Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR),

sequencing DNA, dan Reverse Transcriptase

Melissa Lenardi, 0906508296

I. Pendahuluan

Seiring dengan berkembangnya teknologi diagnosis molekuler, kini manusia telah dapat

melakukan pemeriksaan yang jauh lebih akurat dan efektif dengan menggunakan diagnosis

DNA, baik untuk mendiagnosis penyakit genetis, untuk keperluan pribadi, misalnya

penentuan perwalian anak, bahkan untuk keperluan identifikasi resistensi pada virus misalnya

pada kasus balita yang meninggal dunia akibat HIV/AIDS yang tidak terobati akibat resistensi

virus tersebut terhadap obat. Seperti yang telah diketahui bahwa setiap mahkluk hidup

memiliki materi genetik yang terkandung dalam DNA maupun RNA, begitu pula pada virus.

Hal inilah yang menjadi salah satu dasar dari pemeriksaan materi genetik pada kasus-kasus

resistensi. Penelitian ini membutuhkan penggandaan dari kopi RNA virus yang membutuhkan

teknologi Reverse Transcriptase-Polimerase Chain Reaction (RT-PCR) yang akan

dilanjutkan dengan sequencing DNA.1

II. Isi

Setelah dilakukan berbagai macam teknik pengambilan sampel darah pasien akan

dilakukan ekstraksi untuk dapat memperoleh materi genetik secara murni. Jika telah diperoleh

materi genetik murni, akan dilakukan amplifikasi (perbanyakan) untuk dapat memperoleh

jumlah sampel yang cukup dari keterbatasan sampel yang ada sebelumnya. Salah satu teknik

yang paling banyak digunakan saat ini dalam melakukan amplifikasi adalah Polymerase

Chain Reactions (PCR). Namun pada kasus amplifikasi RNA, maka dibutuhkan enzim

1

Reverse Transcriptase sehingga disebut Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

(RT-PCR).

II.I. PCR

Teknik PCR merupakan suatu metode in vitro yang dapat diterapkan untuk pembuatan

cepat DNA dalam jumlah yang sangat besar. Metode ini sangat cocok untuk keperluan teknik

klinis karena memerlukan jumlah sampel yang sangat sedikit. DNA yang diperoleh dapat

berasal dari sampel darah tepi dengan menggunakan bantuan rekasi berantai enzimatik,

sekuens DNA target-yang diinginkan-dapat diperbanyak2. Teknik ini secara sederhana dapat

dijabarkan sebagai berikut:

1. Persiapan Sediaan Bahan Reaksi

Untuk menyiapkan sediaan reaksi berantai, maka diperlukan kurang lebih bahan-bahan

utama antara lain DNA sampel yang telah diisolasi dari ekstraksi sebelumnya, Primer,

keempat macam deoksiribonukleosida trifosfat, dan DNA polimerase yang tahan panas

dalam jumlah besar ke dalam larutan di mana reaksi akan dimulai dengan pemanasan

terlebih dahulu. Primer adalah oligonukleotida atau sekuen DNA pendek sintetis yang

dibuat secara sengaja bersifat komplementer dengan sekuen DNA target. Namun, primer

ini tidak mencakup keseluruhan sekuen DNA target, tetapi hanya sebagian dari

permulaan DNA target yang akan direplikasi kemudian oleh DNA polimerase. Primer

yang diperlukan ada 2 macam (up-stream dan down-stream) dan keduanya saling

melengkapi untuk dapat membentuk batas yang jelas “dari mana dan sampai di mana”

sekuens DNA target yang dimaksud. Keempat jenis zat ini dicampurkan menjadi satu

dalam sebuah tabung reaksi. Untuk memperbanyak sampel, maka DNA sampel

sebelumnya dapat dibagi ke beberapa tabung reaksi dalam jumlah yang dinilai perlu,

2

kemudian ditambahkan ketiga zat lain tersebut.2 Perhatikan gambar 1 untuk memperoleh

gambaran lebih jelas.3

Gambar 1. Pembagian larutan sediaan PCR ke dalam beberapa

tabung reaksi (kiri) dan mesin PCR (kanan)

2. Reaksi Polimerase Berantai (PCR)

Setelah tabung-tabung yang berisi larutan dimasukkan ke dalam mesin, maka reaksi

amplifikasi berdasarkan PCR ini dapat dilangsungkan dalam 3 tahap utama, antara lain:

2.1. Denaturasi

Denaturasi diawali dengan pemanasan larutan sediaan sampai temperatur ±95ºC

selama 1 menit untuk meluruskan untaian double-helix dari DNA sampel yang ada di

dalam larutan. Denaturasi ini terjadi dalam bentuk lepasnya ikatan hidrogen yang

menjadi sturktur tersier dari DNA, sehingga dihasilkan rantai tunggal lurus dari DNA

dengan basa-basa nitrogen tak berpasangan. DNA yang telah terdenaturasi ini akan

menjadi aksesibel terhadap berbagai sekuens primer yang sudah disediakan di dalam

3

larutan. Namun, karena tingginnya temperatur yang ada, ikatan hidrogen antara

sekuens primer dan sekuens target tidak dapat terbentuk.

2.2. Penggabungan (Annealing)

Penggabungan yang dimaksud adalah pelekatan dari kedua jenis sekuens primer ke

sekuens target yang telah terpisah. Proses ini memerlukan penurunan suhu menjadi

±60ºC selama 1 menit, sehingga hanya sekuens primer yang dapat melekat,

sedangkan ikatan hidrogen antartemplate tidak dapat terjadi. Akibatnya, terbentuklah

pisahan template dengan masing-masing sekuens primernya.

2.3. Pemanjangan (Extension)

Tahap pemanjangan ini memerlukan bantuan DNA polimerase jenis Taq (enzim

yang diisolasi secara khusus dari bakteri Thermus aquaticus) yang tahan terhadap

perubahan suhu ekstem, yaitu pada temperatur ±72ºC selama 1 menit. Pemanjangan

ini pula melibatkan keempat macam deoksiribonukleosida yang telah tersedia dalam

larutan. Proses pemanjangan terjadi pada arah yang berlawanan dari kedua template

dan dimulai dari ujung start pada masing-masing primer yang ada.3

Tahap-tahapan di atas akan terjadi berulang kali dan tiap 3 tahap penuh yang

terselesaikan disebut sebagai 1 siklus. Pada 3 siklus pertama, mulai terbentuk rantai murni

dari sekuens DNA target yang diperlukan/DNA target. Namun, pada tahap-tahap selanjutnya

terbentuk terus kopi dari sekuens DNA target dan kopi dari rantai DNA panjang secara

eksponensial. Sampai kepada siklus 30 kemudian, jumlah DNA rantai panjang hanyalah

sekita 60 kopi, sedangkan jumlah sekuens target yang terkopi dapat mencapai milyaran.4

4

II.II. Reverse Transcriptase

Reverse transcriptase (nama lain: RNA-Dependent DNA

Polimerase ) adalah suatu enzim yang menggunakan cetakan

RNA untuk membuat salinan DNA. Terlihat pada gambar 25.

Cetakan RNA yang ditranskripsi dari DNA oleh RNA

polimerase atau diperoleh dari sumber lain, misalnya virus

RNA. Salinan DNA dari RNA yang dihasilkan oleh reverse

transcriptase dikenal sebagai cDNA. Retrovirus juga

menggunakan reverse transcriptase untuk menghasilkan DNA

untai ganda agar dapat terintegrasi dengan genom manusia.2

II.III.I.Fungsi dan proses reverse transcriptase pada virus

Reverse transcriptase digunakan oleh virus RNA untuk mengubah materi genetiknya

menjadi DNA dalam proses replikasi. Virus RNA seperti retrovirus menggunakan enzim ini

untuk dapat berintegrasi pada genom sel host. Tanpa reverse transcriptase, genom virus tidak

akan dapat berintegrasi dan tidak dapat bereplikasi.

Pada retrovirus, genom terdiri atas dua molekul sense RNA rantai tunggal dengan ujung

5’ dan ekor 3’. Terdapat beberapa langkah pembentukan DNA, yaitu:

1. Sebuah tRNA bertindak sebagai primer dan membentuk rantai komplemen dari enom

virus yang disebut primer binding site (PBS).

2. DNA komplemen kemudian berikatan dengan U5 (daerah non-koding) dan daerah R

(daerah berulang pada ujung-ujung RNA) dari virus RNA.

3. Bagian domain reverse transcriptase yang disebut RNAse H mendegradasi ujung 5’ dan

akan membuang baguan U5 dan R.

4. Primer akan pergi ke ujung 3’ RNA dan akan mensintesis DNA.

5

Gambar 2. Reverse Transriptase

5. Untai komplemen DNA pertama disebut cDNA akan

diperpanjang.

6. Pembentukan komplemen DNA lain pada RNA virus,

dan proses berulang.6

RNA retrovirus dibuat dari ujung 5’ ke ujung 3’. Lokasi

primer berlekatan ke RNA visrus disebut PBS. Ujung 5’

disebut U5 dan ujung 3’ disebut leader. tRNA primer terdiri

atas 14-22 nukleotida yang akan melekat pada PBS.6

II.III.II. Fungsi Reverse Transcriptase bagi manusia

Reverse transcriptase secara umum digunakan dalam penelitian lanjutan proses PCR

(Polimerase Chain Reaction) untuk RNA yang disebut RT-PCR. Jalur PCR konvensional

hanya dapat digunakan untuk untai DNA, namun dengan bantuan reverse transcriptase. RNA

dapat diubah menjadi DNA, dan memungkinkan analisis RNA.

Reverse transcriptase juga digunakan untuk membentuk perpustakaan cDNA yang

dibentuk dari mRNA. Reverse transcriptase pun dapat dimanfaatkan untuk keperluan

komersial, selain digunakan dalam pendidikan kaarena dapat digunakan untuk meng klonik,

membentuk sekuens dan menguji karakteristik DNA.6

II.III. RT-PCR

RT-PCR menggunakan sepasang primer yang berkomplemen sebagai permulaan jalur

transkripsi pada ujung-ujung untai cDNA. Primer ini akan dielongasi oleh DNA polimerase

dan akan menghasilkan untaian DNA pada tiap siklusnya, dan akan membentuk amplifikasi

alogaritmik.1

6

Gambar 3. Proses Reverse Transcriptase

RT-PCR terdiri dari beberapa langkah, meliputi :

a. RT (reverse transcriptase), pembentukan cDNA dari untai RNA dengan

menggunakan reverse transcriptase dan primer. Tahap ini merupakan tahapan yang

paling penting agar proses PCR dapat berlangsung mengingat DNA polimerase hanya

dapat bekerja pada template DNA. Tahap RT dapat dilakukan dalam tabung yang

PCR, maupun terpisah. RT dilakukan pada suhu 40C sampau 50C

b. Denaturasi, dsDNA didenaturasi pada suhu 95C, agar kedua untai terpisah dan

dimulai siklus PCR. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu annealing

(suhu bergantung pada jenis primer yang digunakan, konsentrasi primer, jenis dan

konsentrasi probe, serta konsentrasi kation).

c. Elongasi DNA, pemanjangan sekuense DNA yang dilakukan ooleh termostabil Taq

DNA Polimerase, yang umumnya dilakukan pada suhu 72C, suhu optimal enzim.

Gambar 4. Mekanisme pengaturan temperatur pada PCR terhadap lama waktu dalam

tiap siklus

7

Tidak hanya pada proses amplifikasi, untuk pemeriksaan DNA pun seringkali diperlukan

teknik tertentu yang cukup rumit agar sekuens yang awalnya tidak diketahui dapat terbaca,

dan darisini pulalah seorang pemeriksa dapat mengetahui terdapat atau tidaknya kelainan atau

mutasi pada materi genetik yang diberikan.

II.III.I.Kegunaan RT-PCR

Amplifikasi exponensial dengan bantuan RT-PCR memberikan hasil yang sangat sensitif

dan hanya membutuhkan sejumlah kecil RNA. RT-PCR digunakan secara luas untuk

mendiagnosis penyakit-penyakit genetik secara semikuantitatif, dalam menentukan RNA

molekul spesifik dalam sel atau jaringan. Alanisis Nothern Blot digunakan untuk mempelajari

ekspresi gen RNA.

RT-PCR juga dapat digunakan dalam insersi gen eukariot kepada prokariot. Mengingat

hampir semua gen eukariot mengandung intron yang tidak mengekspresikan gen, dan tidak

terdapat pada mRNA, dengan melakukan RT-PCR pada mRNA kita akan mendapatkan hasil

gen spesifik tanpa intron.

RT-PCR biasanya juga dilakukan dalam berbagai penelitian genom virus RNA, seperti

Influensa, maupun retrovirus seperti HIV.

8

9

II.IV. Sequencing DNA

Awalnya, teknik DNA sequencing dikembangkan oleh Alan Maxam dan Walter

Gilbert. Teknik awal ini cukup rumit karena masih terlalu sederhana dan memiliki banyak

kelemahan, misalnya memerlukan terlalu banyak DNA yang telah dipurifikasi, pembacaan

yang dapat dilakukan relatif pendek, dan tidak adanya automatisasi kimiawi. Tahap-tahapan

dari pembacaan sekuens DNA dengan teknik Maxam-Gilbert dapat dilihat pada tabel dan

bagan di bawah ini.7,8,9

Prinsip umum dari teknik Maxam-Gilbert ini adalah memanfaatkan degradasi kimiawi

dari basa-basa purin, di mana:

1. Purin (basa A dan G) akan dirusak oleh dimetilsulfat

2. Metilasi dari basa-basa nitrogen

3. Pemanasan yang akan melepaskan basa-basa tersebut

4. Pemotongan basa G oleh alkali

5. Asam encer akan memotong basa A lebih banyak dari basa G.

10

Tabel 1. Modifikasi kimia yang digunakan pada

Gambar 5. Penjelasan Skematis Metode Maxam-Gilbert

Namun, disebabkan oleh banyaknya kekurangan dari metode ini, maka pada tahun 1958,

Freedrick Sanger kemudian mengembangkan metode yang lebih efesien dalam DNA

Sequencing, yang disebut sebagai metode Sanger, sampai saat ini masih sering digunakan.

Pada dasarnya, terdapat metode-metode lain misalnya cycle sequencing, RFLP, DNA arrays,

dan sebagainya. Metode Sanger dapat diringkas menjadi skema di bawah ini.11

no hydroxyl group at 3’

endprevents strand

extension

CH2OOPPP5’

3’

BASE

Gambar 6. Penjelasan Skematis Metode Sanger

Secara prinsipial, metode Sanger (1) mengandalkan pembuatan kopi parsial dari fragmen-

fragmen DNA melalui DNA polimerase, (2) Pengumpulan dari fragmen-fragmen DNA yang

dihentikan dengan basa dideoksiribonucleotidatriphospate (ddNTP berupa A,C,G, atau T),

setelah itu (3) Fragmen tersebut kemudian dipisahkan dengan elektroforesis, dan (4)

dilakukan pembacaan sekuens dengan secara manual ataupun terkomputerisasi. Metode ini

pun digunakan oleh Sir Alec Jeffries pada tahun 1985 untuk kegiatan

forensik melalui penemuannya akan perulangan pada basa-basa STR (panjang sekitar 9-80

pasang basa) yang sangat spesifik untuk tiap individu (DNA Fingerprinting).

Pembacaan sekuens dari fragmen DNA dibantu oleh basa-basa ddNTP yang telah

diberikan zat fluoresens sehingga dapat berpendar jika disinari dengan panjang gelombang

12

Gambar 7. Struktur umum ddNTP

tertentu, misal sinar UV. Pembacaan dilakukan pada gel agarosa yang berada dalam medan

listrik, sehingga DNA dengan panjang molekul yang lebih pendek akan bergerak lebih jauh

(lebih ke bawah) dibandingkan DNA dengan panjang molekul yang lebih panjang.8,9

III. Kesimpulan

Dengan menggunakan teknih RT-PCR yang dilanjutkan dengan sequencing DNA, kita

daqpat mengetahui ada tidaknya sifat resistensi obat pada HIV dengan melihat dan

membandingkan HIV non-resisten sehingga dokter dapat memberikan treatment alternatif

yang dapat meningkatkan angjka harapan hidup penderita.

IV. Daftar Pustaka1. Hunt M. Real Time PCR. Diunduh dari http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-

home.htm. Diakses 06 April 2010, pkl. 00.07 WIB.2. Marks DB, Marks AD, Smith CM. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan

Klinis: Penggunaan Teknik DNA Rekombinan dalam Dunia Kedokteran. 1st ed. Jakarta: Penerbit EGC; 2000.p.235-255, 172.

3. Anonymous. Microtubes in PCR. Diunduh dari http://schools-wikipedia.org/images/798/79806.png. Diakses 06 April 2010, pkl. 00.12 WIB.

4. DIPGRI and Cornell University. The Polymerase Chain Reaction. Diunduh dari http://irc.igd.cornell.edu/MolecularMarkers/PCR%20basics.pdf. Diakses 06 April 2010, pkl. 00.15 WIB.

5. Yepyhardi. Important Terms Related to Microarrays. Diunduh dari http://8e.devbio.com/images/ch04/0405fig2.jpg. Diakses pada 06 April 2010, pkl. 00.44 WIB.

6. Bernstein A, Weiss R, Tooze J. Molecular Biology of Tumor Viruses : RNA tumor viruses.2nd ed, New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 1985.

7. Biology and Science. An Overview of Forensic Typic Systems & Procedures for Forensic DNA Analysis. Diunduh dari http://science.kennesaw.edu/~rrascati/forensicpolymorphs.html. Diakses 23 Maret 2010, pkl. 18.24 WIB.

8. Auckland Biomedic Techniques. DNA Profilling. Diunduh dari http://www.sbs.auckland.ac.nz/uoa/fms/default/science/about/departments/sbs/student_information/schools/biotechnology/docs/dnaprofiling.pdf. Diakses 23 Maret 2010, pkl. 21.23 WIB.

9. Universitas Gadjah Mada. DNA Sequencing Presentation. http://faperta.ugm.ac.id /newbie/download/ pak_tar/genetika-molekuler/Instrument20072.ppt. Diakses 23 Maret 2010, pkl.19.33 WIB.

13