Siti Adlina Panca Putri 1106069222 LTM Rekayasa Genetika

Kloning vektor tanaman

Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens

Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning.

Akan tetapi, ada suatu bakteri, yaitu Agrobacterium tumefaciens, yang membawa plasmid berukuran

200 kb dan disebut plasmid Ti (tumor inducing atau penyebab tumor). Bakteri A. tumefaciens dapat

menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil, khususnya padi.

Ketika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid Ti, yang disebut T-DNA, akan terintegrasi ke

dalam DNA kromosom tanaman, mengakibatkan terjadinya pertumbuhan sel-sel tanaman yang tidak

terkendali. Akibatnya, akan terbentuk tumor atau crown gall.

Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA dapat

mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini selanjutnya akan dieskpresikan

menggunakan sistem DNA tanaman.

Dalam prakteknya, ukuran plasmid Ti yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun,

ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasi dengan DNA

tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada di dalam satu

sel bakteri A. tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya

dilakukan pada T-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid E.coli. Selanjutnya,

plasmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel A. tumefaciens yang

membawa plasmid Ti tanpa bagian T-DNA. Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-

gen pembentuk tumor yang terdapat pada T-DNA.

Gambar 1. Ti plasmid tanda panah menunjukan garis wilayah transfer kiri dan dan kanan . gen Onc bertanggung jawab untuk transformasi pertumbuhan. Nos sebagai sintesis nopaline. Vir untuk

mentransfer T-DNA kedalam sel target

T-DNA diinduksi dalam menanggapi berbagai senyawa dalam eksudat dari tanaman yang

telah dilukai, senyawa ini meliputi acetosyringone, alpha-hydroxyacetosyringone dan

prekursor lignin, seperti coniferyl alkohol. T-DNA itu sendiri diapit oleh urutan berulang 25

pasangan basa, T-DNA mengandung sekelompok gen disebut sebagai gen onc yang

bertanggung jawab untuk oncogenicity T-DNA yang mana Mereka termasuk gen untuk

sintesis auksin dan sitokinin, yang merupakan pengatur tumbuh yang menyebabkan gangguan

pertumbuhan sel. Selain itu, T-DNA mengandung gen untuk enzim yang menghasilkan

konjugat asam amino yang tidak biasa, seperti nopaline dan octopine .Oleh karena itu, sel-sel

tumbuhan yang memiliki T-DNA dimasukkan dan akan tumbuh tidak terkendali dan akan

mensintesis opines. Opines diekskresikan oleh sel-sel tumbuhan (yang tidak dapat

menggunakan mereka sendiri). Agrobacterium, memiliki mekanisme yang sangat canggih

untuk menumbangkan fungsi sel normal.

Vektor

Prinsip dasar menggunakan Agrobacterium sebagai alat untuk manipulasi genetik tanaman

adalah untuk memasukkan DNA asing ke dalam T - DNA dari sel bakteri dan mengandalkan

bakteri untuk mentransfer DNA. selama kebutuhan protein disediakan oleh bakteri, T DNA

dapat ditransfer kedalam sel genom tumbuhan . akan tetapi, Ada dua kesulitan dengan hal

ini. Yang pertama adalah bahwa plasmid Ti terlalu besar untuk memanipulasi in vitro . Yang

kedua adalah bahwa T - DNA mengandung gen yang akan mengganggu pertumbuhan

tanaman yang telah ditransfer . Masalah-masalah ini diatasi dengan penggunaan sistem vektor

cointegrative . vektor cointegrative menggunakan vektor menengah kecil yang dapat

dimanipulasi dengan mudah dan membawa selectable marker . Gen yang diinginkan

dimasukkan ke dalamnya dan vektor intermediete rekombinan diperkenalkan ke dalam sel

Agrobacterium yang mengandung plasmid Ti . Vektor intermediet tidak mampu mereplikasi

dalam Agrobacterium , tapi bisa diperbanyak dengan rekombinasi penyisipan ke daerah T -

DNA dari plasmid Ti Agrobacterium . Kemudian mentransfer T - DNA ke tanaman penerima

. Untuk tanaman yang akan dimasukan,jika tidak memiliki pertumbuhan yang tidak normal

,diperlukan juga penonaktifan tempat Ti Plasmid, oleh inaktivasi satu atau lebih gen untuk

biosintesis zat pengatur tumbuh . Pendekatan ini agak rumit ,sehingga diperlukan

rekombinasi antara vektor integratif dan Ti plasmid in vivo dalam sel Agrobacterium .H al

Ini digantikan oleh penggunaan sistem vektor biner . hal Ini menggunakan plasmid kecil ,

vektor biner , yang dapat mudah dimanipulasi . pada sistem ini, Ti plasmid dan vektor yang

kecil melengkapi satu sama lain dalam sel A tumaficiens. T-DNA yang dibawa oleh vektor

kecil di pindahkan ke kromosom DNA tanaman dengan kode protein yang dibawa oleh Ti

plasmid

gambar 2. Sistem vektor biner . bagian Ti Plasmid mentransfer T-DNA dari vektor kecil ke host

genome.

Mentransfer ke dalam sel tanaman

Tahap berikutnya ialah mengatur Agrobacterium termodifikasi untuk menginfeksi sel-sel

tumbuhan dan transfer T-DNA ke dalamnya. Berbagai metode yang ada, dan yang optimal

bervariasi dari spesies ke spesies, metodenya ialah menanan Agrobacterium yang

mengandung vektor yang sesuai dan kemudian mentransfernya ke sebuah media yang cocok

untuk memilih untuk transformasi. Media ini berisi sistem seleksi tambahan antibiotik untuk

membunuh sel Agrobacterium sisa dan pengatur pertumbuhan tanaman untuk membantu

dalam regenerasi. Tanaman Utuh kemudian diregenerasi dengan teknik kultur jaringan.

Pendekatan digunakan secara luas dengan Arabidopsis. Dalam hal ini, tanaman dicelupkan

sebentar ke dalam Agrobacterium dan kemudian tumbuh .Benih-benih tersebut kemudian

berkecambah pada media selektif yang sesuai, dan bibit yang mampu tumbuh harus

mengandung DNA dari vektor biner. Dalam beberapa protokol, tanaman mengalami

perlakuan vakum yang biasa disebut infiltrasi vakum. Teknik lain untuk transfer DNA dari

Agrobacterium meliputi injeksi bakteri ke dalam jaringan tanaman dan inkubasi protoplas

dengan kultur bakteri yang diikuti oleh regenerasi tanaman dari protoplas.

Gambar 3. Transformasi kultur sel

Metode lain dari pemindahan DNA

Metode lain yaitu dengan menggunakan transformasi biolistic. dengan menggunakan sel-sel epidermis

utuh dari bawang merah sebagai target dan microprojectiles yng membawa RNA dari virus mosaik

tembakau atau DNA membangun pengkodean kloramfenikol asetiltransferase . Transformasi

langsung protoplas tanpa menggunakan Agrobacterium cukup mungkin dilakukan . Seleksi untuk

transforman dapat dilakukan dengan menggunakan selectable marker seperti yang digunakan

dalam transformasi Agrobacterium . Namun, yang paling sulit pada aspek pendekatan ini adalah

regenerasi tanaman utuh dari protoplas.

Teknik lainnya ialah dengan menggunakan virus mosaik kembang kol ( CaMV ), injeksi langsung

DNA , fusi protoplas dengan liposom yang mengandung DNA , transformasi biolistic serbuk sari (

diikuti oleh penyerbukan dengan serbuk sari berubah ) dan injeksi DNA ke dalam serbuk sari

tabung .

Ekspresi transien

Sistem ekspresi transien ialah Transformasi yang tidak stabil karena gene tertentu telah dilakukan atau

dimodifikasi. Selain itu, Ekspresi pada protoplas dapat berbeda dari ekspresi jaringan yang utuh.

Promotor dan selectable markers

Promotor yang sering digunakan ialah caMV, yang biasa disebut promotor 35s yang bertanggung

jawab untuk generasi transkripsi 35s dalam sel yang terinfeksi. caMV sangat aktif dan bertindak

sebagai nos promoter.walaupun gen nos bersifat prokariotik, dia dapat berfungsi dalam tanaman yang

mana dia akan mensintesis opine.

Untuk menghasilkan ekspresi dalam beberapa jaringan yang berbeda, sistem regulasi tetrasiklin dapat

digunakan

Untuk selectable marker, yang biasa digunakan ialah yang resisten terhadap kanamisin dan yang

berhubungan dengan antibiotik aminoglikosida. Kanamisin biasa digunakan pada tanaman dikotil

akan tetapi tanaman biji-bijian juga toleran untuk ini dan juga pada beberapa kasus, g418 dam

hygromisin seringkali digunakan

Gen pelapor

Reporter gen yang biasa digunakan ialah protein fluorescent seperti GFP dan warna fluorescense

lainnya. Sebelumnya, gen beta –glucuronidase yang biasa digunakan sebelum GFP

Aplikasi

1. Resistansi herbisida

2. Resistansi virus

3. Resistansi serangga

4. Kontrol kematangan

5. Sterilitas jantan

6. Farmasi

Keterbatasan kloning dengan menggunakan plasmid agrobacterium

- A tumefaciens dan A rhizogenes hanya menginfeksi tanaman dikotil.

- adanya pemakaian mikroprojectile yang mana memasukan plasmid DNA secara langsung

kedalam embrio tanaman.

Daftar Pustaka

C. J. Howe . 2007. Gene Cloning andManipulation. New York. Cambridge University Press

http://140.128.142.86/yclclass/geneengineer/2004Sep/chap7.ppt.pdf (diakses pada tanggal 28

november 2013)

http://www.plantphysiol.org/content/145/4/1144 (diakses pada tanggal 28 november 2013)