Manipolazione in vitro, colture cellulari, rigenerazione e

clonazione.

Totipotenza: capacità propria di cellule differenziate di mantenere

la piena potenzialità genetica e di esprimerla in determinate

condizioni, in modo da ottenere la rigenerazione di un nuovo

individuo. E’ spesso genotipo- ed espianto-dipendente.

This internode section has been cultured

for 5 days on media containing plant

growth regulators. Note the new shoots

developing - this is called organogenesis.

Internode section of Parrot feather.

Per mettere a crescere in vitro dei tessuti vegetali si procede

con una serie di passaggi:

-Scelta e prelievo dell’espianto (porzione di tessuto)

-Sterilizzazione superficiale con candeggina

-Messa a dimora in terreno di crescita sterile

La crescita in vitro richiede la presenza di sostanze nutritive minerali.

La crescita in vitro intesa come divisione e proliferazione richiede

anche la presenza di composti che stimolano il ciclo cellulare e il

de-differenziamento: auxine e citochinine (NON CITOCHINE!!)

Organogenesi in vitro: sviluppo, separato nel tempo, di distinti organi

vegetativi partendo da un espianto

somatico.

Dipende dall’applicazione di ormoni (auxine e citochinine) e dalla

abilità del tessuto a rispondere agli ormoni con un programma di

sviluppo.

Divisibile in tre fasi in base al bilancio ormonale necessario:

1- acquisizione della competenza alla rigenerazione di organi (abilità,

de-differenziamento);

2- le cellule competenti vengono stimolate verso un programma di

sviluppo determinato per un organo specifico in base all’ormone

aggiunto;

3- la morfogenesi prosegue in modo autonomo e indipendentemente

dagli ormoni aggiunti.

1- acquisizione della competenza alla rigenerazione di organi (abilità,

de-differenziamento);

Messa a dimora dell’espianto, aggiunta di ormoni (auxine e citochinine)

ad una concentrazione tale da stimolare la divisione mitotica e la

crescita indifferenziata

formazione del callo

Il parametro importante è

il rapporto tra le

concentrazioni dei due

ormoni,

di solito non devono avere

la stessa concentrazione.

2- le cellule competenti vengono stimolate verso un programma di

sviluppo determinato per un organo specifico in base all’ormone

aggiunto;

L’induzione alla rigenerazione degli organi avviene modificando il

rapporto tra le concentrazioni dei due ormoni:

sbilanciandolo verso le citochinine ( aux.)

sviluppo parte aerea

sbilanciandolo verso le auxine ( citoc.)

sviluppo radici

3- la morfogenesi prosegue in modo autonomo e indipendentemente

dagli ormoni aggiunti.

Una volta ottenuta la piantina rigenerata non è più necessario

aggiungere gli ormoni, la pianta cresce autonomamente.

Quando è sufficientemente cresciuta, la piantina

può essere trasferita in terra indistinguibile dalla pianta madre

Applicazioni:

micropropagazione,

clonazione vegetale,

piante transgeniche,

materiale pathogen-free.

Problemi:

laboriosità,

sterilità,

variazione somaclonale,

mosaicismo o chimerismo,

fragilità degli organismi rigenerati,

abituazione.

Embriogenesi somatica: sviluppo di embrioni partendo da cellule

somatiche, senza fecondazione e sviluppo dello zigote.

Embriogenesi

Nell’embrione degli animali si definiscono già tutti gli organi e tessuti

dell’individuo adulto,

nelle piante si ha invece lo sviluppo di un abbozzo di pianta (l’asse

embrionale e i due cotiledoni) che solo in un secondo tempo e durante

tutta la vita della pianta genererà tutti gli organi grazie all’attività dei

meristemi.

Già nell’asse embrionale si definiscono però:

- la simmetria radiale dei tessuti negli organi

- l’asse di sviluppo verticale apice-base

- i meristemi primari attivi dopo la germinazione.

Lo sviluppo dell’embrione dopo la fecondazione di un ovulo nella

pianta madre segue una serie di fasi ben precise diverse nelle varie

piante, ma ben caratterizzate in Arabidopsis.

Globo/sfera

Cuore

Torpedine

Stadio cotiledonare

Durante le tre fasi principali si osserva che:

la definizione dell’asse di simmetria apice-base avviene già alla prima

divisione mitotica dello zigote (cellula apicale e basale),

già nello stadio a cuore si evidenziano tre porzioni:

apicale cotiledoni e

meristema

centrale ipocotile

basale radici

Embriogenesi somatica:

nel callo in crescita una

sottopopolazione degli aggregati

(masse proembriogeniche, PEM)

mostra la capacità di dare origine ad

embrioni somatici, che si sviluppano in

modo analogo a quelli zigotici.

Tale capacità si manifesta al momento

della rimozione degli ormoni dal

terreno.

A.PEM formation in immature zygotic embryos B. Same photo showing a close up of PEMs (10X). C. PEMs forming at the base of immature

whole seeds D. Same photo showing close up of PEMs (10X). E. PEM formation in split seeds F. Close up of PEMs shown in D (10X).

Heart-shaped somatic embryo

of rose

Somatic embryos of cassave; different stages

Gli ormoni sono necessari per indurre lo sviluppo del callo e per indurre

tale potenzialità embriogenetica.

Induzione: in presenza continua di ormoni le PEM producono tutti i

prodotti genici necessari per la fase globulare ma anche prodotti che ne

inibiscono il successivo sviluppo coltura cellulare con potenzialità

embriogenetica.

Rimuovendo gli ormoni si

interrompe la sintesi degli

inibitori

l’embriogenesi prosegue

da sola

Il completamento del

programma è garantito

dalla sintesi endogena

dell’ormone. Non si hanno

le fasi successive di

dormienza.

Applicazioni embriogenesi somatica:

- moltiplicazione vegetativa,

- semi artificiali o disidratazione indotta da ABA,

Vantaggi:

- no chimerismo perché derivano probabilmente da

singole cellule.

Artificial seed

Somatic embryo

Artificial endosperm

Protoplasti

Manipolazione cellule vegetali singole, ottenute per degradazione della

parete vegetale ad opera di enzimi idrolitici (cellulasi, emicellulasi e

pectinasi, di origine fungina).