magistrski Študijski program laboratorijska … · univerza v ljubljani fakulteta za farmacijo...

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

MATEJA MATJAŽ (ŠTIRN)

MAGISTRSKA NALOGA

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA

BIOMEDICINA

Ljubljana, 2016

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

MATEJA MATJAŽ (ŠTIRN)

ANTIOKSIDATIVNE LASTNOSTI IZBRANIH BARBITURATOV IN

CIKLIČNIH IMIDDIOKSIMOV

ANTIOXIDATIVE PROPERTIES OF SELECTED BARBITURATES

AND CYCLIC IMIDEDIOXIMES

MAGISTRSKA NALOGA

Ljubljana, 2016

Magistrsko nalogo sem opravila na Katedri za farmacevtsko kemijo, Fakultete za

farmacijo, pod mentorstvom doc. dr. Janeza Mravljaka, mag. farm.

Zahvala

Za vso strokovno pomoč, nasvete in koristne napotke pri izdelavi magistrske naloge se

iskreno zahvaljujem mentorju doc. dr. Janezu Mravljaku, mag. farm.

Največja zahvala pa gre mojemu možu Gregorju in mojim staršem, ki so mi omogočili

študij, verjeli vame ter me spodbujali in podpirali.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo izdelala samostojno pod mentorstvom doc. dr. Janeza

Mravljaka, mag. farm..

Mateja Matjaž

Komisija za zagovor magistrskega dela:

1. Predsednik: izr. prof. dr. Matjaž Jeras

2. Mentor: doc. dr. Janez Mravljak

3. Član: doc. dr. Jurij Trontelj

Mateja Matjaž Magistrska naloga

I

KAZALO VSEBINE

POVZETEK .............................................................................................................................. III

ABSTRACT .............................................................................................................................. IV

KAZALO SLIK ........................................................................................................................... V

KAZALO PREGLEDNIC ........................................................................................................ VII

SEZNAM OKRAJŠAV ........................................................................................................... VIII

1. UVOD ..................................................................................................................................... 1

1.1. OKSIDATIVNI STRES ................................................................................................... 1

1.2. ANTIOKSIDANTI ........................................................................................................... 1

1.3. REAKTIVNE ZVRSTI .................................................................................................... 2

1.4. HIDROKSILNI RADIKAL ............................................................................................. 4

1.5. HIDROPEROKSILNI RADIKAL ................................................................................... 4

1.6. FENTONOVA REAKCIJA ............................................................................................. 4

1.7. HABER-WEISSOVA REAKCIJA .................................................................................. 6

1.8. ŽELEZO ........................................................................................................................... 6

1.8.1. OKSIDACIJSKE OBLIKE ŽELEZA ....................................................................... 8

1.9. BARBITURATI ............................................................................................................... 8

1.9.1. RAZVOJ IN UPORABA BARBITURATOV .......................................................... 9

1.9.2. MEHANIZEM DELOVANJA BARBITURATOV ................................................ 10

1.9.3. BARBITURATI IN TIOBARBITURATI ............................................................... 10

1.10. CIKLIČNI IMIDDIOKSIMI ........................................................................................ 11

1.11. DOLOČANJE ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI ................................................ 11

1.11.1 SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH ............................................... 12

1.11.2. KELACIJA ŽELEZA(II) ....................................................................................... 14

1.11.3. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z ŽELEZOM(II) 15

2. NAMEN DELA ..................................................................................................................... 16

3. MATERIALI IN METODE .................................................................................................. 17

3.1.1. TOPILA IN REAGENTI ......................................................................................... 17

3.1.2. POTROŠNI MATERIAL ........................................................................................ 18

3.1.3. OPREMA ................................................................................................................. 19

3.4. PRIPRAVA VZORCEV IN STANDARDOV ............................................................... 20

3.4.1. OPIS VZORCEV ..................................................................................................... 20


II

3.4.2. OPIS STANDARDOV .............................................................................................22

3.4.3. SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH .................................................22

3.4.3.1. PRIPRAVA RAZTOPIN VZORCEV ...................................................................22

3.4.3.2. PRIPRAVA RAZTOPINE STANDARDA ...........................................................23

3.4.4. ZMOŽNOST KELACIJE ŽELEZA(II)....................................................................23


3.4.4.2. PRIPRAVA RAZTOPIN STANDARDOV ..........................................................24

3.4.5. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z ŽELEZOM(II) ...24


3.4.5.2. PRIPRAVA RAZTOPINE STANDARDA ...........................................................24

3.5. ANALIZA VZORCEV IN STANDARDOV ..................................................................25

3.5.1. POSTOPEK DOLOČANJA SPOSOBNOSTI REDUKCIJE DPPH RADIKALA..25

3.5.1.1. IZRAČUN VREDNOSTI EC50 .............................................................................26

3.5.2. POSTOPEK DOLOČANJA ZMOŽNOSTI KELACIJE ŽELEZA(II) ....................26

3.5.2.1 IZRAČUN VREDNOSTI EC50 ..............................................................................27

3.5.3. POSTOPEK DOLOČANJA UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNE TITRACIJE

SPOJIN Z ŽELEZOM(II) ...................................................................................................28

4. REZULTATI IN RAZPRAVA ..............................................................................................29

4.1. ANTIOKSIDATIVNA SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH ..................29

4.1.1. KVERCETIN ............................................................................................................29

4.1.2. VZORCI ...................................................................................................................30

4.1.3. KOMENTAR REZULTATOV REDUKCIJE RADIKALA DPPH ........................33

4.2. ZMOŽNOST KELACIJE ŽELEZA(II) ..........................................................................36

4.2.1. EDTA ........................................................................................................................37

4.2.2. KVERCETIN ............................................................................................................38

4.2.3. VZORCI ...................................................................................................................39

4.2.4. PRIMERJAVE MED SPOJINAMI ..........................................................................42

4.3. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z ŽELEZOM(II) ..........45

4.3.1. KVERCETIN ............................................................................................................45

4.3.2. VZORCI TESTIRANIH SPOJIN .............................................................................46

4.3.3 REZULTATI UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNE TITRACIJE ŽELEZA(II) ...51

5. SKLEP ....................................................................................................................................52

VIRI IN LITERATURA ............................................................................................................54


III

POVZETEK

Preučevanje barbituratov in tiobarbituratov je v zadnjih letih pripeljalo do v številnih novih

odkritj njihovih inhibitornih, antimikrobnih in antioksidativnih učinkov. Prav tako so

ciklični imiddioksimi (npr. glutarimiddioksim) znani po tvorbi kompleksov z elementi

prehodnih kovin. Spojine, ki kompleksirajo železo in druge prehodne kovine, lahko

preprečijo nastanek nevarnih hidroksilnih radikalov, ki nastanejo v Fentonovi reakciji.

Hidroksilni radikali lahko zaradi svoje visoke reaktivnosti hitro vstopijo v nadaljnje

reakcije in povzročijo oksidativne poškodbe celic, saj v človeškem telesu ni ustreznega

mehanizma za njihovo odstranjevanje.

Namen našega dela je bil ugotoviti antioksidativne lastnosti in vezavne sposobnosti za

dvovalentno železo izbranih 5-benziliden(tio)barbituratov ter cikličnih imiddioksimov.

Zanimalo nas je, kako bodo spremembe v strukturah vzorcev, prisotnost hidroksilnih

skupin in zamenjava barbituratnega dela s tiobarbituratnim vplivale na redukcijo radikala

1,1-difenil-2-pikrilhidrazila (DPPH) ter na sposobnost kelacije železa(II). V raziskavo smo

vključili šest spojin 5-benziliden(tio)barbituratov in dve spojini cikličnih imiddioksimov

(glutarimiddioksima in sukcinimiddioksima). Kot pozitivno kontrolo smo uporabili

kvercetin in EDTA, s katerima smo potrdili ustreznost meritev naših vzorcev. Izbrane

spojne smo ovrednotili s tremi različnimi metodami: s sposobnostjo redukcije radikala

DPPH, zmožnostjo kelacije železa in z UV-Vis spektrofotometrično titracijo spojin z

železom(II).

S primerjavo dobljenih rezultatov smo ugotovili, da 5-benziliden(tio)barbiturati, ki imajo

kateholno skupino, izkazujejo najboljšo redukcijo DPPH in kelacijo železa(II). Ugotovili

smo tudi, da metilacija amidnih dušikov, lega hidroksilne skupine na meta mestu v

fenilnem obroču in petčlenski obroč v sukcinimiddioksimu negativno vplivajo na

antioksidativno in kelacijsko aktivnost spojin. Prisotnost žvepla v strukturi 5-

benzilidentiobarbituratov izboljša redukcijo radikala DPPH, a zmanjša oziroma izniči

zmožnost kelacije železa(II). Domnevamo, da se lahko železo(II) veže tudi preko

barbituratnega dela molekule. Na osnovi vseh ugotovitev sklepamo, da najboljšo redukcijo

radikala DPPH in kelacijo železa(II) izkazujejo barbiturati, ki imajo v svoji strukturi več

hidroksilnih skupin.

Ključne besede: Barbiturati, glutarimiddioksim, antioksidanti, kelacija železa(II).


IV

ABSTRACT

The study of barbiturates and tiobarbiturates in recent years has led to many new

discoveries of their inhibitory, antimicrobial and antioxidant effects. Cyclic imidedioximes

(glutarimidedioxime) are also known of their ability to form complexes with transition

metals. Compounds that are complexing iron(II) and other transition metals can prevent the

formation of dangerous hydroxyl radicals generated by the Fenton reaction. Due to its high

reactivity, hydroxyl radicals can quickly enter into further reactions and cause oxidative

damage to cells in the human body, because there is no proper mechanism for their

removal.

The aim of our work was to determine the antioxidant properties and binding capacity for

divalent iron of selected 5-benzylidenebarbiturates and cyclic imidedioximes. We wanted

to find out how the changes in the molecular structure of the samples, the presence of

hydroxyl groups and replacement of barbiturate with tiobarbiturate affect on the reduction

of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical and on the ability to chelate iron(II). Our

research focused on six compounds of 5-benzylidene-(tio)barbiturates and two cyclic

imidedioximes (glutarimidedioxime and succinimidedioxime). As a positive control the

quercetin and EDTA was used, to which the results of measurements on our samples were

compared. Selected compounds were evaluated by three different methods: the ability to

reduce DPPH radical, capability of chelating iron(II) and UV-Vis spectrophotometric

titration of the compounds with iron(II).

By comparing the results, we have found that 5-benzyliden(tio)barbiturates, that have a

catechol group, show the best reduction of DPPH radical and the chelation of iron(II). We

have also found that the methylation of amide nitrogens, meta- position of the hydroxyl

group in the phenyl ring and the five-membered ring in succinimide dioxim negatively

affect the activity of the compounds. The presence of sulfur in the structure of 5-

benzylidenetiobarbiturates improves the reduction of DPPH radical, but reduces or

eliminates the ability of iron(II) chelation. We assume that the iron(II) binds also via

barbiturate moiety. Out of all findings, we concluded that the best reduction of DPPH

radicals and the iron(II) chelation exhibit barbiturates, which have more hydroxyl groups

in its structure.

Keywords: Barbiturates, glutarimidedioxime, antioxidants, iron(II) chelation.


V

KAZALO SLIK

Slika 1: Prikaz elektronske konfiguracije železa. ................................................................. 8

Slika 2: 5,5-disubstituirana-barbiturna kislina (barbiturat). ............................................. 11

Slika 3: Radikal DPPH (α,α-difenil-β-pikrilhidrazil). ........................................................ 12

Slika 4: Redukcija DPPH• v prisotnosti AO. ...................................................................... 13

Slika 5: Kompleks med ferozinom in železom. .................................................................... 14

Slika 6: Titracija kvercetina z Fe2+

. Desno je titracijska krivulja kompleksa (kvercetin-

Fe2+

) pri valovni dolžini 425 nm (27). ................................................................................. 15

Slika 7: Čitalec mikrotitrskih ploščic Synergy™ H4 Hybrid Reader na katerem smo izvedli

meritve redukcije DPPH• in kelacije železa. ....................................................................... 19

Slika 8: Prikaz vzorcev pred analizo. ................................................................................. 20

Slika 9: Mikrotitrska ploščica z reakcijami redukcije DPPH• v triplikatih. ....................... 25

Slika 10: Razpored nanašanja raztopin vzorcev in reagentov na mikrotitrsko ploščico v

triplikatih pri ugotavljanju zmožnosti kelacije železa. ........................................................ 27

Slika 11: UV-Vis Spektrofotometer CARY 50 CONC, ki smo ga uporabljali za titracijo

vzorcev z železom(II). .......................................................................................................... 28

Slika 12: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije kvercetina (μmol/L).

............................................................................................................................................. 29

Slika 13: Prikaz pomembnih skupin v molekuli kvercetina, ki pripomorejo k njegovi

učinkoviti antioksidativni aktivnosti. ................................................................................... 30

Slika 14: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 1 (μmol/L). 30








Slika 22: Prikaz resonančne stabilizacije radikala spojine 6. ............................................ 34

Slika 23: Tavtomerija pri tiobarbituratu 6. Nastali tioenol je donor vodika. .................... 36

Slika 24: A: Etilendiamintetraocetna kislina - [EDTA]4-

. B: Kelatni kompleks med EDTA

in Fe2+

. ................................................................................................................................. 37

Slika 25: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+

kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije

EDTA (μmol/L). ................................................................................................................... 38

Slika 26: Verjetna vezavna mesta med molekulo kvercetina in Fe2+

. ................................. 38



kvercetina (μmol/L). ............................................................................................................ 39



spojine 1 (μmol/L). ............................................................................................................... 39



spojine 2 (μmol/L). ............................................................................................................... 40


VI



spojine 3 (μmol/L). .............................................................................................................. 40



spojine 4 (μmol/L). .............................................................................................................. 40



spojine 5 (μmol/L). .............................................................................................................. 41



spojine 6 (μmol/L). .............................................................................................................. 41



spojine 7 (μmol/L). .............................................................................................................. 41



spojine 8 (μmol/L). .............................................................................................................. 42

Slika 36: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 10 μmol/L kvercetina v prisotnosti 0,

2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 in 50 μmol/L Fe2+

. B) Odvisnost absorbance kompleksa

Kvercetin-Fe2+

pri 425 nm od koncentracije Fe2+

. ............................................................. 45

Slika 37: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 1 v prisotnosti 0, 2,5,

5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 40, 50 in 60 μmol/L Fe2+

. B) Odvisnost absorbance

kompleksa spojine 1-Fe2+

od koncentracije Fe2+

pri 346 nm. ............................................. 46


5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30 in 35 μmol/L Fe2+


spojine 2-Fe2+


pri 348 nm. .............................................................. 47


5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160, 200, 240, 280 in 320

μmol/L Fe2+

. B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 3-Fe2+


pri

285 nm. ................................................................................................................................ 48


5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 160, 200, 280 in 320 μmol/L Fe2+

.

B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 4-Fe2+


pri 315 nm. ... 49

Slika 41: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 5 v prisotnosti 0, 5,

10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 in 70 μmol/L Fe2+


spojine 5-Fe2+


pri 345 nm. .............................................................. 49


5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 in 140 μmol/L Fe2+

. B) Odvisnost

absorbance kompleksa spojine 6-Fe2+


pri 350 nm. ........................ 50


VII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica I: Predstavniki reaktivnih zvrsti. ...................................................................... 2

Preglednica II: Predstavitev strukturnih lastnosti spojin in njihovih molekulskih mas. .... 20

Preglednica III: Opis kemijskih struktur in molekulskih mas standardov. ........................ 22

Preglednica IV: Pripravljene koncentracije raztopin testiranih spojin za določanje

njihove sposobnosti redukcije DPPH•. ................................................................................ 23

Preglednica V: Pripravljene koncentracije testiranih spojin za določanje njihovih

zmožnosti kelacije železa. .................................................................................................... 24

Preglednica VI: Sestavine reagentov in vzorcev nanešenih na mikrotitrsko ploščico. ...... 25

Preglednica VII: Priprava reakcijskih raztopin za določanje kelacije železa(II). ............ 27

Preglednica VIII: Vrednosti EC50 antioksidativne sposobnosti redukcije DPPH•. ........... 33

Preglednica IX: Vrednosti EC50, ki predstavljajo zmožnosti preiskovanih spojin za

kelacijo železa. ..................................................................................................................... 44


VIII

SEZNAM OKRAJŠAV

OKRAJŠAVA RAZLAGA OKRAJŠAVE

AMPA α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazol propionska kislina

AO antioksidant

ATP adenozin trifosfat

DNA deoksiribonukleinska kislina

DPPH• 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal

EC50 50 % efektivna koncentracija

EDTA etilendiamintetraocetna kislina

ESI ionizacija z razprševanjem v električnem polju

GABA gama-aminomaslena kislina

GC plinska kromatografija

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

R2 koeficient determinacije

RNS reaktivne dušikove zvrsti

ROS reaktivne kisikove zvrsti

RZ reaktivne zvrsti

UV ultravijolična svetloba (200 – 350 nm)

Vis vidna svetloba (350 – 700 nm)


1

1. UVOD

1.1. OKSIDATIVNI STRES

Oksidativni stres povzročajo reaktivne zvrsti (RZ), ki vsakodnevno nastajajo v človeškem

telesu in v okolju. V organizmu imajo dvojno vlogo. Z reaktivnim delovanjem lahko

povzročijo škodo na proteinih, lipidih in nukleinskih kislinah, kar vodi v različna

bolezenska stanja. Oksidativne poškodbe spremljajo številne (pato)fiziološke procese kot

so: kardiovaskularne bolezni, diabetes, ateroskleroza, nevrodegenerativne bolezni

(Alzheimerjeva in Parkinsonova), rak, revmatoidni artritis in staranje. Po drugi strani pa so

RZ lahko izredno pomembne za pravilno delovanje fizioloških funkcij, saj sodelujejo pri

imunski obrambi (fagociti), prenosu signalov, vazodilataciji žilne stene, so intermediati pri

presnovnih procesih in aktivatorji nekaterih encimov.

V organizmu je ves čas vzpostavljeno dinamično ravnotežje med RZ (oksidanti) in

antioksidativno zaščito. Kadar pa se to ravnotežje poruši v korist oksidantov, nastane

oksidativni stres. Povečano delovanje oksidantov je mogoče ob zmanjšanem delovanju

antioksidativnih mehanizmov ali pri povečanem nastajanju RZ v telesu. Zmanjšano

antioksidativno delovanje se lahko pojavi zaradi mutacij in pomanjkanja antioksidativnih

snovi, aminokislin ter drugih esencialnih sestavin, ki jih dobimo s hrano. Povečano

nastajanje RZ pa lahko povzročijo sevanje, onesnaženost okolja, citotoksične kemikalije,

zdravila, vnetje, izpostavljenost zvišanim koncentracijam kisika in prisotnost toksinov (1).

1.2. ANTIOKSIDANTI

Antioksidanti (AO) so snovi, ki se sintetizirajo in vivo ali jih vnesemo v telo s prehrano. So

različnega izvora, struktur, velikosti ter fizikalnih in kemičnih lastnosti. Preprečijo

nastanek radikalov, upočasnijo in ustavijo oksidacije sprožene z radikali, ter preprečijo

delovanje singletnega kisika in sodelovanje ionov prehodnih kovin v prenosu signalov.

Najpomembnejši in najučinkovitejši AO v človeškem telesu so endogenega in encimskega

izvora (superoksidna dismutaza, katalaza), sledijo jim blažilci šoka (albumin, transferin,


2

sečna kislina), esencialne spojine (vitamin C in E, aminokisline, koencim Q10, skvalen) in

ostale spojine naravnega izvora (karotenoidi, flavonoidi, polifenoli).

Antioksidanti reagirajo z radikali tako, da jim ponudijo vodikove atome (nenasičene

maščobe, enoli, fenoli, polifenoli, sečna kislina, dihidrokinoni), dvojne vezi (bilirubin,

polinenasičene maščobne kisline, karoteni) ali pa kompleksirajo ione prehodnih kovin, s

čimer preprečijo prenos elektronov v redoks reakcijah (transferin, albumin, haptoglobin,

metalotionein, ceruloplazmin). Antioksidanti so stalno prisotni v vseh delih celic, tkiv in

telesa, saj je nastanek radikalov nepredvidljiv. Njihova koncentracija v celicah je približno

tri velikostne razrede višja, kot je pričakovana koncentracija primarnih radikalov. Za

učinkovito odstranjevanje RZ, pa se AO med seboj povezujejo v mrežo antioksidantov (1,

2).

1.3. REAKTIVNE ZVRSTI

Preglednica I: Predstavniki reaktivnih zvrsti.

RADIKALI NERADIKALI

O2•-

superoksidni radikal H2O2 vodikov peroksid

•OH hidroksilni radikal HOCl hipoklorna kislina

ROO•

peroksilni radikal 1

O2 singletni kisik

RO•

alkoksilni radikal O3 ozon

HOO•

hidroperoksilni radikal ONOO-

peroksinitrit

NO•

dušikov oksid HNO2 dušikova(III) kislina

NO2•

dušikov dioksid NO-

nitroksilni anion

RS•

tioilni radikal H2S vodikov sulfid

RSO•

sulfinilni radikal RSOH sulfenska kislina

RSO2•

sulfonilni radikal RSO3H sulfonska kislina

RSO2OO• sulfonilperoksilni radikal NO

+ nitrozilni (nitrozonijev) kation


3

Reaktivne zvrsti so lahko kisikove, dušikove, žveplove, ogljikove ali halogenske spojine

ali atomi, delimo jih na radikale in neradikale (Preglednica I). Radikali nenehno nastajajo v

naravi in v živih organizmih. To so lahko atomi, ioni, molekule ali kompleksi, ki imajo v

svoji strukturi vsaj en nesparjen elektron. Označujemo jih s piko in končnico –il. Imajo

paramagnetne lastnosti in so obarvani. Izjema so elementi prehodnih kovin, ki imajo

podobne lastnosti, vendar jih ne uvrščamo med radikale. Nesparjen elektron teži k

vzpostavitvi elektronskega para, kar je vzrok za kemično reaktivnost radikalov. Njihova

življenjska doba je zelo kratka, od nekaj milisekund do nekaj sekund, lahko pa so tudi

stabilni desetletja (nitroksidni radikal). V živih organizmih nastajajo v zelo nizkih

koncentracijah (10-7

- 10-11

mol/L) in so na meji ali izven dosega detekcije z običajnimi

analitskimi metodami. Nastajajo v enoelektronskih redoks redukcijah in oksidacijah ter pri

homolitski cepitvi kovalentne vezi pod vplivom svetlobe, sevanja ali toplote. Glavni vir

radikalov izven organizma so različna sevanja, UV svetloba, ultrazvok, kajenje, kemikalije

in onesnaževanje. Znotraj organizma pa nastajajo v mitohondrijski dihalni verigi, pri

transportu kisika s hemoglobinom, pri oksidativnem izbruhu imunskega sistema ter pri

metabolizmu telesu lastnih spojin in ksenobiotikov.

Radikali lahko nenadzorovano vstopijo v reakcijo s prvo spojino, ki jo srečajo, in sicer po

enem od naslednjih treh načinov (3):

Odtegnitev (abstrakcija) vodikovega atoma /1/:

R1• + R2-H → R1-H + R2

• /1/

Adicija na dvojno vez /2/:

R1• + CH2=CH-R2 → R1-CH2-

•CH-R2 /2/

Reakcija z drugim radikalom /3/:

R1• + R2

• → R1-R2 /3/

Radikalske reakcije so hitre, razvejane, stalno prisotne in nanje ne vplivajo okoliški pogoji.

So velikokrat verižne reakcije, v katerih nastajajo novi, stabilnejši radikali (1, 4).


4

1.4. HIDROKSILNI RADIKAL

Hidroksilni radikal (•OH) sodi med reaktivne kisikove zvrsti (ROS). Njegov nastanek je

zelo nevaren dogodek, saj reagira zelo hitro, s hitrostno konstanto 108 - 10

11 Lmol

-1s

-1 in

neselektivno s prvo organsko spojino, ki jo sreča. Vstopa v reakcije z adicijo na dvojno

vez, z abstrakcijo vodika ali z drugim radikalom. Z lahkoto sproži lipidno peroksidacijo,

poškoduje nukleinske kisline, proteine in dela škodo, kjerkoli se v organizmu pojavi.

Človeško telo nima ustreznega mehanizma za odstranjevanje že nastalih •OH. Najbolj

znana reakcija, v kateri nastaja •OH, je Fentonova reakcija. V naravi in organizmih nastaja

v večstopenjskih reakcijah, ki jih najpogosteje katalizirajo železovi in bakrovi kovinski

ioni. Hidroksilni radikal lahko nastane tudi pri homolitski cepitvi kovalentne vezi v

vodikovem peroksidu pod vplivom UV svetlobe /4/, pri radiolizi vode z rentgenskim ali

gama žarčenjem, iz ozona, peroksinitrita in v reakciji hipoklorne kisline s superoksidnim

radikalom (1, 2).

H-O-O-H + UV → 2 •OH /4/

1.5. HIDROPEROKSILNI RADIKAL

Hidroperoksilni radikal ali perhidroksilni radikal (HOO•) je protonirana oblika

superoksidnega radikala. Reakcija je v ravnotežju pri pKa okoli 4,8 /5/, zato je HOO• v

citozolu celice prisoten le v približno 0,3%. Njegova visoka reaktivnost in stanje brez

naboja mu omogočata enostaven prehod celičnih membran. Hidroperoksilni radikal deluje

kot oksidant v številnih biološko pomembnih reakcijah, kot je abstrakcija vodika iz

tokoferola in polinenasičenih maščobnih kislin. Sodeluje v lipidni peroksidaciji in ima

morebiti tudi vlogo pri staranju (5).

•O2

− + H2O ⇌ HOO

• + OH

- /5/

1.6. FENTONOVA REAKCIJA

Fentonova kemija je osnovni primer radikalske reakcije katalizirane s prehodnimi

kovinami. Zmes vodikovega peroksida in Fe2+

soli lahko oksidira številne organske

molekule, pri tem pa nastane zelo nevarni hidroksilni radikal (1). Henry John Horstman

Fenton je leta 1876 v »Chemical News« prvič omenil oksidacijo vinske kisline z Fe2+

in


5

H2O2 (6). Kasneje so Fe2+

-H2O2 poimenovali Fentonov reagent, reakcijo pa Fentonova

reakcija.

V Fentonovi reakciji se Fe2+

z vodikovim peroksidom oksidira do Fe3+

, pri čemer nastane

•OH in hidroksidni anion (OH

-) /6/ (1).

Fe2+

+ H2O2 → Fe3+

+ HO• + OH

– /6/

Poleg železa, lahko pri nastanku •OH sodelujejo tudi bakrovi ioni /7/. Ti se lahko dobro

vežejo na različne biološke molekule in so poleg železovih ionov tudi pomemben vir •OH

in vivo (1).

Cu+ + H2O2 → Cu

2+ + HO

• + OH

– /7/

Fe3+

se nato z drugo molekulo vodikovega peroksida reducira (regenerira) nazaj do Fe2+

.

Pri tem nastaneta še hidroperoksilni radikal (HOO•) in proton /8/.

Fe3+

+ H2O2 → Fe2+

+ HOO• + H

+ /8/

Vsota reakcij /6/ in /8/ je disproporcionacija vodikovega peroksida, v kateri nastaneta dva

različna kisikova radikala (•OH in HOO

•) in voda (H

+ + OH

–) (1). Radikala

•OH in HOO

•

hitro in neselektivno reagirata v sekundarnih reakcijah z organskimi spojinami (7, 8). Če v

eksperimentalnih pogojih ob nastanku •OH ni prisotne nobene druge snovi, ta reagira z

vodikovim peroksidom /9/ ali oksidira Fe2+

/10/.

HO• + H2O2 → H2O + H

+ + O2

•- /9/

HO• + Fe

2+ → Fe

3+ + OH

- /10/

Zaradi tega lahko visoke koncentracije Fe2+

in H2O2 znižajo koncentracijo •OH. Skupna

reakcija je /11/:

2 H2O2 → Fe2+

(sol/katalizator) → O2 + 2 H2O /11/

Nastanek drugih reaktivnih zvrsti v Fentonovi reakciji ni znan. Hitrostna konstanta reakcije

Fe2+

s H2O2 je manjša od 102 M

-1s

-1. Če pa je Fe

2+ vezano na določene ligande, kot so ATP,

citrat, oksalat, pirofosfat ali EDTA, je hitrostna konstanta večja. Ligandi lahko preprečijo

oksidacijo Fe2+

, precipitacijo in lovijo •OH. Tako je npr. kelat železo-EDTA zelo dober


6

Fentonov reagent. Na splošno so lahko železovi kelatorji zaviralci ali spodbujevalci

Fentonove reakcije. Spremenijo lahko redukcijski potencial železa, in sicer tako, da

spodbujajo ali zavirajo oksidacijo s H2O2. Sterično preprečijo dostop H2O2 do železa in

spodbujajo oksidacijo Fe2+

v Fe3+

, ki je manj reaktivno v reakciji s H2O2. Lahko pa tudi

prestrežejo in lovijo hidroksilne radikale, ter tako vzdržujejo višjo koncentracijo železovih

ionov v raztopini (1).

1.7. HABER-WEISSOVA REAKCIJA

Frizt Haber in Joseph Joshua Weiss sta leta 1932 opisala mehanizem nastanka •OH iz

vodikovega peroksida in O2•-, kar danes imenujemo Haber-Weissova reakcija. Reakcija

nastanka •OH je počasna, ciklična in katalizirana z železom (9).

1. stopnja: Redukcija Fe3+

do Fe2+

/12/:

Fe3+

+ •O2

− → Fe

2+ + O2 /12/

2. stopnja: Fentonova reakcija /13/:

Fe2+

+ H2O2 → Fe3+

+ OH− +

•OH /13/

Neto reakcija je Haber-Weissova reakcija /14/:

•O2

- + H2O2 →

•OH + OH

- + O2 /14/

Sprva so predvidevali, da •OH po Haber-Weissovem mehanizmu nastaja v celicah in v

telesu povzroča oksidativni stres. Kasneje pa se je izkazalo, da ni tako. V živih organizmih

nastajajo •OH v večstopenjskih reakcijah, ki jih katalizirajo kovinski ioni (železovi,

bakrovi). Z železovimi ali bakrovimi ioni katalizirane reakcije H2O2 imenujemo Fentonove

reakcije (10).

1.8. ŽELEZO

Večino ionov prehodnih kovin (železovih, bakrovih, manganovih in kromovih) uvrščamo

med RZ. V svoji strukturi imajo nesparjene elektrone, zato lahko sodelujejo v

enoelektronskih redoks redukcijah in oksidacijah. Ker težijo k pritegnitvi ali oddaji

elektrona in vzpostavitvi elektronskega para, so kemično reaktivne spojine. Elektroni brez

para (tripletno stanje) dajejo prehodnim kovinam paramagnetne lastnosti (1). Železo se v

http://en.wikipedia.org/wiki/Joseph_Joshua_Weiss


7

naravi nahaja predvsem v stabilnih oksidacijskih oblikah Fe3+

(feri) in Fe2+

(fero), v

sulfidih, oksidih in hidroksidih. Najverjetneje so sprva na zemlji prevladovale Fe2+

spojine,

ki so v vodi dobro topne. Ko pa je na planetu pričela koncentracija kisika naraščati, so se

oksidirale do manj topnih Fe3+

spojin in se izoborile iz vode (11). V biološkem sistemu

imajo kovinski ioni funkcionalno in strukturno vlogo. Kot biološki katalizatorji sodelujejo

v prenosu elektronov ter pri aktivaciji in transportu manjših molekul, kot je kisik (7). V

človeškem telesu, celicah, plazmi in ostalih zunajceličnih tekočinah je železo prisotno v

zelo nizkih koncentracijah, kar je zelo natančno uravnavano z vezavo na proteine

(transport in shranjevanje). Prosto železo lahko v organizmu povzroči veliko škode, saj

katalizira neželene radikalske reakcije kot so avtooksidacije in nastanek radikalov po

mehanizmu Fentonove reakcije (•OH) (1, 12).

Železo v Fe2+

in Fe3+

obliki je zelo pomembna in esencialna sestavina različnih beljakovin

(hemoglobin, encimi dihalne verige, citokromi, katalaza, mieloperoksidaza v nevtrofilcih),

ki sodelujejo pri prenosu kisika in v metabolizmu. Železo je udeleženo tudi v izgradnji

DNA, v procesu biotransformacije ksenobiotikov in v številnih encimih, ki katalizirajo

redoks reakcije (1, 11). Pomanjkanje železa v človeškem telesu lahko povzroči

sideropenično in hipokromno anemijo, njihovo kopičenje pa zastrupitev, sideroblastno

anemijo in dedno hemokromatozo (13). Za zdravljenje zastrupitev z železom uporabljamo

desferoksamin, ki lahko kelira elementarno železo ter Fe3+

ione na transferinu in feritinu,

deferasiroks in deferipron. Pravzaprav lahko preveč ali premalo železa v telesu povzroči

oksidativni stres s prekomerno proizvodnjo reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Te lahko

oksidirajo različne biomolekule v telesu in povzročijo nastanek številnih bolezni ter

staranje. Zaradi tega imamo v celicah prisotne encime, ki odstranjujejo ROS ter zmanjšajo

njihovo koncentracijo, še preden lahko pridejo v stik s prehodnimi kovinskimi ioni. Slednje

namreč lahko povzroči nastanek veliko bolj nevarnih kemičnih zvrsti, kot je •OH. O2

•-

odstranjujejo superoksid dismutaza, H2O2 pa katalaza in glutationska peroksidaza. Že

nastali oksidativni stres tudi lahko povzroči uhajanje železa iz sistema. Fentonova in

Fentonovi podobne reakcije so najverjetneje prvi kemični načini nastanka ROS v naravi.

Zato ima Fentonova kemija odločilno vlogo v fizioloških in patoloških procesih v živih

organizmih (1, 7, 14).


8

1.8.1. OKSIDACIJSKE OBLIKE ŽELEZA

Pri elementih prehodnih kovin se z elektroni polnijo s- in d-orbitale. Pri oksidaciji oddajo

kovinski atomi najprej elektrone iz s- in nato še iz d-orbitale, pri tem pa postanejo kovinski

kationi (Slika 1). Delna zasedenost d-orbital daje kationom prehodnih kovin številne

tipične lastnosti: več stabilnih oksidacijskih stanj, obarvanost, magnetne lastnosti in

katalitične lastnosti pri enoelektronskih redoks reakcijah (11).

Slika 1: Prikaz elektronske konfiguracije železa.

Sol Fe2+

je šibko redukcijsko sredstvo in se v raztopini ob prisotnosti kisika počasi oksidira

do Fe3+

. Fe2+

tako zapade eno-elektronski oksidaciji (odda e- kisiku), kisik iz zraka pa se

pri tem reducira (sprejme e-) do O2

•- /15/ (1).

Fe2+

+ O2 ⇌ Fe3+

+ O2•- /15/

V naravi pa obstajajo tudi železove (IV), (V) in (VI) zvrsti, ki so manj pogoste in navadno

nastopajo kot kratkoživi intermediati v biokemičnih reakcijah. Feril ali železov(IV) ion

sodeluje pri delovanju katalaz, peroksidaz in citokroma P450. Reaktivne so tudi

železove(V) zvrsti, ki lahko oksidirajo aminokisline. Železove(VI) zvrsti (K2FeO4), pa so

močna oksidativna sredstva (1).

1.9. BARBITURATI

Pred odkritjem barbituratov so tekom 19. stoletju v medicini uporabljali različne

pomirjevalne, hipnotične in antikonvulzivne spojine. Drugo polovico 19. stoletja so

imenovali kar »alkaloidna era«. V psihiatriji so tako uporabljali kloralhidrat, morfij, opij,

alkaloide iz družine Solanaceae, hiosciamin, hioscin, atropin, paraldehid, sulfonal, cinkov

oksid, bromid, indijsko konopljo in druge spojine. Te spojine so bile zdravju škodljive in


9

strupene, saj so povzročale številne neželene učinke, npr. razdražljivost, halucinacije,

delirij, letargijo ter nevrološke in gastrointestinalne bolezni. Z odkritjem dietil-barbiturne

kisline pa se je začelo obdobje velikega napredka farmakološkega zdravljenja psihiatričnih

in nevroloških bolezni. Barbiturati so bili uporabni tudi za zdravljenje nespečnosti in

epileptičnih napadov, ter začetniki na področju intravenske anestezije (15, 16).

1.9.1. RAZVOJ IN UPORABA BARBITURATOV

Začetek razvoja barbituratov in njihovih derivatov sega v leto 1864, ko je nemški kemik

Adolf von Baeyer iz propandiojske kisline (malonska kislina) in sečnine (urea) sintetiziral

barbiturno kislino (malonil urea). Sintezni proces barbiturne kisline pa je leta 1879 razvil

in izpopolnil francoski kemik Edouard Grimaux in omogočil nadaljnji razvoj njenih

derivatov. Leta 1881 sta Conrad in Guthzeit sintetizirala dietil-barbiturno kislino,

imenovano tudi barbital, malonal ali gardenal. Josef Freiherr von Mering in Hermann Emil

Fischer sta leta 1903 proučila lastnosti ter hipnotične učinke dietil-acetiluree in 5,5-dietil-

barbiturne kisline in ugotovila, da ima slednja zelo močan hipnotični učinek. Tako je 5,5-

dietil-barbiturna kislina pod imenom Veronal® postala prvo zdravilo iz skupine

barbituratov. Veronal® je imel hipnotične, pomirjevalne in antikonvulzivne učinke.

Uporabljali so ga kot pomirjevalno in uspavalno sredstvo. Kasneje so sintetizirali in

testirali okoli 18 barbituratnih analogov, med njimi tudi hipnotik fenobarbital s

podaljšanim farmakološkim učinkom. Ta je pod imenom Luminal® postal zelo pogosto

uporabljano zdravilo v bolnišnicah in pri ambulantni oskrbi bolnikov. Znani barbiturati so

tudi butobarbital (Neonal®), amobarbital (Amytal

®), sekobarbital (Seconal

®), pentobarbital

(Nembutal®

), tiopental (Pentothal®) in pentobarbital za intravensko anestezijo (15, 16).

Do danes so sintetizirali že več kot 2.500 različnih barbituratov in njihovih derivatov. Od

tega so jih okoli 50 vpeljali v klinično uporabo. Barbiturati in njihovi derivati povzročajo

odvisnost, kar so ljudje pričeli izkoriščati. Leta 1962 je bilo v Ameriki 250.000 odvisnikov

od barbituratov. Prevelik odmerek pa lahko povzroči tudi smrt, zaradi česar so barbiturate

in njihove derivate zlorabljali za samomore. Poleg tega imajo tudi številne neželene

stranske učinke in ozko terapevtsko okno, zaradi česar so jih zamenjale novejše učinkovine

iz drugih skupin zdravil, kot so npr. benzodiazepini (15, 16).


10

Danes je terapevtska uporaba barbituratov omejena. V Sloveniji se uporabljajo le še v

anesteziji ter pri preprečevanju epilepsij. Barbiturna kislina in njeni derivati izkazujejo

različne biološke učinke: antibakterijske, antisklerotične, hipotenzivne, spazmolitične,

antiepileptične, hipnotične in sedativne. Delujejo lahko tudi kot lokalni anestetiki, proti

vnetjem, raku in inhibirajo metaloproteinaze. Pogosto jih uporabljajo tudi v sintezi

bioaktivnih molekul in v drugih bioloških reakcijah (15, 16).

1.9.2. MEHANIZEM DELOVANJA BARBITURATOV

Barbiturati pomirjujoče delujejo na centralni živčni sistem tako, da se vežejo na receptor

GABAA in ob vezavi endogenega liganda gama-aminomaslene kisline (GABA) povečajo

pretok kloridnih anionov. Vežejo se na drugo vezavno mesto kot benzodiazepini in

zmanjšajo vzdraženost celične membrane živčnih celic. Vežejo se lahko tudi na glutamatni

receptor AMPA ter ovirajo vezavo molekule živčnega prenašalca glutamata, nastanek

akcijskega potenciala v postsinaptični membrani in kemični prenos signala med živčnimi

celicami (16).

1.9.3. BARBITURATI IN TIOBARBITURATI

5-ariliden- in 5-benzilidenbarbiturati nastanejo v reakciji Knoevenaglove kondenzacije,

med aktivirano metilensko skupino v barbiturni ali tiobarbiturni kislini in aldehidi ali

ketoni. Preučevanje barbituratov in tiobarbituratov je v zadnjih letih privedlo do novih

odkritij njihovih številnih inhibitornih (zaviranje delovanja kolagenaze-3, matričnih

metaloproteinaz, encimov rekombinantnega citokroma P450, tirozinaze in ureaze),

antimikrobnih in antioksidativnih učinkov (17).

Barbiturati (5,5-disubstituirane barbiturne kisline) so šibke kisline in so močno lipofilne

(Slika 2). V kemični reakciji z NaOH se enostavno pretvorijo v natrijeve soli, ki so

vodotopne. Lipofilnost molekule se še poveča z vezavo ogljikovih atomov na mesto R2 in s

prisotnostjo žvepla (tiobarbiturati).


11

Slika 2: 5,5-disubstituirana-barbiturna kislina (barbiturat).

Lipofilnost spojine zelo vpliva na njeno spodobnost prehajanja cerebrospinalne bariere

(možgansko-krvna bariera). Bolj kot je spojina lipofilna, hitreje in lažje prehaja bariero,

ima pa tudi krajši čas delovanja. Vendar pa mora spojina za uspešno delovanje doseči tudi

želeno topnost v hidrofilnih medijih (16).

1.10. CIKLIČNI IMIDDIOKSIMI

Ciklični imiddioksimi (npr. glutarimiddioksim) so spojine, ki so znane po tvorbi

kompleksov z elementi prehodnih kovin. Glutarimiddioksim tvori z Fe3+

celo zelo močne

1:1 in 2:1 (glutarimiddioksim:Fe3+

) komplekse, kar so potrdili s preučevanjem kristalne

strukture. Na kovinske ione se koordinira tridentatno, preko dveh oksimskih kisikovih

atomov in enega imidnega dušikovega atoma. Glutarimiddioksim nastane v reakciji med

glutaronitrilom in hidroksilaminom pri temperaturi 80-90 °C (18).

1.11. DOLOČANJE ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI

Vse večje zavedanje o pozitivnih lastnostih AO na zdravje organizma in obstojnost hrane

je vodilo v preučevanje antioksidativnih aktivnosti tovrstnih spojin. Za njihovo

preučevanje uporabljamo različne tehnike (19):

o spektroskopske (UV-Vis spektrofotometrija),

o elektrokemične (voltametrija, amperometrija, biosenzorji) in

o kromatografske tehnike (GC, HPLC).

Antioksidativna aktivnost je sposobnost spojin, da zavirajo oksidativne reakcije različnih

biomolekul v organizmu. Določanje njihovih antioksidativnih aktivnosti pa je način

ugotavljanja zaščite pred reaktivnimi zvrstmi. Do sedaj so predlagali in modificirali že več


12

različnih metod določanja, ki običajno temeljijo na neposredni reakciji preučevane spojine

z radikali ali na reakciji s prehodnimi kovinami. V nadaljevanju smo opisali tri UV-Vis

spektrofotometrične principe določanja antioksidativnih aktivnosti spojin (20).

1.11.1 SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH

1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH•) je stabilni sintezni radikal, ki ima v središču svoje

strukture dušik z nesparjenim elektronom (Slika 3). Stabilnost mu omogoča delokalizacija

prostega elektrona, ki preprečuje dimerizacijo molekule. Je temno vijolično obarvana

spojina, ki ima maksimalno absorpcijo v vidnem delu spektra, pri 517 nm (21).

Antioksidanti, ki lovijo in reducirajo DPPH•, imajo pogosto protivnetno aktivnost in

varujejo pred staranjem in rakom (22).

Slika 3: Radikal DPPH (α,α-difenil-β-pikrilhidrazil).

Metoda z DPPH• je UV-Vis spektrofotometrična tehnika, ki temelji na redukciji DPPH

• z

AO. Prvi jo je leta 1958 opisal Marsden Blois, ki je kot vzorčni AO uporabil aminokislino

cistein. Modifikacijo metode pa je nato leta 1995 izvedel Brand-Williams s sodelavci, kar

je še vedno temelj za nadaljnja raziskovanja antioksidativnega delovanja s tem postopkom

(23).

Antioksidativna spojina donira vodikov atom DPPH• in ga reducira v stabilno diamagnetno

molekulo 1,1-difenil-pikrilhidrazin (Slika 4). Nastanek 1,1-difenil-pikrilhidrazina se kaže z

bledenjem temno vijolične barve in pojavom bledo rumenega obarvanja zaradi pikrilne

skupine, kar zaznamo v obliki upada absorbance pri 517 nm (23).


13

Slika 4: Redukcija DPPH• v prisotnosti AO.

Rezultate testa z DPPH• navadno podajamo kot vrednost EC50. To je efektivna

koncentracija AO, ki reducira 50% začetne koncentracije DPPH• v določenem času. Nižja

kot je vrednost EC50, bolj učinkovito AO reducira DPPH• pod eksperimentalno enakimi

pogoji (21).

Lastnosti testa

Metoda z DPPH• je hitra in priročna metoda. Za njeno izvedbo ne potrebujemo dragh

reagentov in sofisticirane opreme. Njeno največja prednost je, da lahko pod enakimi pogoji

testiramo hidrofilne in lipofilne antioksidativne spojine. Slaba lastnost te metode pa je, da

pogoji zelo odstopajo od bioloških, saj uporablja DPPH• kot nadomestek za peroksilne

radikale (ROO•) in metanol ali etanol kot topilo. Določanje motijo karotenoidi, ker

absorbirajo svetlobo pri 515 nm in prekrijejo spekter DPPH•. Poleg tega lahko na ta način

določamo le neposredne reakcije z DPPH•, kar pa je odvisno od strukture AO. Zaradi tega

lahko s to metodo ugotovimo antioksidativne lastnosti spojin le na splošno (21).

Reducenti DPPH radikala

Blois je ugotovil, da poleg cisteina DPPH• reducirajo tudi askorbinska kislina, α-tokoferol

(vitamin E), glutation, aromatski amini (p-aminofenol) in polihidroksi aromatske spojine

(hidrokinon) (23). Danes vemo, da so dobri reducenti DPPH• predvsem polifenolne

spojine, ker so donorji vodikovega atoma. Več kot imajo prisotnih hidroksilnih skupin,

boljši reducenti DPPH• so (24).


14

1.11.2. KELACIJA ŽELEZA(II)

S testom kelacije železa določamo sposobnost tekmovanja AO za Fe2+

z drugim

kelatorjem, kot sta npr. 2,2'-bipiridin ali ferozin. Če kelator reagira z dvovalentnim

železom, se tvori obarvan kelat z ustreznim absorpcijskim maksimumom. 2,2'-Bipiridin

tvori z Fe2+

rdeče (AMax = 522 nm), ferozin pa vijolično obarvan (AMax = 562 nm) kelat

(21).

Ferozin (natrijeva sol 3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazin-p´,p´´-disulfonske kisline) je

leta 1970 sintetiziral Lawrence L. Stookey. Želel je ustvariti dobro občutljiv in cenovno

ugoden reagent za določanje železa (Slika 5). Pred sintezo ferozina so za določanje železa

uporabljali druge kelatorje kot so: fenantrolin, 4,7-difenil-1,10-fenantrolin, 2,2'-bipiridin,

2,4,6-tris(2-piridil)-1,3,5-triazin in fenil 2-piridil ketoksim. Njihova uporaba je bila

omejena zaradi zahtevne in dolgotrajne organske sinteze, ki je bila tudi draga. Ferozin je

topen v vodi, zato se lahko uporablja tudi za neposredno določitev železa v njej (25).

Slika 5: Kompleks med ferozinom in železom.

Sposobnost kelacije železa določimo UV-Vis spektrofotometrično, z merjenjem

absorbance vijolično obarvanega kelata med ferozinom in Fe2+

, pri različnih koncentracijah

testirane spojine /16/. Reakcijska raztopina vsebuje testirano spojino, FeCl2 in ferozin. Če

testirana spojina kelira Fe2+

, nastane po dodatku ferozina v reakcijsko raztopino manj

vijoličnega kelata Fe(ferozin)34-

. Ta je stabilen v pH območju med 4 in 9 in ima

maksimalno absorbanco pri 562 nm (26).

3 Ferozin2-

+ Fe2+

⇌ Fe(ferozin)34-

/16/(24)


15

Kako dobro testirana spojina kelira železo, ugotovimo z izračunom odstotka prisotnega

vijoličnega kelata Fe(ferozin)34-

, ter z določitvijo vrednosti EC50. Slednja predstavlja

koncentracijo testirane spojine, ki kelira 50% Fe2+

ionov. Kot pozitivno kontrolo v testu

navadno uporabljamo EDTA. Metoda antioksidativne sposobnosti kelacije Fe2+

je hitra in

enostavna, zato jo lahko uporabljamo za testiranje večjega števila vzorcev (21).

1.11.3. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z

ŽELEZOM(II)

Z UV-Vis spektrofotometrično titracijo lahko preučujemo sposobnost spojin za tvorbo

kompleksov z Fe2+

ali katerim drugim kovinskim kationom (Cu2+

, Fe3+

, Mg2+

, Al3+

, Co2+

,

Ni2+

). V reakcijsko raztopino preučevane spojne postopoma dodajamo raztopino Fe2+

in

merimo absorpcijski spekter. Kinetiko nastanka kompleksa med spojino in Fe2+

spremljamo preko sprememb v UV-Vis absorpcijskem spektru. Ko v reakcijsko raztopino

testirane spojine, ki kelira železo, prvič dodamo Fe2+

ione, se v absorpcijskem spektru

lahko pojavi nov vrh pri določeni valovni dolžini. Novonastali vrh simbolizira

stehiometrični nastanek kelata med preučevano spojino in Fe2+

. Z nadaljnjim dodajanjem

Fe2+

ionov se vrh viša, vse dokler ne doseže ekvivalentne točke, kar kaže na konec titracije.

Nato ob upoštevanju valovne dolžine, kjer se nahaja novonastali vrh, izrišemo titracijsko

krivuljo. Preko sprememb v absorbanci titracijske krivulje pa določimo vezavno

stehiometrijo med testirano spojino in Fe2+

. Kot pozitivno kontrolo lahko uporabimo

kvercetin, ki tvori z železom komplekse v razmerju 1:1 in 1:2 (Fe2+

: kvercetin) (Slika 6)

(27, 28).

Slika 6: Titracija kvercetina z Fe2+

. Desno je titracijska krivulja kompleksa (kvercetin-Fe2+

) pri

valovni dolžini 425 nm (27).


16

2. NAMEN DELA

Vse večje zavedanje o pomembnosti uporabe in delovanja antioksidantov v vsakodnevnem

življenju nas vodi v preučevanje različnih snovi in s tem v odkrivanje njihovih

antioksidativnih lastnosti. Antioksidanti nas namreč varujejo pred škodljivim delovanjem

reaktivnih zvrsti, ki ves čas nastajajo v organizmu in izven njega in povzročajo oksidativni

stres. Med najnevarnejše radikale sodi hidroksilni radikal (•OH), saj človeško telo nima

učinkovitega mehanizma za njegovo odstranjevanje. Omenjeni radikal nastaja v Fentonovi

reakciji, ki jo katalizirajo prehodne kovine, kot je Fe2+

. V človeškem telesu je železo varno

spravljeno v depojih (vezano na proteine), nastale ROS (superoksid in peroksid) pa takoj

odstranjujejo različni encimi, da bi preprečili njihovo medsebojno delovanje in nastanek

•OH.

Namen magistrskega dela je ugotoviti antioksidativne lastnosti izbranih derivatov 5-

benziliden(tio)barbituratov in cikličnih imiddioksimov. Antioksidativne lastnosti nekaterih

5-arilidenbarbituratov so v literaturi že opisali (33). Zato smo se odločili, da bomo preverili

tudi antioksidativne lastnosti naših izbranih spojin. V ta namen bomo uporabili tri različne

metode: sposobnost redukcije radikala DPPH, kelacijo železa in UV-Vis

spektrofotometrično titracijo spojin z železom(II). Zanima nas, kako bodo razlike v

strukturah spojin vplivale na njihovo sposobnost vezave Fe2+

in redukcijo DPPH•. Testirani

benziliden(tio)barbiturati se med seboj razlikujejo glede na prisotnost kisika ali žvepla, ter

glede na položaje in število hidroksilnih skupin na fenilnem obroču (benzilidenski del), ki

so pri nekaterih spojinah zaestrene z metilno skupino. Izbrana ciklična imiddioksima pa se

med seboj razlikujeta po številu ogljikovih atomov v svoji strukturi.

Vzorce bomo predhodno raztopili v ustreznem topilu. Za standarda bomo uporabili

kvercetin in EDTA, ki bosta predstavljala primerjalno (referenčno) meritev. Po izvedenih

meritvah bomo za vsak vzorec in standard izrisali ustrezne grafe in antioksidativne

lastnosti spojin vrednotili s pomočjo izračunanih vrednosti EC50. Tako bomo skušali

ugotoviti, katere strukturne lastnosti vplivajo na boljše antioksidativne sposobnosti

preiskovanih spojin. Znano je, da radikali reagirajo z antioksidanti tako, da jim odtegnejo

vodikove atome iz fenolnih –OH skupin (30). Žveplo pa ima antioksidativne in

antimikrobne lastnosti. V biokemiji celice so zelo pomembne tudi tiolne skupine, ki so

prav tako donorji vodikovih atomov. Zato izhajamo iz hipoteze, da bodo spojine, ki imajo


17

več hidroksilnih skupin in možne tavtomere z –SH skupinami v svojih strukturah,

izkazovale boljše antioksidativne lastnosti.

3. MATERIALI IN METODE

3.1.1. TOPILA IN REAGENTI

1. MiliQ® prečiščena voda

2. Metanol, absolutni, ≥ 99,8 %, Merck, Nemčija

3. Etanol, absolutni, brezvodni, p.a., Carlo Erba, Italija

4. 1 mol/L raztopina NaOH (M(NaOH) = 39,997 g/mol, trdno agregatno stanje,

Merck, Nemčija)

V 1.000 mL merilno bučko smo natehtali 40 g NaOH, ga raztopili v vodi, dopolnili

z vodo do oznake in premešali.

5. 50 mmol/L NaOH

v 50 mL merilno bučko smo napipetirali 2,5 mL 1 mol/L NaOH, dopolnili z vodo

do oznake volumna in premešali.

6. 500 mmol/L kalij-acetatni pufer, pH 5,5

Za pripravo 500 mmol/L kalij-acetatnega pufra s pH 5,5, smo uporabili trden

kalijev acetat (CH3COOK, Merck, Nemčija), ocetno kislino (CH3COOH, Merck,

Nemčija) in prečiščeno vodo. Pripravili smo 100 mL pufra.

7. 120 mmol/L kalij-fosfatni pufer, pH 7,4

Za pripravo 120 mmol/L kalij-fosfatnega pufra s pH 7,4, smo uporabili kalijev

hidrogen fosfat (K2HPO4, Merck, Nemčija), kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4,

Merck, Nemčija) in prečiščeno vodo. Pripravili smo 100 mL pufra.

8. Topilo za raztapljanje vzorcev: 50 mmol/L NaOH : brezvodni metanol = 1 : 4

(v/v) = 20 mL : 80 mL.

9. 125 μmol/L raztopina DPPH• (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil, M = 394,32 g/mol,

Merck, Nemčija)

V 20 mL merilno bučko smo natehtali 5,92 mg trdnega DPPH•, ga raztopili v

etanolu in dopolnili z etanolom do oznake. Dobili smo 750 μmol/L raztopino

DPPH•. V penicilinko smo odpipetirali 1,5 mL 750 μmol/L raztopine DPPH

• in ji

dodali 7,5 mL brezvodnega etanola. Tako smo pripravili 125 μmol/L delovno


18

raztopino DPPH•, ki smo jo zaščitili pred svetlobo. Končna koncentracija DPPH

• v

reakcijski raztopini vzorca je bila 62,5 μmol/L.

10. 1 mmol/L raztopina ferozina (3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazin-4´,4´´-

natrijeva sol disulfonske kisline, trdno agregatno stanje, M = 492,46 g/mol, Sigma-

Aldrich, ZDA)

V 20 mL merilno bučko smo natehtali 49,24 mg ferozina, ga raztopili v 500

mmol/L kalij-acetatnem pufru s pH 5,5 in dopolnili s 500 mmol/L kalij-acetatnim

pufrom s pH 5,5 do oznake volumna. Pripravili smo 5 mmol/L raztopino ferozina.

Nato smo v penicilinko odpipetirali 1 mL 5 mmol/L raztopine ferozina in ji dodali

4 mL 500 mmol/L kalij-acetatnega pufra s pH 5,5. Dobili smo 1 mmol/L raztopino

ferozina. Končna koncentracija ferozina v vzorcu za meritev je bila 333 μmol/L.

11. 250 μmol/L raztopina FeCl2 (M(FeCl2∙4H2O) = 198,81 g/mol, trdno agregatno

stanje, Sigma-Aldrich, ZDA)

V 20 mL merilno bučko smo natehtali 23,84 mg FeCl2∙4H2O, ga raztopili v vodi in

z vodo dopolnili do oznake volumna. Pripravili smo 6 mmol/L raztopino FeCl2.

Nato smo v penicilinko odpipetirali 200 μL 6 mmol/L raztopine FeCl2, ter ji dodali

4,6 mL vode. Dobili smo 250 μmol/L delovno raztopino FeCl2 (redčili smo 1 : 24).

Končna koncentracija FeCl2 v vzorcu za meritev je bila 41,67 μmol/L.

12. 1 mmol/L raztopina FeCl2 (M(FeCl2∙4H2O) = 198,81 g/mol, trdno agregatno

stanje, Sigma-Aldrich, ZDA)

V 20 mL merilno bučko smo natehtali 19,88 mg FeCl2∙4H2O, ga raztopili v vodi in

z vodo dopolnili do oznake volumna. Pripravili smo 5 mmol/L raztopino FeCl2.

Nato smo v penicilinko odpipetirali 250 μL 5 mmol/L raztopine FeCl2 in ji dodali 1

mL vode. Pripravili smo 1 mmol/L raztopino FeCl2 (redčili smo 1 : 5).

3.1.2. POTROŠNI MATERIAL

Kiveta iz kvarčnega stekla, 2,5 mL

Stojala za epruvete in kivete

Plastične epruvete

20 mL merilne bučke

Čaše

Infuzijske stekleničke 100 mL


19

Penicilinke

Plastični zamaški za penicilinke in epruvete

Erlenmajerice,

TPP® mikrotitrske ploščice, 96 vdolbinic (Techno Plastic Products AG, Švica)

Kovinska žlička

Plastična žlička

Aluminijasta folija

3.1.3. OPREMA

Čitalec mikrotitrskih ploščic Synergy™ H4 Hybrid Reader (BioTek Instruments,

Združene države Amerike) (Slika 7)

UV-Vis Spektrofotometer CARY 50 CONC (Varian Inc., Agilent Technologies,

Združene države Amerike)

Analitska tehtnica AE-240S (Mettler Toledo, Združene države Amerike )

pH meter MP 220, Mettler-Toledo (Združene države Amerike)

Inkubator VorTemp 56, Labnet International (Združene države Amerike)

Avtomatske pipete Transferpette 5 mL in 1000 μL (Brand GMBH, Nemčija)

Ultrazvočna kadička Sonis 4 (Iskra Pio, Slovenija)

Programska oprema: statistični program Microsoft Office Excel 2010

Slika 7: Čitalec mikrotitrskih ploščic Synergy™ H4 Hybrid Reader na katerem smo izvedli meritve redukcije

DPPH• in kelacije železa.

http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergyh4_hybrid_multimode_microplate_reader.html



20

3.4. PRIPRAVA VZORCEV IN STANDARDOV

3.4.1. OPIS VZORCEV

Vzorci od 1 do 6 so derivati barbiturne kisline (5-benzilidenbarbiturati in 5-

benzilidentiobarbiturati). Sintetizirali so jih na Katedri za farmacevtsko kemijo, Fakultete

za farmacijo, v okviru diplomske naloge Lee Seljak, pod mentorstvom doc. dr. Naceta

Zidarja. Vzorec 7 je glutarimiddioksim (ciklični imidni dioksimski derivat), vzorec 8 pa

derivat sukcinimida (sukcinimiddioksim). Spojini 7 in 8 je sintetiziral doc. dr. Žiga Jakopin

na Katedri za farmacevtsko kemijo, Fakultete za farmacijo (Slika 8). Molekulske strukture

testiranih spojin so prikazane v Preglednici II.

Preglednica II: Predstavitev strukturnih lastnosti spojin in njihovih molekulskih mas.

Št. Oznaka Struktura in IUPAC ime Bruto

formula

M

(g/mol)

1. 1

5-(3,4-dihidroksibenziliden)pirimidin-

2,4,6(1H,3H,5H)-trion

C11H8N2O5 248,19

2. 2

5-(4-hidroksi-3-

metoksibenziliden)pirimidin-

2,4,6(1H,3H,5H)-trion

C12H10N2O5 262,22

Slika 8: Prikaz vzorcev pred analizo.


21

3. 3

5-(4-butoksibenziliden)pirimidin-

2,4,6(1H,3H,5H)-trion

C15H16N2O4 288,30

4. 4

5-(3-hidroksi-4-

metoksibenziliden)pirimidin-

2,4,6(1H,3H,5H)-trion

C12H10N2O5 262,22

5. 5

5-(3,4-dihidroksibenziliden)-2-

tioksodihidropirimidin-4,6(1H,5H)-dion

C11H8N2O4S 264,26

6. 6

5-(4-hidroksi-3-metoksibenziliden)-2-

tioksodihidropirimidin-4,6(1H,5H)-dion

C12H10N2O4S 278,28

7. 7

2,6-bis(hidroksiimino)piperidin

C5H9N3O2 143,14

8. 8

2,5-bis(hidroksiimino)pirolidin

C4H7N3O2 129,12


22

3.4.2. OPIS STANDARDOV

Preglednica III: Opis kemijskih struktur in molekulskih mas standardov.

Št. Oznaka Struktura Bruto formula M

(g/mol)

1. Kvercetin

2-(3,4-dihidroksifenil)-3,5,7-

trihidroksi-4H-1-benzopiran-4-on-

,3,3',4',5,6-pentahidroksiflavone

C15H10O7 302,24

2. EDTA

Etilendiamintetraocetna

kislina dinatrijeva sol

C10H14N2Na2O8·2H2O 372,24

3.4.3. SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH

3.4.3.1. PRIPRAVA RAZTOPIN VZORCEV

Za meritve smo pripravili po 5 mL 1 mmol/L raztopin spojin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 8. Za vsak

vzorec smo s pomočjo enačbe 𝑚 = 𝑐 ∙ 𝑉 ∙ 𝑀 izračunali ustrezno maso, ki smo jo natehtali

v penicilinko. K vsaki natehti smo nato dodali po 2,5 mL topila za raztapljanje, vzorce

sonicirali v ultrazvočni kopeli, dokler se niso v celoti raztopili, in jim nato dodali po 2,5

mL etanola ter jih dobro premešali. Raztopine vzorcev smo nato z etanolom redčili do

ustreznih koncentracij, ki smo jih merili (Preglednica IV).


23

Preglednica IV: Pripravljene koncentracije raztopin testiranih spojin za določanje njihove sposobnosti

redukcije DPPH•.

Vzorci in

standard

Raztopine

vzorca

(μmol/L)

Končna koncentracija

vzorca v reakcijski

raztopini (μmol/L)

Koncentracijsko

razmerje

DPPH˙ : vzorec

1.

2, 3, 4, 7, 8 500 250 1 : 4

2. 250 125 1 : 2

3. 125 62,5 1 : 1

4. 62,5 31,3 1 : 0,5

5.

1, 5, 6

31,3 15,65 1 : 0,25

6.

Kver

ceti

n 15,65 7,83 1 : 0,125

7.

7,83 3,91 1 : 0,063

8. 3,91 1,96 1 : 0,031

9. 1,96 0,98 1 : 0,016

10. 0,98 0,49 1 : 0,008

3.4.3.2. PRIPRAVA RAZTOPINE STANDARDA

Za standard smo uporabili 1 mmol/L raztopino kvercetina, ki smo jo pripravili v

brezvodnem etanolu. V infuzijsko stekleničko smo natehtali 1,5 mg kvercetina, mu dodali

2,5 mL metanola in 2,5 mL etanola ter suspenzijo sonicirali v ultrazvočni kopeli tako

dolgo, dokler se ves kvercetin ni raztopil. Nato smo z redčenjem v etanolu pripravili

ustrezne koncentracije standarda, ki smo jih izmerili (Preglednica IV).

3.4.4. ZMOŽNOST KELACIJE ŽELEZA(II)


Za meritve smo pripravili po 5 mL 1 mmol/L raztopin spojin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 8. Za vsak

vzorec smo izračunali ustrezno maso, ki smo jo natehtali v penicilinko. Nato smo k vsaki

natehti dodali po 2,5 mL topila za raztapljanje, suspenzijo sonicirali v ultrazvočni kopeli,

da se je ves vzorec raztopil in nato vsakemu dodali po 2,5 mL 500 mmol/L kalij-acetatnega

pufra s pH 5,5.

S topilom in 500 mmol/L kalij-acetatnim pufrom s pH 5,5 (1 : 1), smo vseh osem raztopin

vzorcev redčili tako, da smo pripravili od 31,3 do 1.000 μmol/L raztopine, ki smo jih

izmerili (Preglednica V).


24

Preglednica V: Pripravljene koncentracije testiranih spojin za določanje njihovih zmožnosti kelacije železa.

Raztopine vzorcev (μmol/L) Končna koncentracija vzorca v

reakcijski raztopini (μmol/L)

1. 1000 500

2. 667 333,5

3. 500 250

4. 250 125

5. 125 62,5

6. 62,5 31,3

7. 31,3 15,7

3.4.4.2. PRIPRAVA RAZTOPIN STANDARDOV

Za standard smo uporabili 1 mmol/L raztopini kvercetina in EDTA. Raztopino EDTA smo

pripravili na enak način kot raztopine vzorcev, raztopino kvercetina pa v brezvodnem

etanolu. V penicilinko smo natehtali 1,5 mg kvercetina, mu dodali 5 mL brezvodnega

etanola in suspenzijo sonicirali v ultrazvočni kopeli, vse dokler se ves kvercetin ni raztopil.

Razredčine raztopin EDTA smo pripravili po enakem postopku kot raztopine vzorcev.

Ustrezne redčitve kvercetina pa smo pripravili z uporabo 500 mmol/L kalij-acetatnega

pufra s pH 5,5 (Preglednica V).

3.4.5. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z ŽELEZOM(II)


Za meritve smo pripravili po 5 mL 1 mmol/L raztopin spojin 1, 2, 3, 4, 5 in 6. Za vsak

vzorec smo najprej izračunali ustrezno maso, ki smo jo natehtali v penicilinko. Nato smo

vsakemu vzorcu dodali po 2,5 mL topila za raztapljanje in suspenzijo sonicirali v

ultrazvočni kopeli, da se je ves vzorec raztopil, nato pa dodali še po 2,5 mL brezvodnega

etanola in vse dobro premešali.

Raztopine 1, 2, 3, 4, 5 in 6 s koncentracijo 1 mmol/L smo nato redčili s 120 mmol/L kalij-

fosfatnim pufrom s pH 7,4 in tako pripravili 50 μmol/L koncentracije vzorcev 1, 2, 3, 4, 5

ter 10 μmol/L koncentracijo vzorca 6.

3.4.5.2. PRIPRAVA RAZTOPINE STANDARDA

Za standard smo uporabili kvercetin. V penicilinko smo natehtali 2 mg kvercetina in mu

dodali 1,65 mL MeOH ter 1,65 mL 120 mmol/L kalij-fosfatnega pufra s pH 7,4, suspenzijo


25

pa sonicirali v ultrazvočni kopeli, dokler se ves kvercetin ni raztopil. Pripravili smo 2

mmol/L raztopino, ki smo jo nato razredčili s 120 mmol/L kalij-fosfatnim pufrom s pH 7,4,

do 10 μmol/L koncentracije, ki smo jo uporabili za meritve.

3.5. ANALIZA VZORCEV IN STANDARDOV

3.5.1. POSTOPEK DOLOČANJA SPOSOBNOSTI REDUKCIJE DPPH

RADIKALA

Za meritve vsakega vzorca in standarda smo pripravili vsaj pet različnih koncentracij, kot

smo to že predhodno opisali v tem poglavju. Pripravili smo tudi raztopino reagenta DPPH•

za meritve sposobnosti spojin za njihovo redukcijo. Absorbanco temno vijolično

obarvanega DPPH• smo merili v prisotnosti različnih koncentracij testiranih spojin, in sicer

po 30, 60 in 90 minutni inkubaciji v temi, pri sobni temperaturi, da smo lahko določili

optimalen čas poteka reakcije.

Vzorce, standard in reagente smo v triplikatih nanesli na mikrotitrske ploščice s 96

vdolbinicami (Slika 9 in Preglednica VI).

Slika 9: Mikrotitrska ploščica z reakcijami redukcije DPPH• v triplikatih.

Preglednica VI: Sestavine reagentov in vzorcev nanešenih na mikrotitrsko ploščico.

Reakcijska raztopina Sestavine

Preiskovani vzorec/standard 150 μL vzorca + 150 μL DPPH•

Slepi vzorec (ozadje vzorca) 150 μL vzorca + 150 μL etanola

Slepi vzorec DPPH• 150 μL DPPH

• + 150 μL etanola

Etanol (ozadje DPPH•) 300 μL etanola


26

V reakcijsko raztopino smo dodali 150 μL vzorca/standarda in 150 μL reagenčne raztopine

DPPH•, ter mešanico inkubirali 30 minut v temi pri sobni temperaturi. Nato smo s

spektrofotometričnim čitalcem mikrotitrskih ploščic Synergy™ H4 Hybrid Reader in

programom GEN5 izmerili absorbance pri 517 nm. Postopek smo ponovili še po 60 in 90

minutah od začetka inkubacije. Rezultate smo izrazili v obliki povprečnih vrednosti treh

izmerjenih absorbanc po 90 minutni inkubaciji.

3.5.1.1. IZRAČUN VREDNOSTI EC50

Z uporabo naslednje enačbe smo najprej izračunali odstotek inhibicije DPPH•:

I (%) = (A0 – (A1 – A2))/A0 ∙ 100

A0 je absorbanca slepega vzorca DPPH•, A1 je absorbanca preiskovanega vzorca, A2 pa

absorbanca slepega vzorca. Odstotek inhibicije smo nato podali kot obseg redukcije DPPH•

v % in za vsako testirano spojino s pomočjo programa Microsoft Excel 2010 narisali

ustrezen graf v odvisnosti od uporabljene koncentracije preiskovane spojine. Nato smo

izračunali še standardne napake predvidenih vrednosti y za vsak x v regresijski analizi

(funkcija STEXY). Nazadnje smo izračunali še koncentracijo spojine, ki reducira 50%

začetne koncentracije DPPH• (EC50). Vrednost EC50 smo izračunali z uporabo enačbe za

regresijsko premico in jo podali v obliki EC50 ± standardna napaka.

3.5.2. POSTOPEK DOLOČANJA ZMOŽNOSTI KELACIJE ŽELEZA(II)

Za vsak vzorec in standard smo pripravili po sedem različnih koncentracij, tako kot smo to

že opisali tem poglavju. Pripravili smo tudi oba reagenta in sicer 250 μmol/L raztopino

FeCl2 in 1 mmol/L raztopino ferozina. Reagente in vzorce/standarde smo nato v triplikatih

nanesli na mikrotitrske ploščice s 96 vdolbinicami (Slika 10).



27

Slika 10: Razpored nanašanja raztopin vzorcev in reagentov na mikrotitrsko ploščico v triplikatih pri

ugotavljanju zmožnosti kelacije železa.

Preglednica VII: Priprava reakcijskih raztopin za določanje kelacije železa(II).

Reakcijska

raztopina Sestavine

Preiskovani vzorec 150 μL vzorca + 50 μL FeCl2 + 100 μL ferozina

Slepi vzorec 150 μL vzorca + 50 μL FeCl2 + 100 μL prečiščene vode

Slepi vzorec reagenta 75 μL topila za raztapljanje vzorcev + 75 μL 500 mmol/L kalij-

acetatnega pufra s pH 5,5 + 50 μL FeCl2 + 100 μL ferozina.

V reakcijsko raztopino smo dodali 150 μL vzorca in 50 μL raztopine FeCl2, ter jo

inkubirali 15 minut na sobni temperaturi, da je potekla reakcija med preiskovano spojino in

Fe2+

(Slika 10). Potem smo dodali 100 μL raztopine ferozina in reakcijsko zmes inkubirali

60 minut na 37 °C v temi, da je potekla reakcija med ferozinom in preostalim prostim Fe2+

(Preglednica VII). Na koncu smo s spektrofotometričnim čitalcem mikrotitrskih ploščic in

programom GEN5 izmerili absorbance pri 562 nm.

3.5.2.1 IZRAČUN VREDNOSTI EC50

Z uporabo naslednje enačbe smo najprej izračunali odstotek inhibicije nastalega kompleksa

Ferozin-Fe2+

:

I (%) = (A0 – (A1 – A2))/A0 ∙ 100

A0 je absorbanca slepega reagenta, A1 absorbanca preiskovanega vzorca in A2 absorbanca

slepega vzorca. Odstotke inhibicije smo nato preračunali v odstotke prisotnega kompleksa

Ferozin-Fe2+

, nato pa s programom Microsoft Excel 2010 za vsako testirano spojino

narisali graf odstotka (%) prisotnega vijoličnega kelata Fe(ferozin)34-

v odvisnosti od

koncentracij preiskovane spojine. Koncentracijo spojine, ki kelira 50% Fe2+

ionov, EC50,

smo izračunali z enačbo za regresijsko premico in jo podali v obliki EC50 ± standardna


28

napaka. V primerih, ko preiskovane spojine niso izkazovale linearne odvisnosti, smo

vrednosti EC50 odčitali neposredno iz grafa.

3.5.3. POSTOPEK DOLOČANJA UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNE

TITRACIJE SPOJIN Z ŽELEZOM(II)

V stekleno kiveto smo odpipetirali 2,5 mL predhodno pripravljene raztopine

vzorca/standarda z ustrezno koncentracijo ter s pomočjo UV-Vis spektrofotometra izmerili

titracijski spekter v območju 200 - 600 nm (Slika 11). Nato smo k vzorcu/standardu dodali

1 mmol/L raztopino FeCl2, mešanico inkubirali 5 minut pri sobni temperaturi in ponovno

izmerili titracijski spekter. Koncentracijo FeCl2 v raztopini vzorca/standarda smo

postopoma zviševali, vse do nasičenja z železom.

Nato smo preučili titracijske spektre vzorcev. Poiskali smo vrhove in izozbestične točke, ki

nakazujejo na vezavo preiskovane spojine z železom in njeno nasičenje. Izozbestična točka

je specifična valovna dolžina, pri kateri se med kemično reakcijo absorbanca vzorca ne

spreminja. Pri ustrezni valovni dolžini, ki smo jo določili glede na titracijski spekter

spojine, smo nato s pomočjo programa Microsoft Excel 2010 narisali graf nasičenja.

Slika 11: UV-Vis Spektrofotometer CARY 50 CONC, ki smo ga uporabljali za titracijo vzorcev z železom(II).


29

4. REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1. ANTIOKSIDATIVNA SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA

DPPH

4.1.1. KVERCETIN

Kot pozitivno kontrolo smo uporabili učinkovit antioksidant kvercetin, ki ga uvrščamo

med rastlinske polifenole (flavonole). V večjih koncentracijah je prisoten npr. v čebuli,

brokoliju, čaju, vinu, paradižnikih, jabolkih in borovnicah. Kvercetin dokazano učinkovito

reducira DPPH• (29).

Slika 12: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije kvercetina (μmol/L).

Vrednost EC50 za kvercetin je bila 6,2 ± 0,1 μmol/L (Slika 12). Podobno vrednost so dobili

tudi Locatelli in sodelavci, in sicer EC50 = 6,58 μmol/L (29). Ujemanje vrednosti potrjuje

ustreznost izbrane metode za določanje sposobnosti redukcije DPPH•, zato smo nadaljevali

meritve na vzorcih. Za dobro antioksidativno aktivnost so pomembne številne hidroksilne

skupine, njihovi medsebojni položaji, in prisotnost konjugiranih dvojnih vezi. K

učinkovitemu antioksidativnemu delovanju kvercetina pomembno pripomore dvojna vez

konjugirana s karbonilno skupino (obroč C), kateholna skupina (obroč B) ter hidroksilni

skupini na mestih 3 in 5 (Slika 13) (30). Kvercetin v reakciji z radikalom donira proton in


30

postane radikal. Nastali nesparjeni e- v njegovi molekuli se delokalizira po konjugiranem

delu molekule, kar se kaže v nizki energiji in nereaktivnosti radikala (31).

Slika 13: Prikaz pomembnih skupin v molekuli kvercetina, ki pripomorejo k njegovi učinkoviti antioksidativni

aktivnosti.

4.1.2. VZORCI

Rezultati redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracij preiskovanihih spojin

(μmol/L) so prikazani v obliki grafov (Slike 14-21).

Slika 14: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 1 (μmol/L).


31





32





33


Preglednica VIII: Vrednosti EC50 antioksidativne sposobnosti redukcije DPPH•.

Spojina R1 R2 X (EC50 ± SD)μmol/L

1 OH OH O 11,5 ± 0,1

2 O-Me OH O 431,4 ± 74,7

3 H O-Bu O /

4 OH O-Me O /

5 OH OH S 9,4 ± 0,5

6 O-Me OH S 10,3 ± 0,2

7 519,5 ± 6,7

8 /

Kvercetin 6,2 ± 0,1

4.1.3. KOMENTAR REZULTATOV REDUKCIJE RADIKALA DPPH

Za fenolne antioksidante je znano, da so dobri donorji vodikovih atomov. Njihovi radikali

pa so zaradi resonančne delokalizacije nesparjenih elektronov okrog aromatskega obroča

razmeroma dobro stabilni. Ob odtegnitvi vodikovega atoma nastane pri spojinah 1, 2, 4, 5

in 6 primarni kisikov radikal. Stabilnost takega radikala pa vpliva na antioksidativno

sposobnost spojine. Zato je zelo pomembno, da se lahko radikal resonančno stabilizira z

delokalizacijo elektrona po fenilnem obroču. Delokalizacija se lahko prenese tudi na

(tio)barbiturni del molekule preko dodatno konjugirane dvojne vezi, kar okrepi stabilnost


34

radikala in izboljša antioksidativne lastnosti spojine (Slika 22). Vzorci 1, 2, 5 in 6 imajo v

fenilnem obroču hidroksilno skupino na para mestu, to pa omogoča delokalizacijo

elektrona po celotnem (tio)barbituratu. Spojina 4 pa vsebuje hidroksilno skupino le na

meta mestu, zato lahko poteče delokalizacija elektrona izključno znotraj fenilnega obroča

(32).

Slika 22: Prikaz resonančne stabilizacije radikala spojine 6.

Spojina 1 je v primerjavi s kvercetinom izkazala zelo dobro sposobnost redukcije DPPH•

(Slika 14). Vzrok za to je v prisotni dodatni hidroksilni skupini na meta mestu

benzenovega obroča, ki močno izboljša antioksidativne lastnosti omenjene spojine, saj se

ob tem znatno zmanjša disociacijska energija vezi H-O v hidroksilni skupini na para mestu.

Učinek antioksidativnega delovanja je močnejši kot pa če bi se dodatna hidroksilna

skupina nahajala na orto položaju (30). Antioksidativne lastnosti nekaterih 5-

arilidenbarbituratov so v literaturi že opisali. Tako so Khalid M. Khan in sodelavci že

testirali spojino 1 (EC50 = 6,2 μmol/L) (33). Vrednost EC50, ki smo jo določili mi, in sicer

EC50 = 11,5 μmol/L je višja, najverjetneje zaradi razlik v uporabljenih reakcijskih pogojih.

V literaturi smo namreč zasledili podatek, da na sposobnost in občutljivost redukcije

DPPH• pomembno vplivajo vrsta in količina topila, vrednost pH, koncentracije reagentov

in vzorcev, reakcijski čas ter prisotnost vode in kovinskih ionov, zaradi česar so lahko

vrednosti EC50 višje ali nižje. Tako imajo npr. metanolne in vodne raztopine spojin večjo

občutljivost in boljšo sposobnost za redukcijo DPPH• kot etanolne (29, 34, 35).

Spojina 2 je izkazala slabšo redukcijo DPPH• (Slika 15). V svoji strukturi ima na

benzenskem obroču eno hidroksilno skupino na para in eno metoksi skupino na meta


35

mestu. Metiliranje ali glikoziliranje hidroksilnih skupin lahko znatno zmanjša oziroma celo

izniči antioksidativno delovanje polifenolnih spojin (30). V tem primeru je prisotna

metoksi skupina zelo verjetno vzrok za zmanjšano antioksidativno aktivnost te spojine v

primerjavi s spojino 1.

Spojina 3 v svoji strukturi nima hidroksilnih skupin, ki bi donirale vodikov atom, zato ne

povzroča redukcije DPPH•, kar smo tudi pričakovali (Slika 16). Spojina 4 vsebuje

hidroksilno skupino na meta mestu, metoksi skupino pa na para mestu. Njuna položaja zelo

vplivata na znatno zmanjšanje antioksidativne aktivnosti (30). Graf prikaza redukcije

DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 4 (μmol/L) (Slika 17) kaže, da je spojina

izkazala okoli 11% redukcijo DPPH•, ki se z višanjem koncentracije ni kaj dosti

spreminjala.

Spojini 5 in 6 sta glede na kvercetin izkazali zelo dobro redukcijo DPPH•. Spojini imata

barbituratni obroč zamenjan s tiobarbituratnim. Spojina 5 (EC50 = 9,4 μmol/L), ki se od

spojine 1 (EC50 = 11,5 μmol/L) razlikuje le v atomu žvepla v barbituratnem delu, je med

testiranimi vzorci pokazala najboljše antioksidativno delovanje (Slika 18). Spojina 6

((EC50 = 10,3 μmol/L), ki se od spojine 2 (EC50 = 431,4 μmol/L) prav tako razlikuje le v

atomu žvepla, pa je bila po sposobnosti redukcije DPPH• na drugem mestu (Slika 19).

Žveplo je znano po antioksidativnih in antibakterijskih lastnostih, zaradi česar se kot

antioksidant veliko uporablja predvsem v prehrambni industriji, in sicer v obliki

žveplovega dioksida in sulfitov. Tudi tiolne spojine so zelo pomembne v biokemiji celice.

Nahajajo se v cisteinu oz. v cistein vsebujočih beljakovinah ali manjših molekulah

(glutation). Žveplovi radikali (R-S•) so stabilne spojine, ki večinoma med seboj reagirajo

do še bolj stabilnih disulfidov (R-S-S-R). Tiolne (-SH) skupine imajo zelo pomembno

vlogo pri odstranjevanju ROS in RNS v celičnem metabolizmu. Tiolatne (R-S-) skupine pa

so nukleofili in vstopajo v reakcije z različnimi elektrofili ter reagirajo z ioni težkih kovin.

Tako pomembno pripomorejo k obrambi organizma pred RZ. Spojine s tiolnimi in

tiolatnimi skupinami so dobri donorji vodikovega atoma oziroma elektronov, zato jih

uvrščamo med antioksidante (30). Tako lahko trdimo, da prisotnost žvepla v barbituratnem

delu molekule pripomore k pomembnem zvišanju antioksidativne aktivnosti (Slika 23).


36

Slika 23: Tavtomerija pri tiobarbituratu 6. Nastali tioenol je donor vodika.

V analizo smo vključili tudi glutarimiddioksim (7) in sukcinimiddioksim (8), in sicer zato

ker sta po volumnu molekule podobna barbiturni kislini in ker nas je zanimalo, kako

sprememba v velikosti molekule (5- ali 6-členski obroč) vpliva na njune antioksidativne

sposobnosti. Obe spojini imata v svoji strukturi dve hidroksilni (oksimski) skupini, ki

lahko služita kot donorja vodika oziroma elektronov. Spojina 7 je v primerjavi s

kvercetinom slabo reducirala DPPH• (Slika 20). Za spojino 8 pa vrednosti EC50 nismo

mogli določiti, saj je pri 13,6 % redukciji DPPH• dosegla nasičenje (Slika 21).

Sukcinimiddioksim sestavlja petčlenski obroč, medtem ko molekula glutarimiddioksima

vsebuje šestčlenski obroč. Najverjetneje petčlenski obroč spojine 8 zmanjša njen

redukcijski potencial in/ali ji daje bolj togo strukturo, ki onemogoča njeno dostopnost v

reakciji z DPPH•, zato je ta spojina neaktivna. Glede na ostale preiskovane spojine sta

vzorca 7 in 8 pokazala najslabše antioksidativne učinke na DPPH•.

4.2. ZMOŽNOST KELACIJE ŽELEZA(II)

Pomemben mehanizem delovanja AO je kompleksiranje ionov prehodnih kovin (železa,

bakra, kroma, kobalta...), ki katalizirajo radikalske reakcije in tako pospešijo številne

oksidacije. Antioksidanti, ki so zmožni kelirati nevezano železo, zmanjšajo in preprečijo

možnost nastanka škodljivega hidroksilnega radikala, proti kateremu nimamo učinkovitega

obrambnega sistema. Kot smo že omenili, med učinkovite AO sodijo tudi polifenolne

spojine, kamor uvrščamo kvercetin (30). Za pozitivni kontroloi smo zato izbrali AO

kvercetin, poleg tega pa tudi kelator EDTA, za katera je znano, da dobro kelirata Fe2+

.

Najpogostejše koordinacijsko število za Fe2+

in Fe3+

je 6 (oktaedrična razporeditev

ligandov). Koordinacijsko število je odvisno predvsem od vrste vezanega liganda (donor

elektronov) na centralni kation. Ligandi se med seboj razlikujejo v naboju (nevtralni,

anionski in kationski) in so lahko enovezni ali večvezni. Večvezni ligandi se na kovinski

kation vežejo preko več atomov. Imenujejo jih tudi kelatni ligandi ali kelatorji (11). V

kelatih (grško chelè pomeni klešče) ležijo kelatni ligandi okoli kovinskega atoma v obliki


37

rakovih klešč. Pri kelaciji pride do tvorbe dveh ali več koordinacijskih vezi med osrednjim

kovinskim kationom in večveznim ligandom, ki se z več atomi veže v kelatni kompleks

(36). Najznačilnejši večvezni ligand je etilendiamintetraocetna kislina - [EDTA]4-

, ki se ob

deprotonaciji veže na kovinski kation preko šestih donorskih atomov (Slika 24).

Slika 24: A: Etilendiamintetraocetna kislina - [EDTA]4-

. B: Kelatni kompleks med EDTA in Fe2+

.

Koordinacijsko število je odvisno tudi od velikosti ligandov. Večji kot so, manj se jih

lahko veže na centralni kation. Fe3+

lahko veže šest fluoridnih anionov ([FeF6]3-

- oktaeder)

in le štiri kloridne anione ([FeCl4]- - tetraeder). Nastanek koordinacijske spojine je

energetsko ugoden proces, na katerega vpliva energija vezi med kovino in ligandom,

energija polja ligandov, razporeditev ligandov ter odbojne sile med njimi (11).

4.2.1. EDTA

Etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) je zelo močan kelator magnezija, kalcija, železa in

drugih kovinskih ionov. Zato jo pogosto uporabljamo v različnih analiznih metodah, in

sicer za odstranjevanje kovinskih ionov ali za dokazovanje njihove prisotnosti. Molekula

EDTA se poveže z železom preko šestih donorskih atomov in ga popolnoma obda (Slika

24B). Kompleks med EDTA in železom je redoks aktiven. Vrednost EC50 = 21,1 ± 0,7

μmol/L, ki smo jo določili izkazuje zelo dobro zmožnost kelacije železa(II) (Slika 25).


38


kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije EDTA (μmol/L).

4.2.2. KVERCETIN

Dvovalentno železo se najverjetneje veže na kvercetin preko vezavnega mesta 3-hidroksi-

4-keto z 2,3-dvojno vezjo (obroč C). Druga verjetna vezava poteka preko kateholnega dela

spojine (obroč B), tretja pa še preko 5-hidroksi-4-keto vezavnega mesta, vendar pa je ta

manj verjetna, saj je nastali kompleks manj stabilen (Slika 26) (30, 37). Da je

najverjetnejše vezavno mesto Fe2+

tisto na obroču C so ugotovili tudi Guo in sodelavci

(27). Opisana vezavna mesta Fe2+

so značilna tudi za druge polifenolne antioksidante, pa

tudi za spojine, ki v svoji strukturi vsebujejo fenole. Vrednost EC50, ki smo jo določili za

kvercetin je bila 133,9 ± 10,9 μmol/L (Slika 27).

Slika 26: Verjetna vezavna mesta med molekulo kvercetina in Fe2+

.


39


kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije kvercetina

(μmol/L).

4.2.3. VZORCI


kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 1 (μmol/L).


40








41








42



4.2.4. PRIMERJAVE MED SPOJINAMI

Za antioksidativno delovanje spojin 1 in 2 je prisoten fenol s prostimi hidroksilnimi

skupinami in ustreznim redoks potencialom (kateholna skupina). Železo se lahko veže tudi

preko kisikovih in dušikovih atomov v barbituratnem delu spojine (1, 2, 3, 4). Za

barbiturno kislino je znano, da ima sposobnost kelacije ionov prehodnih kovin (38).

Spojna 1 (EC50 = 120,4 μmol/L) je izkazovala dobro zmožnost kelacije železa, in sicer še

nekoliko boljšo od kvercetina, pod enakimi testnimi pogoji. Iz grafa je razvidno, da med

količino prisotnega kelata Ferozin-Fe2+

(%) in koncentracijo spojine 1 ni linearne

odvisnosti. Spojina se je kmalu po 50% kelaciji Fe2+

pričela obnašati nelinearno, zato

nismo mogli izračunati standardnega odklona in smo posledično vrednost EC50 odčitali

neposredno iz grafa (Slika 28). Možni vzrok za to, da se pri višjih koncentracijah spojine 1

delež nastalega Ferozin-Fe2+

kompleksa ne zmanjšuje linearno, je lahko v slabši topnosti

preiskovane spojine v izbrani zmesi topil. Spojina 1 najverjetneje veže železo preko dveh

hidroksilnih skupin na benzenskem obroču ter preko barbituratnega dela molekule (30, 38).

Glede na to da, torej kaže lastnosti večveznega kelatnega liganda, predvidevamo, da z Fe2+

sočasno tvori koordinacijske vezi preko kateholnega in barbituratnega dela, kar vodi v

zvitje molekule in nastanek kelatnega kompleksa.

Spojina 2 je imela zelo šibko zmožnost kelacije železa(II) (EC50 = 9085,1 μmol/L). Na

fenilnem obroču ima eno hidroksilno in eno metoksi skupino. Za slednjo je značilno, da

zmanjša ali izniči zmožnost vezave železa (30). Izkazovanje šibke aktivnosti je

najverjetneje povezano z vezavo železa na barbituratni del molekule (38). Glede na


43

vrednost EC50 in potek grafa (Slika 29) vidimo, da spojina izkazuje tako šibko aktivnost,

da lahko trdimo, da v kompetitivnem ferozinskem testu ni zmožna močneje vezati železa.

Tudi spojina 3 je izkazala šibko zmožnost kelacije železa(II) (EC50 = 6406,7 μmol/L)

(Slika 30). V svoji strukturi nima hidroksilnih skupin na fenilnem obroču. Njena šibka

aktivnost je zato najverjetneje povezana le s kelacijo Fe2+

preko barbituratnega dela

molekule (38). Spojina 3 je kljub šibki sposobnosti kelacije pokazala boljšo aktivnost kot

spojina 2, česar nismo pričakovali. Morda je za to kriva metilacija na fenilnem obroču v

spojini 2 ali pa prisotnost hidrofobnega efekta. Spojina 3 bi namreč lahko tvorila micelije,

ki lahko vežejo Fe2+

.

Še slabše rezultate smo dobili s spojino 4, ki sploh ni kazala zmožnosti kelacije železa. Na

mestu 3 v fenilnem obroču ima vezano metoksi skupino, na mestu 2 pa hidroksilno

skupino. Odstotek kompleksa Ferozin-Fe2+

se z višanjem koncentracije spojine ni zniževal

(Slika 31).

Vrednosti EC50 za spojino 5 nismo mogli določiti, saj ta ni dosegla 50% kelacije Fe2+

(Slika 32). Spojina ima barbituratni del molekule zamenjan s tiobarbituratnim, poleg tega

pa še dve hidroksilni skupini pripeti na fenilnem obroču. Pričakovali smo, da bo dobro

kelirala železo, kar je bilo sprva tudi videti, nato pa se je zgodil obrat in prisotnost

kompleksa Ferozin-Fe2+

je ponovno pričela naraščati. Predvidevamo, da je tako kot pri

spojini 1, za nelinearni odziv vzrok slabša topnosti spojine v izbrani zmesi topil. Spojina 5

je podobna spojini 1, le da ima v svoji strukturi žveplov atom. Slednji verjetno vpliva na

njeno slabšo kelacijsko sposobnost. Podobno je bilo tudi s spojino 6, ki ni imela zmožnosti

za kelacijo železa. Odstotek kompleksa Ferozin-Fe2+

se z višanjem njene koncentracije ni

zniževal (Slika 33). Spojina 6 je podobna spojini 2, le da ima v barbituratnem delu

molekule žveplo. Tako lahko za spojini 5 in 6 trdimo, da prisotnost žvepla v barbituratnem

delu molekule negativno vpliva na kelacijo železa.

Glutarimiddioksim (7) so testiral že Sun in sodelavci in ugotovili, da tvori komplekse z

ioni prehodnih kovin (železom, bakrom, nikljem in svincem). Z Fe3+

tvori celo zelo močne

komplekse (18). Spojina 7 je glede na uporabljena pozitivna standarda izkazovala srednje

dobro kelacijo Fe2+

(EC50 = 601,2 μmol/L) (Slika 34). Molekulo glutarimiddioksima

sestavlja šestčlenski obroč z dvema oksimoma (tu se nahajata hidroksilni skupini) in enim

imidnim dušikovim atomom, kar omogoča tridentatno kelacijo železa.

Sukcinimiddioksim (spojina 8) pa ni bil sposoben kelirati železo. Odstotek prisotnega

kompleksa Ferozin-Fe2+

je bil enak, ne glede na zviševanje koncentracije spojine (Slika


44

35). Spojina 8 ima v svoji strukturi petčlenski obroč. Hidroksilni skupini sta zaradi tega

bolj oddaljeni, molekulska struktura pa je verjetno bolj toga, kar očitno onemogoča zvitje

molekule in s tem zmožnost kelacije železa.

Preglednica IX: Vrednosti EC50, ki predstavljajo zmožnosti preiskovanih spojin za kelacijo železa.

Spojina R1 R2 X (EC50 ± SD) μmol/L

1 OH OH O 120,4

2 O-Me OH O 9085,1 ± 53,5

3 H O-Bu O 6406,7 ± 47,9

4 OH O-Me O /

5 OH OH S /

6 O-Me OH S /

7 601,2 ± 12,6

8 /

Kvercetin 133,9 ± 10,9

EDTA 21,1 ± 0,7


45

4.3. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z

ŽELEZOM(II)

4.3.1. KVERCETIN

Slika 36: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 10 μmol/L kvercetina v prisotnosti 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15,

20, 25, 30, 40 in 50 μmol/L Fe2+

. B) Odvisnost absorbance kompleksa Kvercetin-Fe2+

pri 425 nm od

koncentracije Fe2+

.

Za pozitivni standard smo uporabili antioksidant kvercetin. UV-Vis spektrofotometrično

titracijo z Fe2+

smo izvedli v kalij-fosfatnem pufru s pH 7,4. Po dodatku Fe2+

smo izmerili

padec absorbance prostega kvercetina pri 376 nm, nastajanje novega vrha pri 425 nm in

izozbestično točko pri 403 nm, kar je vse posledica nastanka kompleksov med kvercetinom

in železom (Slika 36A). Nato smo izrisali titracijsko krivuljo pri 425 nm, ter zabeležili

nastanek kompleksa 1:1, kvercetin:Fe2+

(Slika 36B).

Podobno meritev so izvedli tudi Guo in sodelavci, ki so preučevali nastanek kompleksov

med kvercetinom ter Fe2+

in Fe3+

. Z UV-Vis spektroskopsko analizo so ugotovili, da

kvercetin tvori komplekse z Fe2+

v razmerju 2:1 in 1:1, kar so potrdili tudi z ESI masno

spektrometrijo (27). Mi smo zaznali le kompleks 1:1, kompleksa 2:1 pa ne. Eden od

možnih vzrokov za to bi lahko bila oksidacija Fe2+

do Fe3+

. Raztopina Fe2+

je bila namreč

med meritvijo izpostavljena zraku. Razlika v rezultatih pa je verjetno tudi posledica

različnih pH pogojev, uporabljenih topil in metodoloških pristopov. Kljub temu lahko


46

trdimo, da so naši rezultati UV-Vis spektrofotometrične titracije kvercetina z Fe2+

ustrezni,

zato smo nadaljevali z analizo izbanih spojin.

4.3.2. VZORCI TESTIRANIH SPOJIN

Spojina 1

Za spojino 1 smo že pri kelaciji železa(II) ugotovili, da dobro kelira železo. To smo

potrdili tudi z UV-Vis spektrofotometrično titracijo Fe2+

. Pred dodatkom Fe2+

smo zaznali

vrh pri 341 nm. Ta se je nato po dodatku Fe2+

pričel pomikati rahlo v desno proti 349 nm,

dokler spojina ni začela dosegati nasičenja in se je naraščajoči vrh začel pomikati nazaj v

levo. Spojina je nato v prisotnosti 50 μmol/L Fe2+

dosegla nasičenje (Slika 37A). Izrisali

smo titracijsko krivuljo pri 346 nm in zabeležili nastanek kompleksov 2:1 in 1:1 spojine

1:Fe2+

(Slika 37B).

Slika 37: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 1 v prisotnosti 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5,

15, 20, 25, 30, 40, 50 in 60 μmol/L Fe2+


od koncentracije

Fe2+

pri 346 nm.

Spojina 2

Spojina 2 je v testu zmožnosti kelacije Fe2+

izkazala tako šibko aktivnost, da bi jo lahko

označili za neaktivno. Z UV-Vis spektrofotometrično titracijo pa smo ugotovili, da temu ni


47

tako. V testu zmožnosti kelacije Fe2+

smo uporabili reagent ferozin, ki tekmuje za vezavo

železa s testirano spojino. Ferozin pa lahko odtegne železo iz kompleksa s testirano

spojino, če ta ni dovolj stabilen. Pri UV-Vis spektrofotometrični titraciji Fe2+

v raztopini ni

prisotnega drugega tekmeca za železo, zaradi česar je spojina 2 lahko vezala železove ione.

Tako smo v UV-Vis spektru zaznali naraščanje absorbance pri 348 nm, izozbestično točko

pri 430 nm in padec absorbance pri 479 nm (Slika 38A). Pri 348 nm smo izrisali graf

titracijske krivulje in ugotovili nastanek kompleksov 4:1, 3:1 in 1:2 (Slika 38B).


15, 20, 25, 30 in 35 μmol/L Fe2+



pri 348 nm.

Spojina 3

Spojina 3 ni pokazala jasne aktivnosti. Celoten UV-Vis spekter je po dodatku Fe2+

ves čas

le naraščal (Slika 39A). Pri 285 nm smo nato izrisali graf titracijske krivulje, ki je v

prisotnosti 25 μmol/L Fe2+

izkazoval rahlo spremembo v naklonu in s tem nastanek

kompleksa 2:1 (Slika 39B).


48


15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160, 200, 240, 280 in 320 μmol/L Fe2+

. B) Odvisnost

absorbance kompleksa spojine 3-Fe2+


pri 285 nm.

Spojina 4

Absorpcijski spekter spojine 4, je prav tako kot pri spojini 3 le naraščal in kljub visokim

dodanim koncentracijam Fe2+

ni dosegel nasičenja. Izrisani absorpcijski spekter in graf pri

315 nm nista pokazala jasne aktivnosti (Slika 40A). V grafu odvisnosti absorbance



pri 315 nm smo zaznali le rahlo

spremembo v naklonu, kar bi lahko kazalo na nastanek kompleksa v razmerju 2:1 (Slika

40B).

Spojina 5

Po dodatku Fe2+

smo v absorpcijskem spektru spojine 5 zaznali naraščanje absorbance pri

345 nm (Slika 41A). Ta je naraščala do koncentracije 70 μmol/L Fe2+

, nato pa je dosegla

plato. Pri 345 nm smo nato izrisali graf titracijske krivulje, ki je pokazal nastanek

kompleksa med spojino 5 in Fe2+

v razmerju 2:1 (Slika 41B).


49


15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 160, 200, 280 in 320 μmol/L Fe2+

. B) Odvisnost absorbance



pri 315 nm.

Slika 41: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 5 v prisotnosti 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30,

35, 40, 50, 60 in 70 μmol/L Fe2+



pri 345 nm.


50

Spojina 6

Titracijo z Fe2+

smo izvedli s koncentracijo 10 μmol/L spojine 6, in sicer zaradi močne

obarvanosti njene raztopine. Absorpcijski spekter je po dodatku raztopine Fe2+

ionov ves

čas naraščal (Slika 42A). Titracijsko krivuljo smo izrisali pri 350 nm in zaznali rahlo

spremembo v njenem naklonu (Slika 42B). To bi lahko predstavljalo nastanek kompleksa

spojine 6-Fe2+

v razmerju 1:2. Spojina 6 v ferozinskem testu kelacije železa ni bila aktivna.

Vzrok za to je najverjetneje odtegnitev Fe2+

iz njenega šibkega kompleksa 6-Fe2+

s

ferozinom. V testu UV-Vis spektrofotometrične titracije spojin z Fe2+

pa v raztopini ni bilo

prisotnega nobenega drugega tekmeca za železo, zato smo najverjetneje lahko zaznali

šibko sposobnost spojine 6 za vezavo železa.


15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 in 140 μmol/L Fe2+

. B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 6-

Fe2+


pri 350 nm.


51

4.3.3 REZULTATI UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNE TITRACIJE

ŽELEZA(II)

Z UV-Vis spektrofotometrično titracijo smo preverili sposobnost preiskovanih spojin za

vezavo železo(II). Želeli smo pojasniti rezultate meritev, ki smo jih pridobili s testom

kelacije železa(II). V tem testu kelacije smo uporabili reagent ferozin, ki z vzorcem

tekmuje za vezavo Fe2+

, ki pa ga lahko tudi odtegne iz manj stabilnega kompleksa. V UV-

Vis spektrofotometrični titraciji železa(II) pa ni prisotnega nobenega tekmeca, zato lahko

na ta način zaznamo tudi šibko vezavo železa (2). Dobro vezavno sposobnost za Fe2+

smo

ponovno ugotovili pri spojini 1, ki ima v svoji strukturi kateholno skupino. Spojina 5, ki je

podobna spojini 1, pa je zopet hitro dosegla nasičenje. Ta spojina ima v strukturi

barbituratni del zamenjan s tiobarbituratnim, kar očitno vpliva na njeno zmanjšano

aktivnost. Zelo šibko aktivnost, ki je najverjetneje povezana z aktivnostjo barbituratnega

dela molekule, pa smo zaznali še pri spojinah 3, 4 in 6, (38). Rezultate UV-Vis

spektrofotometrične titracije železa(II), ki so posledica nastanka kompleksov in aktivnosti

barbituratnega dela molekule, bi morali potrditi še z drugimi analiznimi tehnikami, npr. z

ESI masno spektrometrijo.


52

5. SKLEP

Ugotovili smo, da so imele spojine, ki v svoji strukturi vsebujejo kateholno

skupino, najboljše antioksidativne učinke v smislu redukcije DPPH• in kelacije

železa(II).

Položaj hidroksilne skupine na para mestu v fenilnem obroču omogoča v nastalem

radikalu delokalizacijo prostega elektrona po celotnem (tio)barbituratnem delu

molekule, kar okrepi stabilnost radikala in izboljša antioksidativne lastnosti

tovrstnih spojin. Dodatna hidroksilna skupina na orto mestu znatno izboljša

antioksidativne lastnosti.

Prisotnost žvepla v strukturi 5-benzilidentiobarbituratov izboljša redukcijo DPPH•,

a obenem zmanjša oziroma izniči sposobnost kelacije železa(II), kar smo potrdili

tudi z UV-Vis spektrofotometrično titracijo železa(II).

Metiliranje hidroksilnih skupin zmanjša oziroma izniči antioksidativno delovanje

spojin.

Odsotnost hidroksilnih skupin v bezilidenskem obroču povzroči antioksidativno

neaktivnost.

Petčlenski obroč daje sukcinimiddioksimu bolj togo molekulsko strukturo, kar

onemogoča vezavo Fe2+

in izniči njegovo potencialno sposobnost redukcije DPPH•.

Glutarimiddioksim (spojina 7), ki ima šestčlenski obroč, je v primerjavi s

sukcinimiddioksimom (spojina 8) izkazal boljšo antioksidativno aktivnost.

Fe2+

se lahko šibko veže tudi preko kisikovih in dušikovih atomov v barbituratnem

delu spojine.

V okviru magistrske naloge smo potrdili našo hipotezo, da 5-benziliden(tio)barbiturati, ki

imajo v svoji strukturi več hidroksilnih skupin vezanih na fenilni obroč, kažejo boljše

antioksidativne lastnosti. Ugotovili smo tudi, da lahko na aktivnost spojin vplivajo različne

strukturne spremembe osnovnega 5-benziliden(tio)barbiturata, ki bodisi okrepijo,

zmanjšajo ali celo izničijo njihovo antioksidativno sposobnost (položaji hidroksilnih

skupin v fenilnem obroč ali njihova metilacija). Predpostavljali smo, da bodo imeli

tiobarbiturati boljše antioksidativne lastnosti, kar smo tudi potrdili z njihovo sposobnostjo

redukcije radikala DPPH. S testom ugotavljanja zmožnosti kelacije železa(II) pa smo prišli


53

do zaključkov, da je prisotno žveplo povzročilo slabšo kelacijo Fe2+

, zato smo to delovno

hipotezo zavrnili.


54

VIRI IN LITERATURA

1. Halliwell B, Gutteridge: Free radicals in biology and medicine. Oxford University

Press Inc., New York, 2007: 38-45, 79-80, 132-142, 187-188, 195-198, 645, 669-

677.

2. Pečar S.: Radikali v našem življenju. Kemija v šoli, 2006:18(3): 13-19.

3. Osredkar J.: Oksidativni stres. Zdrav Vestn, 2012: 81: 393-406.

4. Pečar S.: Radikali v našem okolju. Kemija v šoli, 2006: 18(2): 26-30.

5. de Grey A.D.N.J.: HO2•: The Forgotten Radical. DNA and Cell Biology, 2002:

21(4): 251-257.

6. Koppenol W.H: The centennial of the Fenton reaction. Free Radical Biology and

Medicine, 1993: 15:645-651.

7. Prousek J: Fenton chemistry in biology and medicine. Pure and Applied Chemistry,

2007: 79(12): 2325–2338.

8. Fenton's reagent. Spletna stran: http://en.wikipedia.org/wiki/Fenton%27s_reagent

(dostop: januar 2015).

9. Haber–Weiss reaction. Spletna stran:

http://en.wikipedia.org/wiki/Haber%E2%80%93Weiss_reaction (dostop: januar

2015).

10. Šuput D: Reaktivne kisikove zvrsti v patofizioloških procesih. In: Temelji

patološke fiziologije, 2. Izd, Ljubljana, 2011: 24.

11. Obreza A, Mravljak J, Perdih F: Farmacevtska kemija I. Univerza v Ljubljani,

Fakulteta za farmacijo, Ljubljana, 2014: 7-35, 197-204.

12. Higgins T, Beutler E, Doumas B.T.: Hemoglobin, Iron and Bilirubin. In: Tietz

Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Elsevier Saunders, St

Louis, Missouri, 2006: 1186-1190.

13. Šuput D, Bunc M.: Anemije, In: Patofiziologija s temelji fiziologije. Inštitut za

patološko fiziologijo, Ljubljana, 2002: 15-17.

14. Zdravila z ATC klasifikacijo V03AC. Spletna stran:

http://www.registerzdravil.si/atc/V03AC (dostop: marec 2015).

15. Lopez-Munoz F, Ucha-Udabe R, Alamo C.: The history of barbiturates a century

after their clinical introduction. Neuropsychiatric Disease and Treatment, 2005:

1(4): 329-343.


55

16. Moniri N.H. Sedative-Hypnotics. In: Foy's Principles of Medicinal Chemistry.

Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer business, Philadelphia,

Baltimore, 2013: 489-490.

17. Biling Sokmen B., Ugras S., Yucel Sarikaya H, et al. Antibacterial, Antiurease, and

Antioxidant Activities of some Arylidene Barbiturates. Appl Biochem Biotechnol,

2013: 171: 2030-2039.

18. Sun X, Xu C, Tian G, Rao L.: Complexation of glutarimidedioxime with Fe(III),

Cu(II), Pb(II), and Ni(II), the competing ions for the sequestration of U(VI) from

seawater. Dalton Trans, 2013: 42(40): 14621-14627.

19. Ahmad S, Arshad M. A., Ijaz S, et.al.: Review on methods used to determine

Antioxidant activity. IJMRD, 2014: 1(1): 35-40.

20. Sochor J, Ryvolova M, Krystofova O, et. al.: Fully automated spectrometric

protocols for determination of antioxidant activity: advantages and disadvantages.

Molecules, 2010: 15(12): 8618-8640.

21. Charles D.J.: Antioxidant properties of spices, herbs and other sources. Springer

Science+Business Media, New York, 2013: 12-14.

22. Hossain U, Bhattacharya S.: Synthesis of O-prenylated and O-geranylated

derivatives of 5-benzylidene2,4-thiazolidinediones and evaluation of their free

radical scavenging activity as well as effect on some phase II

antioxidant/detoxifying enzymes. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17, 2007: 1149-1154.

23. Molyneux P.: The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for

estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol., 2004: 26(2): 211-

219.

24. Shahidi F.: Natural Antioxidants: Chemistry, Health Effects, and Applications.

AOCS Press, ZDA, 1997: 216.

25. Stookey L.L.: Ferrozine – A new Spectrophotometric reagent for iron. Analytical

Chemistry, 1970: 42 (7): 779-781.

26. Pratap Chandran R, Vysakhi M.V., Manju S, et. al.: In vitro free radical scavenging

activity of aqueous and methanolic leaf extracts of aegle tamilnadensis abdul kader

(rutaceae). Int J Pharm Sci, 2013: 5(3): 819-823.

27. Guo M, Perez C, Wei Y, et al.: Iron-binding properties of plant phenolics and

cranberry's bio-effects. Dalton Trans., 2007: 4951-4961.


56

28. Geng J, Li M, Wu L, et.al.: Liberation of Copper from Amyloid Plaques: Making a

Risk Factor Useful for Alzheimer’s Disease Treatment. J. Med. Chem., 2012: 55:

9146-9155.

29. Locatelli M., Gindro R., e tal.: Study of the DPPH•-scavenging activity:

Development of a free software for the correct interpretation of data. Food

Chemistry, 2009: 114: 889-897.

30. Pečar S, Mravljak J. Šumi Življenja ali radikali in druge reaktivne snovi v telesu.

Slovensko farmacevtsko društvo. Ljubljana, 2015: 138-198.

31. Bentz A. B.: A Review of Quercetin: Chemistry, Antioxidant Properties, and

Bioavailability. Spletna stran: http://www.jyi.org/issue/a-review-of-quercetin-

chemistry-antioxidant-properties-and-bioavailability/ (dostop: junij 2015).

32. Brand-Williams W, Cuvelier M.E., Berset C: Use of a Free Radical Method to

Evaluate Antioxidant Activity. LWT- Food Science and Technology, 1995: 28: 25-

30.

33. Khan K. M, Ali M, Ajaz A, et al.: Synthesis of 5-Arylidene Barbiturates: A Novel

Class of DPPH Radical Scavengers. Letters in Drug Design & Discovery, 2008:

5(4): 286-291.

34. Sharma O. P., Bhat T. K.: DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry,

2009: 113: 1202-1205.

35. Dawidowicz A. L., Wianowska D., Olszowy M.: On practical problems in

estimation of antioxidant activity of compounds by DPPH• method (Problems in

estimation of antioxidant activity). Food Chemistry, 2012: 131: 1037-1043.

36. Kelacija. Spletna stran: http://sl.wikipedia.org/wiki/Kelacija (dostop: marec 2015).

37. Mladenka P, Macakova K, Filipsky T, e tal.: In vitro analysis of iron chelating

activity of flavonoids. Journal of Inorganic Biochemistry, 2011: 105: 693-701.

38. Ikotun A. A, Ojo Y, Obafemi C, Egharevba G: Synthesis and antibacterial activity

of metal complexes of barbituric acid. Afr. J. Pure Appl. Chem., 2011: 5(5): 97-

103.

http://www.jyi.org/issue/a-review-of-quercetin-chemistry-antioxidant-properties-and-bioavailability/

http://www.jyi.org/issue/a-review-of-quercetin-chemistry-antioxidant-properties-and-bioavailability/

magistrski Študijski program laboratorijska … · univerza v ljubljani fakulteta za farmacijo...

Documents