low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

11
Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose di¡erentiation B. Salazard, L. Bellon, S. Jean, M. Maraninchi 1 , C. El-Yazidi 1 , T. Orsie© re, A. Margotat 1 , A. Botta and J.-L. Berge¨ -Lefranc Laboratoire de Bioge¨ notoxicologie et Mutagene© se Environnementale, (EA 1784, IFR112, PMSE); 2 INSERM U476 (IFR 35), Faculte¨ de Me¨ decine, Marseille, France Received 27 April 2004; accepted 18 January 2005 Keywords: adipose di¡erentiation, arsenite, C/EBPa , gene expression, PPARg Abstract In this study we analyzed gene expression in 3T3-F442A pre-adipocyte cells that di¡erentiate in the presence of micro-molar arsenate concentration. Two concentrations of arsenite (As 2 O 3 , 0.25 mmol/ L and 0.5 mmol/L) were applied for three days with and without insulin (170 nmol/L) and gene expressions were evaluated by quantitative RT-PCR. The genes included genes of oxidative-stress responses: heme-oxygenase-1 (HO1) and the hypoxia inducible factor 1a (HIF1a), genes of cell- cycle: c-jun and Kruppel like factor 5 (KLF5), and genes that play important roles in adipose determination: a peroxisome proliferator-activated receptor (PPARg) and a CCAAT/ enhancer binding protein (C/EBPa). Arsenite induced the expression of HO1, HIF1a, KLF5, PPARg and C/ EBPa . These results suggest that under condition of oxidative stress arsenite induces genes that are required for adipose di¡erentiation. Introduction A prevalence of skin, lung, liver and kidney carcinoma is commonly observed in popula- tions chronically exposed to arsenic. Low levels present in the drinking water are usually con- sidered as the main source of contamination. Although the mechanism by which arsenic induces cancer remains controversial, several recent observations have clearly pointed out oxidative stress as one, if not the main, possible mechanism (Kitchin and Ahmad, 2003). The oxidative stress, like arsenic exposures, induces numerous gene expressions and/or protein reg- ulations. At the transcriptional level, reactive oxygen species (ROS) and arsenic strongly induce the expression of heme oxygenase-1 (HO1) gene (Ferris et al., 1999; Rea et al., 2003; Zheng et al., 2003) In the presence of ROS, gene inductions are mediated by nuclear factors such as the nuclear factor erythroid 2- like 2 (Nrf2). The unusual expression of Nrf2 gene after arsenic exposure has been recently reported (Aono et al., 2003) suggesting com- mon mechanisms. Recently, it has been observed (Duyndam et al., 2003) that arsenic induced the activation of a factor that has a key role in cellular responses to hypoxia: the hypoxia inducible factor 1a (HIF1a). The up- regulation of this factor was related to the stabilization of HIF1a protein and not to the accumulation of HIF1a mRNA. In cultured cells and in animal models, arsenic modulates the expression of several Cell Biology and Toxicology . 2004; 20: 375^385. # 2004 Springer. Printed in the Netherlands

Upload: b-salazard

Post on 15-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

��������� ���� � �� ��� � �� ����� ��� �� ���� �������� �� ������������ �� ���

�� �������� � ����� �� ��� �� ���� � ���� �� ���������� �� ������ �� �� ��������� �� ������ � ���� ������ �� �� ������������ � ����� ������������ �� ������ �� �� � ���� ��� ����� ��� ����� � !��"� #�$�%&"�'$�!�(��) �� ! *+%� ������� � ��� ��� �� ���������� �� ��

!����"�� #$ �%��� #&&'( ����%��� �) �� *��+ #&&,

,�-.���/ ���%��� ��-��� ������ ���� ��� �.��/� �� � �0%������ //�!�

�� ��

1 ���� ��*�+ 2� � ��+��� �� � �0%������ � 3�3�4''#� %������%��+�� ����� ���� ��-��� ����� � ���%���� �� � 5�����5���� ���� ��� �� �� ������ � �2� �� �� ������ � � ���� ��� 6��#�3 &�#, �5��. � � &�, �5��.7 2��� �%%���� �� ����� ��+� 2��� � � 2����*� � �*�� 6�$& 5��.7 � � �� ��0%������ � 2��� �"��*���� 8+ 9*� ������"� !��/�!� ��� �� �� � ��*��� �� �� � �0�����"�����������%� ���: ��5���0+�� ����� 6;��7 � � ��� �+%�0�� � �*��8�� ����� �� 6;14��7 �� �� � ������+���: ��<* � � =�*%%�� ��>� ����� , 6=4,7 � � �� �� ���� %��+ �5%���� � ����� � ���%��������5� ���� : � %���0���5� %���� �����������"���� ����%��� 6//�!�7 � � � �����. � �� ���8� �� � %����� 6�.��/�7� ���� ��� � �*��� ��� �0%������ � ;�� ;14�� =4, //�!� � � �.��/�� ����� ���*��� �*����� ���� * ��� �� ����� � �0�����"� ������ ���� ��� � �*��� �� �� ���� �����9*���� �� ���%��� ��-��� ������ �

�� ���� ���

� %��"��� �� � �>� �* � ��"�� � � >�� �+����� �5� �� ��55� �+ �8���"�� � %�%*������ � ���� �����+ �0%���� �� ���� ��� �2 ��"���%���� � � ��� ��� >� � 2���� ��� *�*���+ �� �������� �� ��� 5�� ��*��� � �� ��5� ���� ������*�� ��� 5���� ��5 8+ 2���� ���� ��� �*��� �� ��� ��5�� � �� ���"������ ��"�������� � �8���"���� � ��"� ������+ %�� ��� �*��0�����"� ������ �� � � � �� ��� 5�� %����8��5���� ��5 6=����� � � ��5�� #&&37� ����0�����"� ������ ��>� ���� �� �0%��*��� � �*��� *5���*� �� � �0%������ � � �.�� %����� ����*����� �� �� ��� ��� ����%��� �� ��"�� ������"��0+�� �%����� 6!��7 � � ���� �� ���� ��+� �*�� ��� �0%������ � ��5� �0+�� �����

6;��7 �� � 64����� �� ��� �???( !�� �� ���#&&3( @�� � �� ��� #&&37 1 ��� %���� �� � !�� �� � � �*���� � ��� 5������� 8+ *����� ������ �*�� �� ��� *����� ����� ��+������ #���>� # 6A� #7� ��� * *�*�� �0%������ � A� #�� � � ��� ���� �� �0%��*�� ��� 8�� ���� ��+��%����� 6�� � �� ��� #&&37 �*������ � ��5�5� 5���� ��5�� !��� ��+ �� ��� 8�� �8���"�� 6B*+ ��5 �� ��� #&&37 ���� ���� ��� �*��� ��� ����"���� � � ����� ���� ��� � >�+���� � ����*��� ���%� ��� �� �+%�0��: ����+%�0�� � �*��8�� ����� �� 6;14��7� ��� *%����*����� � ���� ����� 2�� ������� �� ������8�������� � ;14�� %����� � � �� �� ������*5*����� � ;14�� 5!A��

1 �*��*��� ����� � � � � �5�� 5��������� �� 5��*����� ��� �0%������ � ��"����

0��� �����- � 1��������-� #&&'( ��: 3$,C3),�� #&&' $2�� ���3 #�� �� � �4� '��4���� �

Page 2: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

��� ����%��� ������ 6D��5���� �� ��� �??$7���� ��� ���������� 2��� ���� %���� ������ � ���5��� �� �%��*�*� �0�5%�� 6;* �� ��� #&&#7 ����� ���� ���� �*��� ����"���� � ��<* � � �� �� ���� ��� ��5%� � �� � ��� ����"��� � %������ � 6�/�7� ���� �� 5��*����� ��� ��� ����%���� � �/����%� �� � �� �� ��� � ��������0%������ � ���� ���*% � �� �� ����� �� ����%���� ������ � � �� ��� 8�� %��%���� ���� ������ � %����8�� %���2�+ � �� ��� � �*���� 8+���� �� 6D��5���� �� ��� �??$( =����� #&&�7�;�2�"�� ��� ��0����+ � � ����� ��� ����+ � ���� �� �� ��%� �� � � ��"���� �� ����� �: 6�7���"��� � �� %� ��"��� � ��5� ���� ��� %����*��� �*�� � ��� 5���8���� %���2�+ 6��7 5���+������ �� * 5���+����� ��5� � � 6���7 ��� ��5�.����� � �0%��*��� 1� ��� 8�� ��%����� ����5���+����� �� � � ��5���+����� �� ���� 8*� ��� ���� �� ���� �� 6%� ��"��� � �� ���"��� � ��5�7 �������+ %���*�� BA� ��5��� � E"����F�� � � ���� ����� 6���� �� ��� #&&�7� �����"��5���+����� ���"��� � ��5� � ���� �� ��� �� �������8�+ 5��� %��� � �/� � �*���� ��� � ����� ������"��� � ���� �� 6B��8 � �� ��� #&&37��/� ���� ���� �*��� ����"��+ �� �� ���"������ � �*��*��� ����� � � � � �5�� 5������ ��� �0%���*�� �� � ���������5 �*8�5����5���� �� �� ������� � ���� �� � �*��� �/� ����"��+ 2�������� �� �0%��*��� ���� �� ��������� �/� ����"���+ 6;* �� ��� #&&#7�

����� ��-��� � �8���"���� � * ����� � �����5%��0��+ � ���� �� �-����� ���� �� � �*������ ��-��� ������ � ��*>�5�� ����� � �*��*���6��� �� ��� #&&37� 1� �� *��� �� � � �����*>�5����5%�* � 6@�* �� ��� #&&#7� ���� %��%���+ ��%�����*����+ *�� *� �� %���� �� 2�� �� �� 8�������� 8+ ���� ��� ���� � � ���5������%+ ����%���� �� ����+� � ���� ��������%��� �����"������� � � � ��� %����8�� 5���� ��5� � ������ ��� ���� �� � �58��� �� 8��2�� �2� � ����� ����� %�������� ���� ��� ���� ���2�� � � ��-���� ������ � ��� %�����0 � ���� �� �� ���� �� 5�+��"� � �-��� � 8��� ����� %�������� ��%� ��� � � ��"���� ������ �*�� �� �����.��5�� � �0%��*��� � � ��� ���5���� ���*��*��� ��"����

��*���� � ��� ����� ��� �� �-���� � ���� ����� ���*�� ��5 � 5����� �0%���5� ��� ;�2�"������� 2��>� 5�� �+ ��*��� � ������ ���� ��"����� �� �%�%����� 8*� �� � ���� ��-��� ������ �����8������ %�����%��+�� ���� �� �� ��� 5������ ��� � 5����� ��-��� ������ 6D��� � �=��� �� �?$G7� 1 ��� ���� �2������� � ������� � %������� ��� 8�� 5��� � ��� �� +� � ���5����*��� ������� � ���� ��-��� ������ %������2��� ��� ��� ��H����� � � ����� *58�� � ������� �� ��� � ������ � �� I*� �� %���� ������ � %�����%��+��� 8���5� ���2����������� 8+�� ���� � ��8���� � � ��� � �*���� � ��� %����� �� � � �*�� � � ����� ��-��� ������ ������� �� ������ ��8���� %�����%��+��� * �������� �� �0%� ��� ������������� 8+ ���� ��+ � ������ �+���� �� ���� ����� �0%������ � �������� � �� ��� 8� �� � %����� ��� ����%���� ������ 6�.��/ � � � �7 �� � ������� ������� � %��� ����*�� ��� ����"���� � �����=.�!= 6;� �� �� ��� #&&37 %���2�+�� ��� �8�*� ����� ��+� � ���� �*��*��� ����� ������ � �*�� ��� �0%������ � %���0���5�%���� �����������"���� ����%��� 6//�!�7� ����� ����� 5����� ���*������ 5������ ��� ��9*������� � ��� ���%��+�� %�� ��+%� �������������8+ 5��%��������� ��� ��� ���*5*����� � � �������*��� ��%�� ���%���� � �*���� � ��%���� �� �� �� 5������� 8+ ���*�����+ ���5� ���*�� �� ��� ������ ���*�����+ ���5� � 8� �� � ������� 6�!��/7 � � ��� �� ��5��� � �0%������� � �.��/� 6B���� ��� �� ��� �??)7� �������� ��+ ��*���� *�� � 5��������+ 5���������+� "����*� �0%���5� ��� ����� � �� H�5�� ����������� ���� � ��� %��"��*��+ ��� ��H�� *���������%���� � � ��� ����%��� ������ 2������%���� � � ��� ��� ��� � ��� �0%������ � �"�� #&&& �� �� 6��� �� ��� #&&�( ����� � ����"� � #&&#7� J� ��"� � ��+��� �� � �0%������� � � %������%��+�� ����� ���� ��-��� ����� � ��� %���� �� � 5����5���� ���� ��� �� �� ������� � ��*�� � � : 6�7 �� �� � 2���� �0%������ �� � ��5���"� � �0�����"� ������ � � ���� ���0%��*��� 6;�� A� # ;14�� ��<* 7 � � 6��7�� �� � 2���� �0%������ �� ��9*���� �� ���

3$G

Page 3: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

���%��� ��-��� ������ %������ 6�.��/�//�!�7 �� ���� 5������ ��� � �*���� � ��%���� �� �� �� 6�!��/7� J� ���� � ��+��� ����0%������ � ��� =�*%%�����>� �����, 6=4,7� ��� ����%��� ����� � "��"�� � ����*� 5���%���� ����� �� ��� *58�� � %������%��+������� * ������ � ���%��� ��-��� ������ ����%� �� � � ��� %���� �� � � �*�� � �����*��*��� �� � �0%������ � 2��� �����5� �� � ��� %���� �� � � � ��� �8�� �� � � �*�� ����5%��� ���� �� �-���� � ����"��+ ��-��� ������ � ���� � � %����+ ��-��� ����� � ���� K ��������� �0%���5� ��� �� ����� � �� ��� 8�� �8���"�� ���� ��� � �*���� � ;�� =4,� � ;14�� �0%������ � 2��� �� ��5��� � 2����0%������ � � �� �� ��9*���� �� ���%��� ��-���� ������ : �.��/� � � //�!��

�� ���� ��� �� ���

0��� ������� � 4���� � ������� �

3�3�4''#� %�����%��+��� 2��� ���2 �� �� �I*� �� � B*�8����F� 5���H�� �����F� 5���*56B���7 �� ��� � � '�, �. ��*���� � � �&L �28�� ��� ���*5 � � ��5��%���� � ,L��# ?,L ��� �� 3$��� ��� �*��*�� 5���*5 2����� ��� �"��+ 3 ��+�� B��� � � ��� ���*52��� %*������� ��5 1 "������ � K=� � ��� 3��+� � �*��*�� �28�� ��� ���*5 2����%����� 8+ �&L ���� ��� ���*5� �� �� I*�� �� � �*�� 2�� ����� 6�$& 5��. H ���� �� ������ 7 �� 3 ��+��

6���

/�2����� ��#�3 2�� %*������� ��5 ���5����� M*� �� 4���"��� 4�� �� ������"�� � A��; �� � 5��. ���*��� 6���1117 ��� ���*���2��� /�� �� �8��� � �& 55��. ���*��� ����2�� ����� �������+ �� ��� �*��*�� 5���*5� ������111 �� �� ������ 2�� �0%������ �� 5������ �� ������ � ��#�3� � ���� ���111 ���*��� 2�� %��%���� �� ���� �2 �0%���5� ��

� ��-��� �7 ���� ��������-

�� �� I*� �� ����� 2��� �*��*��� �� ������������ �� ��+� � ��� %���� �� � &�&&, �� #,�5��. ���111� ��� ���111 2�� ��5�"�� �����2��� �*���"���� �� ��"� *����� ��+� � � �����"��8����+ 2�� �����5� �� *�� � ��� �@'K >��6���5������ �*�����7� ��� %�� ��%�� � ����������5����� ���� �� 8���� � 5������ ���������"��� � ��� +����2 ���������*5 ���� N�� �� ��5 � ��� �� ��5��� �+� 8+ 5���8������5%��� � ������ ��� �+����+��� %���*�� 2��9*� ��H�� 8+ �%��������%+� �%����� �� ���+6�B7 2�� 5���*��� �� ',& 5 � � G#& 56�� ��� �� 2�"� �� ���7 *�� � � 5����%���������� 6�*����>� !� �8�+���5�7� /���� ������ � �+����0�� ����"��+ � � "��8����+ 2�������*����� ��5 ��� 5���*��� �B',&C�BG#&

"��*��� ���� �0%���5� � 2�� %�� ��5�� 2������%������ �����5� ���� � �2� ��%����� �0%����5� ���

!'� 2��2������ � � ����5���� 8�� ��������!15#0!

����� !A� 2�� �������� ��5 3�3�4''#� �����*�� � ��� !A� 11 *�����%� � >�� 6�������+�A���� B*O �� D��5� +7� !A� �5�* �� � #&& � 2��� ��"�������� ����8�� *�� � ����*%������%�� 61 "������ � K=7� !� ��5 ��0�� *��������� 2��� *��� �� %��5���

!������5� 9*� ������"� !��/�! 2�� %��� ��5�� � ��1�/!1�� $&&& *�� � ���!D��� ���5����+� ��9*� ��� � ��� ������ � ���"���� %��5��� 2��� ����� �� *�� � /��5����0%����� 6/� �%%���� ����+���5� /��>� ��5��7 � � �5%�� + �� �2����� �������9*� ��� 2��� ��5%���� �� ��� �"����8��5�*�� �� �5� � � ��� ����8���� �� ������%��5��� ���� ��"� � �� ��� �5%��H����� %���*��6��8�� �7� ����� � ��%� �� � �0%���5� �� 2���%�� ��5���

��� 9*����+ � ��� ����� �� %��5��� 2���"��*���� 8+ �5%�� +� � ������ ���*��� � � �BA� 6� �:�& �:�&& �:�&&&7 � � 8+ %�� ��5�� � � 8�� > 2����*� �BA�� !��*��� 2���

3$$

Page 4: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

�0%������ �� � �*���� ����� 61!7� 1! 2�� ����*������ �� �*������� 8+ ��� 5� * ���*��� 2��� �����5%�����"� ���� 5����� *�� � �)� !A� ��� ��� �� �� ���� 6K��� �*����� A�� # ��1/!1�� $$&& ��9*� �� B������� �+���5 /��%%���� ����+���5�7� 1!�#�& � � 1!�&�,2��� �� ������� ��� �H�� ��

$���������� � ��-���

����������� ��� �H�� �� �� ���� "��8����+ 2������*����� 2��� ��� J����0� ���� �� %���������� � 2�"��*� �&�&, 2�� �� ������� ��� �H��� �� ��5%����� � �� � �0%������ � 2���%�� ��5�� 8+ ��*�� �F� ������� �� %����� ��* %����� ���� �� �%%��%������ B�-��� ��� 2����� ������� ��� �H�� � 2�� 2�&�&,� P��*�� � � �*���� ����� 61!7 �# �� �&�, 2��� �����+�� ��������

����

�9��� �7 ���� �� � ���� ���.�4

�� �����5� � ��� �*8������� ���� �� ����0����� �� ������ � *��� �� �� � �0%������ �0%����5� �� ��� ��"��� � ��� ���� �*�"�"�� � ������� ��� �0%��*�� 2��� �"��*����� 3�3�4''#������ 2��� ���2 �� �� I*� �� ��� �0%���� ������ �� ����0��� 6���1117 � ��� %���� �� �� � ��� �8�� �� � � �*�� �� ����� ��+�� � ��� ���

�� ���� %����� �*��*�� 5���*5� 2��� ��%�����8+ ���� 5���*5 2����*� ���� �� � � ����� 2����*���"���� �� ��"� ������� �� ��+�� ���� "��8�����+ 2�� ��� �����5� �� *�� � N�� 8��������+�� ���� �� �� �� ������ � 2��� ����*������� 5���� �� �� ������ � ��#�3� ���� "��8����+��������� �� &�, �5��. ���� �� �� �� ������ �2��� ����� �0%���5� ��� �� ����� �� ;������� �� ������ � � �*��� ��� �H�� � ���� ������4� ���+ � �� �� ������ � , �5��. ���*����� ��� ��5%���� ����� � �*��*��� 64��*�� �7������ ���*��� � ������� ���� �0%��*��� ��5&�#, �5��. �� &�, �5��. ���� �� �� �� ������� � �� ����� ��+� � ���� �*��*�� 5��� ��%����8�� �� ��>� � �� ����* � ��� ����+ �-����� ���%��� ��-��� ������ � �*��� 8+ ���� ��* ��� �*8������� ������ ���%��������� ��� ���� � ���*5*����� � � �������*��� ��%�� ����%���� � ���� �� ������� ���%��+��� � �* ������� ���%��+��� 2��� �"��*���� 8+ ��� ������� � �� 1 ��� %���� �� � &�#, �5��. �� &�,�5��. ���� �� � ����� ��-��� ��� 2����8���"�� 8��2�� ������� �� * ������� ����� *%�� �,C�$ ��+� � �*��*��� ;�2�"�� �� ��� ��5��� �0%��*�� � ��8���� ��� ���%��� ���� � ����*���� � "���8�� ���� 5�������+�

#��:�� �7 �� � ��2������ ��� � ���� ����2�����

3�3�4''#� %������%��+�� ����� 2��� ���2 ���� I*� �� ��� �0%���� �� ����� ��+� ��

1���� �� ��9*� ��� � ������ � � ��"���� %��5��� *��� �� ��� �������5� 9*� ������"� !��/�!

B����� %��5�� !�"���� %��5��

�)� ,��D���D����D��DD��D����������3 ,����������DD�������D�������D3//�!� ,��DD�D�D�������D�����DD����3 ,��DD��������������D������3;�� ,�D�D���D�D�D��D��������D��3 ,���D��D������������D�D�D�D��3�.��/� ,�DD��D���D�������D���D���DD��D�3 ,������D���D�����������D���3�!��/ ,�����D�D�DD��D�D�����D�����3 ,���D�������D�������������D��3A� # ,�������D���D���D������D���3 ,���������D�����D�������D��3��<* ,�D���DD����D���������D����D�3 ,�DD��DD����D��DD��D���D��D3=4, ,�D���D���D�����������������3 ,�DDD���D��D������D����D����3;14 �� ,�������D�����D��������D���������3 ,���D�D�D��������������D�����������D�3

3$)

Page 5: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

���� �� ����0��� � ��� %���� �� �� � ����8�� �� � � �*�� �� ������8�� �8�"�� �������+� � ���5� �� ���5*����� � ��� �� I*� ���� �������+ �� * ����� ��� ���%��� ��-��� ������� %�����5� ����� !A�� 2��� %��%���� � ���� �0%������ ��"��� � �� �� 2��� �����5� ��*�� � �������5� !��/�!� /��H��� � �� ��0%������ � 2��� �0%������ �� 5�� "��*�� � ����� ��%����� �0%���5� ��� �� "��� + ���� �� �� �*���� � ���*���� * ��� �*� �0%���5� ����� ����� � 2� ��*���� ��� �0%������ � �� ��� "��"�� � ���� �� ���%� �� �� �0�����"� ���������%� �� � � �� �� � "��"�� � ������+��� 5����H����� � ��� �H�� � *%����*����� � � ;�� � �;14�� �� �� 2��� �8���"�� 64��*�� #7� 1 �*����� � 2��� ���� � ��� %���� �� � � � ����8�� �� � �*�� � 4*�����5��� ;�� � �*���� 2�� ���� ��%� �� � �� �� �� � � �*���� � �� &�,�5��. �� �� ������ � 2��� 5*�� 5��� �-���

��"� ��� ����� �8���"�� �� &�#, �5��. �� ��� ������ �� ;14�� � �*���� ���*�� ���*���� �+ �� &�, �5��. �� �� ������ �� ��� �0%������� � A� # �� � 2�� �� 5���H�� �� 8������� �� �� �� ������ �� ��� �0%������ %����� � ����� �� �� �*������� ���� �0�����"� ���������*�� ���*��� � ��� ���� �� �0%���� %������%��+����

/��"��*� ��*���� ��"� �*������� ���� ���� ����*�� 5��*����� ��� �0%������ � �� ��� "��"�� � ��� ������+���� K�� � �*� �0%���5� ���� �� ����� � ��� �0%������ � � ��<* � �=4, �� �� 2��� ��������� P������� � � ����0%������ � =4, 2��� ��%� �� � � ���%���� �� � � �*�� � �*��*�� 5���*5 64��*��37� � � ������� �0%������ � =4, �� � 2�������5� �� �� ��� ������� �� �� ������ � ���� �� 6&�, �5��.7 2����*� � �*�� � ��5�����+��2 ��"��� � ��<* � �*���� 2��� �8���"�� ��

����� �� P��8����+ � %�����%��+��� � ��� ���� �� �0%��*��: �� �� I*� ��� ���� �*��*��� 2��� �0%���� �� ���� �� ����0��� �� ����� ��+�� ��� %���� �� �� � ��� �8�� �� � � �*�� ��� ��� ����� 2��� ����2�� �� ���2 �� ��"� ������� �� ��+�� ����� �B "��*�� � �� ����%�����%��+��� 2��� #�&&�# � � ��)&�# � ��� %���� �� � � � ��� �8�� �� � � �*�� ���%����"��+� B��� ��� 5�� ��� � �������%����� �0%���5� ���

3$?

Page 6: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

����� "� � ��+��� � ��� 5��*����� � ;�� � � ;14�� �� � �0%������ � � ��� �0%��*�� �� ���� ��� �� I*� � ���� �*��*��� � 3�3�4''#� %������%��+��� 2��� � �*8���� �� ����� ��+� � ��� %���� �� � ���� �� ����0���� ��� � �*���� � �� � �0%������ 61 �*���� !����7 2�� �0%������ �� ��� ����� � ��� �0%������ ��"�� � ��� � ��� �� �� ���� ��5%���� 2��� ���� � ����� �*���"���� � 5���*5 2���� �*�� 6����%�� 8�0��7 �� 2����*� � �*�� 62���� 8�0��7� ��C 2����*� ���� ��( ��&�#, &�#, �5��. ���� ��( ��&�, &�, �5��. ���� ���B��� ��� 5�� ��� � ����� ��%����� �0%���5� ��� Q2�&�&,�

3)&

Page 7: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

���� �� �� ������ 2����*� � �*�� 6���� �����2 7�

��� ����� ���*% � ��*���� �� �� � ��*����� �� � 2���� �0%������ ��� 8�� ������� �����%��� �� ��-��� ������ : //�!�� ��.��/�64��*�� '7� �0%������ � //�!� � � �.��/��� ��2��� ��� �H�� ��+ � ������� �� &�, �5��.���� �� �� �� ������ �� ��� � �*��� �0%������ � ����� �� �� 2�� ��%� �� � � ��� %���� �� � � �*�� � �*��*�� 5���*5����� � �*��� �0%������� � �.��/� 2�� 5��� �R��� � � � �*�� �������� ������ ��5�����+ ��� � �*���� � //�!�2�� 5*�� 5��� �-����"� � � �*�� �������� �����61!:�#�'7� J� ���� � ��+��� ��� �0%������ %��H�� � �!��/� �� � 6���� �� ���2 7� J��8���"�� ���� �� 2�� �� 5���H�� 8+ ���� ���� ��%� �� ��+ � ��� %���� �� �� ��� �8�� �� � � �*�� �

�������

�����*�� ��� �-��� � ���� �� � ���� %���� ������� � � ��*� � ����� ��� ���� ��� �����"���� ������8�� ���� ��� ����� �� ������ � ��5����� � ��� %������ ���� � ���� ��-��� ������ ����� �� %��8�8�+ �*� �� ��� %�����0���� �-����� ���� �� ���� 5�+ �� ��5��� ��+ � �*�� ����%���� ������ �� �%�%����� 6=����� #&&�(��� ����� #&&#7� ��� �����5� ���� � ��� �-���� � ���� �� �� ��� ��� ����%��� �� ��"�� �*�� � ���-��� ������ %������ 2�*�� ���� �� � 8�����* ������ �� � � ��� 8��� �� 8��2�� ��� �� � ��� ������ � � %���� ������ %�������� ���� ���%��8�8�+ ��� 8���� � ����� ��� �����

1 ������*��*�� �� ����� � � ��5���� *58��� 3�3�4''#� ����� * ����� � ���%��+�� �� � ��� ������ %�����5� ��� %���� �� � � �*�� � � ����� ��-��� ������ ������ � �*��*��5���*5 ������+ � ������� ��� *58�� � �����

����� *� � ��+��� � ��� 5��*����� � =4, �� � �0%������ � ��� �0%��*�� �� ���� ��� �� I*� � ���� �*��*��� � 3�3�4''#� %������%��+��� 2��� � �*8���� �� ����� ��+� � ��� %���� �� � ���� �� ����0���� ��� � �*���� � �� � �0%������ 61 �*���� !����7 2���0%������ �� ��� ����� � ��� �0%������ ��"�� � ��� � ��� �� �� ���� ��5%���� 2��� ���� � ����� �*���"���� � 5���*5 2��� � �*�� 6����%�� 8�0��7 �� 2����*� � �*�� 62���� 8�0��7� ��C 2����*� ���� ��( ��&�#, &�#, �5��. ���� ��( ��&�, &�, �5��. ���� ��� B������ 5�� ��� � ����� ��%����� �0%���5� ��� Q2�&�&,�

3)�

Page 8: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

����� �� � ��+��� � ��� 5��*����� � �.��/� � � //�!� �� � �0%������ � � ��� �0%��*�� �� ���� ��� �� I*� � ���� �*��*��� � 3�3�4''#� %������%��+��� 2��� � �*8���� �� ����� ��+� � ��� %���� �� � ���� �� ����0���� ��� � �*���� � �� � �0%������ 61 �*���� !����7 2�� �0%������ �� ��� ����� � ��� �0%������ ��"�� � ��� � ��� �� �� ���� ��5%���� 2��� ���� � ����� �*���"���� � 5���*5 2���� �*�� 6����%�� 8�0��7 �� 2����*� � �*�� 62���� 8�0��7� ��C 2����*� ���� ��( ��&�#, &�#, �5��. ���� ��( ��&�, &�, �5��. ���� ���B��� ��� 5�� ��� � ����� ��%����� �0%���5� ��� Q2�&�&,�

3)#

Page 9: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

���� ��� � ����� � ��� ��-��� ������ %�����5�1� ��� 8�� ��%����� ���� ���� �� ����0��� 5����H�� ���� ��-��� ������ %�����5 6���*8� �� ���#&&&7� J�� *��� �� ���� �� �� ������ � ������5%�* � � ��8��� 5��%��������� ��� ��� � ���%��+��� 2���� 5��*���� � ��� �0%������ � ��"���� �� �� � ��*�� � �� �� 2���� �0%������� � ��� *8�9*���*� � � �� �� �%���H� �� ������%������-��� ������ %������� ��� ��� ��H������ � �"����� ��� ��� � �� � �0%������ �*��� � ��� ���%��+�� ��-��� ������ %�����5��5�� � � ���� ������ ��� ;�2�"�� �����%%����� �� ��5%������� 8+ ��� � ���� � ��5�%��0��+ � ��-��� ������ 5���� ��5�� 1 ���%���� � ��%��� *�� � !��M/�! 2� � ��+������ �0%������ � � ��5���� *58�� � �� �� � 3�3�4''#� ����� ������� 2��� 5����5�������� �� �� �� ������ � �*�� � � ����+ %����� ���%��� ��-��� ������ � K ��� ����� �� ������ � �� � ��� ����%��� � %��8�8�+ ������� ���0�����"� ������ 2��� � �*���� ��� �0%������ � ��5� �0+�� ��� � 6;��7 2�� � ������� � ���� �� ������� %������%��+���� ��� ���� ��� �*��� �0%������ � ;�� �� � ��� 8�� ��%����� � ��"���� ��*���� 6!�� �� ��� #&&3(@�� � �� ��� #&&37� ��� ;�� ��� ��5 �� ���5�<�� ��� ��5 � ����� "���� ��� 1�� �0%������ �� *8�9*���*� � � ��� ����"��+ �� � ������� 8+5� + �+%�� � ��� �� %�����*����+ ������ "��"�� � �0�����"� ������ �*�� �� ��5�5������%��%���� � � � ��� ����� 5����� 64������� ��� �???7���� �0%������ � ;�� �� * ��� ������*����� � ��� ����%��� ������ �*�� �� �/�A4=� ;14�� � � A� #� 1 ��� %���� �� � ����������� A� # ����"��+ �� � �*��� 8+ %��� ��� �����%��� �� 5���� ��5� 6D� � �� ��� #&&�( 1������ ��� #&&&( �� � �� ��� #&&37� 1� ��� 8�� ��%����� 6�� � �� ��� #&&37 ���� ���� ��� �*��� � ����+ �0%������ � A� #� ���� �� ��0��8���� ��� 5�0�5*5 ���� �# � � ��� ���8��� � � � �0%��*�� � � ���*� �� �� ��� ������ �� ��"�� � ��� #' �� ;14�� �� � �+%�0�� � �*���8�� ������ B��� ��%����� 8+ B*+ ��5 �� ���6#&&37 ���2�� ���� � ���� �� �� ������ � ���� �� ����0��� � �*��� � *%����*����� �

;14�� �*� �� ���8�������� � ��� %����� � � �� ��5 ���*5*����� � ��� 5!A�� K�� ���2���"�� ���� ��� 2� ��"� �8���"�� ��� *%����*����� � ;14�� 5!A�� �"� 5��� �*����*��� �*����� � �������%� �� � �-��� ��;14�� *%����*����� 2�� 5��� �R��� � �� &�,�5��. ��� �� &�#, �5��. ���� �� �� �� ������� �� J� �� �� ��5%��� ��� �-���� � ������"��� � ���� �� � � � ���� �+%� � � ��� �-����� "��+ ��2 ��"��� � � ������ ;�2�"�� �*����*��� �*����� ��� � "��"�5� � � � ���%��+���%���H� 5���� ��5 ���� ���*��� � �� � �0%������� 2�� �0%���� �� 5����5���� ���� �� �� ��� ������ �� 4*����� 2��>� � ���%��+�� �������>� � � �� �� ��������� %����� ����"������� � �0%������ � � � ���� �� �� �� ������ ���� �������+ �� ��H ���"��+ �� ��*�� � ����%�� �� 1 ��� %���� � ��%��� *�� � &�#, �� &�,�5��. ���� �� �� �� ������ � � � ����� ��+�� �0%��*�� 2� ��%��� � � ������� �0%������ � ;14�� � � ;�� �� �� 8*� �� A� # �� ������� �0%������ %��H��� � ��� � �����5� �2��� ����� %��"��*��+ ��%����� 61���� �� ���#&&&( D� � �� ��� #&&�( �� � �� ��� #&&37�

���� �� ��� 8�� ���2 �� � �*�� ��� �0%������� � ��<* � � �� �� �� �� �����8+ ����� � ����� ����"���� � ��� �/� ��5%�* � 6��"�������� ��� �??G7� �/� ����"���� �� � *8�9*���*�����������%� �� 5���� ��5 ���� �� �8���"�� � ��"���� �� ����� �� 1 ����� �0%���� �� ���� ���/� ����"���� �� ���� ��%� �� � �� ���� ����2����� �0%��*�� ���� �� � �*�� �/� ����"��+�� �������� ��<* � � �� �� �0%������ 6;* ����� #&&#7� 4�� ����� ����� � 2� ������� ��5� ���� ��<* �� � �0%������ �*�� � ���� ���0%��*���J� ��� �� �8���"� ��� �H�� � � �*����� � � ��<* �� � � � �*�� ������� ����� 2���� �5������� 8*� ��� �H�� � � �*���� 2�� ���� � * ������� ������ ���� ���*�� �*������� ���� ����/� ����"���� �� ��� ��� ����%��� �� ��"��*�*���+ �8���"�� � ���� �� �������� ����� ��� �� ���*� * ��� �*� �*��*�� �� ����� �� ;�2��"�� �/� ����"���� ��*�� ��"� ��>� %����� ��� %������� ����%��� �� �"� �� �*�� �� ��<* %���%���+����� � ;�2�"�� ���� %���%���+���

3)3

Page 10: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

��� 2�� �� �������� � ���� ��%���� ��� =4, ����� � 5�58�� � ��� =4 �5��+ %��+� � �5%���� � ���� � 5��%���� ���� � � ����� ���� ���� %��� �����+ "�� � �������� � 2��� A4���6�*� �� ��� #&&#7� 1 %������%��+�� ����� ���� ��� �*��� =4, �� � �0%������ � � �������%� �� � 5� ��� ;�2�"�� ������� �� ��*����� ��� �������+ �� %�������+ � ��+�� ���=4, �0%������ �� � ��� �H�� � � �*���� 2�� � �+ �8���"�� � ��� %���� �� � &�, �5��. ���� ��� ��5���� �8���"���� � 2��� ���� � 3�3�� ���� �� �� 6� ����� %������%��+�� ������ �7 � 2���� ��-��� ������ �� ��%� �� � � � �*�� ��0�5������ � � � 1��N 6���8*�+�5���+� 0� ��� �7� 1 ����� ���� �*��*��� � �*�� ��� � � �*��� ��� �0%������ � =4, �� � � ���� ������� � ���� �� �� �*��*�� 5���*5��������� ���� � �*���� %������� ����� ���*����*����� ���� � �*�� � � ���� �� ���5*���� =4,�0%������ 8+ ��-��� � 5������ %���2�+� ������*�� 8� � ��5%������ 2��� ���� ������

1 �3; �&��.# ����� � ����� %�����%��+������ �� � �� ��� 8�� ��%����� ���� ���� ��%��"� �� ���%��+�� ��-��� ������ 8+ ��������� � ��"��� � 5!A� �� ��5� ������ %�����*�����+ //�!� � � �.��/� 6J�*�� �� ���#&&#7� ;�2�"�� ���� ��*�+ 2�� 8���� � ���������5� �� �� �� � %������ 6� 5� �5*5 � �2�5� ���7 2��� ���� ���� ��� �� �� ������ � 6G�5��.7� K ��� �*� �0%���5� ��� �� ����� �2� ��*���� ��� �0%������ � �� �� �*�� � ���� ����� ���%� � ��� ��-��� ������ %������ �������� 2��� ������� 2��� � ��2 ��"�� � ���� ���6&�#, �� &�, �5��.7� ��� %��������� � ���%���+�� ��-��� ������ �� 8� ��"���� � � �*�������� � �"� �� ���� ��� �5�� "��+ ����+ ����+� ���5������ � � ���� ���%� 6!��� � � �%������5� #&&&7� 1 � �*�� ������� ����� 2� ��*������ � �0%������ �*�� � ��� � ���5������ ���% � ��� ��-��� ������ %�����5� ��� ���� ���� �*��� �� � �0%������ ��5*����� ��� %���������� � ��� ��5�� �� � �0%������ � 1 ���%���� �� �� ��� �8�� �� � � �*�� 2� �8���"������ 5����5���� �5�* �� � ���� �� � ���������� �0%������ � //�!� � � �.��/� � ���

����� ��+� � ���� �*��*��� �� �%%���� �� ���� �*���� � =4, �� � ��� �-���� � ���� ��� � � �*�� � //�!� � � �.��/� �� �� 2����*5*����"�� �*� ���*��� � ������ ���� 1! ������� ��� %���� �� � � �*�� � � ���� �� 2����� ����� ��+ ������ ��� ��� ������ 2��� ���� ����� � �� � �*�� ��� �� B*�� � ���%��� ��-���� ������ //�!� � � �.��/� �� � � �*���� ����> %���� ����*���+ � ��� � ���% � ������ � ������"���� � �*� ���*��� �*����� ���� ���� �� ��� �� �%%��%������+ � �*�� �� � �0%������ 8*������� ���5*����� ��� ����%��� �� ���*����� �"� �� ���� ���*� �%� �� ��*��+ �*�� � �����-��� ������ %������� ;�2�"�� �*�� � ���H��� ��+� � ���%��+�� �*��*��� ��� � ��������� � �0%������ ��� ������ �� � �-��� � ���%��+�� %�� ��+%��� � �55������ �� ��*���� ��*�� 8� ���� //�!� � � �.��/� �0%������� �� �������+ 8*� �� �*R��� � �� ���%�����-��� ������ � ����� ������ ���� 2�*�� �*-�� ��5 ���� �� �0%��*�� ��*�� 8� � "��"��� ����8���"���� ���� �� �����5 �*��*��� 65��� ��� �,C�$ ��+�7 � ��� %���� �� � ���� �� ���*����� ���� ����� �*������� ���� ��� ��5� � � �������%� �� �� ���� �� �0%��*�� 2�� �%�%������

���� �� �� � ��*��� �� ����*� � � ���� � �2���� � � ��*� �*5� �0%��*�� �� � �"���8������ ����� ��� �� �-���� � ��� ��0�� ��"�� � ���� �� ��� �2 2��� ���*5� ���� ;�2�"�� ���� "��"�5� � � ���� ��-��� ������ ��5�� � �������+ �� 8� �����5� �� �� ���� �� ���� 8���>� ���* ��-��� ������ ����� � ������ ���� %��%���+ ����� 8���� � ��� *�� �� � ����� ��� ��*�� ����8���"���� ���� ��2 ��"��� ���� �� ��*�� ���5*����� ��� �0%������ � �� �� ���� ���*���� ���%���� �� ��-��� ������ 5�+ 8� ������� �� ��� ���*�� ��2 ���� �� �� ������ ����� ��� ���� %����������

�������������

���� 2��> 2�� �*%%����� 8+ ��� �� ��5 ���E�� ����� �� �� �F�5%��� �� �� �� ����������� ���F1 ����*� A���� �� �� P����� �� ������F � � ���

3)'

Page 11: Low-level arsenite activates the transcription of genes involved in adipose differentiation

E4� ����� /����%%� B���� 64� ����� ��4�� ��7F� ��� �*����� ��� > /���� �*�>�� � ������� B� ��� � �� ���% *� � �������� �*�����"��2 � ��� 5� *����%��

��������

�� � � �� ���2� � 1��� = �� ��� ����"���� � A� # � ����*5*����� � *8�9*��� ���� ��$& 8+ ���� �� � ������8������ ������5 ���%�+� !�� ��55* � #&&3(3&,6#7:#$�C$�

��"������ � � JJ � � �* � ������>� = =��� �� ����*5�� %��5���� ���� ��� ���5*����� �/�� ����"��+ 8+ � ��8���� � � �A= %���%������� ���� �� �??G(�,6##7:G#G?C$?�

��� DM @��* ��+8�� � �� ��� ����+����� 5���8������ � ���� �� ����0��� ��� 5��� %��� � ��� ���� �� ����0��� ���%�%����� 8*� �� ��-��� ������ � �*���� � ��*>�5�� � ��+5%��5� ������ �� ��� !��� #&&3(G36)7:�),3C?�

��� ; �* � ������> �� J���>�� �/� D� ���� �"� ������������ 2��� ���� ���� �*��� 5���� � � ��� � ��5���� :�%%������� � � �BA� 5��������+ ���� ����+� ��� ����� ���� � #&&�(3&6#7:$?C)$�

B���� ��� D� !��� �� ���B�*���� ��� ��� ���� � �.��/�� �� � ���%��+�� ��-��� ������ � � ���� ���5� �??)(#$36'G7:3&&,$CG&�

B��8 � @ ���%��� 1 ���5�� B� ��+8�� �� B�-��� ��������"���� � �/�� � �*5� 8������ �%�������� ����� 8+� ���� �� � � 5���+����� ���� ������ 4���� �� #&&3(�$6�7:G$C?�

B*+ ��5 �� ;*������ �� "� ��� J��� � /� ��� ;���"� �� �"��� �� �� � ���� � %3) >� ��� � �+%�0���� �*��8�� ����� ��� ��%� �� � � �*���� � "���*��� � ���������� ���2�� ����� �0%������ 8+ ����*5 ���� ���� ����� ���5� #&&3(#$)6?7:G)),C?,�

4����� �B ��-��+ �! ��2� � �� ��� ;��5 �0+�� �����%��"� �� ���� ����� 8+ ���*���� � ����*��� ��� � A�� ���� ������???(�637:�,#C$�

D��5���� B! �%���� � � ����5� D� �� ��� ���� �� �� 5������ �>� ��%����� 8+ ���� �� ���5*����� � >����� ���+�������"�� ���2�� ������� �*��� !��� �??$(3)G637:#&?C�)�

D� � / ;* � ���2��� B �� ��� ��8��� � �*��� ��5� �0+�� ����� �0%������ 8+ � �+%�0���� �*��8�� ������� ��%� �� �5���� ��5 � ��� ��� ��5���� �"��+ �����: ���*����� 8+A� # � � �� D ��� ����%��� ������� � ���� ���5� #&&�(#$G6#?7:#$&�)C#,�

D��� ; =��� �� �� �%� �� ��*� ������8�� ��� ��� ����� � ��� ������� ���%��� �� "����� � 3�3 ������ ����� �?$G($6�7:�&,C�3�

;� �� /! D� �5 D ��� �� ��5�5��� � �� ����� �!���!� � � �!=���%� �� � %���2�+� * ���� �+ ������������+ �� 5������ #3$)��������������8� ���2����0� �*%�

%������ � %���0���5� %���� �����������"���� ����%������55�� �0%������ � � �*8��9*� � ���%��+�� ��-��� ������� � ��0���� �%%� /���5����� #&&3(�)?6�7:��C#$�

;* � �� N � �2 ��� �-��� � ���� �� � ��� ����%��� ������/�� � � A4�>�%%�� BA� 8� �� � ����"��+ � � ��������� � �0%������ � ��0���� ���� #&&#(�336�7:33C',�

1���� � 1��� = ��>������ � �� ��� ��� ����%��� ����� A� #������ ����+ ���*����� � ���*% � �0�����"� �������� �*��8���� �� � 5����%������ � ���� ���5� #&&&(#$,6#�7:�G&#3C?�

����� �� ���"� � D�� �0%������ %��H�� � �*�� � ���%��+����-��� ������ � 3�3�� H8��8������ D� �� #&&#(#??6�C#7:?,C�&&�

=����� =�� !��� � ��"� ��� � ���� �� ����� ��� ����: 5����� ����� � �5�� 5���� �+���5� � � 5���+����� ���� ��5���8������� ��0���� �%%� /���5����� #&&�(�$#637:#'?CG��

=����� =� ��5�� �� �0�����"� ������ �� � %����8�� 5��� � ����� �� ���� �� ����� ��� ����� ��0���� ���� #&&3(�3$6��#7:3C�3�

���� �� �� � � � !��% �� �� ��� ����+����� ���"��� ����� �� �%����� ��� �� ���0��� ���5 !�� ��0����� #&&�(�'6'7:3,,CG��

!�� �� D���� �/ M� M /�����%� �� !��� !;� D��8����������� � �� � �0%������ � �*5� >����� ��+��� 8+� ���� �� ���� ��� ����� ��� ����� #&&3(#'6'7:$'$C,G�

!��� �B �%�����5� ��� �����*��� ���*����� � ���%��� ������ � * !�" ���� B�" ����� #&&&(�G:�',C$��

�*� 1 K �� �� �� ����� !� ;*5� =�*%%�����>� �����,.=4,: �+ ���+ 2��� A4�>�%%��.!�� ������ � � �0%������ � �*5� �>� � � ���� ��������� �*� � ���� ����� #&&#()�6G7:3#3C3'�

���*8� =� J�*�� �� P���� !� ����*5 ���� ��� � ��8������5� �� ��-��� ������ � 5*�� � �3; �&��.# %�����%���+���� ��0���� �%%� /���5����� #&&&(�G)6�7:#,C3,�

J�*�� �� � �� �� P���� !� ����*5 ���� ��� � ��8���� � ��"����� �0%������ � ���%��� �� � � �� ������%���H��� �� �*�� � � ����� ���%��� ����� ��0���� ���� #&&#(G,6#7:#��C?�

��� ; /��> = ����� ��� ��� � �� � �0%������ %��H��� � �*5� H8��8����� � ���%� �� �� ����*5 ���� ��� �����5� ������� ��� ����� #&&#(#36,7:)G$C$G�

@�� � N; J���� D� P�*��� � D� ���H ��� �2���"������ ��� � �*��� �� � �0%������ � ;�=#?3 ������ ��0�������+� #&&3(�)$6�7:3?C')�

@�* � ��� @ ����5� �������� 8��� P �� ��� ;� ;�2 ��*��%��5+����+��� ��*>��5�� ��"�"�� ���� ��� A�� !�" �� ����#&&#(#6?7:$&,C�3�

����� 7�� ������2� � ��/ ��� ��*�� ������ �� �� � �8��������� �� ������ ���0�������� �� 5*���� �� �� � "��� �5� ����4��*���� �� 5�� ���� � #$ ��*��"��� ��� ��*�� �33), ���������� ����0 &, 4�� �����5���: <��8������� �� �S5����� ��* �"�5��� �

3),