lma – diagnóstico laboratorial nydia s. bacal
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LMA – Diagnóstico laboratorial Nydia S. Bacal. LMA – OMS Leucemia Promielocítica Aguda LMA M3 clássica LMA M3 variante. Classificação da OMS. LMA 99P - LMA12. Robin Foá – Atibaia 03/2007. Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007. LMA não categorizada. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
LMA – Diagnóstico laboratorialNydia S. Bacal
LMA – OMS
Leucemia Promielocítica AgudaLMA M3 clássicaLMA M3 variante
Categoria Freqüência
L.M.A. com anormalidades genéticas recorrentesLMA com t(8;21)(q22;q22)/ AML1-ETO 5-12%LMA com inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22)/ CBF/ MYH11 10-12%LMA com t(15;17)(q22;q12)/ PML-RAR 5-8%LMA com anormalidades do 11q23 / MLL 5-6%
LMA com displasia de múltiplas linhagensPós-SMD ou doença mieloproliferativa VariávelSem antecedentes Variável
LMA/ SMD associada a tratamentoLMA/ SMD associada com agentes alquilantes VariávelLMA/ SMD associada com inibidores da topoisomerase II Variável
LMA não categorizada nos itens anterioresLMA com mínima diferenciação 5%LMA sem maturação 10%LMA com maturação 30-45%Leucemia mielomonocitária aguda 15-25%Leucemia monoblástica e monocitária aguda 3-6%Leucemia eritróide aguda 5-6%Leucemia megacariocitária aguda 3-5%Leucemia basofílica aguda RaraPan-mielose com mielofibrose aguda RaraSarcoma mielóide Rara
Classificação da OMS
LMA 99P - LMA12
Robin Foá – Atibaia 03/2007
Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
LMA não categorizada
• > 60% dos casos de LMA• Base para classificação é a morfologia, grau de maturação
e citoquímica• Não existem anormalidades citogenéticas recorrentes• O critério diagnóstico é ≥20% de blastos na MO (em 500
células) ou SP (200 leucócitos)• Se houver leucopenia acentuada pode se fazer esfregaços
do buffy coat• Biópsia de MO é necessária para o diagnóstico de
leucemia aguda hipocelular em S.P. e M.O.• Recomendações para classificação são aplicáveis apenas
em amostras obtidas antes da quimioterapia.
IMUNOFENOTIPAGEM
• Fundamental para o diagnóstico de:
• LMA-M0
• LMA-M7
• Pode ser importante no diagnóstico de: LMA-M6b (Leucemia eritróide pura)
• LMA-M3 (hipogranular)
Diagnóstico Laboratorial LMA e LPA – LMA M3
• Diagnóstico na rotinaPML-RARα qualitativo PCR e FISH – HIAEPML-RARα quantitativo - Nichols– 72horas(s/ estabilidade) FLT3 qualitativo – Nichols NPM – Exon 12 – Nichols C-Kit – qualitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade)CBFβ MHY11 (inv 16) – Quali/quantitativo– Nichols – 72horas(s/ estabilidade)
FISH – envio de célulasAML1-ETO (t:8;21) – Quali e quantitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade)
FISH – HIAEMLL PTD 11q23 - FISH – HIAENão Disponíveis: t(11;17) PLZF-RARα/NuMA- RARα/ t(5;17)NPM-RARα/ t(17;17)STSTSb-RARαCEBPα ; BAALC ; ERG ; NRAS ;
• Valor Prognóstico e Futuro
Forma Clássica - LPA - LMAM3
Faggot CellsFaggot Cells
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Forma Variante LPA - M3v
S. P.
Forma Variante LPA - M3v
Citoquímica para MPO – deve ser fortemente positivaCitoquímica para MPO – deve ser fortemente positiva
MO
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Forma Hiperbasofílica
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Diferenciação Granulocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais
CD34CD34CD117CD117HLA-DRHLA-DR
I II III IV V
Mieloblasto Pro- Mielócito Meta- Neutrófilo mielócito mielócito
Bastão
CD117CD117
CD15CD15CD11CD11b b
CD15CD15CD11bCD11bCD16CD16
CD15CD15CD11b+forteCD11b+forteCD16+forteCD16+forte
CD34/CD117/CD45/CD13.33
CD16/CD13/CD45/CD11b
CD13+fortCD13+forteeCD33+fortCD33+fortee
CD13+fortCD13+forteeCD33+fortCD33+fortee
CD13+fracCD13+fracooCD33+fracCD33+fracoo
CD13+CD13+CD33+fracCD33+fracoo
CD13+fortCD13+forteeCD33+fracCD33+fracoo
CD15CD15
Dra. Maria Silvia – Florianópolis Santa Catarina
I II III IV V I II III IV V
Imunofenotipagem
0 256 512 768 1024
FJL.002Forward Scatter ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
FJL.002Anti-HLA-DR FITC ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
FJL.003CD7 FITC ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
FJL.004CD42a FITC ->
FJL.002CD13 PE ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
FJL.006CD15 FITC ->
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
LMA M3
CD45xSS
HLA-DRxCD45
CD33xCD45
CD2xCD45
CD13xCD45
CD34xCD45
CD117xCD45
CD56xCD45
CD71xCD45
MPO(c)xCD45
IMUNOFENOTIPAGEM
• Antígenos mielomonocíticos (CD13, CD15 e CD33) e ausência de expressão de antígenos monocíticos (CD14, incluindo My4, Leu M3 e Mo2) e ausência de HLA-DR
• Estudos iniciais - ausência de CD34 e CD7,mas Edward et al (1999) observaram que 41% dos casos
de LPA com CD34 (+).
• HLA-DR (+) em LPA e HLA-DR (-) em LMA com
morfologia não M3
Dr. Alberto Orfao – Universidade de Salamanca
LMA - TRIAGEM FENOTÍPICA DE ALTERAÇÕES GENÉTICAS
t(8;21) MPO+, CD13, CD33, CD19+, CD56+ Comumente LMA-M2
t(15;17) MPO+, CD13+ heterogêneo, CD33++ homogêneo, CD15-, CD34-, HLA-DR-
LMA Promielocítica – FAB M3
Hurwitz, CA et al, Blood, 80: 3182, 1992 Orfao, A et al, Haematologica, 84:405, 1999
• 111 casos de LMA de novo • 38 morfologia de M3 (34 morfologia típica e 4 M3v)
• PML-RARα - 39 dos 111 (35%)
• 34 morfologias M3 e 5 casos foram classificados como M0 (2 casos), M1(1 caso) e M2 (2 casos)
ORFAO et al
• Quatro grupos conforme
Morfologia / genética molecular
1) M3 / PML- RARα + (n=34)
2) Não-M3 / PLM-RARα + (n=5)
3) M3 com PML- RARα - (n=4)
4) Não-M3 / PML- RARα – (n=68)
ORFAO et al
• CD33 homogêneo nas células blásticas em 82% dos casos
• CD13 em todas as células leucêmicas com padrão heterogêneo de expressão (100%)
• Expressão de CD34/CD15 (100%) • Discriminação entre M3/PLM-RARα (+) e M3/PLM-RARα (-) :
padrão fenotípico CD34/CD15 ٭
expressão de CD13 ٭
.presença de subtipo maior de células blásticas ٭
ORFAO et al
• A sensibilidade da imunofenotipagem para selecionar casos PLM-RARα foi de 100% e especificidade 99%
• HLA-DR negativo é provavelmente o achado mais
específico ( 91%)
0 256 512 768 1024
Spalice R. MO 14/11/02.003FSC-Height ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Spalice R. MO 14/11/02.003CD33 PE ->
APL80% Blasti CD33+
N O molecole CD33/cell = 23017
0 256 512 768 1024
Petriconi R. MO 30/12/02.003FSC-Height ->
AML M4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Petriconi R. MO 30/12/02.003FL3-H ->
80% Blasti CD33 +NO molecole CD33/cell =1648
0 256 512 768 1024
Caboni ext 19/12/02.003FSC-Height ->
AML M2
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Caboni ext 19/12/02.003CD34 FITC ->
70% Blasti CD34+ CD33+NO molecole CD33/cell = 2992
Expressão e quantificação do CD33 em LMA / LPA
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA)LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA)
LPA é caracterizada por uma translocação específica t(15;17)
t(15;17) envolve o gene receptor do ácido retinóico RAR-alpha no cromossomo 17 e o gene PML, um fator de transcripção, no cromossomo 15, gerando o gene quimérico PML-RAR-alpha
o resultado da proteina quimérica PML/RARα é crucial para a patogênese da LPA
Dr. Zago – Atibaia 03/2007
standard-risk: median DFS = 3.2 years
years from CR
p<0.0001
standard: 85 events 47intermediate: 56 events 34high: 91 events 75
intermediate-risk: median DFS = 1.6 years
high-risk: median DFS = 0.62 years
SLD de acordo com o grupo de risco citogenético-molecular
Median: Standard: 3.2 years (C.I. 95%: 38,6 - 60,6) Intermediate: 1.6 years (C.I. 95%: 36,9 - 63,1) High: 0.62 years (C.I. 95%: 39,2 - 59,7)
Mancini et al, Blood 2005
Translocação Gene de Fusão Morfologia R esposta ao ATR A
t(15;17)(q22;q12) PML-R AR C lássica ou m icrogranular
Sensível
t(11;17)(q23;q21) PLZF-R AR Assoc. m icrogranular
R esistente
t(11;17)(q13;q21) NuMA-R AR C lássica Sensível
t(5;17)(q23;q12) NPM-R AR C lássica ou m icrogranular
Sensível
t(17;17) STAT5b- R AR R esistente
Translocações Cromossômicas Envolvendo o Gene RARα
Genes X
Genes X-RARDr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
Artefatos, não define alvo para MRD
Rápido, barato
1 diaImunofluores.
Proteína PML
Núcleo
Qualidade do RNA, falsos positivos
Rápido, sensível, define alvo p/ MRD
1 diaRT-PCRfusão PML/RARa
RNA
Laborioso, uso de radioativos, não define alvo para MRD
Específico7 dias
Southerngenes PML e RARα
DNA
Custo, não define alvo para MRD
Céls. intérfase
2-3 dias
FISH
Crescimento em cultura; fusões crípticas não são detectadas, não define alvo para MRD
Específico13-14
dias
Cariótipot(15;17)Cromossomos
DesvantagemVantagemTMétodoAlvoEstrut.
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Imunofluorescência anti-PML
5’ 3’5’ 3’DR5 DR5
RXRRXR RARRAR
RARRARPMLPML
RARA
PMLPML
LMA – não LPMaDr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Acute Myeloid Leukemia
Tyrosine Kinase Receptor Mutations
Gene Mutation Frequency
FLT-3 Duplication 15-30%Point Mutation 5-10%
FMS Point Mutation 10-20%
c-KIT Various <10%
Gene Mutation Frequency
FLT-3 Duplication 15-30%Point Mutation 5-10%
FMS Point Mutation 10-20%
c-KIT Various <10%
Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
E F
S (
%)
1 2 3 4 5 6years
FLT3 wildtype
Core Binding Factor AMLPrognostic impact of TK receptor mutations
FLT3 mutationp<0.001p<0.001
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
E F
S (
%)
1 2 3 4 5 6years
1 2 3 4 5 6years
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
O S
(%
)
FLT3 wildtype
p=0.03p=0.03
p<0.001p<0.001 FLT3 mutation
c-KIT wildtype
c-KIT mutationc-KIT mutation
Core Binding Factor AMLPrognostic impact of TK receptor mutations
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
LMA. Carcaterísticas clínicas de acordo com o status FLT3
FLT3 pos FLT3 neg
Pts 150 (20%) 582
Idade(mediana) 15-60 (48.5) 16-60 (40.5)
Sexo F/M 86/64 290/292
G.B.(mediana) 10.1-410 (126.0) 1.0-170 (28.2)
Blastos (%) 50-100 (85) 12-98 (46)
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1110 12
Oligomerization HeterodimerizationAc AcNLS NLSMB
Falini et al., NEJM 352: 254-266, 2005
NPM1 Kb
MutationsNone (wild type) GATCTCTG....GCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation A (77%) GATCTCTGTCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAGMutation B (13%) GATCTCTGCATGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation C (2%) GATCTCTGCGTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAGMutation D (2%) GATCTCTGCCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAGMutation E (2%) GATCTCTG....GCAGTCTCTTGCCCAAGTCTCTTTAAGAAAATAGMutation F (2%) GATCTCTG....GCAGTCCCTGGAGAAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Pelo menos 40 variantes da mutação NPM já foram identificadas
Exon 12
WB: anti-NPM (376)
86
47
NIH 3T3
NPM wild-type NPM-mutated
NPM MUTANTS LOCALIZE ABERRANTLY IN THE CYTOPLASM
GFPNPMm
GFPNPMwt
C
WT Mutated
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Tratamento: Fatores Prognósticos• Pacientes idosos (>60 anos ? ; >80 anos)• Sanz et al (PETHEMA+GIMEMA)
– Baixo risco: GB<10.000/μl e Plt>40.000/ μl– Alto risco: GB≥10.000/ μ l– Risco intermediário:GB<10.000/ μl e Plt<40.000/ μl
• Persistência do PML/RARα pós-consolidação• Mau prognóstico mas não modificam o tratamento:
CD56+, isoforma S do PML/RARα e mutações do FLT3
• Não são fatores de mau prognóstico: anormalidades citogenéticas adicionais (30%)
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
GIMEMA-AIEOP “AIDA” Trial GIMEMA-AIEOP “AIDA” Trial Risco de recaída de acordo com Risco de recaída de acordo com
monitoramento precoce de RT-PCR após monitoramento precoce de RT-PCR após consolidaçãoconsolidação
11
00 1212 2424 3636 4848MonthsMonths
RT-PCR negativeRT-PCR negative
RT-PCR positiveRT-PCR positive
00
0.20.2
0.40.4
0.60.6
0.80.8
Pro
bab
ility
Pro
bab
ility
p=0.0001p=0.0001
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Sobrevida da LPA em pacientes Sobrevida da LPA em pacientes tratados por recaída hematológica vs tratados por recaída hematológica vs
molecular molecular
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
Molecular
Hematologico
32 20 7 2
94 47 26 14
P = 0.01
Robin Foá – Atibaia 03/2007
Expressões gênicas em LMA: grupos moleculares e resultados
Clear correlation between cytogentic groups and gene expression (Kohlmann, 2003, Genes,Chrom Cancer)
Identification of a HOX signature in sampleswith normal cytogenetics (Debernardi, 2003, Genes, Chrom Cancer)
54 AML pediatric samples with a different signaturethat is associated with outcome (Yagi, 2003, Blood)
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
Objective 1:
Clinical accuracy of the microarray test as compared to
standard leukemia laboratory methods (“gold standard”)
Gold standard Diagnostic
Information
Morphology Cytogenetics Immunophenotyping
FISHCytochemistry PCR
Microarray-based gene expression profile
n = 4000 patients
AmpliChip LeukemiaMILE: Clinical Objectives
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Microarray Innovations in LEukemia
A retrospective and prospective study to compare laboratory standard leukemia tests with a new microarray-based gene expression test
AmpliChip LeukemiaThe “MILE” multi-center pre-
marketing study
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
The MILE study will be conducted in collaboration with the European Leukemia Network plus US participants
European Leukemia Network (WP13)
• Site 1 Montpellier / France• Site 2 Munich / Germany• Site 3 Berlin / Germany• Site 4 Rome / Italy• Site 5 Padua / Italy• Site 6 Salamanca / Spain• Site 7 Cardiff / UK
Principal Investigator: T. Haferlach
US Sites – Memphis, La Jolla
AmpliChip LeukemiaKey hematological centers participating in Phase-I
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Accuracy by cross-validation:
95.65%
- based on 30fold CV- HG-U133 Plus 2.0- 2,647 samples for training
Classification performance of 17 - class algorithm: MDS not included in data set
Class Name N Sensitivity SpecificityC1 mature B-ALL with t(8;14) 18 0.833 1.000C2 Pro-B-ALL with t(11q23)/MLL 101 1.000 0.999C3 c-ALL/Pre-B-ALL with t(9;22) 127 0.934 0.999C4 T-ALL 152 0.974 0.998C5 ALL with t(12;21) 61 0.934 0.997C6 ALL with t(1;19) 44 1.000 1.000
C7 ALL with hyperdiploid karyotype 50 0.853 0.997C8 c-ALL/Pre-B-ALL without t(9;22) 188 0.871 0.991C9 AML with t(8;21) 72 1.000 1.000C10 AML with t(15;17) 72 0.986 0.999C11 AML with inv(16)/t(16;16) 73 1.000 1.000C12 AML with t(11q23)/MLL 82 0.855 0.997
C13AML with normal karyotype + other abnormalities 685 0.962 0.984
C14 AML complex aberrant karyotype 144 0.887 0.997C15 CLL 455 0.996 0.999C16 CML 151 0.984 1.000C18 None of the above 172 0.972 0.994
2647
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
AmpliChip Leukemia TestMILES Stage I data presented at ASH conference 2006
[852] An International Multi-Center Microarray Study for the Molecular Classification of Leukemia Identifies Novel Sub-Groupings in MDS Overlapping with AML.
Session Type: Oral SessionAuthors: Ken I. Mills, Torsten Haferlach, Jesus M. Hernandez, Wolf-Karsten Hofmann, Alexander Kohlmann, Mickey Williams, Lothar Wieczorek
Date/Time: Tuesday, December 12, 2006 - 8:45 AM
Session Info: Simultaneous Session: Myelodysplastic Syndromes: Molecular Biology (8:00 AM-10:00 AM)
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Illumina
Genes
CBFCBF
Subunity(promotes interaction with DNA)
Subunity(direct contact with DNA)
Proteins
CBFCBFAML-1(21q22)
Core Binding Factor
Genes
CBFCBF
Subunity(promotes interaction with DNA)
Core Binding Factor
Subunity(direct contact with DNA)
Proteins
rhd
Runt homology domain (RUNX1)
CBF(16p13)
AML-1(21q22)
CBF-MHY11inv (16)
rhd
CBFCBF
MYH11MYH11
rhd
CBFCBF
rhd ETO
CBFCBF
AML1-ETOt(8;21)
Wild type
Core Binding Factor Translocationsin AML
5-12% AML8 t(8;21) 21
LEUCEMIAS MIELÓIDES AGUDAS – 912 casos analisados LEUCEMIAS MIELÓIDES AGUDAS – 912 casos analisados MDS – 59 casos / BIFENOTÍPICAS – 10 casos no HIAEMDS – 59 casos / BIFENOTÍPICAS – 10 casos no HIAE
5.139 CASOS DE DOENÇAS ONCOHEMATOLÓGICAS (Novembro 1991 a Julho 2006)(Novembro 1991 a Julho 2006)
LMA M0 65LMA M1 154LMA M2 135LMA M3 120LMA M4 149LMA M5 61LMA M6 17LMA M7 16LMA (com expressão aberrrante) 47LMA Indiferenciada 4LMA 144TOTAL (17,7%) 912LEUCEMIA (Bifenotípica) (0,19%) 10MIELODISPLASIA (1,15%) 59
OBRIGADA PELA ATENÇÃO !
Nydia
Grupo de Citometria de Fluxo do Laboratório Clínico HIAE - 2007
Ana Claudia Miranda BritoAlexandra CavalcanteSonia Tsukasa NozawaRuth Hissae Kanayama
I II III IV
Monoblasto Promonócito Monócito Macrófago
CD34CD34CD117CD117HLA-DRHLA-DR
CD117CD117HLA-DRHLA-DR
CD11b CD11b CD15+fracoCD15+fracoCD14 CD14
CD11bCD11b
CD14CD14
CD34/CD117/CD45/CD13.33
CD14/CD33/CD45/CD34
Diferenciação Monocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais
CD13+forteCD13+forteCD33+forteCD33+forte
CD13+forteCD13+forteCD33+forteCD33+forte
CD13+CD13+CD33+CD33+
CD11bCD11bCD15CD15CD14CD14
CD13+forteCD13+forteCD33+forteCD33+forte
HLA-DRHLA-DR HLA-DRHLA-DR
Dra. Silvia – Florianópolis Santa Catarina