig E en el suero. El suero del individuo problema es inoculado en una rata por vía intradérmica, la IgE del suero se une a los mastocitos, a los que sensibiliza; 48 hs más tarde se inocula por vía endovenosa el antígeno y un colorante: Azul de Evans. El antígeno desencadena la degranulación de los mastocitos sensibilizados, liberando mediadores en el lugar de la inoculación primaria y causando aumento local de la permeabilidad vascular, por lo que el colorante inoculado se extravasa. El área coloreada de la piel determina la presencia de IgE específica para el antígeno inoculado. La IgE tiene una muy baja concentración en suero, por lo que se puede cuantificar sólo por pruebas de alta sensibilidad, como el radioinmunoanálisis,.

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- Inmunobiología. El sistema inmunitario en condiciones de salud y enfermedad.

Janeway C, Travers P, Walpor M, Shlomchik M. 2da. ed. Ediciones Masson S.A, Barcelona. España 2003.

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- Versión electrónica de acceso gratuito. Inmunobiology. Janeway C. Biblioteca

electrónica SECYT. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&depth=2