1. TRANSGENICOS 2. 13/03/13 3. 13/03/13 4. DEFINICINOrganismo modificado genticamente (OMG) aquel cuyo materialgentico ha sido modificado de una manera que no se producenaturalmente en el apareamiento ni en la recombinacin natural sinomediante alguna de las siguientes tcnicas:- Tcnicas de recombinacin del cido nucleico mediante la insercinde molculas de cido nucleico obtenidas por cualquier medio en unvirus, plsmido bacteriano u otro sistema de vector y su incorporacin alorganismo hospedador en el que no se encuentren de forma naturalpero puedan seguir reproducindose.- Microinyeccin, macroinyeccin o microencapsulacin tcnicasque suponen la incorporacin mecnica directa- Tcnicas de fusin de clulas (incluida la fusin de protoplastos) o dehibridacin mediante la fusin de dos o ms clulas utilizando mtodosque no se producen naturalmente.Directiva 2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo sobre la liberacin intencional en el medio ambiente de organismosmodificados genticamente. 5. TCNICAS QUE NO DAN OMG Fertilizacin in vitro Conjugacin, transduccin, transformacin o cualquier otro proceso natural Induccin poliploideY tampoco: Mutagnesis Fusin (incluida la de protoplastos) de clulas vegetales de organismos que puedanintercambiar material gentico mediante mtodos tradicionales de multiplicacin. 6. RESUMENUn OMG es el que se obtiene mediante tcnicas que permiten la inclusin en un organismo de materialgentico procedente de una especie diferente, lo queno se podra conseguir de modo natural (porejemplo, un gen de bacteria en una planta). 7. DIFERENCIA CON GENTICA CLSICALas tcnicas de modificacin gentica permiten la inclusin de una caractersticaconcreta de manera dirigida en una especie determinada. Las tcnicas de mejora gentica clsica generan una gran variabilidad genticapara a continuacin seleccionar el organismo que contiene la caractersticadeseada, frecuentemente junto a otras caractersticas que no eran el objeto de lamejora. 8. TECNICAS DE RECOMBINACIN DE ADNConsiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y ste, a su vez,dentro de una clula, denominada clula anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular, elgen se expresa, sintetizndose as la protena codificada en el gen.Al dividirse la clula, las nuevas clulas formadas contienen ese gen y tambin sintetizanesa protena.Pasos:1.- Preparacin de la secuencia del ADN2.- Preparacin deL vector3.- Formacin del ADN recombinante4.- Introduccin del ADN recombinante en una clula anfitriona5.- Propagacin del cultivo6.- Deteccin y seleccin de clones recombinantes 9. 1 PREPARACIN DE LA SECUENCIA DE ADNEs la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.* Partimos de clulas con ncleo, que deben ser lisadas (rotas).* Las protenas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse delADN.* El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por accin de las enzimas de restriccin.* Se asla el ADN que se desea, por ejemplo, mediante cromatografa lquida o porcentrifugacin.* Si el ADN debe expresarse hay que aadir los segmentos reguladores de la expresingnica. 10. 2 PREPARACIN DEL VECTOR AEl vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debepresentar las siguientes caractersticas:* Una pequea secuencia de ADN fcil de aislar, como, por ejemplo, un plsmido.* Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restriccin y que sean conocidos.* Poder ser incluido en la clula anfitriona con facilidad.* Replicarse de forma independiente al ADN de la clula anfitriona.* Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las clulasclonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibitico. 11. 2 PREPARACIN DEL VECTOR BLas etapas del proceso consisten en:* Cortar el vector con enzimas de restriccin, las mismas enzimas que se utilizaron paracortar el ADN que se quiere insertar.* Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, opegajosos, o escalonados.* Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, osimplemente, inserto.* Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plsmidos, virus como el fago l,cromosomas creados de forma artificial y quimeras. 12. 13/03/13 13. ESQUEMA13/03/13 14. 3. FORMACIN DEL ADN RECOMBINATEEn esta etapa se produce la unin covalente del vector y el ADN inserto mediante unaligasa. As se realiza el sellado de la llamada Mella, Muesca o Nick.4. INTRODUCCIN EN LA CELULA ANFITRIONALos tipos de clulas anfitrionas son:* Clulas bacterianas: son las ms utilizadas, ya que tienen una alta velocidad dereplicacin, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fcilmentemanipulables.* Clulas eucariotas: aunque las clulas eucariotas son, en general, difciles demantener se usan levaduras y clulas tumorales:- Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigacin de la expresin yla regulacin gnica y la sntesis de protenas eucariotas.- Clulas tumorales: apropiadas en procesos de clonacin, ya que la velocidad dereplicacin es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues sonmuy estables. 15. 5. PROPAGACIN DEL CULTIVOSe induce la divisin de clulas anfitrionas, de forma que se producen tambin copias de ADNrecombinante. Primero se efecta una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo.Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas ser seleccionada y transferida a distintos medioslquidos, donde seguir aumentando el nmero de individuos de la colonia.6. DETECCIN Y SELECCINAl final del proceso se hace necesario separar las clulas que contienen ADNrecombinante de las que no lo contienen.La deteccin y la seleccin de colonias se realiza en los medios de cultivo. Los mtodospara detectar y seleccionar son:Mtodo de hibridacin: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADNrecombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de l.Mtodo inmunolgico: se detecta la protena codificada en el ADN recombinantemediante anticuerpos especficos. 16. Mtodos genticos: que, a su vez, pueden ser:* Insercin del vector y el ADN recombinante en un gen de la clula anfitriona quequeda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no produce enzima lactasa, es que elADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen.* Vector con genes de resistencia a un antibitico: en el medio se agrega elantibitico y slo crecer aquella colonia que sea resistente a l, por tanto, que porte elADN.* Colonias con defectos nutricionales: se utilizan clulas anfitrionas mutantes que nopuedan sintetizar, por ejemplo, un aminocido. Para que la colonia sobreviva, elaminocido debe ser aadido al medio de cultivo. Empleando un vector que lleve el gencorrecto para la sntesis de dicho aminocido, haciendo crecer las colonias celulares enmedios carentes de l slo crecern las bacterias que lleven el ADN inserto. 17. MICROINYECCIN, MACROINYECCIN OMICROENCAPSULACINLos ms empleados son:Microinyeccin: mtodo fsico activo en el que se introduce el ADN recombinante en elinterior celular con una micropipeta. Este mtodo es utilizado cuando existe la necesidadde asegurarse que se ha introducido el ADN. Debido a la laboriosidad del proceso, sloes utilizado sobre ovocitos o cigotos. Por contra, puede prescindirse del vector eintroducir directamente el ADN seleccionado.Microproyeccin o biobalstica: mtodo fsico activo en el que se utiliza unamicropistola que dispara microbalas de acero en las que va impregnado el ADN. Seutiliza sobre suspensiones celulares, cultivos celulares o "in vivo" sobre rganos comopiel, hojas, etc. 18. BIOBALISTICA13/03/13 19. 13/03/13 20. 13/03/13 21. TCNICAS DE FUSIN DE CELULASTransformacin: es un tratamiento fisico-qumico para variar la prmeabilidad de lamembrana de las bacterias. En un cultivo celular a 0C, con presencia de Ca++, seproduce un brusco cambio de temperatura, llegando a 37-43C.Lipofeccin: El ADN recombinante se introduce en liposomas, que son pequeasvesculas fosfolipdicas. Estos liposomas se unen con la membrana celular y el ADNcontenido en su interior se introduce en la clula.Electroporacin: mtodo fsico activo en el que una solucin con clulas y ADNrecombinante es sometida a descargas elctricas de alto voltaje. Esto altera lapermeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante. 22. 13/03/13