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Los transportadores del maíz dentro de los mecanismos de
respuesta en la interacción planta-microorganismo.
Los transportadores de sacarosa.
Dra. Sobeida Sánchez Nieto
Sistema circulatorio y vascular para transporte de nutrimentos
HUMANOS PLANTAS
Arterias O2 del corazón a los órganosVenas CO2 de los órganos al corazón
Xilema mueve agua y minerales de la raíz hacia arribaFloema mueve azúcares, aminoácidos en todas direcciones
Experimento que demuestra que el carbono fijado se distribuye en la planta desde las hojas hacia los tejidos no fotosintéticos
CH3COOH + NaH[14-C]CO3 CH3COONa + [14-C]CO2 + H2O
CH3COOH
NaH[14-C]CO3
Se revelo colocando una placa fotográfica sobre la superficie del tejido
El carbono fijado se distribuye en la planta
La marca se distribuyo en las hojas en donde se administró la marca y en los tallos, flores y raíces.
PERO NO en las hojas fuente ya que estas sintetizan su propio carbono
Excess of sucrose goes from photosynthetic cells (source) to the non photosynthetic tissues and/or is exudate from some sinks
1M
Wang et al., 2013, Front. Plant Sci.,doi: 10.3389/fpls.2013.00201
Las plantas transportan sacarosa debido a:
1. Alta solubilidad1 g sacarosa/ml0.5 g glucosa/ml
2. Químicamente inerteazúcar no reductor
3. Ningún requerimiento energético para su hidrólisis
Glucosa Fructosa
El transporte de azúcares en las plantas involucra:
Modified from Truernit, 2001
Current Biology 11 (5), R169 - R171
Difusión1. Plasmodesmata
2. SWEET
Transporte activo1. Sacarosa/H+ y2. Hexose/H+
Plasmodesmata
SUT: ES UN TRANSPORTADOR DE SACAROSA, FUNCIÓN: CONCENTRA SAC EN LA CÉLULA, TIPO DE TRANSPORTADOR: ACTIVO SECUNDARIOSOLUTOS QUE TRANSPORTA: PROTÓN Y SACAROSA
Sauer, 2007; FEBS letters 581 (2), 2309–2317
Proteína con 12 hélices altamente hidrofóbicas, denominadas cruces transmembranales
Sut1 mutants have reduced growth of vegetative and reproductive tissues, accelerates senescence and accumulates sucrose at the leaves
Slewinski T L et al. J. Exp. Bot. 2009;60:881-892
ESPIGATejido reproductor masculino
HOJAS CONTROL
HOJAS DE LA MUTANTE EN SUT1
CONTROL MUTANTECONTROL MUTANTE
CONTROL MUTANTE
Tejido fuente
Célula del mesófilo
Célula del
parénquima
Célula
acompañante
La hoja acumula azúcares en forma de almidón debido a que carece del simportador sacarosa/H+.
El almidón se hizo visible mediante una tinción con lugol
Las hojas envejecen prematuramente, se tornan amarillas o café
control
- lugol + lugol
Modelo de como se encuentra la planta mutante sin SUT
SWEET: TRANSPORTADOR DE HEXOSAS Y/O SACAROSA, TIPO DE TRANSPORTADOR: DIFUSIONALDIRECCIÓN DEL TRANSPORTE: BIDIRECCIONALSOLUTOS QUE TRANSPORTA: SACAROSA, GLUCOSA, FRUCTOSA CON DIFERENTES AFINIDADES.
Proteína de 7 cruces transmembranales
SWEET a diffusional bidirectional sugar transporter
Chen et al., 2010; Braun, 2012; Yuan y Wang, 2013
Entrada de azúcar a la célula Salida de azúcares de las células
Papel fisiológico de los SWEETs
Llenado del floema Chen et al., Science (2012).
Desarrollo del embriónChen et al., Plant Cell (2015).
Las mutantes acumulan
almidón en las hojas
La triple mutante sweet11,12 y 15 retrasa el desarrollo el embrión
Papel fisiológico de los SWEETs
Llenado de la semillaSosso et al., Nature Genet (2015).
Formación del néctarLin et al., Nature (2014).
Composición del néctar: Arabinose, glucose, galactose, fructose, sucrose,
pentose, rhamnose, raffinose, ribose, xylose
and mannitolLa mutante zmsweet4c reduce su acumulación de almidón en el endospermo
La mutante en atsweet9 no produce néctar
Papel fisiológico de los SWEETsExudación de
fotosintatos por la raízChen et al., Plant J (2010).
Root Exudates Regulate Soil Fungal Community Composition and
Diversity
SWEET2 es un transportador vacuolar. Las mutantes sweet2 línea 2 y sweet2 línea 3 aumentan la salida de azúcar a las raíces.
Lo que indica que SWEET2 normalmente introduce los azúcares a las vacuola y hace menos disponible a la célula estos por lo que la exportación de azúcares se reduce
Papel fisiológico de los SWEETsInteracción planta-
patógenoChong et al., J Exp Bot (2014).
Infección con B. cinerea Chen et al., 2010 y 2012
SWEET4 hace susceptible a la planta a la infección por B. cinerea, una planta mutante para este transportador le permite resistir la enfermedad
Varios microorganismos activan la expresión de los SWEETs en Arabidopsis
Para bien o para mal?
Control Infectados con Phytium
SWEET vacuolarDisminuye la cantidad de azúcares disponibles para el hongo.
Efectores TAL (Transcription activator-Like protein)
SWEETs de MPAumenta la salida de azúcares y la planta nutre al microorganismo
Hay SWEETs que aumentan su expresión cuando los patógenos se encuentran en contacto con la planta.
PARA BIEN DE LA PLANTAPARA MAL, HACKEANDO EL SISTEMA DE TRANSCRIPCIÓN DE LA PLANTA
Relación fuente-demanda
Los microorganismos actúan como tejido demanda
Respuestas múltiples DE LA PLANTA a la presencia de los patógenos:
A) De defensaB) Donador de azúcaresC) De muerte
Incrementar la productividad? y/o Reducir la enfermedad
Photo by Nicolle Rager Fuller, National Science Foundation
La relación entre los SWEETs y la susceptibilidad a patógenospodría ser aprovechada para desarrollar cultivos resistentes apatógenos.
Diseño de oligonucleótidos a partir del análisis Bioinformático
Obtención del material biológico
Extracción de RNA por el método del Trizol
Producción de cDNA mediante la Reacción de transcriptasa reversa
(RT)
Amplificación de un fragmento de la secuencia del gen de interés por PCR
punto final
1. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LOS SWEETs DE MAÍZ.1. Comprobar la expresión de los SWEETs en el maíz Chalqueño2. Determinar su expresión en condiciones diferentes a las reportadas
Análisis in silico
En maíz, 22 presuntos transportadores
tipo SWEET.
¿Cuáles se expresan preferencialmente
en los diferentes tejidos?
Familia de SWEETs se distribuyen en 4 clados
Aparentemente está distribución coincide con el azúcar que transportan
Clado I, homólogos a SWEET1 y 2, son transportadores de hexosas; SWEET2 está en el tonoplasto.
Clado II son SWEET3 al 8 varios son transportadores de hexosas.
Clado III se encuentran los SWEET 9-15 capaces de transportar sacarosa.
Clado IV contiene a los SWEETs 16 y 17 presentes en tonoplasto y transportan fructosa.
Análisis in silico
En maíz, 22 presuntos transportadores
tipo SWEET.
¿Cuáles se expresan preferencialmente
en los diferentes tejidos?
ZmSWEET12b
ZmSWEET2
ZmSWEET3b
ZmSWEET12a
ZmSWEET14b
Los que se expresan preferencialmente en raíces
DATOS OBTENIDOS DEL TRANSCRIPTOMA DE MAÍZ
Se identificaron los sitios en donde más se expresan la
familia de genes que codifica para los supuestos SWEETs
de maíz. Accession number
EnsemblePlantsAccession number
NCBISWEETnumber
Tissue localization(MaizeGDB)
GRMZM2G368827 NM_001155492.1 SWEET1 Cariópside, espiga
GRMZM2G144581 NM_001150167.1 SWEET2 Embrión
GRMZM5G872392 NM_001153137.1 SWEET3 Embrión
GRMZM2G137954 NM_001148118.1 SWEET4 Endospermo
GRMZM2G094955 NM_001139364.1 SWEET5 Endospermo
GRMZM2G000812 NM_001175008.1 SWEET6 Hoja de planta madura
GRMZM2G153358 NM_001154214.1 SWEET7 Hoja planta madura
GRMZM2G179679 NM_001196704.1 SWEET8 Hoja de planta madura
GRMZM2G021706 NM_001148182.1 SWEET9 Hojas
GRMZM2G168365 NM_001155556.1 SWEET10 Base de hojas y espiga
GRMZM2G157675 NM_001155539.1 SWEET11 Espiga
GRMZM2G416965 NM_001157247.1 SWEET12 Espiga
GRMZM2G324903 NM_001152631.1 SWEET13 Raíz primaria
GRMZM2G015976 NM_001137817.1 SWEET14 Raíz primaria
GRMZM2G133322 NM_001143456.1 SWEET15 Raíz primaria
GRMZM2G060974 DAA52821.1 SWEET16 Raíz primaria
GRMZM2G099609 AFW88409.1 SWEET17 Raíz primaria
GRMZM2G106462 DAA54392.1 SWEET18 Coleoptilo
GRMZM2G107597 DAA45288.1 SWEET19 Semilla
GRMZM2G173669 NM_001155615.1 SWEET20 Hojas
The SWEET numbers does not correspond to the analoguous numbering in Arabidopsis
Para la obtención de material vegetal se crecieron
plantas en diferentes etapas del desarrollo del maíz
Vegetativas (V) Reproductivas (R)
http://odells.typepad.com/blog/corn-growth-stages.html
Expresión de SWEETs en embrión, espigas y semillas inmaduras.
SWEETPM1. RT-PCR usando
oligonucleótidos específicos para amplificar cada SWEETsy el cDNA de cada tejido
2. Separación de los productos amplificados en un gel de agarosa al 2 % en presencia de bromuro de etidio.
3. Realizar la réplica biológicas
Gel representativo de 3 gel con
muestras biológicas distintas
Tissue Major expressed
ZmSWEET
Mature embryo 4b
Germinated embryo 11a, 14a
Coleptile 1b, 4a, 13a, 13b, 17
Embryo radicle 14b
Mature
leaves
Apex 1b, 13a, 13b
Middle 1b, 13a
Basis 1b, 13a, 13b
Roots 3b
Husk 1b, 4a, 17
Immature silk 11a, 6b, 6a
Mature silk 11a, 6b, 6a
Immature embryo 6b, 6a
Relative ZmSWEETs expression in maize tissues along the plant life cycle. The expression was obtained by RT-PCR. To mature, immature and germinated embryo, as well as silks, Zm18s expression was used as control. To all others tissues, 25s RNA band was used as control.
Expresión de SWEETs en el desarrollo de las hojas del maíz.
Néstor E. Delgado Rubio
Base
Media
Punta
Los SWEET13 se presentan en todas las partes aéreas del maíz excepto en la hoja envolvente
ZmSWEETs expression throughout the circadian cycle. Upper side represents the most abundant ZmSWEETs transcripts found at different hours. Below RT-PCR for each SWEET was showed.
Pocos cambios en la expresión de los SWEETs a lo largo del día, excepto a las 14 h
Resistencia sistémica inducida
Antimicrobianos de la planta
F. verticillioidesT. asperellum
Se establece en raíces
De la Torre-Hernández et al., 2010
Micoparásito
Harman et al., 2004; Druzhinina et al., 2011
Productor de micotoxinas
Necrótrofo
Patógeno del maíz
Biótrofo y saprótrofo
Determinar el efecto que dos hongos con estilos de vida distintos provocan sobre la expresión de los
SWEETs
Exposición de las plantas a los hongos Cuantificación de ZmSWEET en hojas de plántulas infectadas
con F. verticillioides y/o T. asperellum
Relative ZmSWEETs expression levels on Zea mays aerial parts from 14 days old plants growth in greenhouse, the plants comes from seeds treated with A) F. verticilloides, B) Trichoderma at. Columns represents relative expression. The ZmSWEETs expression levels were normalizated based on the expression levels of ZM18s. Error bars indicated the SD of the mean derived from three replicates form two independent biological samples.
Fusarium MY3 low FB1 mycotoxinproducer reduces SWEET1b, 4a, 13a, 13b y 17 expression
Trichoderma induces low changes in expression, but significantly different
0
2
4
6
8
10
12
14
1 2 4 5
Re
lati
ve e
xpre
ssio
n
Dpi
Control
Control H2O
Control F. verticillioides
A
0
2
4
6
8
10
12
14
1 2 4 5
Re
lati
ve e
xpre
ssio
n
Dpi
ControlTrichodermaTrichoderma H2OTrichoderma F. verticillioides
B
Trichoderma asperellum y Fusarium verticillioidesinducen la expresión de ZmSWEET13a en las
hojas.
Carvente-García Roberto, 2014
Modelo propuesto (análisis bioinformáticode la secuencia de proteínas predicha)
Protein properties
Length 302 aa
MW (calc.) 33.0 kDa
IEP (calc.) 9.57
Amplificación de SWEET13a
ZmSWEET13a fue clonado usando las regiones UTR del gene
1 ATGGCTGGCA TGTCTCTGCA ACACCCCTGG GCGTTTGCTT TCGGTCTACT AGGTAACGTC
61 ATCTCCTTCA TGACCTTCCT GGCCCCGATA CCGACGTTCT ACCGCATCTA CAAGAGCAAG
121 TCGACGGAAG GCTTCCAGTC GGTTCCCTAC GTGGTTGCCC TGTTCAGCGC CATGCTGTGG
181 ATCTTCTACG CACTGATCAA GTCCAACGAG ACCTTCCTCA TCACCATCAA CGCCGCCGGC
241 TGCGTCATCG AGACCATCTA CGTCGTCATG TACTTCGTCT ACGCGCCCAA GAAAGCCAAG
301 CTGTTCACGG CCAAGATCAT GGTCCTCCTC AATGGCGGCG TCTTTGGGGT CATCCTCCTG
361 CTCACCCTTC TCCTCTTCAA GGGCAGTAAG CGCGTTGTGC TGCTTGGCTG GATCTGCGTC
421 GGCTTCTCCG TCAGTGTCTT CGTCGCGCCA CTCAGCATCA TGAGACGAGT GATCCAGACG
481 AAGAGCGTGG AGTACATGCC CTTCTCCCTC TCCCTCTCGC TCACCCTCAG CGCCGTCGTC
541 TGGTTCCTCT ACGGCCTCCT CATCAAGGAC AAATACGTCG CGCTTCCAAA CATCCTGGGG
601 TTCACCTTCG GCGTGGTCCA GATGGTGCTC TACGTGTTGT ACATGAACAA GACGCCGGTG
661 GCGGCGACTG CCGAGGGCAA GGATGCCGGC AAGCTTTCCT CAGCTGCAGA CGAGCACGTC
721 CTCGTCAACA TCGCCAAGCT CAGCCCAGCC CTCCCGGAGA GGAGCTCCGG GGTGCACCCA
781 GTCACCCAGA TGGCGGGCGT TCCTGTCAGG AGCTGCGCTG CTGAAGCAAC CGCGCCGGCG
841 ATGCTGCCCA ACAGGGACGT GGTCGACGTC TTCGTCAGCC GACACAGCCC CGCCGTCCAC
901 GTGGCATAG
10001500
750
2000
Células HEK293
transfectadas
Inmunodetección de SWEET13a con un anticuerpocontra el epítope V5.
Std Total Microsomal Total Microsomal
(kDa) Fraction Fraction Fraction Fraction
ZmSWEET13a se expresa en membranas
pcDNA/V5ZmSWEET13a
Carvente-García Roberto, 2014
HERRAMIENTAS PARA CARACTERIZAR EL TRANSPORTE DE SACAROSA
Cómo caracterizar al transportador SWEET13?
Aislamiento de las membranas
1. Aislar vesículas de membrana
2. Ponerlas en contacto con el soluto a transportar marcado radiactivamente
3. Leer la marca incorporada en las vesículas.
56
Centrifugación diferencial
Caracterización de la actividad del transportador de sacarosa
• Medición del transporte de sacarosa mediante el método radiactivo.
pH 7.8
[14-C]SacarosaH+
MP
pH medio de ensayo
57
Proteínas que perciben solutos específicos
• Proteínas que perciben solutos flanqueadas por ambos lados (amino y carboxilo) por proteínas fluorescentes
Células dobles transformantes
• Para el sensor de azúcares y para la proteína transportadora
• Se mide el cambio en la fluorescencia
Se obtienen diferentes datos de los experimentos en células
• Párametros bioquímicos
Km, Vmax Especificidad Dirección
Análisis de la función del transportador de sacarosa de tomate (LeSUT1 y LeSUT2) en el sistema de levadura.
•SUT1 puede complementar la mutante de levadura, SUT1 es untransportador de sacarosa•SUT2 no complementa a la mutante, SUT2 no es un transportador desacarosa.
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LOS TRANSPORTADORES DE AZÚCARES
ZmSWEET13a Y ZmSWEET13b DE MAÍZ.
Nancy Hernández Chávez
Determinación de la actividad de transporte de azúcares
Ensayo de complementación en la levadura EBY4000VW para determinar actividad de transporte de
glucosa. Control (-) Levadura transformada con el vector vacío. Control (+) Levadura transformada con
AtSWEET1 transportador de glucosa de la membrana plasmática.
EBY4000VW, mutante que carece de los transportadores de hexosas
La mutante de levadura crece en medio sintético de URA (-) suplementado con
Maltosa 2%. Posteriormente se crece en medios con diferentes carbohidratos,
se hacen diluciones del cultivo y se colocan en la cuadricula y se observa el
crecimiento
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LOS TRANSPORTADORES DE AZÚCARES
ZmSWEET13a Y ZmSWEET13b DE MAÍZ.
Nancy Hernández Chávez
Ensayo de complementación en la levadura SEY6210 para determinar la actividad de transporte de
sacarosa. La mutante de levadura crece en en un medio sintético de URA (-) suplementado con Glucosa al
2%. Control (-) Levadura transformada con el vector vacío.
SEY6210 mutante que carece de las invertasas
Porque no crecieron las levaduras? A. Los SWEETs No transportan los azúcares?B. O la proteína no es de la MP?
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LOS TRANSPORTADORES DE
AZÚCARES ZmSWEET13a Y ZmSWEET13b DE MAÍZ.
Nancy Hernández Chávez
Protoplastos de Arabidopsis thaliana transformados con ZmSWEET13a y 13b fusionados a
proteínas fluorescentes y observados bajo el microscopio confocal. Los organelos rojos son
cloroplastos, la zona amarilla corresponde a la fluorescencia de AtSWEET1 (b), la zona azul corresponde
a la fluorescencia ZmSWEET13a (c) y ZmSWEET13b (d), se observa que ambos SWEETs se localizan
en el interior de la célula.
c
a
b
d
Cual será su localización subcelular?
Control (-)
AtSWEET1-GFP
ZmSWEET13a
ZmSWEET13b
Campo claro Canal YFP o CFP Canal clorofila Merged
C B C B C B C B
Peso molecular (pb): 188 166 171 128
Efecto del biopriming en la expresión de los SWEET de maíz.
Raíces embrionarias
Raíces post-embrionariasZmSWEET
2 14b 12a 3b 12b
C B C B C B C B C B
Peso molecular (pb): 188 128 166 179 128
ZmSWEET
2 12a 12b 14b
Establecimiento de las condiciones óptimas para la qPCR
Eficiencia de la
amplificación:90-110%
Un solo pico de
amplificación
(Pfaffl, 2001)
Curvas de disociación de ZmSWEET12b.
1°
2°
3°
4°
5°
6°
7°
Ningún par de oligonucleótidos produjo un solo pico, por lo tanto no se obtuvieron los valores de expresión de este gen
El biopriming aumenta la expresión de diferentes SWEETs dependiendo de la edad de las raíces
SWEET de maíz 2 3b 12a 14b
Localización del homólogo en
ArabidopsisVacuola No determinado
Membrana
plasmática
Membrana
plasmática
predicho
Azúcar que transporta el
homólogo en ArabidopsisGlucosa Hexosas predicho
Sacarosa,
Glucosa, Fructosa
Sacarosa y
Glucosa predicho
Palacios-Vargas Itzel, 2017
2 3b 12a 14b
Experimentos en progreso: Determinación de los niveles de azúcares en los exudados de las raíces T.
asperellum. Clonación y caracterización de SWEET3b y 14b
Conclusiones
1. La expresión de los SWEET es diferencial, tejido y tiempo de desarrollo específico
2. El hongo T. asperellum aumenta la expresión de los transportadores de azúcares difusionales, SWEET, en las hojas solo cuando se encuentra F. verticillioides en la planta lo cual regula probablemente la disponibilidad de azúcares en la planta y le permite continuar su desarrollo a pesar de la presencia de ambos hongos.
3. El aumento en la expresión de los SWEET durante el biopriming con T. asperellum indica que la planta ajusta su transporte de azúcares para mantener su crecimiento y al hongo en las raíces
4. Tenemos las herramientas para caracterizar a transportadores de MP, pero aún nos falta desarrollarlas o mejorarlas para los de la vacuola
5. La localización subcelular es importante de determinar para conocer el flujo de los azúcares en la célula.
Dr. Arturo GuevaraInstituto de Biotecnología, Cuernavaca MorelosDr. José Luis Hernández MendozaInstituto de Ciencias Genómicas IPN, Tamaulipas.Dr. Javier Plasencia de la Parra, Dra. Marina Gavilanes Ruíz,Dra. Karina Durán (USAI-Microscopía confocal)M. en C. Manuela Nájera MartínezQ. Laurel Fabila Ibarra Facultad de Química, UNAMDra Sara L. Morales-Lázaro Dra. Tamara RosenbaumInstituto de Fisiología Celular
Colaboradores
M. en C. Paulina Aguilera Alvarado
M. en C. Fernando Guzmán Chávez
M. en C. Roberto Carvente García
M. en C. Montserrat López Coria
pQA Itzel Palacios Vargas
pQFB Mireya Flores Barrera
pQFB Néstor E. Delgado Rubio
pQFB Nancy Hernández Chávez
pQA Méndez Ramírez Moisés
pQA Muñoz Chapul Daniela
M. en C. Beatriz King Díaz
Facultad de
Química
Nestor Dany Pau
Moy Nancy Bety Mire Itzel Montse