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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LIPOSSOMAS CONVENCIONAIS E SÍTIO-ESPECÍFICOS (LECTINA-CONJUGADA)
CONTENDO ANTINEOPLÁSICOS
HERCILIA MARIA LINS ROLIM SANTOS
Recife, PE 2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LIPOSSOMAS CONVENCIONAIS E SÍTIO-ESPECÍFICOS (LECTINA-CONJUGADA)
CONTENDO ANTINEOPLÁSICOS
Tese apresentada ao Doutorado em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Doutora em Ciências Biológicas na área de Biotecnologia.
Doutoranda: HERCILIA MARIA LINS ROLIM SANTOS Orientação: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães. Co-orientação: Profa. Dra. Rosa Maria Souto Maior.
Recife, PE 2005
LIPOSSOMAS CONVENCIONAIS E SÍTIO-ESPECÍFICOS (LECTINA-
CONJUGADA) CONTENDO ANTINEOPLÁSICOS
HERCÍLIA MARIA LINS ROLIM SANTOS
BANCA EXAMINADORA
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Agradecimentos
À Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães pela orientação científica, confiança
durante o desenvolvimento deste trabalho e pela oportunidade ímpar que me foi concedida
para desenvolver um trabalho em nanotecnologia de medicamentos antineoplásicos.
À Profa. Dra. Rosa Maria Souto Maior (Departamento de Química Fundamental/
UFPE) pela sua atenção e co-orientação científica durante o desenvolvimento deste trabalho.
À Profa. Dra. Silene Carneiro do Nascimento pela orientação durante os testes de
citotoxicidade, pela paciência e disponibilidade para a discussão dos resultados.
Ao Prof. Dr. Paulo Henrique Menezes (Laboratório de Orgânica Aplicada – DQF/
UFPE) pela utilização das intalações do laboratório para que a síntese do fosfolipídeo pudesse
continuar durante a ausência da Profa. Dra. Rosa Mª Souto Maior.
Ao Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito (Departamento de Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte) pelo estágio proporcionado
em seu laboratório na tentativa de solubilizar o ácido úsnico, pela sua atenção e bom humor
sempre.
Ao Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Jr., responsável pelo Laboratório de
Bioquímica, onde grande parte deste projeto foi desenvolvida.
Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho (Diretor do Laboratório de Imunopatologia
Keiso-Asami – LIKA), por permitir o desenvolvimento deste projeto utilizando as instalações
do LIKA.
À Profa. Dra. Luana Cassandra Breintenbach Barroso Coelho, pela atenção e
entusiasmo durante o estudo de caracterização parcial da lectina de sementes de Parkia
pendula por espectroscopia de fluorescência, trabalho este realizado durante o período de tese,
mas que não consta nestes manuscritos. Ao Prof. Dr. Celso Pinto de Melo (Departamento de
Física/ UFPE) por viablizar a caracterização parcial da referida lectina através da técnica
mencionada e ao doutorando César Augusto Souza Andrade pelo auxílio durante as medidas
de fluorescência efetuadas em espectrofluorímetro.
À Mariane Cajubá de Britto Lyra, bolsista de Iniciação Científica – CNPq (LIKA/
UFPE), pela sua dedicação durante os experimentos, amizade e bom humor. Trabalhar com
você não foi apenas sorte, mas uma benção.
À Fernando Brederodes de Queiroz, bolsista de Iniciação Científica - CNPq
(Departamento de Química Fundamental/ UFPE), pela sua valiosa contribuição e assistência
na modificação do fosfolipídeo. Agradeço por apresentar este trabalho, promovendo-o com o
título de 1° lugar na categoria “Tecnologia de Medicamentos” durante o X Encontro
Científico dos Estudantes de Farmácia.
À Dra. Noêmia Pereira da Silva Santos, pelo auxílio nas medidas utilizando Sistema
HPLC e ao Depto. de Antibióticos por permitir a utilização do referido sistema.
Aos meus colegas do Grupo de Sistemas de Liberação Controlada e Vacinas (SLC):
Jaqueline Rodrigues, Simone Santos, João Paulo Neto, Taciana Estanislau, Robson Amaro,
Dayse Vasconcelos, Agenor Jácome Jr., Henrique Marques, Marigilson Siqueira, Mozart
Néris e os estagiários: Ruben Correia Filho e Paulo Menezes Filho. Em especial, a Marcela
Outtes, Mariane C. Lyra, Milena Ferraz, Noêmia Santos, Lúcio Pimentel, Roseane Ribeiro,
Rosângela Vidal, Marcília Costa e Ana Catarina Siminetti. A agradável e descontraída
companhia de vocês tornou este trabalho ainda mais gratificante.
Aos colegas do Laboratório de Bioquímica: Luciana da Mata, Givanildo e Luciana,
Ana Helena, Diego, Marina, Jaqueline; em especial a Ian Porto pela disponibilidade.
A todos os colegas e pesquisadores do LIKA, por proporcionarem um ambiente de
trabalho de muita amizade e respeito. Em especial, a Profa. Dra. Danyelly Bruneska G.
Martins, Prof. Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão e Profa. Dra. Ana Maria dos Anjos
Carneiro Leão.
À Maria do Desterro Rodrigues, técnica do Setor de Cultura de Células do
Departamento de Antibióticos/ UFPE, pela assistência durante os experimentos com células,
pelos contos bem humorados que transformaram as várias horas de testes em momentos
descontraídos.
Aos técnicos da Central de Análises do DQF/UFPE, pela atenção e análise dos
produtos de síntese DPPE-MBS e Con A-SATA em RMN H1 e infravermelho.
Aos funcionários do LIKA e do Departamento de Antibióticos que através de suas
atividades tornaram muito mais fácil o desenvolvimento deste trabalho. Meus sinceros
agradecimentos.
Às secretárias do Doutorado em Ciências Biológicas, Adenilda, Liane e Jacilene, pela
atenção e apoio nos momentos necessários.
Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães pela colaboração na leitura das placas pelo
método do MTT.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)/
Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT), Rede de Nanotecnologia e Banco do Nordeste do
Brasil (BNB) pelo suporte financeiro e tecnológico.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS i
LISTA DE TABELAS iii
LISTA DE ABREVIATURAS iv
RESUMO v
ABSTRACT vii
INTRODUÇÃO 01
1. Câncer 01
1.1. Terapia do câncer 03
1.2. Doxorrubicina 05
2. Liquens e Compostos liquênicos 07
2.1. Ácido úsnico 08
3. Tecnologia de lipossomas 11
4. Proteínas 18
4.1. Estrutura protéica 18
4.2. Lectinas 19
4.2.1. Lectina Concanavalina A 21
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO I – Lipossomas lectina-conjugada: Técnicas de conjugação, aplicações e implicações farmacêuticas.
23
34
CAPÍTULO II – Cytotoxicity of doxorubicin-loaded Con A-liposomes 67
CAPÍTULO III – Caracterização físico-química e avaliação da citotoxicidade de ácido úsnico encapsulado em lipossomas em células HEp-2 e NCI-H292.
93
CONCLUSÕES 118
ANEXOS 120
i
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO Figura 1: Representação esquemática do processo de metástase 02
Figura 2: Estrutura da Doxorrubicina exibindo as porções amino açúcar e aglicona
05
Figura 3: Estrutura do ácido úsnico 09
Figura 4: Adaptação de uma representação esquemática da estrutura de lipossomas convencionais
11
Figura 5: Representação esquemática do tamanho de lipossomas 12
Figura 6: Lipossomas Stealth contendo Doxorrubicina 14
Figura 7: Estrutura da Con A (tetrâmero) apresentando sítios de ligação para íons e sítios de ligação a carboidratos
22
CAPÍTULO I Figura 1: Agente de ativação N-hidroxissuccinimida (NHS). 60
Figura 2: Reação de acoplamento entre um fosfolipídeo (PE-NH2) e o SPDP para obtenção do derivado fosfolipídico PDP-PE.
61
Figura 3: Reação de acoplamento entre um fosfolipídeo e o SMPB para obtenção do derivado fosfolipídico MPB-PE.
62
Figura 4: Reação de acoplamento entre um fosfolipídeo e o MBS para obtenção do derivado fosfolipídico PE-MBS.
63
Figura 5: Incorporação de um grupamento tiol em uma proteína através da reação com o SPDP. DTT promove a redução da ponte ditiopiridina para obtenção da proteína tiolada.
64
Figure 6: Incorporação de um grupamento tiol em uma molécula proteína através da reação com o SATA. A hidroxilamina é utilizada para reduzir o grupo acetato para obtenção de uma proteína tiolada.
65
Figura 7: Reação de complexação entre proteínas e derivados de ácidos graxos: anidridos, cloretos de acila e ésteres ativados.
66
CAPÍTULO II
Figure 1: 1HMNR spectrum of DPPE-MBS derivative obtained at 300 MHz in CDCl3. (Inset: Chemical structure of DPPE-MBS with attribution of signals in ppm in the spectrum).
87
Figure 2: Elution profile of Con A-SATA product (first peak) and unreacted Con A (second peak) on sephadex G 50 columm.
88
Figure 3: Elution profile of separation of DOX-loaded Con A-liposomes (A) from unreacted DOX-loaded liposomes (B) on sepharose 4 B.
89
Figure 4: Cytotoxicity of DOX-loaded Con A-liposomes (�) on NCI-H292 (a) and HEp-2 (b) cells after 72 h of treatment in comparison with free DOX in
90
ii
solution (�). Unloaded Con A-liposomes (�) were used as control.
CAPÍTULO III
Figura 1: Perfil de cinética de liberação de AU (1,5 mg/ml) encapsulado em lipossomas (42 µmol/ 10µl) em solução tampão fosfato salino a 37 °C.
113
Figura 2: Citotoxicidade de AU lipossomal (1,5 mg/ml) em células: a). HEp-2 e b). NCI-H292 em comparação com AU livre em meio MEM. Formulações sem AU foram usadas como controle.
114
iii
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO II Table 1: Cytotoxicity of doxorubicin encapsulated into conventional, pegylated and targeted-liposomal formulations on diferent cell lines.
92
CAPÍTULO III Tabela 1: Formulação de lipossomas. 116
Tabela 2: Avaliação da estabilidade acelerada e a longo prazo das formulações contendo ácido úsnico.
117
iv
LISTA DE ABREVIATURAS
PC – Fosfatidilcolina de soja
CH – Colesterol
SA – Estearilamina
PA – Ácido fosfatídico
AU – Ácido úsnico
DOX – Doxorrubicina
HPLC – Cromatografia líquida de alta pressão (High performance liquid chromatography)
MTT – Brometo de 3-(4,5- dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio
MEM – Meio essencial mínimo (Minimum Essential Medium)
HEp-2 – Células de carcinoma epidermóide de laringe
NCI-H292 – Células de carcinoma de pulmão
SPDP - Propionato de N-succinimidila-3-(2-piridioditio)
SMPB - Butirato de N-succinimidila-4-(p-fenilmaleimido)
SATA – N-succinimidila-S-acetiltioacetato
SAMSA – Anidrido de S-acetilmercaptosuccínico
MBS – Maleimidobenzoila-N-hidroxisuccinimida
DPPC - DL-α-dipalmitoilfosfatidilcolina
DPPE – DL-α-dipalmitoilfosfatidiletanolamina
PDP-PE – Propionato de N-[3-(2-piridioditio)] fosfatidiletanolamina
MPB-PE – Butirato de N-[4-(p-maleimidofenil)] fosfatidiletanolamina
DPPE-MBS – Dipalmitoilfosfatidiletanolamina-maleimidobenzoila-N-hidroxisuccinimida
Via i.m. - Via intramuscular
Via i.v - Via intravenosa
Con A – lectina Concanavalina A obtida de Canavalia ensiformis
WGA – Wheat germ agglutinin (lectina de germem de trigo)
SUV – Vesículas unilamelares pequenas (Small Unillamelar vesicle)
LUV - Vesículas unilamelares (Unillamelar Vesicle)
MLV - Vesículas multilamelares (Multillamelar Vesicle)
SRE – Sistema retículoendotelial
SFM – Sistema fagocítico mononuclear
v
RESUMO
Lipossomas são vesículas aquosas formadas por bicamadas de fosfolipídios e
constituem excelentesformas farmacêuticas de liberação controlada de fármacos devido à sua
flexibilidade estrutural em termos de tamanho, composição, fluidez da bicamada lipídica e
capacidade para incorporar tanto compostos hidrofílicos quanto lipofílicos. As lectinas,
proteínas de reconhecimento a carboidratos com capacidade para ligar-se a glicoconjugados
de membranas biológicas, podem ser utilizadas como moléculas sinalizadoras na superfície de
lipossomas tornando-os sítio-específicos (lipossomas lectina-conjugada). O objetivo desta tese
foi desenvolver lipossomas lectina-conjugada e lipossomas convencionais para o
direcionamento de fármacos anticancerígenos à células antitumorais. A doxorrubicina (DOX)
e o ácido úsnico (AU), um antitumoral de origem liquênica, foram utilizados como fármacos
modelos a serem nanoencapsulados em lipossomas. A lectina Concanavalina A (Con A) foi
conjugada a lipossomas contendo DOX (Con A-lipossomas) para liberação sítio-específica do
fármaco. Adicionalmente, o AU foi encapsulado em lipossomas convencionais. Con A-
lipossomas foram preparados por incubação da lectina modificada (SATA-Con A) com DOX-
lipossomas (DPPE-MBS lipossomas) previamente preparados. A atividade biológica da
lectina foi monitorada antes e após conjugação aos lipossomas por ensaio de hemaglutinação.
Lipossomas contendo AU foram preparados pelo método de hidratação do filme lipídico
seguido de sonicação. As propriedades físico-químicas e a estabilidade dos lipossomas foram
avaliadas. A citotoxicidade de DOX encapsulada em Con A-lipossomas e do AU lipossomal
foi avaliada em termos de inibição da proliferação celular em linhagens humanas NCI-H292 e
HEp-2 utilizando o método do MTT. A citotoxicidade dos fármacos encapsulados foi
comparada com aquela dos fármacos nas suas formas livres em solução. Lipossomas sítio-
específicos contendo DOX (1 mg/ml), com superfície modificada pela Con A, foram obtidos
vi
com tamanho de partículas de 172,6 ± 12,7 nm e com atividade hemaglutinante parcialmente
preservada. A encapsulação de DOX em Con A-lipossomas promoveu uma inibição de
aproximadamente 70% da proliferação das células HEp-2 nas concentrações testadas (0,63-5
µg/ml). Uma inibição de 50% da proliferação das células NCI-H292 foi observada para a
concentração de 1,25 µg/ml (CI50), enquanto que a DOX livre apresentou uma CI50 de 5
µg/ml. DOX em solução foi capaz de inibir apenas 20% da proliferação das células HEp-2.
Con A-lipossomas não carregados com fármaco não apresentaram citotoxicidade em nenhuma
das células testadas. Lipossomas (42 µmol/10µl) contendo 1,5 mg/ml de AU foram obtidos e
a formulação mais resistente permaneceu estável por mais de 100 dias em suspensão. A
citotoxicidade do AU livre e encapsulado em células HEp-2 foi de 20 e 5 µg/ml,
respectivamente, e de 20 µg/ml para ambas as formas livre e encapsulada testadas em células
NCI-H292. A encapsulação de DOX em Con A-lipossomas levou a um melhoramento na
penetração do fármaco nas células, e como conseqüência ao aumento da citotoxicidade,
especialmente em células HEp-2. A nanoencapsulação de fármacos anticancerígenos em
lipossomas convencionais ou sítio-específico promove um aumento na eficácia do fármaco
constituindo, portanto, uma forma potencial de administração de tais fármacos.
Palavras-chaves: Sistema de liberação controlada, lipossomas lectina-conjugada,
Concanavalina A, doxorrubicina, ácido úsnico.
vii
ABSTRACT
Liposomes are aqueous vesicles composed by phospholipidic bilayers, they are used as drug
delivery systems due to their structural flexibility in terms of size, composition, fluidity of the
lipid bilayer and capacity of incorporating both hydrophilic and hydrophobic compounds.
Lectins are proteins that recognize carbohydrates and can efficiently bind to glycoconjugates
of biological membranes. They are consequently effective tools for producing site-specific
liposomes (lectin-conjugated liposomes). The aim of this thesis was to develop a novel lectin
conjugated-liposomes and conventional liposomes intended for targeting antineoplastic drugs
to cells. Doxorubicin (DOX) and the usnic acid (UA), an antitumor agent from lichens, have
been chosen as model drugs. Concanavalin A (Con A) was conjugated at the surface of
liposomes (Con A-liposomes) so as to achieve a site-specific delivery of DOX. Furthermore,
UA was encapsulated into conventional liposomes. DOX-loaded Con A-liposomes were
prepared through the incubation of a derivative of the lectin (SATA-Con A) with previously
prepared DOX-loaded liposomes (DPPE-MBS liposomes). The biological activity of the
lectin was monitored before and after conjugation to liposomes by haemmaglutinating assays.
The UA-loaded liposomes were prepared by the hydratation of a thin lipidic film followed by
sonication. The physicochemical properties and stability of liposomes were then evaluated.
The cytotoxicity of DOX-loaded Con A-liposomes and UA-loaded liposomes was evaluated
in terms of the proliferation of human NCI-H292 and HEp-2 cells according to the MTT
method. The cytotoxicity of encapsulated drugs was compared to that of the free drug in
solution. Stable specific-site liposomes loaded with DOX (1 mg/ml) with the surface tailored
by Con A, were obtained. The mean particle size of liposomes was 172.2 ± 12.7 nm and it
was shown that their haemmaglutinating activity was partially preserved. The encapsulation
of DOX into Con A-liposomes caused an inhibition of roughly 70% of the HEp-2 cell
viii
proliferation in the drug concentration ranging from 0.63 to 5 µg/ml. An inhibition of 50% of
NCI-H292 cells was achieved at the concentration of 1.25 µg/ml (IC50), whereas the DOX in
solution presented an IC50 of 5 µg/ml. In contrast, free DOX was barely able to inhibit 20% of
HEp-2 cell proliferation. Unloaded Con A-liposomes did not present cytotoxicity for either
cell lines. Liposomes (42 µmol/10 µl) containing 1.5 mg/ml of UA remained stable over 100
days. The cytotoxicity of free and encapsulated UA in HEp-2 cells was 20 and 5 µg/ml,
respectively, and in NCI-H292 cells was 20 µg/ml for both dosage forms. The encapsulation
of DOX into Con A-liposomes improved the drug penetration into cells, thereby enhancing its
cytotoxicity, especially in HEp-2 cells. The nanoencapsulation of anticancer drugs into
conventional or site-specific liposomes increases the drug efficiency, supplying therefore a
potential dosage form for such drugs.
Key words: Drug delivery system, liposomes lectin-conjugated, Concanavalin A lectin,
doxorubicin, usnic acid
1
INTRODUÇÃO
1.1. Câncer
Câncer é uma palavra singular que abrange uma diversidade de desequilíbrios que
podem acontecer a nível celular. A biologia de divisão, diferenciação e apoptose são similares
em ambas às células normais e cancerosas. A célula cancerosa é definida por duas
propriedades: ela e sua descendência (1) reproduzem-se desobedecendo às complexas regras
de arquitetura e função celular que governam a usual localização e comportamento das células
nos tecidos e (2) invadem e colonizam regiões normalmente destinadas a outras células. É a
combinação dessas duas atividades que faz com que o câncer seja particularmente perigoso.
Se uma célula não mais responde aos meios de controle, ela dará início a um tumor, uma
massa compacta de células anormais continuamente em crescimento, entretanto, desde que as
células neoplásicas permaneçam agregadas formando uma massa única, o tumor é dito ser
benigno. Normalmente, neste estágio, é possível haver cura completa pela remoção cirúrgica
da massa. Um tumor é considerado um câncer apenas se for maligno, isto é, somente se suas
células tiverem adquirido a capacidade de invadir os tecidos adjacentes. Geralmente a
invasividade implica capacidade de desagregação, penetração na corrente sanguínea ou nos
vasos linfáticos e formação de tumores secundários, denominados metástases, em outros
locais do corpo (Kufe et al., 2003; Alberts et al., 2004). As principais características dos
tumores malignos são: crescimento ilimitado, insensível aos mecanismos de controle normais
que limitam o crescimento e divisão celular nos tecidos; tendência invasora das células
cancerosas, que penetram capilares, paredes de veias e canais linfáticos adjacentes; tendência
a propagar-se metastaticamente a regiões remotas do organismo (Figura 1) (esta invasão de
tecidos normais e crescimento entre células normais é o que torna o câncer letal); e
morfologia celular menos diferenciada (Franks & Teich, 1999; Kufe et al., 2003).
2
Figura 1 – Representação esquemática do processo de metástase.
http://www.prostate-cancer-institute.org/prostate-cq...
A superfície das membranas celular exerce importante papel na função “social” de
comportamento das células, sendo estes: comunicação com outras células, movimentos
celulares e migração, aderência a outras células e estruturas, acesso a nutrientes do
microambiente e reconhecimento pelo sistema imune. Alterações da membrana plasmática
nas células malignas podem afetar uma variedade de propriedades que caracteriza seu
crescimento e comportamento. Mudanças nas características bioquímicas de superfícies de
células malignas incluem aparecimento de novos antígenos de superfície, proteoglicanos,
glicolipídeos e mucinas. Uma das características que define alterações nas membranas de
células transformadas é sua aumentada aglutinação por lectinas como aglutininas de germe de
trigo (WGA), fitohemaglutinina (PHA) e concanavalina A (Con A). As lectinas se ligam
especificamente a certos carboidratos de membranas e estas têm sido usadas como sondas
para determinar aglutinibilidade como composição de glicolipídeos e glicoproteínas e a
configuração destas membranas de células normais e transformadas (Kufe et al., 2003).
3
1.1. Terapia do câncer
As neoplasias malignas ocupam o segundo lugar como causa mortis, vindo em seguida
às doenças cardiovasculares (Farnks & Teich, 1999; Korolkovas & França, 2003/2004). 85%
dos pacientes cancerosos têm tumores sólidos e aproximadamente metade destes morrem
como resultado de suas doenças. Uma inabilidade para controlar o crescimento de tumores
primários ou regionais, levam a fatalidade em aproximadamente metade dos pacientes
tratados com terapias localizadas, pois são muitas vezes difíceis de tratar, levando o
tratamento a falência e o retorno do crescimento tumoral. Cânceres de importância particular
são de cérvices, pâncreas, coloretal, cérebro e ovário. Há uma necessidade de
desenvolvimento de terapias mais eficazes para controle local destes tumores de difícil
tratamento, bem como melhorar a eficácia do controle localizado para outros tipos de
cânceres como de mama e próstata (Needham e Dewhirst, 2001).
Há vários tipos de tratamento de câncer na atualidade: cirurgia, que é o método mais
freqüentemente empregado e também o tratamento de escolha para tumores sólidos
localizados, tais como câncer de mama e do cólon uterino; radioterapia, geralmente como
adjuvante da cirurgia e usada logo após esta e também no tratamento de tumores sensíveis a
ela, como seminoma dos testículos, retinoblastoma e carcinoma espinocelular localizado da
nasofaringe; quimioterapia, recurso para tratamento de tumores generalizados, isto é, não-
localizados, tais como leucemia, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin e linfoma de Burkitt e
como adjuvante à cirurgia, e em determinados casos, à radioterapia (Needham & Dewhirst,
2001).
Os agentes antineoplásicos são, em sua maioria, essencialmente fármacos
antiproliferativos, planejados na suposição de que as células cancerosas multiplicam-se
sempre mais rapidamente do que todas as células normais; assim, os agentes antioneoplásicos
devem de algum modo, interferir na mitose celular. Entretanto, as células tumorais não sofrem
4
mitose mais rapidamente do que todas as células normais, por exemplo, as células do sistema
hematopoiético, mucosa oral, folículos capilares e pele dividem-se mais rapidamente do que
as células tumorais. Por isto, os fármacos que atuam destruindo células tumorais deverão
atacar também os tecidos normais, causando toxicidade ao paciente (Kufe et al., 2003;
Korolkovas & França, 2003/2004). Na maioria dos casos, somente uma pequena fração da
dose administrada da droga reage com os sítios de ação, o restante é distribuído aos órgãos
sadios, causando-lhes toxicidades.
Nas últimas décadas tem se dada ênfase ao uso combinado de vários quimioterápicos
em conjuntos ou alternados. Alguns casos têm reduzido tumores, outros apenas aumentam a
toxicidade. A combinação de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona foram
testadas para tratar cânceres. A adição posterior de etoposido a esta combinação de fármacos
para tratamento de linfomas progressivos de células T apresentou resultados desapontadores
como leucocitopenia/ neutropenia de grau IV, necesitando de fator estimulante de colônia,
ocorreram em todos os pacientes, além de outras complicações como cirurgia de emergência
devido perfuração de intestino foram alguns dos relatos após algumas “sessões do tratamento”
(Wohrer et al., 2004).
Os efeitos colaterais associados com a quimioterapia limitam a dose ou as doses
cumulativas que podem ser administradas ao paciente. Entretanto, baixas concentrações do
fármaco podem levar ao desenvolvimento de resistência ao medicamento e consequentemente
reincidência do tumor. A comunidade científica tem buscado alternativas terapêuticas que
aumentem a eficácia e/ou reduzam a toxicidade dos quimioterápicos antitumorais. Uma
abordagem tem dado certo com o uso de carreadores coloidais como lipossomas para alterar a
farmacocinética e a biodistribuição do fármaco. Em geral, a encapsulação de fármacos em
lipossomas resulta em reduções (algumas vezes drásticas) no volume de distribuição e
aumento significante deste fármaco no tumor (Sapra & Allen, 2003).
5
1.2. Doxorrubicina
Doxorrubicina (DOX) é um potente agente ativo antineoplásico da classe
antraquinona isolado de Streptmocyces peucetius var. caesius composto de um amino açucar
(daunosamina) ligado por ponte O-glicosídica a uma aglicona (doxorrubicinona) como
mostrado na figura 2. O fármaco tem sido usado por mais de 20 anos no tratamento de
pacientes com certos tipos de leucemias, linfomas, sarcoma de tecidos moles e tumores
sólidos. É utilizado sozinho ou em combinação com outros fármacos. Infelizmente, o uso
clínico da DOX é limitado por sua toxicidade, tais como cardiotoxicidade dose-relativa
cumulativa, mielossupressão e o desenvolvimento de resistência ao fármaco (Steinherz et al.,
1991; Sridhar et al., 1992).
Figura 2 – Estrutura da Doxorrubicina exibindo as porções amino açúcar e aglicona.
http://www.canmedbotanics.nl/theanine.html
A DOX liga-se ao DNA e inibe sua síntese através de seu efeito sobre a
topoisomerase II (uma DNA girase), cuja atividade está acentuadamente aumentada nas
células em proliferação. A importância da enzima reside no fato de que, durante a replicação
da hélice de DNA, é necessário que ocorra um giro reversível em torno da forquilha de
replicação para impedir que a molécula-filha de DNA se torne irremediavelmente emaranhada
durante a segregação mitótica. O giro em torno do eixo é produzido pela topoisomerase II,
que efetua um corte um ambos os filamentos do DNA e, posteriormente, procede a reunião
das rupturas. A DOX intercala-se no DNA, e seu efeito consiste, basicamente, em estabilizar
6
o complexo DNA-topoisimerasse II após a ruptura dos filamentos, detendo o processo neste
ponto (Rang et al., 2001; Laroche-Clary et al., 2000).
DOX é rapidamente distribuída em tecidos humanos, quando administrada por via i.v
e é acumulada em tecidos irrigados tais como, fígado, pulmão, rim, etc. e especialmente no
coração. Esta cardiotoxicidade pode ser explicada em termos de ligação massiva com o
miocárdio (Korolkovas & França, 2003/2004).
As principais toxicidades associadas a DOX incluem: 1. Mielossupressão
(leucopenia em torno 14° dia de tratamento). 2. Cardiotoxicidade (aguda transitória -
arritmias, tarquicardia sinusal e extracístoles; e o tipo crônico cumulativo, dose-dependente,
que pode ocorrer quando a dose cumulativa se aproxima de 400-500 mg/m2 corpóreo. 3.
Toxicidade gastrointestinal, como estomatite e esofagite podem ocorrer. Náuseas e vômitos
podem ocorrer em 50% dos pacientes e ocasionalmente anorexia e diarréia. 4. Efeitos
dermatológicos (alopecia total, hiperpigmentação do leito ungual, bandas pigmentadas das
unhas e falanges, dermatite por radiação). 5. Reações no local da injeção. O extravasamento
da DOX produz grave necrose tecidual local, celulite, tromflebite, linfagite, entre outros
efeitos (Bulário Eletrônico da ANVISA).
A DOX tem sido conjugada a macromoléculas tais como N-(2-hidroxipropil)
metacrilamida (HPMA), pirano, dextrana, entre outros a fim de reduzir a toxicidade enquanto
mantem a sua eficácia terapêutica. Estes conjugados têm tempo de meia vida relativamente
curtos no plasma. Aumentar este tempo com máxima acumulação no tumor pode ser possível
através da encapsulação de fármacos em carreadores de longa circulação, tais como,
lipossomas ou nanopartículas furtivas. Nanopartículas (sistemas contituídos de rede
polimérica matricial ou vesicular) contendo polímeros de hidrogéis de pequenos tamanhos
têm baixa captação por células do sistema reticuloendotelial (SRE) e estas partículas têm
longo tempo de circulação no sangue e são altamente estáveis no meio biológico (Mitra et al.,
7
2000). A eficácia destas nanopartículas como carreadores da doxorrubicina conjugadas a
dextrana foi determinada por regressão do tumor e aumento do tempo de sobrevivência de
camundongos Balb/C quando comparado a DOX livre. Estes resultados sugerem que a
encapsulação de conjugados com dextrana em nanopartículas, não somente reduzem os
efeitos colaterais, como melhora a eficácia terapêutica no tratamento de tumores sólidos
(Mitra et al., 2001).
Devido às complicações relacionadas às várias formas de apresentação da DOX, é de
suma importância estudar uma forma farmacêutica de encapsulação da DOX que reduza cada
vez mais os efeitos colaterais aos pacientes. Formulações de nanopartículas de
polialquilcianoacrilato (PACA) individual e combinada, contendo DOX, foram testadas em
linhagem de células resistentes (P388). Os resultados mostraram que a associação de dois
fármacos em uma simples formulação de nanopartículas provocou a mais efetiva inibição do
crescimento celular quando comparado a outras combinações de ambos os quimioterápicos.
Isto provavelmente aconteceu devido ao efeito sinérgico obtido pela combinação destes
fármacos nas formulações. Entretanto, nanopartículas de PACA contendo DOX apresentaram
considerável aumento na citotoxidade de DOX para metástases de camundongos, mas
permitiu a superexpressão de resistência multidroga in vitro em muitas linhagens celulares
resistentes (Soma et al., 2000).
2. Liquens e Compostos liquênicos
Liquens são plantas complexas vivendo em relação simbiótica com fungos e algas
(Muller, 2001). Os liquens produzem metabólitos intracelulares e extracelulares, classificados
de acordo com sua localização no talo. Os produtos intracelulares, sintetizados pelas hifas,
são: carboidratos, carotenóides, vitaminas, aminoácidos e proteínas. São freqüentemente
solúveis em água, podendo ser extraídos com água quente. Os metabólitos extracelulares são
8
compostos resultantes de seu metabolismo secundário, depositados na superfície externa do
talo dos liquens como cristais pigmentados (ex. ácido úsnico) ou como secreção amorfa
incolor (ex. atronorina). São classificados em quatro grupos químicos relacionados:
depsídeos, depsidonas, dibenzofuranos e ácidos úsnicos (Culberson, 1972; Abo-Khatwa et al.,
1996). São substâncias altamente lipofílicas, possuem grupos ionizáveis em sua estrutura, isto
é, agem como ácido fraco em solução aquosa. São capazes de formar pontes de hidrogênio e
possuem porções fenólicas em suas estruturas (Abo-Khatwan et al., 1996). A concentração
destes compostos pode variar de 0,1 a 5% em relação ao peso seco do talo liquênico, e em
alguns casos mais do que isto. Estes produtos extracelulares são os responsáveis pela maioria
dos benefícios advindos dos liquens (Nash, 1996; Müller, 2001).
Mais de 630 metabólitos secundários de liquens são conhecidos. A maioria é
produzida unicamente pelos liquens e uma pequena minoria, em torno de 50 a 60, é produzida
por fungos de vida livre e plantas superiores. Os depsídeos, depsidonas, dibenzofuranos e
ácidos úsnicos são derivados fenólicos encontrados exclusivamente em liquens. Os (+)- e (-)
ácidos úsnicos são considerados um dos mais importantes metabólitos liquênicos
biologicamente ativos, podendo representar mais de 5% do talo seco do liquen (Mitchel et al.,
1965; Muller, 2001).
2.1. Ácido úsnico
O ácido úsnico, AU, ([2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3(2h,9bH)-
dibenzeno-furadiona]; C18H16O7), ocorre na natureza em duas formas enantioméricas (+) e (-),
as quais dependem da projeção do grupo metil angular localizado na posição do carbono
quiral 9b. É uma substância opticamente ativa apresentando-se nas formas D e L. Está
presente de forma abundante em diversos gêneros de liquens, filogeneticamente distintos, tais
como Usnea, Cladonia, Cetraria, Ramalina e Parmelia (Venkataramana & Krishna, 1992;
9
Muller, 2001; Cocchietto et al., 2002; Ingólfsdóttir, 2002). O caráter hidrofóbico desta
molécula está relacionado aos grupos cetônicos e um anel furano ligado a dois anéis
aromáticos (Figura 3) que compõe a sua estrutura (Asashina & Shibata, 1954; Cocchietto et
al., 2002).
Figura 3 – Estrutura do ácido úsnico.
www.drugintel.com/drugs/lipokinetix.htm
O AU é produzido pelos liquens visando sua defesa contra herbívoros e larvas de
insetos (Müller, 2001). A presença de agentes poluentes parece estimular sua biossíntese e sua
concentração no talo liquênico está relacionada com a quantidade integral dos agentes tóxicos
aromáticos, podendo ser utilizada como indicador para biomonitoramento ambiental
(Carderelli et al., 1997; Muller, 2001).
Apesar de sua aplicação clínica ainda estar limitada pela sua ação tóxica e pouca
solubilidade em água e em solventes orgânicos (Correché et al. 1998; Erba et al. 1998), o AU
apresenta diferentes propriedades biológicas tais como: ação antimicrobiana, antiviral,
antiproliferativa, antitumoral, antiinflamatória, analgésica, antipirética (Abo-Khatwa et al.,
1996; Vijiyakumar et al., 2000; Muller, 2001; Cocchietto et al., 2002; Ingólfsdóttir, 2002).
Estudos antigos sugeriram que alguns ácidos liquênicos interferem na energia do
metabolismo (Johnson et al., 1950). O AU pode ser um desacoplador da cadeia respiratória.
Este produziu efeito oxidativo em mitocôndria de fígado de camundongo em vários estágios
da cadeia respiratória e na fosforilação oxidativa in vitro detectados por medidas
polarográficas. Os ácidos liquênicos exibem características do 2,4 dinitrofenol (DNP), um
clássico desacoplador da fosforilação oxidativa (Abo-Khatwa et al., 1996). O AU também já
10
foi usado como constituinte ativo de suplementos alimentares para redução de peso, o
Lipokinetix® (Syntrax), com o objetivo de romper os processos metabólicos normais das
células e provocar redução de gordura, contudo, os estudos in vitro recentes demonstraram
que este produto é hepatotóxico, mas, a adição de antioxidantes como a vitamina E protegeu
as células hepáticas da oxidação atribuída ao AU em cultura de hepatócitos (Han et al., 2004).
A ação antiproliferativa do AU já despertou interesse na terapia do câncer (Al-
Bekairi et al., 1991; Kumar et al., 1999). Estudos preliminares da atividade antitumoral do
AU da espécie Cladonia sobre o carcinoma de pulmão de Lewis em camundongos
evidenciaram que a sobrevida dos animais aumentou entre 35-52 % sobre o grupo controle
não tratado (Kupchan e Kopperman, 1975). A síntese de novos derivados de ácido úsnico
provou que modificações estruturais realizadas na molécula de AU não promoveram
alterações em sua ação antimicrobiana, contudo produziram um aumento da citotoxidade,
inibindo completamente o crescimento de linfócitos de fígado de ratos em cultura (Correché
et al., 1998).
Lodetti et al. (2000) narraram que nos estudos de ação citotóxica do AU como
componente de uma formulação oral contra cárie testada em cultura de queratinócitos
gengival, fibroblastos e células de carcinoma de boca (células KB), não foram encontrados
sinais de citotoxicidade, utilizando os métodos colorimétricos do MTT e do vermelho neutro.
O AU foi testado contra o bacilo da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) e os
resultados comparados com fármacos antimicrobianos atualmente utilizados para o combate
da tuberculose (rifampicina, estreptomicina e isoniazida). Os resultados demonstraram que a
potência do AU foi considerada mais baixa do que os antibióticos, isto pode ser decorrente de
interferências nos diferentes métodos utilizados para esta determinação (Marshak & Kuscher,
1950; Ingólfsdóttir et al., 1998).
11
3. Tecnologia de lipossomas
Os lipossomas podem ser definidos como associações coloidais de lipídeos
anfipáticos (geralmente fosfolipídeos) que se organizam espontaneamente em bicamadas que
contenham um compartimento interno aquoso (Santos e Castanho, 2002).
Lipossomas clássicos, primeiramente descritos por Bangham et al. (1965) são
preparados de fosfolipídeos e colesterol, os quais após hidratação, se auto-associam para
formar uma ou mais bicamadas envolvendo um compartimento aquoso interno (Figura 4).
Figura 4 – Adaptação de uma representação esquemática da estrutura de lipossomas convencionais
http://www.uic.edu/.../bios100/lectf03am/avantilipids.com
Lipossomas convencionais podem ser definidos como lipossomas que são
tipicamente compostos somente de fosfolipídeos neutros e/ ou carregados e/ ou colesterol.
Eles podem variar na suas propriedades físico-químicas, tais como, tamanho, composição
lipídica, carga de superfície, número e fluidez da bicamada fosfolipídica. A Figura 5 mostra a
classificação de lipossomas por número de bicamadas e tamanho mais comumente utilizado:
lipossomas unilamelares pequenos (Small unilamellar vesicles – SUV), com tamanho
12
aproximado entre 20 a 100 nm; lipossomas unilamelares grandes (Large unilamellar vesicles -
LUV) maiores que 100 nm e lipossomas multilamelares (Multilamellar vesicles - MLV) com
diâmetro maior que 0,5 µm (Storm & Crommelin, 1998; Santos & Castanho, 2002).
Figura 5 – Representação esquemática do tamanho de lipossomas
http://www.bytheplanet.com/.../collagenRX/liposome.htm
O uso destes sistemas de liberação de fármacos é viável clinicamente por serem estes
tipicamente feitos de moléculas lipídicas de origem natural, biodegradável, não-tóxica e não-
imunogênica (Meyenburg et al., 2000; Medina et al. 2004).
Lipídeos naturais têm carga neutra ou negativa em pH neutro. Na verdade, lipídeos
com cargas são incorporados a membranas lipossomais para previnir agregação de vesículas e
aumentar o volume aquoso interno entre as lamelas. Octadecilamina, também conhecido
como estearilamina (carga positiva), fosfatidilserina (negativa), fosfatidilglicerol (negativa) e
ácido fosfatídico (carga negativa) são freqüentemente usados como componentes de
membranas lipossomais em torno de 10 a 20 moles % para obter lipossomas carregados. O
colesterol é também utilizado para compor a bicamada lipídica com o intuito de reduzir a
permeabilidade entre os fosfolipídeos, resultando em aumento da rigidez de membrana (Oku,
1991). A influência de constituintes lipídicos com cargas (lipídeos carregados positivamente
ou negativamente) na estabilidade dos lipossomas contendo Penicilina G benzatina resultou
em formulações de mais longa durabilidade quando comparada com lipossomas não
carregados. Os resultados reforçaram o conceito de que a presença de lipídeos carregados
promove um aumento na repulsão eletrostática entre as bicamadas, aumentando a estabilidade
das partículas dispersas (Oliveira-Pontes et al., 1999).
Small unilamellar vesicle (SUV)
Large unilamellar vesicle (LUV)
Multilamellar vesicle (MLV)
13
Fármacos hidrofílicos podem ser encapsulados na fase interna, enquanto fármacos
hidrofóbicos podem se associar na bicamada lipídica. Moléculas anfifílicas como base fraca
e/ou ácido fraco podem ser também incorporados a lipossomas.
Os lipossomas tendem a se acumular no organismo e esta propriedade tem sido
explorada na quimioterapia do câncer, terapia antimicrobiana, vacinas, diagnóstico por
imagem. Os resultados têm indicado claramente que alguns lipossomas que encapsulam
fármacos e vacinas exibem superior propriedades farmacológicas sobre os medicamentos
tradicionais (Srinath & Diwan, 1994).
O crescimento tumoral, bem como regiões de infecção e inflamação, contêm
capilares com permeabilidade alterada como resultado do processo da doença. O diâmetro dos
poros capilares pode alcançar de 100 a 800 nm. Lipossomas SUV contendo fármaco
encapsulado têm diâmetros de aproximadamente 60 a 150 nm que podem passar da corrente
sanguínea para o espaço intersticial tumoral através destes poros. Tecidos normais contêm
capilares com junções compactas que são impermeáveis aos lipossomas e outras partículas do
mesmo diâmetro. Isto favorece o acúmulo de fármaco lipossomal no tecido tumoral em
relação ao normal, sendo então a base da especificidade tumoral aumentada para lipossomas
contendo o fármaco em relação ao fármaco livre (não-lipossomal). Ademais, tumores carentes
de drenagem linfática têm baixo clearance de lipossomas e não conseguem deixar o local do
tumor (Sapra & Allen, 2003).
Mayer et al. (1990), em estudos de atividade antitumoral com vincristina
encapsulada em lipossomas observaram uma redução da toxicidade e aumento da atividade
antitumoral quando comparado a vincristina livre, sugerindo vantagens terapêuticas da
vincristina lipossomal em aplicações clínicas. Preparações lipossomais de antineoplásicos
como doxorrubicina (Doxil® / Caelix® e Myocet®) e daunorrubicina (Daunosome®) estão
14
sendo clinicamente utilizadas e muitas outras estão em estudos clínicos (Woodle & Storm,
1998; Allen, 2000).
DOX lipossomal (Doxil®) combinado a ciclofosfamida em tumores sólidos
apresentaram perfil de toxicidade significantemente diferente da DOX livre combinada a
ciclofosfamida, mas a toxicidade desta associação incluiu síndrome palmo-plantar, estomatite
e neutropenia (El-Rayes et al., 2005).
Avanços no campo dos sistemas de liberação lipossomais têm sido alcançados com o
desenvolvimento de lipossomas Stealth® ou seja, lipossomas furtivos(Figura 6). Estes contêm
na sua superfície carboidratos hidrofílicos ou polímeros como polietilenoglicol (PEG),
utilizados para evadir do reconhecimento pelo sistema fagocítico mononuclear (SMF). A
inclusão de PEG ou outros polímeros hidrofílicos extende o tempo de meia-vida das vesículas
de alguns minutos (lipossomas clássicos) para várias horas (lipossomas Stealth®) e mudam a
farmacocinética dos lipossomas de dose-dependente para dose-independente, como revisado
em Sapra & Allen, 2003.
PEG
Doxorrubicina
Figura 6: Lipossomas Stealth contendo Doxorrubicina http://www.especi.fr/esp/CONF/2004/C04_01/conf01_2004.htm
A DOX encapsulada em lipossomas peguilados (Caelix®), foi testada juntamente
com a vincristina, ciclofosfamida e prednisona em pacientes idosos com linfoma de células B
de larga difusão, mais comumente denominada de linfomas não-Hodgkin agressivos. Este
15
esquema de tratamento reduziu a cardiotoxidade, mas a toxicidade específica do Caelix®
como eritrodesestesia palmo-plantar, estomatite e mucosite permaneceram presentes. DOX
lipossomal produziu toxicidade hematológica similar à causada por DOX livre (Martino et al.,
2002).
Estudos clínicos utilizando o Caelix® versus antimicina C mais vimblastina para
tratar câncer de mama refratário aos fármacos da classe dos taxanos mostraram que a DOX
lipossomal pequilada teve eficácia comparável ao regime de drogas comumente usadas em
pacientes com metástases de câncer de mama refratária aos taxanos, representando desse
modo uma opção terapêutica com menos efeitos colaterais (Keller et al., 2004). DOX
lipossomal pequilada também foi usada em pacientes com HIV para tratamento do sarcoma de
Kaposi e apresentou, após 48 semanas, melhor resposta junto com a terapia antiretroviral do
que a terapia antiretroviral sozinha (Martin-Carbonero et al., 2004).
Muitas pesquisas no sentido de aumentar a especificidade de interações fármaco
lipossomal com células alvo e aumentar a quantidade de princípio ativo liberado nestas
células, tem gerado o desenvolvimento de lipossomas sítio-específicos. Muitos trabalhos vêm
mostrando que frações alvo podem ser incluídas nestas vesículas tornando-as mais seletivas,
essencialmente, alguma molécula que seletivamente reconheça e ligue-se a antígenos ou
receptores superexpressos ou seletivamente expressos nas células tumorais como por
exemplo, anticorpos ou fragmentos destes, moléculas de baixo peso molecular, peptídeos,
carboidratos, glicoproteínas, entre elas as lectinas ou ainda ligantes receptores que possam ser
conjugados a superfície das mesmas.
Imunolipossomas são lipossomas com anticorpos específicos ou fragmentos de
anticorpos (Fab’ ou simplesmente uma cadeia do anticorpo) inseridos na superfície dos
mesmos para reconhecer sítios alvo. Embora os imunolipossomas tenham sido investigados
16
para várias aplicações terapêuticas, o foco primário tem sido a vetorização de agentes
antineoplásicos (Storm & Crommelin, 1998).
Lipossomas furtivos encapsulando DOX ligados a Anisamida, uma molécula que
possui alta afinidade por receptores sigma superexpressos em alguns cânceres, como câncer
de próstata humano, foram usados para atinjir especialmente células de câncer de próstata. Os
resultados mostraram que a DOX lipossomal conjugada a Anisamida foi mais tóxica para
células cancerosas DU-145 do que a DOX lipossomal não-conjugada. A administração i.v.
aumentou o acúmulo do princípio ativo no tumor e inibiu o crescimento do mesmo em
camundongos nude, esta ação ocorreu com um mínimo de toxicidade. Por outro lado, a DOX
livre foi efetiva, mais muito tóxica (Banerjee et al., 2004).
Marty et al. (2002) usou lipossomas conjugados com fragmentos de anticorpos para
o domínio ED-B da proteína β-fibronectina que se expressa ao redor do tumor para formar
vasos sanguíneos nas proximidades de alguns tipos de tumores. A análise quantitativa revelou
uma redução de células tumorais e excesso de deposição de fibronectina na matriz
extracelular após tratamento com imunolipossomas.
Uma outra vantagem dos imunolipossomas é a adição ou sinergismo entre os
anticorpos sinalizados presentes na superfície dos mesmos e o fármaco neles contidos.
Estudos em animais confirmaram esta atividade sinérgica quando os imunolipossomas foram
usados em combinação com quimioterápicos (Slamon et al., 2001; Coiffier et al., 2002; Sapra
& Allen, 2003).
O uso de proteínas como sinalizadoras para lipossomas vem sendo investigado há
vários anos, apresentando diversas técnicas de acoplamento de anticorpos (Blume & Ceve,
1993; Bendas et al., 1999; Park et al., 2002), proteínas ou derivados protéicos (Duncan et al.,
1983; Derksen et al, 1985; Maruyama et al., 1991; Francis et al., 1992).
17
As lectinas por sua capacidade de se ligarem a carboidratos específicos de
membranas celulares são também utilizadas como ferramentas de produção de lipossomas
sítio-específicos (Carpenter-Green & Huang, 1983; Francis et al., 1991; 1992). Experimentos
de modificação da aglutinina de germe de trigo (WGA) apresentaram acentuada atividade
para aglutinar eritrócitos e se ligar a células de baço quando comparada a WGA nativa
(Carpenter-Green & Huang, 1983).
Bendas et al, (1997) planejou um sistema modelo baseado em lipossomas para a
simulação de adesão celular induzido por lectinas, onde a Con A foi usada como modelo. Os
lipossomas deste modelo foram capazes de simular a adesão mediada por lectina a células em
fluxo contínuo e uma vez feita à adesão, os lipossomas ligaram-se irreversivelmente às
membranas celulares.
Lipossomas contendo uma cobertura de Con A, denominados pelo autor de
“lipossomas lectinizados”, foram testados in vitro contra bacilos gram-negativos
(Streptococcus mutans) presentes em bolsa periodontal e apresentaram aproximadamente
100% de inibição do crescimento bacteriano. Os efeitos foram comparados com lipossomas
convencionais contendo metronidazol e o antimicrobiano livre nas mesmas doses. Os
resultados sugeriram que lipossomas lectinizados foram capazes de manter a afinidade aos
açucares e a especificidade do ligante associado e podem ser usados para reconhecer
glicocálix de filme bacteriano (Vyas et al., 2001).
Vesículas lipossomais mediadas por lectina de germe de trigo (WGA) foram testadas
em cultura de células HeLa e observadas por microscopia de fluorescência e se apresentaram
muito eficientemente ligados às células. A forte ligação entre células HeLa e os lipossomas-
WGA foi quebrada por tripsina ou N-acetilglicosamina, no qual competem com ligação pela
WGA (Liautard, 1985).
18
As lectinas têm sido utilizadas como sistemas modelo pra entendimento de processos
biológicos que ocorrem em uma variedade de seres vivos incluindo processos de metástase,
crescimento e diferenciação celulares, podendo também ser utilizadas em sistemas
carreadores coloidais sítios-específicos (Loris et al., 1998).
4. Proteínas
4.1. Estrutura protéica
Como todas as moléculas poliméricas, as proteínas podem ser descritas em termos de
níveis de organização em estrutura primária, secundária, terciária e quaternária.
A estrutura primária de uma proteína consiste na sequência de aminoácidos da sua
cadeia polipeptídica ou das suas cadeias polipeptícas. Um resíduo de aminoácido está ligado
ao próximo por uma ligação peptídica, e tal ligação se caracteriza pela remoção de uma
molécula de água apartir do grupo carboxila de um aminoácido e do grupo α-amino do outro.
Os outros níveis de organização das proteínas referem-se às formas tridimensionais assumidas
pelas cadeias polipeptídicas como resultado de dobramentos das cadeias protéicas. A estrutura
secundária inclui os dobramentos em forma de α-hélices e folhas β-pregueadas. Estes
ocorrem em proteínas globulares em proporções e combinações variáveis. Algumas proteínas,
como as subunidades da hemoglobina, consistem apenas de α-hélices, outras como a Con A,
possuem uma grande proporção de folhas β e são desprovidas de α-hélices. A estrutura
terciária descreve o dobramento dos elementos estruturais secundários, e especifica a posição
de cada átomo na proteína.
Grande parte das proteínas é constituída por mais de uma cadeia polipeptídica. Essas
subunidades polipeptídicas associam-se com uma geometria específica. O arranjo espacial
dessas subunidades é conhecido como estrutura quaternária da proteína. A região de contato
19
entre as subunidades protéicas parece muito com o interior de uma proteína de uma única
subunidade.
As proteínas removidas do ambiente natural ficam expostas a muitos agentes que
podem danificá-la de forma irreversível. Tais influências devem ser cuidadosamente
controladas no processo de purificação e utilização das proteínas. Dentre outros fatores devem
ser considerados: 1. pH: os materiais biológicos são rotineiramente dissolvidas em soluções-
tampão com valores de pH nos quais os materiais são estáveis. Descuidos com esse aspecto
podem causar a desnaturação (deformação estrutural) e até mesmo a degradação química. 2.
temperatura: a estabilidade térmica das proteínas é muito variada, algumas proteínas são
desnaturadas por temperaturas elevadas ou, em alguns casos, por temperaturas pouco
superiores à do seu ambiente natural (Voet et al., 2004).
4.2. Lectinas
Lectinas são proteínas aglutinantes de células em virtude da especificidade por
carboidratos. São ferramentas amplamente difundidas em aplicações de monitoramento da
expressão de carboidratos nas superfícies celulares, bem como purificação e caracterização de
glicoconjugados (Konozy et al., 2003).
Em geral, as lectinas contêm no máximo dois sítios de fixação para carboidratos por
molécula, no qual podem interagir com mono ou oligossacarídeos. Esta interação é obtida
principalmente por uma rede de pontes de hidrogênio com contribuições adicionais de forças
de Van der Waals e interações hidrofóbicas (Barondes, 1988; Sharon & Lis, 1990; Kennedy et
al., 1995).
As lectinas de plantas leguminosas têm sido mais extensivamente estudadas do que
as de origem animal e de microorganismos (Sharon & Lis, 1990; Yamagushi et al., 1993).
Centenas dessas proteínas têm sido isoladas e investigadas em relação às suas propriedades
20
físico-químicas, estruturais e atividades biológicas para que possam auxiliar em diagnósticos
e terapias.
A verdadeira função fisiológica das lectinas de plantas, tais como a Con A não está
ainda claramente entendida (Peumans & Van Damne, 1995). Os avanços no conhecimento
das glicoproteínas têm sido marcados pela produção biotecnológica de muitas delas em uso
terapêutico, com conseqüências de longo alcance em várias áreas da biologia e medicina
(Sharon & Lis, 1990; Moreira et al., 1991).
Numerosos estudos têm demonstrado que carboidratos servem como determinantes
de mediação molécula-célula e interação célula-célula. Interações lectina-glicoligantes estão
associadas com uma variedade de processos biológicos e o reconhecimento de carboidratos
por lectinas está também envolvido em metástases em cânceres (Voet et al., 2004). Uma das
características que diferencia a membrana plasmática de células transformadas das células
normais é sua capacidade aumentada para aglutinar ou ligar-se a lectinas como a
fitohemaglutinina (PHA), WGA e Con A. A habilidade de lectinas para se ligarem
seletivamente a glicoconjugados tem feito destas moléculas valiosas ferramentas na
caracterização de estruturas normais e anormais de carboidratos em células humanas (Kim e
Varki, 1997; Carvalho et al., 2001). Ligação de lectinas a células de câncer tem sido usada
para distinguir diferentes carcterísticas malignas, incluindo potencial metastático, por
exemplo. A maioria das alterações consiste de mudanças na expressão de oligossacarídeos de
membranas celulares distinguindo alto potencial metastático de baixo potencial metastático
em células de linfoma murino. Esta capacidade foi explorada neste trabalho, que utilizou
lectina conjugada quimicamente a lipossomas para direcionar anticancerígenos a células
tumorais.
21
4.2.1. Lectina Concanavalina A
Con A é o membro mais representativo da classe das lectinas de proteínas de plantas,
extraída da Canavalia ensiformes, no qual foi isolada primeiramente em forma cristalina por
Sumner (1919) apud Kantardjieff et al. (2002).
A Con A geralmente se liga a sacarídeos contendo resíduos �-D-manose ou �-D-
glicose (Kanellopoulos et al., 1996). Existe em soluções nas formas de monômero, dímero
(abaixo de pH 6,5) ou tetrâmero (pH fisiológico), dependendo do pH e condições de
temperatura (Agrawal e Goldstein, 1986). Cada subunidade consiste de 237 resíduos de
aminoácidos e sítios de ligação a metais. A Con A nativa tem 2 sítios ligantes a metais e um
sítio ligante a sacarídeos próximo ao final distal da molécula. O primeiro sítio para metais
(S1) liga-se metais de transição: Ni, Co, Zn, Mn e Cd, enquanto o segundo sítio (S2) liga-se
somente a Ca+2 e Cd. A Con A nativa contém uma mistura de metais de transição para o sítio
S1, enquanto o sítio S2 é ocupado preferencialmente por íons Ca+2 (Figura 7). Íons podem ser
removidos em meio ácido a pH 1,2 e a proteína pode ser reconstituída na presença de Ca+2,
pH 5,2 (Kantardjieff et al., 2002). A ligação a sacarídeos requer a presença de cátions
divalentes (Sumner & Howell, 1936) e ambos sítios ligantes a metais devem ser ocupados
para que ocorra a ligação (Kalb e Levitzki, 1968). O monômero da con A é descrito como um
sanduíche de folhas β antipararelas organizadas como seis folhas β no plano, uma sétima
folha curvada de frente e cinco fitas de folhas β no topo, formando uma estrutura parecida
com um teto sobre as outras duas fitas. Esta arquitetura β sanduíche do monômero da Con A é
essencialmente conservada na família das lectinas de legumes e as estruturas são
superponíveis, independente da especificidade das lectinas. A Con A não apresenta α-hélice
em sua estrutura (Loris et al., 1998; Chatterjee & Mandal, 2005).
22
Figura 7 -Estrutura da Con A (tetrâmero) apresentando sítios de ligação para íons e sítios de ligação a
carboidratos. http://www.cs.steadwards.edu/.../Lectin/STRUCTURE2.html
A proposta deste trabalho foi desenvolver lipossomas convencionais e sítio-
específicos como carreadores antitumorais. A Con A foi conjugada a superfície dos
lipossomas, servindo como molécula sinalizadora e obtenção de lipossomas sítio-dirigíveis
(lipossomas Con A–conjugada). A doxorrubicina e o ácido úsnico foram encapsulados nestes
sistemas e a toxicidade avaliada em linhagens de cânceres humanos, NCI-H292 e HEp-2.
23
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34
CAPÍTULO I
Lipossomas lectina-conjugada: Técnicas de conjugação, aplicações e
implicações farmacêuticas.
Este trabalho será submetido ao “Química Nova - Review”
35
Lipossomas lectina-conjugada: Técnica de conjugação, aplicações e implicações
farmacêuticas.
Lectin-conjugated liposomes: Techniques of conjugation, aplications and
pharmaceutical issues
Hercília M. L. Rolim Santos, Nereide S. Santos Magalhães
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco –
UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária, Recife, 50670-901, Pernambuco,
Brasil.
Rosa M. Souto-Maior*
Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Av.
Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária, Recife, 50670-091, Pernambuco, Brasil.
*E-mail: [email protected]
36
ABSTRACT
The cell surfaces possesses oligosaccharides that oncode biological information. The
biorecognition between carbohydrates expressed on cells have been recognized as an effective
strategy for increasing the therapeutic indices of drugs. The lectins, protein of carbohydrates
reconizing can be used as tool to target drugs when acoupled to liposomes. Liposomes are
aqueous vesicles, formed by phospholipidic bilayers, which are used as drug delivery systems
to the intended site of action in the body, thus enhancing its therapeutic efficacy. This review
summarizes some methods of lectin conjugation onto liposomes and their advantages are
discuted. Some potential problems associated with therapeutic application are described.
Key-words: proteoliposomes, lectin, techniques of conjugation.
37
INTRODUÇÃO
Os sistemas de liberação controlada de medicamentos surgiram como uma
alternativa para solubilizar fármacos que apresentam propriedades tóxicas, fotossensíveis ou
insolúveis para administração na forma livre. Lipossomas são vesículas formadas de
fosfolipídeos que ocorrem naturalmente nas membranas biológicas biodegradáveis1. Tais
sistemas foram estudados no passado e continuam sendo investigados como sistemas
carreadores de fármacos e têm mostrado bons resultados para incorporar fármacos insolúveis,
fotossensíveis e citotóxicos.
Os sistemas lipossomais podem ser usados como excipientes não-tóxicos para a
solubilização de fármacos hidrofóbicos1, além de prolongar a residência do fármaco na
circulação e realçar a captação da vesícula por células alvo. Lipossomas convencionais
(formados apenas por lipídeos) têm mostrado bons resultados em tumores, sendo aprovados
para o tratamento do sarcoma de Kaposi e testados na clínica para o tratamento de outras
neoplasias2.
A primeira proposta de um sistema direcionado de transporte de fármacos data do
início do século XX, quando Paul Ehrlich propôs o modelo que ficou conhecido como “Bala
Mágica de Ehrlich”, onde o fármaco é ligado ao transportador direcionado e idealmente
exibirá a sua atividade farmacológica apenas no tecido alvo, através de um mecanismo de
especificidade como o que acontece entre antígeno e anticorpo. Conseqüentemente, os efeitos
indesejáveis, resultantes da ação do fármaco em outros tecidos seriam diminuídos, enquanto o
aumento da eficiência permitiram o decréscimo da dose administrada. Apesar de atrativos e
por mais simples que possa parecer à proposta de Ehrlich, os avanços obtidos nesta área ainda
não são suficientes para que estes sistemas possam ser considerados sistemas ideais de
liberação de fármacos3.
38
Os oligossacarídeos presentes na superfície celular constituem um potencial sítio de
reconhecimento para interações entre células e drogas ligadas a moléculas de reconhecimento
ou incorporadas a sistemas sítio-específicos, como por exemplo, os lipossomas. A viabilidade
de incorporar uma variedade de moléculas na superfície de lipossomas possibilita uma grande
diversidade de sistemas de liberação controlada sítio-dirigíveis.
Lectinas são glicoproteinas as quais estão envolvidas nos processos de adesão,
diferenciação e reconhecimento a células4. Baseados em suas propriedades biológicas e
fisicoquímicas, as lectinas podem ser usadas como moléculas sinalizadoras na superfície de
lipossomas5 e nanopartículas6. Lipossomas com superfície modificadas pela introdução de
moléculas direcionadoras como peptídeos, anticorpos, proteínas ou lectinas podem ser usadas
para direcionar fármacos a um sítio desejado no organismo. O uso de lipossomas é
particularmente vantajoso quando as reduções dos efeitos tóxicos do fármaco são requeridas7.
O objetivo agora é estudar modelos e novas estratégias utilizando-se de lectinas para se
alcançar sistemas lectinas-conjugadas a lipossomas para alcance de alvos específicos do
organismo.
1. Lectina
Lectinas são proteínas aglutinantes de células em virtude da afinidade específica por
carboidratos e são ferramentas amplamente difundidas em aplicações de monitoramento da
expressão de carboidratos nas superfícies celulares, bem como purificação e caracterização de
glicoconjugados8.
Em geral, as lectinas contêm no máximo dois sítios de fixação para carboidratos por
molécula, os quais podem interagir com mono ou oligossacarídeos. Esta interação é obtida
principalmente por uma rede de pontes de hidrogênio com contribuições adicionais de forças
de Van der Waals e interações hidrofóbicas9-11.
39
As lectinas de plantas leguminosas têm sido mais extensivamente estudadas do que
as de origem animal e de microorganismos10, 12. Centenas dessas proteínas têm sido isoladas e
investigadas em relação às suas propriedades físico-químicas, estruturais e atividades
biológicas para que possam auxiliar em diagnósticos e terapias.
Os carboidratos presentes na superfície celular entre outras funções também
intermediam eventos de ligação célula-célula. Diferenças na distribuição destes carboidratos
na superfície celular podem contribuir para o crescimento descontrolado de tais células. Em
células normais o cresciemento celular cessa quando as células se tocam, um fenômeno
conhecido por inibição por contato, mas as células transformadas não respondem a este
controle e, portanto, formam-se massas tumorais com capacidade invasora, são os tumores
malígnos13. Uma das características que diferencia a membrana plasmática de células
transformadas das células normais é sua capacidade aumentada para aglutinar ou ligar-se a
lectinas como a aglutinina de germe de trigo (WGA), fitohemaglutinina (PHA) e
concanavalina A (Con A). A habilidade de lectinas para se ligarem seletivamente a
glicoconjugados tem feito das lectinas valiosas ferramentas na caracterização de estruturas
normais e anormais de carboidratos em células humanas14-17. Ligação de lectinas a células de
câncer tem sido usada para distinguir diferentes carcterísticas malignas, incluindo potencial
metastático, por exemplo. A maioria das alterações consiste de mudanças na expressão de
oligossacarídeos de membranas celulares distinguindo alto potencial metastático de baixo
potencial metastático em células de linfoma murino.
A especificidade e afinidade das lectinas por glicoconjugados têm permitido muitas
aplicações dessas moléculas em pesquisas biológicas e biomédicas14,15,18,19. Os usos de
lectinas em biologia incluem investigação de estruturas e dinâmica de membranas de células
normais e tumorais, estudos de mutantes de glicosilação de células transformadas e
preparações de polissacarídeos, glicopeptídeos e glicoproteínas para colunas de afinidade.
40
Lectinas de legumes estão disponíveis em vários tipos de associações quaternárias e podem
servir como excelentes sistemas modelos para a investigação de reações de dobramentos e
desdobramentos de associações de proteínas oligoméricas19,20. A Con A é um exemplo
clássico de uma lectina bem caracterizada, extensivamente usada como ferramenta de estudos
biológicos19. Outras lectinas também foram bem caracterizadas, como por exemplo, a lectina
de Lycopersicum esculentum (tomate), específica para N-acetilgalactosamina, que apresenta
características como especificidade relativa para regiões específicas do trato gastrointestinal,
ausência de citotoxicidade e ainda resistência à digestão. Estas particularidades fazem desta
lectina um atrativo para a entrega de drogas por via oral21.
2. Lipossomas
Os lipossomas podem ser definidos como associações coloidais de lipídeos
anfipáticos (geralmente fosfolipídeos) que se organizam espontaneamente em bicamadas que
contenham um compartimento interno aquoso3,22.
Lipossomas clássicos, primeiramente descritos por Alec Bangham et al.23, são
preparados a partir de fosfolipídeos e colesterol, os quais após hidratação, se auto-associam
para formar uma ou mais bicamadas envolvendo um compartimento aquoso interno.
Lipossomas convencionais podem ser definidos como lipossomas que são tipicamente
compostos somente de fosfolipídeos neutros e/ ou carregados e/ ou colesterol. Eles podem
variar nas suas propriedades físico-químicas, tais como, tamanho, composição lipídica, carga
de superfície, número e fluidez da bicamada fosfolipídica. Os lipossomas podem ser
classificados de acordo com o número de bicamadas e o tamanho: lipossomas unilamelares
pequenos (Small unilamellar vesicles – SUV), com tamanho aproximado entre 20 a 100 nm e
apenas uma bicamada; lipossomas unilamelares grandes (Large unilamellar vesicles - LUV)
maiores que 100 nm, contendo uma bicamada lipídica e lipossomas multilamelares
41
(Multilamellar vesicles - MLV) com diâmetro maior que 0,5 µm, contendo várias bicamadas
lipídicas3,24.
O uso destes sistemas de liberação de fármacos é viável clinicamente por serem estes
tipicamente feitos de moléculas lipídicas de origem natural, biodegradável, não-tóxica e não-
imunogênica1,25.
Lipídeos com cargas são incorporados a membranas dos lipossomas para prevenir
agregação de vesículas, obtendo assim maior tempo de durabilidade comparada a lipossomas
neutros. A presença de lipídeos carregados promove um aumento na repulsão eletrostática
entre as bicamadas da superfície dos lipossomas, aumentando a estabilidade das partículas
dispersas. Octadecilamina, também conhecida como estearilamina (carga positiva),
fosfatidilserina (negativa), fosfatidilglicerol (negativa) e ácido fosfatídico (carga negativa) são
freqüentemente usados como componentes de membranas lipossomais em torno de 10 a 20
moles % para fornecer carga. O colesterol é também utilizado para compor a bicamada
lipídica com o intuito de reduzir a permeabilidade entre os fosfolipídeos, resultando em
aumento da rigidez de membrana26. Os fármacos hidrofílicos são encapsulados na fase
interna, enquanto fármacos hidrofóbicos podem se associar na bicamada lipídica27.
Vários métodos de preparação de lipossomas foram desenvolvidos, entretanto, os
mais utilizados para conjugação de lectinas na superfície são: evaporação em fase reversa
(REV, Reverse evaporation vesicles,) e hidratação do filme lipídico seguido de sonicação.
Todos os métodos de preparação de lipossomas envolvem algumas etapas semelhantes que
são:
1. Dissolução dos lipídeos em um solvente orgânico, se o fármaco for lipossolúvel será
incorporado nesta fase da preparação;
2. Evaporação do solvente orgânico;
42
3. Dispersão dos lipídeos secos em uma solução aquosa, se o fármaco for hidrossolúvel
será dissolvido na solução aquosa;
4. Eliminação das substâncias que não foram encapsuladas através de técnicas de
separação, como a filtração em gel, diálise e centrifugação.
Evaporação em fase reversa permite preparar lipossomas LUV com uma grande
cavidade aquosa. Por este procedimento os fosfolipídeos são dissolvidos em um solvente
orgânico, como o éter etílico, éter propílico ou mistura de solventes orgânicos. A fase aquosa
é adicionada à fase orgânica, neste estágio os fosfolipídeos se dirigem para a interface das
duas fases imiscíveis. Após alguns minutos de sonicação forma-se uma emulsão A/O, na qual
os fosfolipídeos se organizam sob a forma de micelas inversas, circulando os compartimentos
aquosos. A eliminação do solvente por evaporação sob pressão reduzida leva a aproximação
dessas micelas inversas, seguida da formação de um gel, nesta etapa, as micelas inversas se
agregam para formar uma estrutura gelificada compacta. Na etapa seguinte, a pressão é
reduzida ainda mais a fim de favorecer a total evaporação dos solventes, promovendo uma
ruptura da fase gel e aproximação das monocamadas para a formação das bicamadas que
compõem os lipossomas. As vesículas assim obtidas são unilamelares. Após esta etapa de
preparação é recomendável remover traços finais dos solventes por diálise ou cromatografia
de coluna28. Esta técnica é utilizada para preparação de lipossomas proteína ou lectina-
conjugada29-32. A vantagem deste método é o volume e a elevada taxa de encapsulação (30-
60%) do fármaco, entretanto, os materiais são expostos a ultrassom e solventes, além das
etapas adicionais de diálise ou de cromatografia33.
A técnica de hidratação do filme lipídico é obtida através de uma solução aquosa
adicionada a um filme fosfolipídico obtido pela evaporação de solventes orgânicos. A
dispersão dos fosfolipídeos é facilitada pela utilização de uma vórtex e pela introdução de
43
pérolas no balão. O filme fosfolipídico, em contato com a solução aquosa, envolve parte dessa
solução até que se descola das paredes do balão para formar espontaneamente as vesículas.
Este método produz lipossomas (MLV) de diferentes tamanhos22,34. Com a finalidade
de reduzir o diâmetro das vesículas obtidas por este procedimento, a suspensão é submetida à
ação de ultra-sons. A sonicação de MLV leva a obtenção de SUV que se caracteriza por
preparações opticamente claras, as quais consistem de microvesículas de bicamadas
lipídicas35. Esta técnica é utilizada para preparação de lipossomas ou lectina-
conjugada5,7,30,36,37. A vantagem do método de hidratação é a sua facilidade e rapidez,
entretanto, as taxas de encapsulação são baixas (9-27%)33.
A utilização de lipídeos carregados na preparação de lipossomas aumenta a distância
entre as bicamadas. Lipídeos carregados positivamente (estearilamina) ou negativamente
(ácido fosfatídico) influenciaram na estabilidade dos lipossomas contendo Penicilina G
benzatina, resultando em formulações de mais longa durabilidade quando comparada com
lipossomas não carregados. Os resultados reforçaram o conceito de que a presença de lipídeos
carregados promove um aumento na repulsão eletrostática entre as bicamadas, aumentando a
estabilidade das partículas dispersas38.
Os lipossomas tendem a se acumular in vivo e esta propriedade tem sido explorada
na quimioterapia do câncer, terapia antimicrobiana, vacinas, diagnóstico por imagem. Os
resultados têm indicado claramente que alguns lipossomas que encapsularam fármacos e
vacinas exibem superior propriedades farmacológicas em relação a formulações
convencionais39. Avanços no campo dos sistemas de liberação lipossomais têm sido
alcançados com o desenvolvimento de lipossomas Stealth®, ou seja, lipossomas furtivos.
Estes contêm na sua superfície carboidratos hidrofílicos ou polímeros como polietilenoglicol
(PEG), utilizados para evadir do reconhecimento do sistema retículoendotelial (SRE),
primariamente células de Kupfer do fígado e macrófagos do baço. A inclusão de PEG ou
44
outros polímeros hidrofílicos aumenta o tempo de meia-vida das vesículas de alguns minutos
(lipossomas clássicos) para várias horas (lipossomas Stealth®) e mudam a farmacocinética
dos lipossomas de dose-dependente para dose-independente40.
Os lipossomas direcionados por moléculas sinalizadoras podem ser divididos em
quatro categorias: lipossomas conjugados a anticorpos ou porções de anticorpos
(imunolipossomas), lipossomas mediados por proteínas ou lectinas (proteolipossomas),
lipossomas conjugados a carboidratos (glicolipídeos, glicoproteínas não-virais e
polissacarídeos) e ainda os lipossomas conjugados a glicoproteínas obtida de vírus, ou seja, os
virossomas41.
3. Métodos de Incorporação de Proteínas a Lipossomas
Historicamente, o primeiro método usado para imobilizar proteínas na superfície de
lipossomas foi adsorção por simples incubação da proteína com lipossomas pré-formados.
Esta metodologia tem alguns pontos negativos: primeiro, a proteína não tem afinidade
específica para a superfície de lipossomas, portanto, a eficácia deste método é baixa; segundo,
a ligação da proteína ao lipossoma através de adsorção não é forte e a proteína pode ser
facilmente retirada da superfície de lipossomas sob condições fisiológicas; e terceiro, a
proximidade da superfície dos lipossomas poderia criar um impedimento estérico para a
ligação das proteínas lipossomais e a molécula alvo42.
Uma variedade de técnicas tem sido desenvolvida para realizar vetorização de
lipossomas a células alvo, no entanto, a pesquisa científica ainda não desenvolveu uma
terapêutica simples e clinicamente viável de vetorização sítio-específica de fármacos na forma
lipossomal. A tecnologia não é sofisticada o bastante, e na ausência de meios mais avançados,
os métodos utilizados para a preparação de lipossomas sítio-específicos são, por enquanto
somente, apropriados para estabelecer o conceito destes sistemas43, mostrando que é viável
continuar os estudos na área de sistemas de liberação controlada lipossomal sítio-específico.
45
Existem 2 métodos de incorporação de proteínas a lipossomas: 1. Conjugação
covalente e 2. Formação de complexos não-covalentes.
3.1 Conjugação Covalente
Este é o método mais freqüentemente usado na preparação de lipossomas proteína-
conjugada, o qual se refere a reações entre um fosfolipídeo, ou um de seus derivados,
incorporado na bicamada dos lipossomas pré-formados com um grupo funcional da protéica.
Alguns reagentes foram criados com o objetivo de promover ligação de proteínas a
lipossomas, entre eles, os derivados do éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). A Figura 1
apresenta o éster NHS. A maioria dos ligantes amino-reativos ou reagentes de modificação
comercialmente disponíveis utilizam ésteres NHS. Reagentes contendo ésteres NHS ou tio-
NHS reagem com grupos nucleófilos com liberação de NHS ou tio-NHS levando o grupo a
formar um produto acilado. Em moléculas protéicas, ésteres reagentes de ligação NHS
associam-se principalmente com α-aminas N-terminal e ε-aminas de cadeias laterais de lisina.
Ésteres NHS são relativamente insolúveis em água e devem ser primeiro dissolvido em
solvente orgânico antes de ser adicionado a soluções aquosas. O NHS é um reagente
bifuncional, uma vez que se presta tanto para ativação de lipídeos, quanto de moléculas
protéicas, ambos contendo grupamento amina. Os derivados do NHS mais utilizados como
agentes de ativação são o butirato de N-succinimidila-4-(p-fenilmaleimido), SMPB;
propionato de N-succinimidila-3-(2-piridioditio), SPDP; maleimidobenzoila-N-
hidroxisucinimida, MBS, e N-succinimidila S-acetiltioacetato (SATA)44.
Modificação de proteínas (peptídeos, anticorpos e lectinas) para conjugação a
lipossomas podem ocorrer através de grupamentos amina. Estes são mais utilizados devido à
sua disponibilidade nas moléculas protéicas. Aminas primárias são abundantes na superfície
hidrofílica de proteínas, sendo a mais reativa a ε-amina da lisina. Grupos sulfidrilas
encontrados nos resíduos cisteínas ou gerados por redução de pontes dissulfetos, podem
46
também ser usados para a conjugação de anticorpos e proteínas, além de grupos funcionais
menos reativos, mas são menos indicados devido à instabilidade dos ligantes resultantes e as
dificuldades encontradas com as reações químicas42. As reações seguintes apresentam as
formas de incorporação de grupos sulfidrila em fosfolipídeos que contenham um grupamento
amino disponível (PE-NH2), por exemplo, fosfatidiletanolamina ou seus derivados. As formas
de conjugação de –SH a proteínas, mais especificamente a lectinas, também serão abordados.
3.1.1 Acoplamento de grupos -SH a fosfolipídeos
a) Reação entre o fosfolipídeo com o SPDP, para obtenção do derivado que possui
uma ligação piridil-dissulfeto reativa, o propionato de N-[3-(2-piridioditio)]
fosfatidiletanolamina, PDP-PE45,46,47. A Figura 2 representa a reação de acoplamento.
b) Reação do PE-NH2 com o SMPB, para obtenção de um derivado que contém um
grupo reativo com os tióis, uma maleimida, butirato de N-[4-(p-maleimidofenil)]
fosfatidiletanolamina, MPB-PE47,47,48. A Figura 3 apresenta a reação de acoplamento.
Os conjugados ou derivados lipídicos são adicionados a mistura lipídica durante a
preparação de lipossomas. Quando a molécula ligante é uma proteína, os conjugados PDP-PE
e MPB-PE são incorporados aos lipossomas em proporções que variam de 1 a 5 mol% dos
lipídeos totais. Para moléculas ligantes pequenas, a proporção pode aumentar para até 25
mol%. A partir deste ponto, as vesículas lipossomais possuirão em suas superfícies funções
químicas susceptíveis de reação com moléculas protéicas, formando ligações tióis em meio
aquoso, sob condições brandas, por exemplo, pH 6,5 em ambiente de argônio que são
compatíveis com lipossomas e não desnaturantes para proteínas. Nos PDP-PE, em presença
de ligantes-SH em excesso, ocorre uma substituição no hetero-ditiol, composto pela 2-
tiopiridina, resultando em conjugação de moléculas protéicas para dar origem a uma nova
ponte dissulfeto em pH neutro, reação esta praticamente irreversível. Esta técnica foi usada
para ligação de anticorpos49. Apesar de bem definido, este método é limitado pela labilidade
47
por redução de uma ligação dissulfeto in vivo, que pode liberar a proteína acoplada aos
lipossomas, desaparecendo a função de molécula sítio-dirigível47,50.
Este método tem sido usado para conjugar outras porções protéicas ou moléculas
com porções frágeis como as lectinas. Os ligantes aderidos à superfície de lipossomas podem
influenciar na estabilidade das vesículas. O fenômeno depende ao mesmo tempo da natureza
do ligante e do número de moléculas conjugadas por unidade de superfície. Por exemplo, uma
conjugação superior a 2,5 mol% de MPB-PE a lipossomas, após conjugação com certos
anticorpos, aumenta consideravelmente a fuga de moléculas encapsuladas. Isto se deve ao
procedimento de acoplagem sobre a integridade dos lipossomas. Outras vezes o acoplamento
é acompanhado de fenômenos de agregação51. Um derivado fosfolipídico pode ser também
obtido da reação do maleimidobenzoil-N-hidroxisucinimida (MBS) com o
dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) formando o derivado
dipalmitoilfosfatidiletanolamina-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (DPPE-MBS)
como mostrado na Figura 4. Este composto é muito usado para preparação lipossomais sítio-
dirigíveis, principalmente para a conjugação de lectinas na superfície destes sistemas30,36,52.
3.1.2. Acoplamento de grupos –SH a moléculas protéicas
Para adicionar grupos sulfidrila a moléculas protéicas, os reagentes mais utilizados
são o SPDP e o SATA, que reagem através de sua função éster ativa com as aminas das
proteínas.
a). No método de tiolação de moléculas protéicas pelo SPDP para a obtenção de um
derivado proteína-SPDP. Ao final da reação, uma função –SH é liberada por redução da
ligação piridildissulfeto com ditiotreitol (DTT). O excesso do redutor deve ser retirado por
filtração em gel ou por diálise, esta técnica não deve ser aplicada a moléculas com porções
frágeis, por exemplo, lectinas47. A Figura 5 representa a reação de tiolação.
48
b). Para introduzir funções tióis extrínsecas em proteínas destinadas a se acoplarem a
lipossomas e para evitar a etapa de eliminação do excesso de redutor, o uso do SATA é
indicado29, como mostrado na Figura 6. Esta molécula possui também uma função éster ativo
que reage com grupos aminas das proteínas fornecendo um resíduo tioacetato. A função –SH
é gerada por um excesso de hidroxilamina, liberando o grupo acetato. Existem outros métodos
para tiolação de proteínas como o 2-(S-acetil) mercapto anidrido succínico (SAMSA) ou o 2-
amino-tiolano (reativo de Traut). As condições de modificação das proteínas com o SAMSA
são equivalentes às do SATA, entretanto, requer condições relativamente básicas (pH 9,0) que
não são compatíveis para maioria das proteínas53, principalmente as lectinas. O uso do SATA
oferece várias vantagens sobre SPDP. A mais importante é a eliminação de um agente
redutor, como o ditiotreitol, para desproteger o grupo tiol, pois traços de ditiotreitol interferem
com a reação de acoplamento. A desproteção do SATA é realizada pela hidroxilamina, a qual
promove a redução do grupo acetato para obtenção de um conjugado protéico contendo grupo
sulfidrila. Este método tem uma vantagem sobre SPDP, principalmente no tempo de meia-
vida da sulfidrila livre que é prolongado. Uma outra vantagem do SATA é a formação de um
único produto, enquanto o SAMSA pode formar ligação amida com outra função, uma
carboxila, levando a formação de mais de um produto, dificultando desta forma a
caracterização do produto54.
Duas estratégias para a preparação de lipossomas sítio-específicos diferem
dependendo de quando a proteína será conjugada aos lipossomas. A primeira estratégia
envolve a conjugação de uma proteína a fosfolipídeos antes da formação dos lipossomas. A
proteína-lipídeo conjugada é então adicionada à mistura lipídica que consiste de micelas e
detergente55, como descrito na técnica de REV. A Esta técnica fornece taxa de encapsulação
de 85-90%56, entretanto, quando utilizada para preparar lipossomas proteína-conjugada, não
há controle sobre a orientação das proteínas na monocamada interna ou externa dos
49
lipossomas43. A segunda estratégia envolve o ataque de proteínas ou de lectinas contendo
grupos sulfidrilas a derivados fosfolipídeos presentes na bicamada de lipossomas pré-
formados29. A vantagem do acoplamento de ligantes a lipossomas pré-formados está baseada
no fato de que estes lipossomas apresentam homogênea distribuição de tamanho de partículas,
além do que, os lipossomas pré-formados apresentam excelentes taxas de encapsulação de
agentes terapêuticos57,58.
3.2. Formação de complexos não-covalentes
Na técnica de formação de complexos não-covalentes, as moléculas protéicas são
ligadas quimicamente aos lipídeos através de um ataque nucleofílico da amina das proteínas
aos grupos carbonila das moléculas hidrofóbicas tais como: ácidos graxos, colesterol, ou
fosfolipídeos (Figura 7). Os produtos destas reações são adicionados aos lipídeos que farão
parte da preparação dos lipossomas. Uma vantagem primária deste método de ancoragem
hidrofóbica é a de permitir que vários tipos de ligantes sítios-específicos possam ser
incorporados em uma mesma vesícula, além de evitar a exposição dos lipossomas e de seus
conteúdos às reações químicas. Uma outra vantagem da complexação não-covalente é a
mínima redução da afinidade dos conjugados protéicos acoplados, isto não se repete na
técnica de conjugação covalente, que freqüentemente reduz a afinidade das proteínas
modificadas, como lectinas, anteriormente abordado. Um inconveniente é notado quando se
quer inserir o fosfolipídeo-proteína na bicamada de lipossomas pré-formados, na qual
acontece uma perda inevitável do conteúdo encapsulado nos lipossomas durante a etapa de
inserção dos ligantes hidrofóbicos47. Contudo, testes revelaram que ligações não-covalentes
são estáveis in vitro50 e in vivo59. Estes métodos são aplicados a proteínas não-específicas e
anticorpos monoclonais43. Exemplos destas proteínas incluem a avidina, estreptavidina e a
proteína A do gênero Staphylococcus. Uma outra âncora hidrofóbica foi descrita, esta utiliza
50
N-glutaril fosfatidiletanolamina (N-glu-PE) a partir da reação do ácido glutárico com
fosfatidiletanolamina usando como exemplo a proteína α-quimiotripsina32,60,61.
4. Aplicações de lipossomas lectina-conjugada
A capacidade das lectinas de se ligarem a açucares específicos de superfície de
membranas tem sido utilizada para direcionar fármacos encapsulados em lipossomas. As
lectinas mais extensivamente utilizadas são a aglutinina de germe de trigo, específica para
ácido N-acetilneuramínico31,36,62,63 e a Con A7,30,37,64 a qual têm especificidade para resíduos
os glicose e manose. O método mais moderno de acoplamento de lectina a lipossomas pré-
formados utiliza o conjugado DPPE-MBS incorporado durante a preparação dos lipossomas e
posterior reação com um derivado da lectina tiolada pelo SATA e deacilação5,30,36,52. Embora
outros métodos tenham sido utilizados para o acoplamento de lectina a lipossomas51, a
utilização do DPPE-MBS foi o método que apresentou uma relação linear entre a massa da
lectina por mol de lipídeo lipossomal e mol% de DPPE-MBS em lipossomas30,31. Lipossomas
conjugado a Con A contendo metronidazol foi testado in vitro após preparação a partir do
acoplamento por indução de interação de cargas opostas entre a Con A e os lipídeos da
bicamada, onde o comportamento zwitteriônico da Con A foi explorado37.
Bendas et al.32 planejaram um sistema modelo baseado em lipossomas para a
simulação de adesão celular induzido por lectinas, onde a Con A foi usada como modelo. Os
lipossomas deste modelo foram capazes de simular a adesão mediada por lectina a células em
fluxo contínuo e uma vez feita à adesão, os lipossomas ligaram-se irreversivelmente às
membranas celulares.
Lectinas conjugadas a liposssomas foram utilizadas para entrega de bactericida
contra Streptococcus mutans e S. oralis da cavidade oral como método para melhorar a
higiene bucal5. Con A conjugada a lipossomas tem sido efetiva na entrega de Triclosan, um
bactericida incorporado a biofilmes de bactéria da flora oral7. Lipossomas lectina-conjugada
51
tem sido considerado um potencial sistema de entrega de drogas para controle da placa
dentária e gengivites65,66. Um método de entrega pulmonar de lipossomas lectinizados (130-
170 nm de diâmetro) com as lectinas Con A, WGA e aglutinina de soja, testados em células
alveolar tipo II, células A549 mostrou que, a ligação dos lipossomas conjugados a lectinas às
células foi de 6 a 11 vezes mais eficientes do que para lipossomas não-conjugados. A ligação
não foi afetada pelo surfactante sintético e não apresentou efeito tóxico decorrente da
presença de lectinas livres ou de lipossomas lectinizados. Em incubação com células de
cultura primária do epitélio alveolar, no qual exibe função de barreira, lipossomas-WGA não
somente ligou-se ao epitélio, como também foram captados por estas células67.
Lipossomas lectina-conjugada estão sendo testados in vitro7, outros como os
lipossomas proteína-conjugada, encontra-se em fase de testes em animais68. Contudo, os
imunolipossomas já estão sendo testados em humanos para comprovação da eficácia
terapêutica69.
5. Implicações farmacêuticas de lipossomas proteína-conjugada
A imunogenicidade causada por porções reativas presentes na superfície de
liposomas tem sido um problema. Repetidas administrações de lipossomas conjugados a
anticorpos têm ressaltado a resposta imune contra os anticorpos conjugados, resultando em
significante redução no tempo de permanência dos lipossomas sítio-específicos no sangue70 e
a resposta imune foi dirigida a anticorpos de superfície. Estudos com SPDP e SMPB
apresentaram exacerbada resposta imune, independente da extensão do tamanho dos
conjugados71. Acredita-se que a imunogenicidade também possa ser influenciada por fatores
relacionados aos lipossomas tais como: tamanho da vesícula, carga de superfície ou que possa
estar associada com o agente terapêutico encapsulado72. Tem sido demonstrado que a
eliminação plasmática aumenta depois de repetidas administrações de lipossomas contendo
ovalbumina de superfície. Contudo, quando estes lipossomas encapsulavam o antineoplásico
52
doxorrubicina, não ocorria eliminação deste lipossomas do plasma sanguíneo. Este resultado
foi atribuído à inibição da produção de anticorpos contra a ovoalbumina73. Experimento
similar comprovou que baixas doses de doxorrubicina encapsuladas em lipossomas albumina-
conjugada evitavam a resposta imune contra a proteína de superfície lipossomal. Esta
supressão da resposta imune poderia ser útil para administrações repetidas de
proteolipossomas onde múltiplas doses são requeridas68.
6. Perspectivas
Na era pós-genômica podemos prever uma quimioterapia sob medida para doenças
específicas dos pacientes. Lipossomas sítio-específico poderiam ser produzidos a partir de
ligantes e drogas selecionadas de uma biblioteca baseada em receptor e sensibilidade do
tumor, para a preparação de lipossomas sítio-dirigíveis seletivos para determinado paciente,
possibilidade esta, dada pelo número de ligantes e fármacos que estariam disponíveis.
Entretanto, isto é impraticável para fabricação em escala industrial por técnicas de
acoplamento hoje praticadas. A combinação de métodos que permitam uma variedade de
lipossomas-alvo para ser produzidos por inserção de ligantes em lipossomas pré-formados é
uma estratégia atrativa e justifica o motivo de contínuas investigações41.
No momento, o conhecimento científico a respeito de lectinas conjugadas a
superfície de lipossomas para entrega sítio-específica de fármacos, está baseado nas
modificações de fosfolipídeo e lectina, através de ligantes reativos, e ainda encontra-se em
fase de testes, apesar de sua eficácia como molécula de reconhecimento já ter sido
comprovada. Ao contrário de lipossomas convencionais que já estão bem estabelecidos e
sendo comercializado para tratamento de várias doenças. O desenvolvimento de fármacos
sítio-específicos via lectina depende de como estes conhecimentos adquiridos serão
aprimorados, somando-se a descoberta de novas substâncias para uso terapêutico, além de
melhoramento de fármacos clinicamente já utilizados. No entanto, a criação de agentes
53
ligantes de superfície também pode vir a contribuir para o desenvolvimento na área de
lipossomas lectinizados.
Para que as moléculas sinalizadoras sejam usadas com sucesso na superfície de
lipossomas para a terapia do câncer, por exemplo, estes sistemas devem permanecer por mais
tempo na circulação sanguínea para permitir maior acesso ao sítio tumoral44. Como a
citotoxicidade de lectinas de plantas varia consideravelmente, cuidados concernentes a tais
citotoxicidades e imunogênicidades requerem rigorosos testes antes de sua utilização para
preparação de fármacos sítio-específicos21. Embora os resultados in vitro sejam
encorajadores, principalmente na entrega de bactericidas como potencial sistema de entrega
de drogas para controle da placa dentária e gengivites, a aplicação intravenosa está limitada
pela retenção ao nível de sistema retículo-endotelial.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional para o Desenvolvimento Tecnológico e Científico Brasileiro
pela bolsa de doutoramento à H. M. L. Rolim-Santos. Os autores são gratos também ao
Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT) e Rede Brasileira de Nanobiotecnologia -
Nanobiotec.
54
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59
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Agente de ativação N-hidroxissuccinimida (NHS).
Figura 2: Reação de acoplamento entre um fosfolipídeo e o SPDP para obtenção do derivado
fosfolipídico PDP-PE.
Figura 3: Reação de acoplamento entre um fosfolipídeo e o SMPB para obtenção do derivado
fosfolipídico MPB-PE.
Figura 4: Reação de acoplamento entre o fosfolipídeo e o MBS para obtenção do derivado
fosfolipídico PE-MBS.
Figura 5: Incorporação de um grupamento tiol em uma proteína através de reação com o
SPDP. O DTT promove a redução para obtenção de uma proteína tiolada.
Figura 6: Incorporação de um grupamento tiol em uma molécula protéica, através de reação
com o SATA. A hidroxilamina é utilizada para reduzir o grupo acetato.
Figura 7: Reação de complexação entre proteínas e derivados de ácidos graxos: anidridos,
cloretos de acila ou ésteres ativados.
60
Figura 1
61
Figura 2
62
Figura 3.
63
Figura 4
64
Figura 5
65
Figura 6
66
Figura 7
67
CAPÍTULO II
Cytotoxicity of doxorubicin-loaded Con A-liposomes
Trabalho submetido à revista “Drug Development Research”
68
Cytotoxicity of doxorubicin-loaded Con A-liposomes
1Hercília Maria Lins Rolim Santos, 1Fernando Brederodes de Queiroz, 1Rosa Maria
Souto Maior, 2Silene Carneiro do Nascimento, 3Nereide Stela Santos Magalhães1*
1Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami
(LIKA); 2Departamento de Química Fundamental, Laboratório de Síntese de Novos Materiais
Orgânicos - UFPE; 3Departamento de Antibióticos, Setor de Cultura de Células - UFPE
* Correspondence to:
Dr. Nereide Stela Santos Magalhães
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)
Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária.
50670-901, Recife-PE, Brasil.
Tel: +55-81-2126 8587
Fax: +55-81-2126 8485
E-mail: [email protected]
69
ABSTRACT
The present study investigates the potential of Concanavalin A lectin (Con A)
conjugated to liposomes (Con A-liposomes) for doxorubicin targeting (DOX) to cells. The
physicochemical properties and the cytotoxicity of DOX-loaded Con A-liposomes were
evaluated. DOX-loaded Con A-liposomes were prepared by incubation of DOX-loaded
liposomes with a Con A-SATA derivative. Lectin biological activity was monitored before
and after conjugation by hemagglutinating assay. The cytotoxicity of DOX-loaded Con A-
liposomes was evaluated in terms of the inhibition of lung carcinoma (NCI-H299) and larynx
epidermoid carcinoma (HEp-2) cells proliferation using the MTT method. The affinity of
lectinized liposomes for these cells was thus assessed by evaluating the cytotoxic effect of the
DOX released into cells. Stable DOX-loaded Con A-liposomes were obtained and their high
affinity for cells was corroboracted. Results were compared with the treatment of cells with
free DOX in solution. The encapsulation of DOX into Con A-liposomes promoted an
inhibition of roughly 70% of the HEp-2 cell proliferation and 50% of cell inhibition was
verified on HCI-H292. DOX in solution was able to inhibit only 20% of cell proliferation for
both cell lines. Unloaded Con A-liposomes do not present any cytotoxicity. The encapsulation
of DOX into Con A-liposomes leads to an improvement on the drug penetration into the cells
enhancing thereby its cytotoxicity, especially in HEp-2 cells.
Keywords: Con A-liposomes, doxorubicn, cytotoxicity, lectin, NCI-H292 cells, HEp-2 cells
70
INTRODUCTION
Lectins are carbohydrate-binding glycoproteins, which are involved in cellular
process such as adhesion, differentiation and cell-recognition [Sharon, 1993]. Based on their
physicochemical and biological properties, lectins can be used as signaling molecules at the
surface of liposomes [Jones et al., 1993] and nanoparticles [Rodrigues et al., 2003] intended
to drug targeting.
Liposomes with chemical modified surface provided by the introduction of site-
directing molecules such as peptides, antibodies, proteins or lectins can be used for drug
targeting. Purposes the effectiveness of liposomes in drug delivery is greatest at low drug
concentration, especially in the case where free anticancer drugs are not effective to inhibit
the cell growth in equivalent concentrations. Moreover, the use of liposomes is particularly
advantageous when the reduction of drug toxic effects is required [Jones, 2005].
The potential of liposomal drug carriers based on carbohydrate-mediated recognition
are reported in the literature. One of the most relevant techniques that exploit the
carbohydrate-lectin recognition concept is the coating of the surface of liposomes with lectin
to engineer proteoliposomes, which should retain the specificity and affinity of the
immobilized lectin towards its specific sugar on the cellular surface.
Nowadays, a renewed interest has been established in the study of the conjugation of
proteins to the surface of drug delivery systems as a potential strategy for drug targeting. As a
consequence, the conjugation of antibodies or other proteic ligands to liposomes has long
been proposed for improving cell recognition and site-specific drug delivery. Furthermore,
plant lectins also received attention as a means for targeting drug-loaded liposomes to specific
carbohydrate receptors on biosurfaces [Lehr, 2000, Liautard et al., 1985]. In the last decades,
different antimicrobial agents have been encapsulated into lectin-conjugated liposomes such
as metronidazole, triclosam, vancomycin and benzylpenicilin [Vyas et al., 2001].
71
Different lectinized liposomes have been proposed and theirs specificities were
investigated in vitro on chicken erythrocytes and mouse spleen cells [Carpenter-Green and
Huang, 1983], as HeLa cells [Liautard et al., 1985], and mouse fibroblasts [Bogdanov et al.,
1989). The binding of lectin-mediated liposomes to HeLa cells was evidenced at 1:100 cell-
liposome ratio [Liautard et al., 1985].
Recently, the fifth generation of liposomes was proposed as a combination of stealth
(pegylated) and immunoliposomes formulations for targeting of anticancer agents [Lu et al.,
2004]. More recently, a new pegylated liposomal formulation containing doxorubicin was
offered as tumor-targeted liposomes with the mAb 2C5 antibody as a surface modifier for
improving tumor cell recognition and drug cytotoxicity [Lukyanov et al., 2004].
The antitumor effect of doxorubicin encapsulated into immunoliposomes coated with
monoclonal antibody GA4 was evaluated in colorectal cancer xenografts. A significantly
higher antitumor activity was obtained in terms of the tumor growth inhibition as compared to
free DOX [Hamaguchi et al., 2004].
In this challenger scenario, the aim of the present study is the design and
characterization of a new strategy for using lectin to prepare Con A-conjugated liposomes
containing doxorubicin as a model for targeting anticancer agents. Emphasis was placed on
preserving biological activity of the lectin after its conjugation to liposomes. In order to
ensure the cellular uptake of DOX and improve its cytotoxicity, the specificity of DOX-
loaded Con A-liposomes was evaluated in vitro on NCI-H292 and HEp-2 cells.
72
MATERIALS AND METHODS
Materials
Soybean phosphatydilcholine (PC), cholesterol (CH), stearylamine (SA), DL-α-
phosphatidylethanolamine dipalmitoyl (DPPE), maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide
ester (MBS), S-acetylthioglycolic acid N-hydroxysuccinimide ester (SATA), concanavalin A
(Con A), doxorubicin, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and N,N-dimethylformamide
(DMF) were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA). Others reagents were of
analytical grade and the aqueous solutions were made with double filtered water.
Methods
Phospholipid and lectin derivatization
The phospholipid derivative DDPE-MBS was synthesized according to Francis and
collaborators [1992] to be further linked to Con A. DPPE-MBS was identified by 1HRMN
spectroscopy (Varian Unity Plus) at 300 MHz in deuterated chloroform (CDCl3) using the
software CS ChemiDraw Ultra (Cambridge Soft Co, USA). The phospholipid derivative
was stored in a chloroform/methanol 9:1 v/v solution at 4°C until usage. Con A was
conjugated to SATA using a modified previously reported technique (Francis et al., 1992).
Briefly, 10 µl of a dimethylformamyde solution of SATA (10 mg/50 µl) was added to 2.5 ml
of a 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) of Con A (4mg/ml) containing 1 mM EDTA.
The mixture was submitted to moderate stirring for 20 min. The Con A-SATA derivative was
purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (20 cm x 1.5 cm). 2 ml fractions were
recovered and spectrophotometrically analyzed at 280 nm. The protein content was assessed
by the modified Peterson-Lowry method [Peterson, 1977].
73
Following characterization ConA-SATA derivative (2 ml) was submitted to
deacetylation by hydroxylamine 0.1M (200 µl). The mixture was incubated for 1h at room
temperature under moderated stirring and stored at 4°C until usage.
Preparation of Con A-conjugated liposomes
In a first step, DOX-loaded liposomes were prepared using the lipidic thin-film
formation method followed by sonication [Anselem et al., 1993]. A mixture of soybean
phosphatidylcholine, cholesterol and stearylamine (55:20:10 molar ratio), and DPPE-MBS
(15 mol%) was dissolved in a chloroform/methanol (3:1) mixture. The solvent was then
evaporated to form a thin lipidic film. This film was redispersed with 10 ml of pH 7.4 buffer
phosphate solution containing doxorubicin at 1mg/ml concentration, obtaining a liposomal
suspension of 40 µM lipid/10 µl buffer solution (DOX-loaded liposomes). The mixture was
maintained under stirring for 15 minutes and then sonicated in an ice bath at 4°C using a
sonifier (TT13 Brason) operating under pulsated cycles (50 cycles/sec) at 50 W and 60 MHz
for 300 sec. Following, Con A-liposomes containing DOX were obtained by incubation of
DOX-loaded liposomes (1 ml/5.35 mg DPPE-MBS) with deacetylated Con A-SATA at 1:1
weight ratio under moderated magnetic stirring at room temperature for 2 h. Con A-
liposomes loading DOX were separated from unreacted DOX-loaded liposomes using a
sepharose 4B column (20 cm x 1.5 cm). Finally, purified Con A-liposomes containing
doxorubicin (DOX-loaded-Con A liposomes) was lyophilized after freezing at -80°C.
Lyophilizer (EZ-Dryer, FST Systems, New York) operated at 200 mBar for 16h.
Characterization of DOX-loaded Con A-liposomes
The analysis of size diameter and zeta potential (ξ) of liposomes was carried out
using a Zeta-sizer (Nano ZS90, Malvern). The measurements were performed after
redispersion of lyophilized DOX-loaded-Con A liposomes in deionized water.
74
The content of DOX encapsulated into liposomes was evaluated by using an UV
spectrophotometer (Ultrospec® 3000 pro, Amersham-Pharmacia Biotech, Foster, California).
Liposomes (100 µl) were diluted in 1:1 chloroform/methanol mixture (4.9 ml) and submitted
to sonication for 3 min. Samples were then filtered and read at 233 nm. Calibration curve was
prepared using DOX standard solutions in a concentration range from 1 to 40 µg/ml.
The DOX encapsulation ratio in liposomes was determined using the ultrafiltration
by centrifugation technique [Guterres et al., 1995]. A sample of DOX-loaded Con A-
liposomes (500 µl) was placed in a Ultrafree unit (Millipore, USA) and submitted to
centrifugation at 8776 g for 1 h at 4°C. The filtrate was diluted with deionized water (5ml)
and read at 233 nm. The encapsulation efficiency (%) was then calculated by the difference
between the total DOX content in liposomes and the DOX concentration in the filtrate, which
corresponds to the non-encapsulated drug.
DOX-loaded Con A-liposomes were submitted to both accelerated and long-term
stability testing [Santos-Magalhães et al., 1991]. Samples of liposomes were submitted to
centrifugation (3,000 rpm/min for 1 h), mechanical stress (180 strokes/min for 48 h/ 30°C)
and freeze-thawing cycles (16 h at -18°C and 8 h at 25°C). DOX-loaded Con A-liposomes
were stored at 4°C and physicochemical parameters such as macroscopic and microscopic
aspects, pH and drug content were determined.
The hemagglutinating activity of the conjugated lectin (ConA-SATA) was evaluated
using rabbit erythrocytes treated with glutaraldheyde at room temperature [Paiva et al., 2003].
Sample of DOX-loaded Con A-liposomes (50 µl) was serially diluted twofold in 0.15 M
NaCl, in microtitre wells. Then 50 µl of rabbit erythrocyte suspension (4% v/v in 0.15 M
NaCl) previously treated with glutaraldehyde (1%) was added and incubated for 1 h at room
temperature. The end-point titre of an agglutinin is defined as the lowest agglutinin
concentration, which caused cloudy sediments of cells and is scored as positive agglutinating.
75
This assignment was also confirmed by microscopic observation of the cells. The
hemagglutinating titre was expressed as the reciprocal of the higher dilution that presented
detectable hemagglutinating reaction.
Cytotoxicity
The cytotoxicity of DOX-loaded Con A-liposomes was performed on HEp-2 and
NCI-H292 cells cultured in MEM. The cell viability was evaluated using the exclusion of
Trypan blue technique. Cell suspensions were then diluted to 105 cells/ml and aliquots of 220
µl of this suspension were seeded on 96-well plates and incubated for 24 hours. After this
time, the cells were treated with DOX solution or DOX-loaded Con A-liposomes, at
concentrations ranging from 0.63 to 5 µg/ml and reincubated for 72 hours. Unloaded Con A-
liposomes were adopted as a negative control. After treatment, the cell viability was
determined using the MTT method [Alley et al., 1988]. The cytotoxicity was expressed by the
concentration that causes an 50% inhibition of cell proliferation (IC50).
76
RESULTS AND DISCUSSION
Phospholipid and lectin derivatization
DPPE-MBS phospholipid derivative was successfully obtained as inferred from the
1HNMR spectrum (Fig. 1). Proton characteristic signals of MBS and DPPE appear at 0.86 (a),
1.18 (b), 1.23 (c), 1.57 (d), 2.28 (e), 3.39 (i), 3.62 (h), 3.97 (j), 4.12 (f), 4.34 (g), 5.20 (l), 6.26
(m), 6.91 (r), 7.39 (n), 7.71 (p), 8.16 (o), and 8.59 (q) ppm. The signal of protons of the
succinimide group of the free MBS, situated at 2.73 ppm, is not present in the spectrum,
confirming that MBS has been covalently linked to DPPE.
Con A-SATA derivative was separated from unreacted Con A by gel filtration
chromatography and the peaks are shown in Fig. 2. The material collected from the first peak
presented an hemagglutinating of 64-1 and a protein content of aproximately 1 mg/ml
confirming the conjugation of Con A to SATA. The second peak, which is attributed to the
unreacted Con A, had a protein concentration of aproximately 0.5 mg/ml and a slight
hemagglutinating activity of 2-1.
The fractions of unreacted Con A and the Con A-SATA conjugate was analysed by
infrared spectroscopy (data not showed). The spectrum of Con A shows a wide band at 3,250
cm-1, which is maintained in the spectrum of Con A-SATA derivative at 3,500 cm-1. The band
comprised between 3,000 and 3,500 cm-1 presented the same profile in both spectra of Con A
and Con A-SATA conjugate. SATA spectrum shows a band from 3,800 to 4,000 cm-1 that is
preserved in the spectrum of Con A-SATA derivative. Data suggested thus the occurrence of
the Con A-SATA reaction. Despite IR spectroscopy was unable to detect a characteristic
specific signal for the covalent binding between SATA and Con A, the data ensemble with
protein analysis and determination of hemagglutinating activity of fractions from gel filtration
chromatography strongly suggest that the reaction Con A-SATA occurred.
77
Among the techniques used to produce proteoliposomes that proposed by Duncan
and colleagues [1983], this one present advantages such as the introduction of exogenous
sulphydryl groups in protein molecules using SATA. Also, another advantage is that SATA
avoid the additional use of a reducing agent such as dithiothreitol, which can lead to residues
that interfere in the coupling reaction during proteoliposomes formation. Other advantages of
the use of SATA as coupling agent can be point out. For example, the protein electrostatic
charge is less disturbed; just one derivative formed; and the modified protein preserves at
least in part its activity [Derksen and Scherphof, 1985]. Therefore, SATA is still in use for the
conjugation of enzymes, antibodies, peptides, hormones and lectins for producing
proteoliposomes [Jones et al., 2005].
In the present study, the yielding of the derivatization reaction of Con A was low.
The determination of protein content revealed that 25% of Con A was conjugated to SATA.
DOX-loaded Con A-liposomes
DOX-loaded Con A-liposomes were prepared from incubation of the DOX-loaded
liposomes (15 mol% of DPPE-MBS) with Con A-SATA derivative. The elution profile of
purification of Con A-liposomes is shown in Fig. 3 and corresponds to the first peak. A
hemagglutinating activity of 8-1 for the first peak was determined, confirming the presence of
Con A-liposomes. No hemagglutinating activity was verified and protein was not detectable
in the fraction of the second peak.
According to Francis and collaborators [1992] the extent of the conjugation of
thiolated proteins to liposomes increases with the augmentation of the presence of reactive
lipid (DPPE-MBS, mol%) in liposomes. As reported, quantities of DPPE-MBS higher than 27
mol% produced lectin agglutinating and avoid the coupling of WGA lectin to liposomes, as
well as make difficult the separation of lectin-conjugated liposomes from unconjugated
liposomes by using gel filtration chromatography [Hutchinson and Jones, 1988; Hutchinson et
78
al., 1989]. However, the extent of the lectin conjugation is not only dependent on the quantity
of the reactive lipid (mol %), but is also related to the properties of the lectin to be conjugated
[Liautard et al., 1985; Hutchinson et al., 1989]. In previous experiments the conjugation of
Con A lectin was higher than the coupling of WGA lectin to DPPE-MBS liposomes. This can
be explained by the fact that Con A presents more reactive lysine residues (24 residues per
dimer) for thioalkylation than WGA (only 11 residues per dimer) [Liautard et al., 1985,
Francis et al., 1992]. Based on these findings, in the present study, Con A was chosen to be
conjugated to DOX-loaded liposomes.
The free Con A showed a hemagglutinating activity of 512-1, and, after conjugation
with DOX-liposomes, it presents a very low hemagglutinating activity (8-1). However, our
results are in agreement with those reported by Carpenter-Green and Huang [1983] for WGA-
conjugated liposomes, which had a worse activity to agglutinate the rabbit red cells,
approximately eight fold less than activity (from 1.25 to 0.16 µg/ml) after conjugation.
Characterization of DOX-loaded Con A-liposomes
DOX-loaded liposomes prepared with DPPE-MBS (15 mol %) presented as a
colloidal reddish transparent suspension. DOX content in DOX-loaded liposomes was 96%
(960 µg/ml) with an encapsulation ratio of 99.9%. DOX-loaded Con A-liposomes were
separated from unconjugated DOX-loaded liposomes using gel filtration chromatography as
shown in Fig. 3. A DOX content of 129.5 µg/ml was determined for DOX-loaded Con A-
liposomes (Fig 3, first peak), and the DOX content in unreacted DOX-loaded liposomes
(second peak) was 50.4 µg/ml.
A mean size diameter of 172.6 ± 12.7 nm was determined for DOX-loaded Con A-
liposomes, while a size diameter of 142.7 ± 52 nm was verified for DOX-loaded liposomes.
However, an increase in the size of vesicles was detected after redispersion of the lyophilized
79
DOX-loaded Con A-liposomes diameter (349 ± 74 nm). Liophylized DOX-loaded Con A-
liposomes showed a small increase in size (on average 12.9%) over six months of storage,
which most probably arises from vesicle aggregation during redispersion [Francis et al.,
1992].
The zeta potential to DOX-loaded Con A-liposomes was –77 ± 7.6 mV, while DOX-
loaded liposomes showed – 8.50 ± 1.3 mV and the Con A in buffer solution had a zeta
potential of -11 mV (pH 7.4). From these results, it is clear that DOX-loaded Con A-
liposomes were more surface negative charged than DOX-loaded liposomes, indicating that
Con A molecules were place at the surface of the liposomes inducing remarkable reducion on
zeta potential.
In general, the charge of DOX-loaded liposomes prepared with 10 mol% of
stearylamine was reduced after conjugation with Con A, resulting in a much more negative
zeta potential. These results suggest the binding of Con A at the surface of liposomes.
Lectin-conjugated liposomes present variable size diameter, which is tightly
dependent on the type of lectin and lipids, and the method of preparation of liposomes.
Thioacetyl-γ globulin-conjugated liposomes prepared by extrusion using SATA as sulphydryl
group donor present a higher size diameter (240 nm) in comparison with unconjugated
liposomes (65 nm) [Derken et al., 1983], while the unconjugated liposomes formed from
DPPE-MBS had a size of 200 nm. No significant increase of size vesicles was observed for
Con A-conjugated liposomes prepared by sonication that has a size diameter of 300 nm
[Francis and Jones, 1990, Francis et al., 1992, Jones et al., 1993]. On the contrary,
proteoliposomes prepared with antibody fragments or other small molecules as interleukin-2
presented a reduced size (46-60 nm) in comparison with lectin-conjugated liposomes
[Koningsberg et al., 1998].
80
Cytotoxicity of DOX-loaded Con A-liposomes
The cytotoxicity (IC50) of DOX-loaded Con A-liposomes was 1.25 µg/ml, whereas
free DOX presented an IC50 of 5 µg/ml on NCI-H292 cells (Fig. 4a). A pronounced
cytotoxicity was found out for DOX-loaded Con A-liposomes on HEp-2 cells with a 70% cell
proliferation inhibition, regardless the drug concentration (Fig. 4b). In contrast, free DOX
caused a low cytotoxicity on HEp-2 cells and only a 20% cell proliferation inhibition was
observed for all drug concentrations. Unloaded Con A-liposomes have no cytotoxic effect on
both cell lines. Based on these findings, DOX-loaded Con A-liposomes can be assumed to be
more toxic against NCI-H292 and HEp-2 cells than free DOX after 72h treatment, and a high
sensibility was detected on HEp-2 cells. The use of Con A-conjugated liposomes as a vehicle
for doxorubicin improved the drug penetration into the cells and, as consequence, enhanced
its cytotoxicity.
As well known, the cytotoxicity of drugs is strongly dependent on the type of treated
cell, time of contact, as well as the vehicle of the drug. In the case of doxorubicin, its
cytotoxic activity is variable with the vehicle used to target it to cells as shown in Table 1.
Regarding the kind of cells used in the experiments, our results are comparable with
those reported by Moreira and Gaspar [2004] for DOX-loaded into antagonist G-targeted
liposomes incubated with a human variant of a small cell lung cancer (NCI-H82). An IC50 of
5.7 ± 3.7 µM (3.5 µg/ml approximately) was detected for the cell treatment with targeted-
liposomes, whereas an IC50 of 200 µM (11.6 µg/ml) was observed for conventional
liposomes. Our system with Con A conjugated at the surface of liposomes was five times
more efficient than antagonist G-targeted liposomes against cell proliferation.
Regarding the signaling molecule at the surface of liposomes, pegylated
proteoliposomes containing doxorubicin were more cytotoxic on LLC and BT-20 cells when
the targeting was performed using peptide instead of immunoglobulin [Lukyanov et al.,
81
2004]. In fact, 2C5-targeted Doxil® caused a higher cytotoxicity (IC50= 15-20 µg/ml) than
IgG-Doxil® (IC50= 100-128 µg/ml).
The cytotoxicity of DOX encapsulated into standard and pegylated liposomes was
evaluated on human ovarian tumor cells (OV-1063) [Harowitz et al., 1992]. It was recognized
that the IC50 of DOX-loaded into pegylated liposomes (0.0978 µg/ml) have the same order of
magnitude as free DOX (0.103 µg/ml) or DOX-loaded conventional liposomes (0.163 µg/ml).
On the contrary to other cells, OV-1063 cells had shown to be quite sensitivity to doxorubicin
and the vehicle seems not to play a role on its cytotoxicity, presenting an IC50 about ten times
lesser than that found in the present study.
Due to the fact that Con A lectin exhibit a specific binding to mannose and glucose
residues, presented in glycoproteins of the cell membranes, a tightly interaction of ConA-
liposomes with HEp-2 cells may occur and, as a consequence, a change on the cell membrane
arrangement is accomplished. In this way, it is reasonable to conjecture the opening of gated
ionophore channels leading to the drug penetration into the cells. This argument could
account for the twelve fold enhancement on the cytotoxicity of DOX-loaded Con A-
liposomes in comparison with the 2C5-targeted Doxil®.
The presence of polyethylene glycol on the surface of liposomes seems to play an
important role on the cytotoxicity of doxorubicin. However, in general, the presence of a
signaling molecule (peptide, protein or lectin) at the surface of liposomes is crucial for
improving the cytotoxic effect of doxorubicin.
In conclusion, DOX-loaded Con A-liposomes were obtained and the hemagglutinating
activity of Con A was to some extent conserved after conjugation to the surface of liposomes.
Despite the partial loss of lectin activity after derivatization, the encapsulation of doxorubicin
into Con A-liposomes leads to an increase on the drug penetration into the cells, thereby
enhancing 2C5-targeted Doxil® cytotoxicity.
82
ACKNOWLEDGEMENTS
HMLRS wishes to thank the Brazilian Council for Scientific and Technological
Development (CNPq) for a PhD scholarship. The other authors thank the Brazilian Ministry
of Science and Technology (CNPq) for research grants (Brazilian Nanobiotechnology
Network- Nanobiotec).
83
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86
FIGURE LEGENDS
Figure 1: 1HMNR spectrum of DPPE-MBS derivative obtained at 300 MHz in CDCl3.
(Insert: Chemical structure of DPPE-MBS with attribution of signals in ppm in the
spectrum).
Figure 2: Elution profile of Con A-SATA product (first peak) and unreacted Con A (second
peak) on sephadex G 50 columm.
Figure 3: Elution profile of separation of DOX-loaded Con A-liposomes (A) from unreacted
DOX-loaded liposomes (B) on sepharose 4 B.
Figure 4: Cytotoxicity of DOX-loaded Con A-liposomes (�) on NCI-H292 (a) and HEp-2 (b)
cells after 72 h of treatment in comparison with free DOX in solution (�). Unloaded Con A-
liposomes (�) were used as control.
87
Figure 1
88
0 10 20 30 40 50
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0Con ACon A-SATA
Abs
orba
nce
(280
nm
)
Fractions
Figure 2
89
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
B
A
Abs
orba
nce
(233
nm)
Fractions
Figure 3
90
0 1 2 3 4 50
20
40
60
80
100
120
Cel
l pro
lifer
atio
n (%
)
DOX concentration (µµµµg/ml)
(a)
Figure 4
91
0 1 2 3 4 50
20
40
60
80
100
120
Cel
l pro
lifer
atio
n (%
)
DOX concentration (µµµµg/ml)
(b)
Figure 4
92
TABLE
Table 1 – Cytotoxicity of doxorubicin encapsulated into conventional, pegylated and targeted-liposomal formulations on different cell lines.
Cell lines DOX-liposomal formulation Incubation
time (h)
Method IC50
(µg/ml)
Reference
NCI – H292 DOX-loaded Con A-liposomes
72 MTT 1.25 Rolim-Santos et al., 2005
HEp-2 DOX-loaded Con A-liposomes 72 MTT < 0.63 (current study)
LLC
BT-20
Proteopegylated liposomes
2C5-Doxil®
IgG-Doxil®
2C5-Doxil®
IgG-Doxil®
24
MTS
15 ± 1
128 ± 8
20 ± 1.5
100 ± 6.5
Lukyanov et al., 2004
NCI – H82 Conventional liposomes
Targeted liposomes
(PEG-antagonist G peptide-liposomes)
48 MTT
11.60
3.50
Moreira and Gaspar, 2004
OV – 1063 Conventional liposomes
Pegylated liposomes
72 MB/ MTT 0.16
� 0.10
Horovitz et al., 1999
93
CAPÍTULO III
Caracterização fisico-quimica e Avaliação da citotoxicidade do ácido úsnico
encapsulado em lipossomas em células HEp-2 E NCI-H292
Este trabalho será submetido ao “Current Pharmaceutical Biotechnology”
94
CARACTERIZAÇÃO FISICO-QUIMICA E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
DO ÁCIDO ÚSNICO ENCAPSULADO EM LIPOSSOMAS EM CÉLULAS HEp-2 E
NCI-H292
H. M. L. Rolim-Santos1, M. C. B. Lira1, S. C. Nascimento2, N. S. Santos-Magalhães1*.
1Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco
– UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, 1235 Cidade Universitária, 50670-901, Recife-PE, Brasil. 2Setor de Cultura de Células – Departamento de Antibióticos – UFPE
*Correspondência com o Autor:
Dr. Nereide Stela Santos Magalhães
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)
Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária.
50670-901, Recife-PE, Brasil.
Tel: +55-081-2126 8587.
Fax: +55-081-2126 8485.
E-mail: [email protected]
95
RESUMO
O ácido úsnico (AU) é um derivado liquênico lipofílico de alta hepatotoxicidade,
entretanto, detém atividade antitumoral. O AU (0,5-1,5 mg/ml) foi encapsulado em vesículas
unilamelares pequenas (36-44 µmol lipídeos/10µl de tampão fosfato pH 7.4), preparadas pelo
método de formação de filme lipídico por evaporação em fase reversa, seguido de sonicação.
As formulações foram avaliadas após a fabricação e em tempos prolongados até a perda da
estabilidade. A taxa de encapsulação do AU e a cinética in vitro destes sistemas foram
determinadas. Os efeitos citotóxicos do AU livre e encapsulado foram analisados pelo método
colorimétrico do MTT nas linhagens HEp-2 e NCI-H292. Lipossomas (42 µmol/ 10µl)
contendo 1,5 mg/ml de AU foi a formulação mais resistente e permaneceu estável por mais de
100 dias. 99,65 ± 0,25 % de AU foi encapsulado em lipossomas. O perfil de liberação in vitro
foi bimodal atingindo 56% de liberação em 10 h e 99% em 40 h. A concentração que inibe
50% da proliferação celular (CI50) de AU livre e encapsulado foi de 20 e 5 µg/ml
respectivamente para as células HEp-2. As formas livre e encapsulada do AU apresentaram
CI50 de 20 µg/ml para células NCI-H292. A forma lipossomal aumentou a citotoxicidade do
AU para as células HEp-2 e não alterou a citotoxicidade para as células NCI-H292.
Comparando os resultados de citotoxicidade do AU (Sigma) com AU purificado de Cladonia
substellata descrito na literatura, observou-se que o primeiro foi menos tóxico para as
linhagens celulares do que o segundo derivado liquênico.
Palavras-chaves: Ácido úsnico, lipossomas, citotoxicidade, células HEp-2, células NCI-
H292.
96
INTRODUÇÃO
O Ácido úsnico [2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3(2h,9bh)-dibenzeno-
furadione] (AU) é um metabólito secundário liquênico que tem sido extensivamente estudado
desde os anos 50. A análise da literatura do AU revela três períodos de interesse científico
pelo derivado liquênico: O primeiro no final da 2ª guerra mundial, refletindo um interesse
pela sua atividade antibiótica. Um segundo período entre os anos 60 e 70, em que se
caracteriza por uma redução de interesse pelo composto, provavelmente causado por sucesso
dos antibióticos sintéticos; contudo, a baixa solubilidade em água dos derivados liquênicos e a
dificuldade para reunir líquens em largas escalas desencorajaram o uso de tais substâncias.
Um terceiro período iniciou-se por volta dos anos 80 e apresenta-se como uma retomada do
interesse pelo AU, provavelmente devido o aumento da incidência de resistência pleiotrópica
causada pelo uso intensivo de antibiótico [1].
Estudos vêm comprovando a atividade antibacteriana gram-positiva [2-4], a
atividade antimitótica [5], antimicótica [6], antiprotozoária [7], antiinflamatória, analgésica e
antipirética [4,8]. Apesar de tantas aplicações do AU [9], foram observados efeitos tóxicos
como: mitodepressão e efeito clastogênico após administração oral de AU em modelos de
camundongos. O AU pode estar também interfer na biossíntese de RNA, contudo, todos os
efeitos colaterais narrados são completamente reversíveis, como revisado em Cochietto et al.
[1]. Uma alternativa para reduzir a toxicidade é a elaboração de um composto sintético ou
semi-sintético do AU, entretanto, pequenas modificações na molécula do AU trazem
resultados indesejáveis como redução da atividade antimicrobiana in vitro e aumento da
citotoxicidade, comprovada por uma completa inibição do crescimento de linfócitos
esplênicos [10].
Considerando este argumento, torna-se imponente que este composto ativo seja
incorporado a uma forma farmacêutica que proteja o fármaco de degradações prévias e o
97
organismo da toxicidade, liberando-o de forma progressiva ou controlada para se reduzir ao
máximo os seus efeitos colaterais. Os sistemas de liberação controlada de medicamentos
surgiram como uma alternativa para fármacos que apresentam propriedades complicantes para
administração na forma livre. Os lipossomas, vesículas basicamente formadas de
fosfolipídeos que ocorrem naturalmente, são biodegradável e detêm alto grau de
biocompatibilidade [11], foram estudados no passado e continuam sendo investigados como
sistemas carreadores de fármacos e têm mostrado bons resultados com fármacos insolúveis,
fotossensíveis e citotóxicos. Por causa de sua versatilidade estrutural em termos de tamanho,
composição, carga de superfície, fluidez de bicamada ou por carrear em suas superfícies
moléculas ligantes, específicos a células, além de serem preparados das mais variadas formas
garantem formulações estáveis para uso clínico [12].
Os sistemas lipossomais podem ser usados como excipientes não-tóxicos para a
solubilização de fármacos hidrofóbicos [11,13], além de prolongar a residência da vesícula na
circulação e realçar a captação da vesícula por células alvo. Evidências de acúmulos in vivo,
particularmente em áreas tais como quimioterapia do câncer, terapia antimicrobiana e vacinas,
indicaram claramente que alguns lipossomas que encapsulam fármacos e vacinas exibem
superior propriedades farmacológicas sobre as formulações convencionais [14].
Lipossomas têm mostrado resultados em tecidos tumorais, já foram aprovados para o
tratamento do sarcoma de Kaposi e está em testes clínicos para o tratamento de outras
neoplasias [15].
O objetivo deste trabalho foi incorporar o ácido úsnico em sistemas lipossomais
(lipossomas AU), verificando a estabilidade destes sistemas e o percentual do fármaco
encapsulado, bem como acompanhar a cinética de liberação in vitro e a citotoxicidade do
ácido úsnico encapsulado em culturas de células.
98
METODOLOGIA
Materiais
(+)- Ácido úsnico, colesterol e octadecilamina (estearilamina) foram obtidos da
Sigma-Aldrich Chemicals (USA), fosfatidilcolina de soja (Epikuron 200®) foi obtido da
Lucas Meyer (Alemanha), metanol e clorofórmio da Merck (USA). As soluções aquosas
foram preparadas com água deionizada.
Métodos
Preparação de lipossomas
As vesículas unilamelares pequenas (SUV) foram obtidas através de sonicação de
vesículas multilamelares (MLV) [16], baseado na formação do filme lipídico obtido por
evaporação em fase reversa.
Inicialmente os constituintes lipídicos: fosfatidilcolina de soja (PC), colesterol (CH),
esterilamina (SA) ou ácido fosfatídico (PA) em diferentes concentrações (36-44 µmol lipídeos
totais/10 µl tampão fosfato) e ácido úsnico (0,5-1,5 mg) foram solubilizados em uma mistura
de clorofómio e metanol (3:1 v/v) sob agitação moderada. Esta solução foi evaporada sob
pressão reduzida por 20 min e temperatura constante de 35 °C para obtenção de um filme
lipídico. O filme foi redisperso em 10 ml de tampão fosfato pH 7,4 obtendo assim uma
suspensão coloidal que posteriormente, foi submetida a sonicação para reduzir o tamanho das
vesículas (Tabela 1).
99
Estabilidade e caracterização de sistemas lipossomais
Os lipossomas foram caracterizados imediatamente após a preparação (estabilidade
acelerada) e armazenados a 4°C (estabilidade a longo prazo).
Teste de estabilidade acelerada
Os testes de estabilidade acelerada avaliam as condições de estresse a que os
medicamentos são submetidos quando da sua fabricação, transporte e armazenamento. Testes
de resistência à centrifugação (6.000 rpm/1h a 25°C) para simular a passagem acelerada do
tempo; agitações mecânicas (180 movimentos/min/48h a 30°C), para simular as condições de
transporte e ciclos de congelamento e descongelamento (-18°C/ 16h e 25°C/ 8h), para simular
as variações de temperatura durante transporte e armazenamento[17].
Teste de estabilidade a longo prazo
Com o objetivo de estabelecer a durabilidade das preparações estas foram observadas
logo após a fabricação e a longo prazo em tempos regulares (7, 15, 30, 45, 60 dias) até a
manutenção da estabilidade. Aspectos macroscópicos (cor, viscosidade, homogeneidade,
deposição de materiais, floculação, coalescência ou separação de fases) e aspectos
microscópicos pela microscopia óptica para avaliar presença de cristais ou agregados lipídicos
foram observados [17]. O tamanho dos lipossomas foi avaliado por por Seta sizer (Nano
ZS90, Malvern). Após o teste de estabilidade a longo prazo, as preparações lipossomais mais
estáveis foram novamente preparadas e liofilizadas (EZ-Dryer, FST Systems, New York) a
200 mBarr por 16 h.
Dosagem e determinação da taxa de encapsulação do ácido úsnico
O conteúdo total de AU nas preparações lipossomais bem como a taxa de
encapsulação foi determinada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) usando o
método isocrático modificado [18]. A corrida cromatográfica foi formada pelo sistema
100
Hewllet-Packard Chem Station equipado com um detetor UV operando a 280 nm, usando
uma coluna µBondapck C18 (3,9 x 300 mm, Waters). A fase móvel foi composta de solução
de metanol/ tampão fostato pH 7,4 (70:30) a uma razão de fluxo de 1,5 ml/min. A curva de
calibração foi preparada a partir de uma solução padrão de AU (0,5 mg/ml) para obter
concentrações de 1 a 10 µg/ml. A extração do ácido úsnico dos lipossomas (concentração
prática) foi realizada com uma solução de metanol/ clorofórmio (1:1) sob agitação ultrasônica
por 6 min. Uma solução da amostra foi preparada com a fase móvel para obtenção de solução
cuja concentração teórica foi de 8 µg/ml. Esta solução foi filtrada e injetada (20 µl) no sistema
HPLC. O conteúdo total de AU na formulação foi obtido da relação entre a concentração
teórica e a concentração prática do AU na formulação.
A taxa de encapsulação foi determinada após a separação do AU encapsulado do não
encapsulado por ultracentrifugação a 8.776 g durante 1 h a 4 °C utilizando eppendorffs
acoplados a filtros de membrana de policarbonato 0,22 µm (Ultrafree�, Millipore, USA) [19],
obtendo-se assim duas fases: uma fase não filtrada, constituída somente do AU encapsulado
em lipossomas e uma fase filtrada, que correspondeu ao AU que não foi encapsulado. Através
do doseamento do filtrado pelo método isocrático em HPLC e relacionando este ao conteúdo
total do fármaco dosado nas preparações, foi determinada a concentração e o percentual do
fármaco encapsulado em lipossomas.
Perfil de liberação in vitro de AU lipossomal
O perfil de liberação in vitro de AU encapsulado em lipossomas (Lipossomas-AU)
foi executado utilizando a técnica de difusão em membrana de diálise [20]. Uma alíquota de
10 ml de suspensão de lipossomas-AU foi colocada dentro de uma membrana de diálise (meio
doador). Este foi fechado e mergulhado em 150 ml de meio aquoso (receptor). O sistema foi
deixado em 37 °C com contínua agitação magnética. Amostras (2 ml) da solução do receptor
101
foi retirada a vários intervalos de tempo e analisada por espectrofotometria a 280 nm. O
volume do compartimento receptor foi mantido constante pela adição de 2 ml de solução
tampão após cada retirada de meio, mantendo as mesmas condições.
Citotoxicidade do ácido úsnico
A citotoxicidade do AU livre e incorporado aos sistemas lipossomais foi analisado
em cultura de células HEp-2 e NCI-H292 cultivadas em MEM (Mimimum Essential
Medium). O Azul Tripan foi utilizado para avaliar a viabilidade celular [21]. Uma suspensão
celular de 105 células.ml-1 foi semeada em cada um dos poço de uma placa de 96 poços.
Sistemas lipossomais contendo AU e Lipossomas controle foram adicionados à placa para
uma concentração final de 2,5; 5,0; 10,0 e 20,0 µg/ml. O método colorimétrico Brometo de 3-
(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) foi escolhido como meio de avaliação da
citotoxicidade após 72 h de incubação [22], modificado por Alley et al. [23]. Os resultados da
citotoxicidade foram valores das medidas com o desvio padrão obtido de três experimentos
realizados em quatro poços por cada concentração testada (n = 12).
102
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Preparações lipossomais
Para obtenção de lipossomas-AU, várias concentrações de AU foram incorporadas às
formulações contendo diferentes composições e concentrações lipídicas até que se obtivesse
preparações estáveis com maior concentração possível de princípio ativo. Foram testadas
formulações cujas concentrações molares variaram de 36 a 44 µmol de lipídeos totais/ 10µl de
tampão fosfato, pH 7,4, e concentrações de AU de 0,5 a 1,5 mg/ml.
Macroscopicamente, as formulações positivas (estearilamina) em concentrações de
36 a 42 µmol/10µl (F1-F8) apresentaram-se como suspensões coloidais brancas-amareladas,
apresentando efeito Tyndal, que caracteriza as partículas de pequeno tamanho (SUV). O pH
variou entre 7,3 e 7,6 com 24 h de preparados. Lipossomas positivos de 44 µmol/10µl (F9)
apresentaram-se como suspensões viscosas, opacas, precipitação de AU e floculação lipídica
com 24 horas de formulados.
As preparações negativas (ácido fosfatídico) apresentaram-se como formulações
viscosas e não-homogêneas, o aparecimento de um precipitado de AU foi percebido em um
tempo máximo de aproximadamente sete dias. Formulações neutras, ou seja, não contendo
lipídeo carregado (F12), foram suspensões coloidais branca-amareladas com floculação de
lipídeos e precipitado de AU logo nas primeiras horas de preparadas. F8 (42µmol/10µl e
1,5µg/ml) foi considerada a melhor formulação pela capacidade de carrear maior
concentração do fármaco e se aproximou da dose terapêutica que é de 15 mg/kg/peso.
Os lipossomas observados na microscopia eletrônica de varredura apresentaram-se
bem distribuídos espacialmente e de tamanhos bem uniformes. O diâmetro das vesículas foi
de 90 ± 20 nm medida por espalhamento de luz em ângulo de 90 ° a 20 °C. O potencial Zeta
dessas formulações foi de – 9,37 ± 3,6 nm. Lipossomas com tamanho variando entre 100 e
103
120 nm de diâmetro se acumulam em tumores malignos devido à alta permeabilidade vascular
próximo ao tumor [24].
Os resultados demonstraram que as concentrações e as cargas dos lipídeos
empregados exerceram influência na estabilidade das preparações. As formulações contendo
lipídeos carregados conseguiram se manter estáveis por mais tempo em relação às
formulações elaboradas com lipídeos neutros.
Ensaios de estabilidade e caracterização dos sistemas lipossomais
Estabilidade acelerada
As formulações positivas de 36 a 44 µmol/10µl (F1 a F8) permaneceram intactas
frente a estresse mecânico, centrifugação e ciclos gelo-degelo, sem que houvesse mudanças
nas suas características macroscópicas e microscópicas por M.O (Tabela 2). Os lipossomas
negativos (F10 e F11) apresentaram floculação lipídica quando submetidos à centrifugação,
enquanto os neutros (F12) não foram submetidos aos testes devido à perda da estabilidade
logo depois de formulados, apresentando precipitação do AU e posteriormente separação de
fases. Lipossomas contendo carga total negativa são mais rapidamente removidos da
circulação do que lipossomas com carga positiva ou neutra [13, 25], isto significa que os
lipossomas positivos têm a vantagem de permanecer mais tempo no sangue e, portanto,
maiores chances de alcançar os sítios tumorais. Somando estas vantagens aos achados deste
trabalho, torna-se viável e promissora a utilização de lipossomas positivos para encapsular o
AU.
Estabilidade a longo prazo
A estabilidade a longo prazo testada a 4°C utilizou somente formulações carregadas
positivamente. Lipossomas-AU de 38 (F3 e F4), 40 (F5 e F6) e 42 (F8) µmol/10µl
apresentaram estabilidade superior a 100 dias em suspensão (Tabela 2) e acima de 24 meses
para formulações liofilizadas.
104
Determinação da taxa de encapsulação do ácido úsnico
Lipossomas convencionais (42 µmol/10µl de lipídeos totais e 1,5 mg/ml AU)
encapsularam um conteúdo de 99,65 ± 0,25 % de AU determinados pelo HPLC. O AU é uma
substância altamente lipofílica, cuja solubilidade em água a 25 °C (g/100 ml) é menor que
0,01.
Budesonida, um fármaco lipofílico encapsulado em lipossomas de PC de ovo e
Diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) apresentou uma taxa de incorporação de 85-95%,
utilizando a mesma técnica deste trabalho [26]. Paclitaxel, também um fármaco lipofílico, foi
encapsulado em lipossomas de PC de ovo, CH e fosfatidilglicerol (9:1:5) obtendo uma
eficiência de encapsulação de apenas 60% [27]. Taxas elevadas de encapsulação (100%) são
conseguidas para fármacos hidrofílicos como a vincristina encapsulada em lipossomas de
DSPC e CH [28]. Diante de uma eficiência de quase 100% de encapsulação de AU, resta
concluir que o sistema carreador escolhido, os componentes lipídicos e as razões entre eles
foram eficazes para a solubilização do AU mostrando um percentual de AU encapsulado mais
elevado que os citados na literatura para fármacos pouco solúveis em água. As membranas de
diálise foram colocadas em água destilada durante 1h para garantir a hidratação das mesmas.
Perfil de liberação in vitro de AU lipossomal
O perfil de liberação in vitro do AU (1,5 mg/ml) a partir de lipossomas (42
µmol/10µl de lipídeos totais) foi bimodal com constante de velocidade K= 0,030530 ±
0,000723 µg/h, atingindo um máximo de 99,6% de liberação em 40 h (Figura 1). Com 10 h,
mais de 56% de AU foi liberado da membrana de diálise para o meio receptor.
O método direto que utiliza membrana de diálise para acompanhar a liberação de
budesonida encapsulado em lipossomas convencionais apresentou uma liberação de 50% do
fármaco em 13 h quando a agitação magnética foi realizada apenas fora da membrna de
105
diálise, e uma liberação de 50% em 5 h quando a agitação aconteceu dentro e fora da
membrana. A cinética de AU lipossomal utilizou apenas agitação magnética fora da
membrana e a liberação de AU aconteceu em um tempo menor que o da budesonida
lipossomal. A avaliação da liberação da droga de dispersões coloidais é problemática,
principalmente para os carreadores de tamanho muito pequeno (< 10 µm de diâmetros), há
dificuldades técnicas na separação de drogas dos sistemas carreadores. No caso de drogas
lipofílicas a solubilidade na fase aquosa é baixa e grandes volumes são necessários para a fase
receptora. A difusão de drogas lipofílicas para o saco de diálise pelo método inverso é dose-
limitante [26].
Com o intuito de aumentar a solubilidade das substâncias, o uso de sistemas
solventes tem sido utilizado para testar fármacos insolúveis em água ou sistemas de liberação
controlada [29]. Entretanto, torna-se impróprio o uso para lipossomas uma vez que, o uso de
solventes solubiliza os lipídeos da bicamada dos lipossomas, destruindo as vesículas e
consequentemente, induzindo a uma liberação total e imediata do fármaco encapsulado.
Citotoxicidade
Na avaliação citotóxica, 50% de inibição da proliferação celular (CI50) foi observada
para 20 µg/ml de AU livre obtido da Sigma (em suspensão de DMSO) e 5 µg/ml para AU
lipossomal testado em células HEp-2 (Fig. 2a). AU encapsulado (2,5 µg/ml) não provocou
citotoxicidade considerável, apresentando 90% de proliferação celular, esta mesma
concentração de AU livre apresentou um menor percentual de proliferação celular (60%).
A figura 2b mostra a citotoxicidade da linhagem NCI-H292 apresentando uma CI50
de AU livre e encapsulado de 20 µg/ml. As formulações controle (lipossomas não-carregados
com AU) não foram considerados citotóxicos para ambas as células, apresentando-se com
90% de proliferação celular para a linhagem HEp-2 e 80% para NCI-H292. A incorporação de
106
AU em lipossomas proporcionou um aumento na sua citotoxicidade para células HEp-2 e não
modificou a citotoxicidade para células NCI-H292. Desta forma, AU (Sigma) encapsulado em
lipossomas foi mais tóxico para células HEp-2 do que para células NCI-H292.
O AU purificado de Cladonia substellata (Vanio) foi encapsulado em microsferas de
copolímero de ácido láctico e glicólico (PLGA) e testado em linhagem HEp-2, apresentando
CI50 de 12,6 e 14,4 µg/ml para AU livre e encapsulado, respectivamente [30]. A forma livre
do AU obtido de C. substellata foi mais tóxica para células HEp-2 do que o AU (Sigma) livre.
AU obtido da Sigma (corrente trabalho) se comportou diferente do AU de C. substellata
quando testado na mesma linhagem celular. Uma vantagem dos lipossomas é o menor
tamanho das vesículas (90 ± 20 nm) em relação as microsferas (7,02 ± 2,72 µm). Como
descrito na literatura, resultados in vivo mostram que lipossomas de tamanho reduzido
conseguem chegar até áreas tumorais mais facilmente do que carreadores de tamanhos
maiores. No caso do tratamento de tumores, a permeabilidade vascular próxima ao tumor
encontra-se alterada, facilitando a entrada de vesículas lipossomais de pequenos tamanhos
[17].
AU obtido de C. substellata também foi incorporado em nanocápsula de PLGA e
revelou CI50 de 10 e 13,5 µg/ml para AU livre e nanoencapsulado, respectivamente [31]. AU
livre de C. substellata foi mais tóxico do que AU (Sigma) livre testado neste trabalho para a
linhagem NCI-H292. Embora a encapsulação de AU (Sigma) em lipossomas tenha mostrado
menor toxicidade, a CI50 entre o AU livre e encapsulado foi da mesma ordem de magnitude
do que AU de C. substellata incorporado em nanocápsulas. Estes resultados sugerem que o
AU (Sigma) e AU de C. substella apresentam formas tautoméricas diferentes. Em cultura de
linfócitos obtido de baço de ratos Hoffman, AU (10 µg/ml) isolado de Usnea densirostra
(Taylor) inibiu de forma diferente a proliferação celular para as três formas tautoméricas do
AU (ácido úsnico, ácido dihidroúsnico e ácido diacetatoúsnico), sugerindo que a menor
107
modificação ocorrida na estrutura muda significativamente à atividade citotóxica do AU e
derivados [10].
Outros resultados de citotoxicidade de AU apresentaram respostas bem diferentes
dependendo do tipo celular. AU (Sigma) foi testado em duas linhagens de câncer de mama
(MCF7 E MDA-MB-231) e uma linhagem de câncer de pulmão (H1299). As três linhagens
foram sensíveis ao AU apresentando CI50 em torno de 10 µg/ml [32]. Quando uma linhagem
leucêmica (K-562) e duas linhagens de adenocarcinoma humano (Ishikawa e HEC-50) foram
expostas a 50 µg/ml de AU, essas linhagens foram inibidas em torno de 70 a 90% [5]. Em
células de queratócitos (HaCaT) a CI50 foi de 2,1 µg/ml [33]. Em cultura primária de
hepatócitos murinos tratados com AU por apenas 16 h sofreram necrose (98% da cultura) e a
apoptose não foi detectada [34].
Um fato curioso aconteceu a baixas concentrações de AU, onde testes
respirométricos usados para avaliar a viabilidade celular na presença ou ausência de AU sobre
cultura de Saccharomyces cerevisae, revelou que baixas concentrações de AU (0,1 a 5 µg/ml)
não provocaram efeitos tóxicos nesta levedura e ainda apresentou leve estimulação do
consumo de O2 a 0,5 µg/ml de AU, como resultado de estimulação do metabolismo em alguns
sistemas biológicos [5].
Desde que o AU apresentou efeito anticancerígeno in vitro, que este vem sendo
estudado para uso como agente quimioterápico. Muitos estudos têm sugerido que o AU inibe
a transcrição do RNA [35] ou a função mitocondrial [33], entretanto, um estudo recente
apresentou que a proteína supressora de tumor (p53) que aparece de forma pronunciada em
células com danos no DNA, não apareceu em células tratadas com AU, portanto, não
danificou o DNA, desta forma, o AU poderia ser usado como antineoplásico não-genotóxico
[32].
108
CONCLUSÃO
Os resultados indicam que o ácido úsnico (Sigma) pode ser encapsulado em lipossomas
convencionais composto de fosfatidilcolina de soja, colesterol e estearilamina (7:2:1) com um
percentual de encapsulação de quase 100%, mantendo-se estáveis mais de 24 meses na forma
liofilizada. Os lipossomas aumentaram a citotoxicidade deste derivado liquênico para a
linhagem HEp-2, no entanto, para células NCI-H292, tanto a forma lipossomal quanto a
forma livre apresentaram a mesma citotoxicidade. Comparando os resultados de
citotoxicidade obtidos neste trabalho utilizando AU (Sigma) com os resultados do AU
purificado de Cladonia substellata, descrito na literatura, observou-se que o AU (Sigma) foi
menos tóxico para as linhagens celulares do que o segundo derivado liquênico.
A encapsulação de ácido úsnico na forma lipossomal fornece subsídios para o
desenvolvimento de novas preparações contendo outras substâncias liquênicas lipofílicas e/ou
tóxicas que contenham atividades biológicas de interesse clínico.
Agradecimentos
Os autores são gratos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento de Pesquisa
Científica (CNPq), Rede Nacional de Nanotecnologia (Nanobiotec) e Banco do Nordeste do
Brasil (BNB) pelo suporte financeiro.
109
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112
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Perfil de cinética de liberação de AU (1,5 mg/ml) encapsulado em lipossomas (42
µmol/ 10µl) em solução tampão fosfato salino a 37 °C.
Figura 2: Citotoxicidade de AU lipossomal (1,5 mg/ml) em células: a). HEp-2 e b). NCI- H
292 em comparação com AU livre em meio MEM. Formulações sem AU foram usadas como
controle.
113
Figura 1
114
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pro
lifer
ação
cel
ular
(%)
Ácido úsnico (µµµµg/ml)
Ácido úsnico livre Lipossomas AU Lipossomas controle
(a)
Figura 2
115
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pro
lifer
ação
cel
ular
(%)
Ácido úsnico (µµµµg/ml)
Ácido úsnico livre Lipossomas AU Lipossomas controle
(b)
Figura 2
116
TABELAS
Tabela 1 - Formulação de lipossomas.
Formulação Composição lipídica Proporção molar (lipídeos/sol. tampão)
(�mol/10�l)
Ácido úsnico
(mg/ml)
F1 PC: CH: SA(7: 2:1) 36 0,5
F2 PC: CH: SA(7: 2:1) 36 1,0
F3 PC: CH: SA(7: 2:1) 38 1,0
F4 PC: CH: SA(7: 2:1) 38 1,5
F5 PC: CH: SA(7: 2:1) 40 1,0
F6 PC: CH: SA(7: 2:1) 40 1,2
F7 PC: CH: SA(7: 2:1) 40 1,5
F8 PC: CH: SA(7: 2:1) 42 1,5
F9 PC: CH: SA(7: 2:1) 44 1,0
F10 PC: CH: PA (7:2:1) 38 1,0
F11 PC: CH: PA (7:2:0,5) 38 1,0
F12 PC: CH (7:2) 38 1,0
PC: Fosfatidilcolina de soja; CH: Colesterol; SA: Estearilamina (carga positiva); PA: Ácido fosfatídico (carga negativa).
117
Tabela 2 - Avaliação da estabilidade acelerada e a longo prazo das formulações contendo ácido úsnico.
Formulação Agitação (48 h/ 180 movimentos/ min/ 30 °C)
Centrifugação (1 h/ 6000 rpm)
Ciclo gelo-degelo (-18o C/ 16 h e 25 ± 2o C/ 8 h)
Estabilidade em dias (4° C)
F1 Estável Estável 3 ciclos > 180
F2 Estável Estável 3 ciclos > 100
F3 Estável Estável 3 ciclos > 180
F4 Estável Estável 1 ciclo > 100
F5 Estável Estável 3 ciclos > 180
F6 Estável Estável 3 ciclos > 180
F7 Estável Estável 3 ciclos 30
F8 Estável Estável 2 ciclos > 160
F9 Instável Instável 1 ciclo < 30
F10 Estável Instável 1 ciclo < 7
F11 Estável Instável 1 ciclo < 7
F12 * * * *
* As formulações F12 não participaram dos testes de estabilidade devido as mesmas apresentarem sinais de instabilidade logo após formulados.
118
CONCLUSÕES
Capítulo I
• O conhecimento científico a respeito de lectinas conjugadas a superfície de lipossomas
para vetorização sítio-específica de fármacos, está baseado em modificações químicas
através da inserção de grupos reativos em fosfolipídeos e em lectinas. Estas moléculas têm
sua eficácia comprovada como moléculas sinalizadoras para lipossomas e encontra-se
ainda em fase de testes in vitro. Embora os resultados tenham sido encorajadores, a
aplicação intravenosa ainda encontra-se limitada pela captação pelo sistema
retículoendotelial.
• A literatura mostra que lipossomas Con A-conjugada foram efetivos na vetorização de
bactericidas contra bactérias da flora oral sendo considerado um potencial sistema de
vetorização de drogas para controle da placa dentária e gengivites.
Capítulo II
• Sistemas lipossomais sítio-específicos contendo Con A como molécula sinalizadora
encapsularam o antineoplásico doxorrubicina. Lipossomas foram obtidos a partir da
mistura de fosfatidilcolina de soja, colesterol, estearilamina e um derivado fosfolipídico
(DDPE-MBS).
• O método de hidratação do filme lipídico mostrou-se eficiente para encapsular 1,0
µg/ml de doxorrubicina.
• Estes sistemas lipossomais conservaram suas propriedades físico-químicas quando
submetidas aos testes de estabilidade e a forma liofilizada foi capaz de manter as
características por mais de 6 meses;
• Doxorrubicina encapsulada em lipossomas Con A-conjugada apresentou-se ser mais
citotóxica para as linhagens HEp-2 e NCI-H292 do que a doxorrubicina livre. As células
HEp-2 demonstraram ser mais sensíveis ao tratamento do que células NCI-H292;
119
• A atividade hemaglutinante da lectina foi reduzida após conjugação com lipossomas;
• Lectinas conjugadas a lipossomas promoveram aumento na penetração da
doxorrubicina nas células.
• Lipossomas Con A-conjugada apresenta-se como uma forma farmacêutica potencial
para reconhecer células tumorais e aumentar a penetração de doxorrubicina em sítios
tumorais.
Capítulo III
• O ácido úsnico foi encapsulado em lipossomas a partir da mistura de fosfatidilcolina de
soja, colesterol e estearilamina;
• O método de hidratação do filme lipídico mostrou-se eficiente para encapsular o ácido
úsnico com uma concentração máxima de 1,5 µg/ml.
• Estes sistemas lipossomais conservaram suas propriedades físico-químicas quando
submetidas aos testes de estabilidade e permaneceram estáveis na forma liofilizada por
mais de 24 meses. A taxa de encapsulação mostrou que 100 % do fármaco foi encapsulado;
• O perfil de liberação do ácido úsnico em lipossomas convencionais demonstrou que
estes sistemas são potencialmente viáveis para utilização como sistema de liberação
controlada de ácido úsnico;
• A encapsulação de ácido úsnico em lipossomas potencializou a citotoxicidade deste
derivado liquênico para a linhagem HEp-2 e não a alterou para as células NCI-H292.
• O ácido úsnico (Sigma) foi menos tóxico para as linhagens testadas do que o ácido
úsnico obtido de Cladonia substellata.
• Ácido úsnico na forma lipossomal oferece uma alternativa a ser mais bem explorada
para a quimioterapia do câncer.
120
ANEXOS
(Instruções para publicações nos periódicos selecionados)
121
QUÍMICA NOVA (Artigo 1)
ISSN 0100-4042 Impresso ISSN 1678-7064 On-Line QUIMICA NOVA - Órgão de divulgação da Sociedade Brasileira de Química NORMAS DE PUBLICAÇÃO - 2004
GERAL - Serão considerados para publicação na Revista Química Nova manuscritos que cubram as áreas tradicionais da Química bem como artigos sobre Ensino de Química, História da Química, Política Científica, etc. Os trabalhos devem se encaixar dentro de uma das modalidades abaixo:
Artigos Originais (em português, inglês ou espanhol): refere-se a trabalhos inéditos de pesquisa. Devem seguir a forma usual de apresentação, contendo Introdução, Resultados e Discussão, Parte Experimental, etc, de acordo com as peculiaridades de cada trabalho.
Artigos de Revisão (em português, inglês ou espanhol): destinados à apresentação do progresso em uma área específica de Química, contendo uma visão crítica, com o objetivo principal de beneficiar clientela formada por pós-graduandos e não-especialistas da área. O Corpo Editorial de QN poderá, eventualmente, convidar pesquisadores qualificados para submeter artigo de revisão. É desejável que o autor tenha publicações na referida área.
Artigos de Divulgação (em português, inglês ou espanhol): apresentação de algum aspecto ou área de Química, redigido de forma didática, com o objetivo de beneficiar clientela formada por estudantes de graduação, pós-graduação, não-especialistas na área, professores secundários de Química, etc.
Artigos sobre Educação (em português ou espanhol): refere-se a trabalhos de pesquisas relacionadas ao ensino de Química e divulgação de experiências inovadoras no ensino de graduação e pós-graduação.
Notas Técnicas (em português, inglês ou espanhol): destinados à comunicação de métodos, técnicas, aparelhagens ou acessórios desenvolvidos no laboratório de origem do autor do manuscrito.
Assuntos Gerais (em português, inglês ou espanhol): abordagem de assuntos de interesse geral dos químicos, tais como política científica, programas de graduação e pós-graduação, história da química, etc.
PREPARAÇÃO DE MANUSCRITOS - Todos os trabalhos deverão ser enviados em 3 vias, digitados em espaço duplo, utilizando somente Microsoft Word. Deverão ter no máximo 40 páginas, incluindo figuras, tabelas, esquemas, etc. O disquete (3 1/2") ou CD deverá ser enviado somente após a aceitação do trabalho pela Editoria. Todas as páginas devem ser numeradas, inclusive as de figuras, tabelas, gráficos, esquemas, etc. A primeira página deverá conter o título do trabalho, nome e endereço dos autores (consultar o último número da revista). Havendo autores com diferentes endereços estes deverão se seguir imediatamente ao nome de cada autor. Os autores devem ser agrupados por endereço. Indicar com asterisco(*) o autor para correspondência, colocando seu e-mail no rodapé desta página (um só e-mail).A segunda página deverá conter o título e o resumo do trabalho em inglês (ABSTRACT), com no máximo 100 palavras, e a indicação de 3 keywords, também em inglês. As figuras (gráficos, esquemas, etc.) deverão ter qualidade gráfica adequada (usar somente fundo branco). No disquete ou CD, as figuras devem ser enviadas em arquivo eletrônico separado do texto (a imagem aplicada no processador de texto não significa que o original está copiado). Para evitar problemas que comprometam o padrão da Revista, o processo de digitalização de imagens ("scan") deverá obedecer os seguintes parâmetros: para gráficos ou esquemas usar 800 dpi/bitmap para traço; para ilustrações coloridas e fotos (coloridas ou preto e branco) usar 300 dpi/RGB ou grayscale. Em todos os casos os arquivos deverão ter extensão .tif e/ou .jpg. Outras extensões possíveis: .cdr (CorelDraw); .cdx (ChemDraw); .opj/.org (Origin); .xls (Excel); .eps; .wmf. No caso de não ser possível a entrega do arquivo eletrônico das figuras, os originais devem ser enviados em papel vegetal ou impressora a laser para serem escaneados diretamente; as fotografias deverão ser em preto e branco. No caso particular de esquemas contendo estruturas químicas, estas deverão ter sempre a mesma dimensão, para que possam ser reduzidas uniformemente. Considerar que as figuras deverão ter largura de uma coluna (8,5 cm) ou de 2 colunas (17,5 cm). Figuras coloridas tem custo de publicação repassado aos autores, quando da publicação. Para figuras, gráficos, esquemas, tabelas, etc idênticos aos já publicados anteriormente na literatura, os autores devem providenciar a permissão para publicação junto à empresa/sociedade científica que detenha o copyright e enviar à editoria de QN junto com a versão final do manuscrito. As referências serão numeradas consecutivamente no texto, na forma de expoentes; a lista de referências será colocada no final do texto. As legendas das figuras devem ser colocadas em folha à parte, separadas das figuras. A seguir, devem ser colocadas as figuras, os gráficos, os esquemas, as tabelas e os quadros. No texto, apenas indicar a inserção de cada um(a).
122
REFERÊNCIAS Revistas:
Será utilizada a abreviatura da revista como definida no Chemical Abstracts Service Source Index (ver http://www.cas.org/sent.html). Caso a abreviatura autorizada de uma determinada revista não puder ser localizada e não for óbvio como o título deve ser abreviado, deve-se citar o título completo. 1. Varma, R. S.; Singh, A. P.; J. Indian Chem. Soc. 1990, 67, 518. No caso especial da revista citada não ser de fácil acesso, é recomendado citar o seu número de Chemical Abstract, como segue: 2. Provstyanoi, M. V.; Logachev, E. V.; Kochergin, P. M.; Beilis, Y. I.; Izv. Vyssh. Uchebn. Zadev.; Khim. Khim. Tekhnol. 1976, 19, 708. (CA 85:78051s). É recomendado o uso de referências compostas na medida do possível, em lugar de uma lista de referências individuais. O estilo das referências compostas é o seguinte: 3. Varela, H.; Torresi, R. M.; J. Electrochem. Soc. 2000, 147, 665; Lemos, T. L. G.; Andrade, C. H. S.; Guimarães, A. M.; Wolter-Filho, W.; Braz-Filho, R.; J. Braz. Chem. Soc. 1996, 7, 123; Ângelo, A. C. D.; de Souza, A.; Morgon, N. H.; Sambrano, J. R.; Quim. Nova 2001, 24, 473. Patentes: Devem ser identificadas da seguinte forma (na medida do possível o número do Chemical Abstracts deve ser informado entre parênteses). 4. Hashiba, I.; Ando, Y.; Kawakami, I.; Sakota, R.; Nagano, K.; Mori, T.; Jpn. Kokai Tokkyo Koho 79 73,771 1979. (CA 91:P193174v) 5. Kadin, S.B.; US pat. 4,730,004 1988. (CA 110:P23729y) 6. Eberlin, M. N.; Mendes, M. A.; Sparrapan, R.; Kotiaho, T.; Br PI 9.604.468-3, 1999. Livros: 7. Regitz, M. Em Multiple Bonds and Low Coordination in Phosphorus Chemistry; Regitz, M.; Scherer, O. J., eds.; Georg Thieme Verlag: Stuttgart, 1990, cap. 2. 8. Cotton, F.A.: Wilkinson, G.; Advanced Inorganic Chemistry, 5a ed., Wiley: New York, 1988. Programas de computação (Softwares): 9. Sheldrick, G. M.; SHELXL-93; Program for Crystal Structure Refinement; Universidade de Göttingen, Alemanha, 1993. Teses: 10. Velandia, J. R.; Tese de Doutorado, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Brasil, 1997. Material apresentado em Congressos: 11. Ferreira, A. B; Brito, S. L.; Resumos da 20a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Poços de Caldas, Brasil, 1998. Páginas Internet: http://www.sbq.org.br/jbcs, acessada em Junho 2001. Material não publicado: Para material aceito para publicação: Magalhães, U. H.; J. Braz. Chem. Soc., no prelo. Para material submetido mas ainda não aceito: Magalhães, U. H.; J. Braz. Chem. Soc., submetido. Para trabalho não publicado ou comunicação pessoal: Magalhães, U. H.; trabalho não publicado ou Magalhães, U. H., comunicação pessoal. Os resultados não publicados só poderão ser citados com a permissão explícita das pessoas envolvidas na sua obtenção. Quando o trabalho for redigido em idioma inglês, os autores são solicitados a se remeterem às normas do Journal of the Brazilian Chemical Society.
123
SUBMISSÃO DOS ARTIGOS - Os manuscritos devem ser enviados para: Editoria Química Nova Sociedade Brasileira de Química-SBQ, Caixa Postal 26037 05513-970 São Paulo – SP Devem ser acompanhados de carta indicando: a) modalidade do artigo; b) nomes e endereços de três ou quatro possíveis assessores e c) o e-mail do autor para correspondência. MANUSCRITOS REVISADOS - Manuscritos enviados aos autores para revisão devem retornar à Editoria dentro de prazo máximo de três meses ou serão considerados retirados. A Editoria de QN reserva-se o direito de efetuar, quando necessário, pequenas alterações nos manuscritos, de modo a adequá-los às normas da revista ou tornar seu estilo mais claro, respeitando, naturalmente, o conteúdo do trabalho. Qualquer que seja a natureza do manuscrito submetido, ele deve ser original ao nível de metodologia, informação, interpretação ou crítica. A qualificação do trabalho será atestada por, no mínimo, dois consultores, indicados pela Editoria.
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DRUG DEVELOPMENT RESEARCH (Artigo 2) Instructions to Authors Disk Submission Instructions Wiley's Journal Styles and EndNote
Scope
DRUG DEVELOPMENT RESEARCH documents all aspects of the research focusing on the discovery, development and post-marketing surveillance related to new therapeutic entities. The pharmacology, biotechnology and biopharmaceuticals, toxicology, and drug delivery, formulation, and pharmacokinetics. The journal welcomes manuscripts on new compounds and technologies in all areas focused on human therapeutics, as well as global management, health care policy, and regulatory issues involving the drug discovery and development process. In addition to full-length articles, DRUG DEVELOPMENT RESEARCH publishes in-depth review articles. The journal will also feature periodic special thematic issues devoted to specific compound classes, new technologies, and broad aspects of drug discovery and development.
What to submit
1. Diskette in PC compatible format—preferably Microsoft. 2. Three paper copies of the manuscript and figures. 3. Where necessary, copyright permission for use of data previously published. 4. Notation of programs used for text, figure, and table preparation.
NOTE: If all programs used for the preparation of the manuscripts are Microsoft Word-based, submissions can be made electronically.
Submit to:
Dr. Michael Williams Dept. of Molecular Pharmacology and Biological Chemistry Northwestern University Medical School 1130 Walden Lane Lake Forest, IL 60045-3325 USA Fax: 847-615-8547 E-mail: [email protected] or:
Dr. David Gurwitz Department of Human Genetics and Molecular Medicine Sackler Faculty of Medicine Tel-Aviv University Tel-Aviv 69978 Israel Phone & Fax: ++972-3-640-7611 E-mail: [email protected] or:
Prof. Flaminio Cattabeni Institute of Pharmacological Sciences University of Milan Via Balzaretti 9 Milan 20133 Italy Fax: 39-02-5031-8284 E-mail: [email protected]
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Format
English, double-spaced in 10-point size type. Typeface is Arial or Helvetica.
Title page with:
• title; • affiliation of authors with phone, fax, and e-mail information; • running title with a maximum length of 50 characters including spaces; • three to five keywords; • funding/support information; • total number of text pages, figures, tables.
Abstract: Maximum of 250 words on a separate page. Abstract should be intelligible without reference to the rest of the paper.
Text divided into:
• Introduction; • Methods and Materials; • Results; • Discussion; • Acknowledgment.
References
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Tables with full legends on a separate page, numbered in Arabic in order of appearance, with a title, and keyed into text.
Legends to figures on a separate page, numbered in Arabic in order of appearance.
Illustrations
Figures should not duplicate information already presented in tabular form. Black and white figures and illustrations may be submitted in electronic format with the software used clearly identified. All graphics and lettering must be legible after reduction to 25% of original size. Figures must be numbered in order of appearance in the text with Arabic numerals. Color figures should be used sparingly and where the use of color is essential to conveying pertinent scientific information. Authors are responsible for the cost of color reproduction ($950 for the first page) and must indicate agreement to pay such charges prior to acceptance of their paper. For best reproduction, bright, clear colors should be used. Dark colors against a dark background do not reproduce well; please place your color images against a white background wherever possible. Please contact Karen Accavallo via e-mail at [email protected] for further information. All graphics and lettering must be legible after reduction in size. Illustrations must be numbered in order of appearance with arabic numerals and keyed into the text. Name of author, figure number, reduction requested, and an arrow indicating the orientation should be typed on a gummed label and affixed to the back of each illustration. Do not write directly on the back
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of the photo. An illustration or group of illustrations should not exceed 6-3/4” wide by 8-3/4” long (approximately 17.1 cm by 22.2 cm). Illustrations should be enclosed in an envelope.
Reference style
Cite in text as Smith and Jones [2001], Smith and Jones [2002a,b], or Smith et al. [2002]. Parenthetical citations appear as [Smith and Jones, 2002], etc. Abbreviations for journals used in the reference list should conform to Index Medicus. Refer to the following examples when preparing citations:
Journal Article (list all authors and avoid use of et al.): Smith A, Jones B. 2002. Full article title. Jrnl Abbr 1:20–29.
Books: Smith A, Jones B. 2002. Complete book title. New York: John Wiley & Sons. 300 p.
Chapter in Book: Smith A. 2002. Full chapter title: including subtitle, if any. In: Jones B, editor. Book title in full. New York: Wiley-Liss. p 12-34.
Manuscripts for consideration by Drug Development Research must be submitted solely to this journal, and may not have been published in another publication of any type, professional or lay. The journal will not be responsible for loss of manuscripts at any time. Upon acceptance of a manuscript for publication, the corresponding author will be required to sign an agreement transferring copyright to the publisher. All such manuscripts become the property of the publisher, and no material published in Drug Development Research may be reproduced or published elsewhere without written permission from the publisher, who reserves copyright.
Any possible conflict of interest, financial or otherwise, related to the submitted work must be clearly indicated in the manuscript, or in a cover letter accompanying the submission.
All statements in, or omissions from, published manuscripts are the responsibility of authors, who will be asked to review proofs prior to publication. Reprint order forms will be sent with the page proofs. No page charges will be levied against authors or their institutions for publication in the journal.
Disk Submission Instructions
Please return your final, revised manuscript on disk as well as hard copy. The hard copy must match the disk.
The Journal strongly encourages authors to deliver the final, revised version of their accepted manuscripts (text, tables, and, if possible, illustrations) on disk. Given the near-universal use of computer word-processing for manuscript preparation, we anticipate that providing a disk will be convenient for you, and it carries the added advantages of maintaining the integrity of your keystrokes and expediting typesetting. Please return the disk submission slip below with your manuscript and labeled disk(s).
Guidelines for Electronic Submission
Text Storage medium. 3-1/2" high-density disk in IBM MS-DOS, Windows, or Macintosh format.
Software and format. Microsoft Word 6.0 is preferred, although manuscripts prepared with any other microcomputer word processor are acceptable. Refrain from complex formatting; the Publisher will style your manuscript according to the Journal design specifications. Do not use desktop publishing software such as Aldus PageMaker or Quark XPress. If you prepared your manuscript with one of these programs, export the text to a word processing format. Please make sure your word processing program's "fast save" feature is turned off. Please do not deliver files that contain hidden text: for example, do not use your word processor's automated features to create footnotes or reference lists.
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File names. Submit the text and tables of each manuscript as a single file. Name each file with your last name (up to eight letters). Text files should be given the three-letter extension that identifies the file format. Macintosh users should maintain the MS-DOS "eight dot three" file-naming convention.
Labels. Label all disks with your name, the file name, and the word processing program and version used.
Illustrations All print reproduction requires files for full color images to be in a CMYK color space. If possible, ICC or ColorSync profiles of your output device should accompany all digital image submissions.
Storage medium. Submit as separate files from text files, on separate disks or cartridges. If feasible, full color files should be submitted on separate disks from other image files. 3-1/2" high-density disks, CD, Iomega Zip, and 5 1/4" 44- or 88-MB SyQuest cartridges can be submitted. At authors' request, cartridges and disks will be returned after publication.
Software and format. All illustration files should be in TIFF or EPS (with preview) formats. Do not submit native application formats.
Resolution. Journal quality reproduction will require greyscale and color files at resolutions yielding approximately 300 ppi. Bitmapped line art should be submitted at resolutions yielding 600-1200 ppi. These resolutions refer to the output size of the file; if you anticipate that your images will be enlarged or reduced, resolutions should be adjusted accordingly.
File names. Illustration files should be given the 2- or 3-letter extension that identifies the file format used (i.e., .tif, .eps).
Labels. Label all disks and cartridges with your name, the file names, formats, and compression schemes (if any) used. Hard copy output must accompany all files.
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CURRENT PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY (Artigo 3)
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Manuscripts should be submitted to the Editor-in-Chief without prior invitation at the following address:
Dr. Alain P. Rolland,
Editor-in-Chief "Current Pharmaceutical Biotechnology",
Vice President, Product Development,
Vical, Inc., 9373 Towne Centre Drive,
Suite 100, San Diego,
CA 92121-3088, USA;
Phone: +1-858-646-1208;
Fax: +1-858-646-1250;
E-mail: [email protected]
It is advisable that authors submit an abstract to the Editor-in-Chief prior to submitting the full manuscript. The submitted abstract should outline the intended contents and coverage of their article. For full review articles, the manuscript, written in English, should not exceed 70 pages in length (ca. 30 printed pages) and for mini-reviews a maximum of 40 pages in length (ca. 15 printed pages). The manuscript should be typed in double-spacing throughout on A-4 or American quarto paper. Dot matrix print or any print that is difficult to read is unacceptable. Two copies of the manuscript must accompany the original (along with a computer disk) and should be sent to the Editor-in-Chief at his address. All pages should be numbered. Abbreviations should be defined the first time that they are used in the manuscript and a list of abbreviations used should be provided.
Manuscript Organisation: The manuscript should be divided as: Title page, abstract and the main text. The text may be subdivided further according to the areas to be discussed. This should be followed by the Acknowledgement (if any) and Reference sections. The first page should contain the title, the author's names (initials and surname only), with an asterisk (*) in front of the name of the principal author. Financial contributions to the work being reported should be clearly acknowledged, as should any potential conflict of interest.
Abstract: The abstract should not exceed 250 words and it should condense the essential features of the review article, with the focus on the major advances in the field.
Key Words: Authors must supply up to eight key words along with their manuscript.
Text: The main text should begin on a separate page and it may be subdivided into separate sections. The review article should mention any previous important reviews in the field and contain a comprehensive discussion starting with the general background of the field. It should then go on to discuss the salient features of recent developments. The authors should avoid presenting material which has already been published in a previous review. The reference numbers should be given in square brackets [ ] in the text. Acknowledgements should be kept to a minimum.
Tables: * Data tables should be submitted in Microsoft Excel or in Microsoft Word table format.
* Each table should include a title/caption explaining what the table shows. Detailed legends may then follow.
* Tables should be given on separate pages with indications on the left hand margin to the text, as to the appropriate placement of the tables.
* Tables should not contain vertical rules.
* Columns and rows of data should be made visibly distinct by ensuring the borders of each cell display as black lines.
* Tables should be numbered consecutively in order of their citation in the body of the text, with Arabic numerals.
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* If a reference is cited in both the table and text, insert a lettered footnote in the table to refer to the numbered reference in the text.
* Tabular data provided as additional files can be submitted as an Excel spreadsheet.
Figures / Illustrations: All authors must strictly follow the guidelines below for preparing illustrations for publication in Current Pharmaceutical Biotechnology.
Editorial Requirements:
The quality of the illustrations printed in the journal largely depends on the quality of the figures/illustrations provided by the author. In preparing artwork or graphics for publication, keep in mind the following points.
* Submit the original artwork or a photographic print of the original for publication.
* Do not submit photocopies (Hardcopy submission requirement).
* Illustrations should be provided as separate files, not embedded in the text (Hardcopy submission requirement).
* Remove all color from graphics except for those illustrations (Greyscale), which are intended to be printed in color.
* Good quality of hardcopy originals are a requirement.
* Figures/illustrations cannot be modified or enhanced by the journal production staff.
* Figures should be referred to as “Fig. (1)”, “Fig. (2)” etc. in the text with figure numbers in bold within round bracket.
* Revised manuscripts should contain a complete set of artwork and photographs.
Technical Details:
* Figures should be provided on high quality, white, smooth opaque paper (Hardcopy submission requirement).
Format & Resolution:
* The following file formats can be accepted. (Preference in order of appearance) PDF, TIFF, JPEG, GIF.
* Illustrations must fit a single or double column format on the journal page, according to the following guideline below:
HEIGHT WIDTH
SINGLE COLUMN 24 cm (max) 8.5 cm (max)
DOUBLE COLUMN 24 cm (max) 18 cm (max)
* Whenever possible, submit graphics that do not have to be reduced to fit the standard figure size.
* Use the best resolution available (hardcopy submission requirement). For online submission the maximum resolution is 300 dpi.
* Avoid textures and shadings giving a three-dimensional effect to the illustration.
* Symbols and lettering in the illustration should be of similar size.
* Smaller lettering is used.
* Font: Times New Roman or Helvetica is preferable Font size: 10pt (maximum).
* Line drawings should have clear and sharp lines and should be of uniform density. Moreover, lines should be continuous without any breaks.
* Do not use lines thinner than 1 point.
Color Figures/Illustrations: * One color plate will be published free of charge in each article. The cost for the first additional published page of color figures is US$ 605; the second additional page will be for US$ 440, and each subsequent page for $ 303.
* Color figures should be supplied in CMYK not RGB colors.
* Required resolution for online submission is 300 dpi. In case of hardcopy submission, please use the maximum resolution available.
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Photographs: Submit high-contrast prints that are of single- or double-column width so that they will not have to be reduced when printed. Negatives are not acceptable. However, in case of hardcopy submission, color illustrations and plates can be published from 35 mm color slides.
Chemical Structures: Chemical structures must be drawn according to the guidelines below.
Structures should be drawn using a suitable drawing program e.g. ChemDraw and provided as separate file, submitted both on disk and in printed formats.
Numbers in bold should identify all chemical structure. If a name is also used to describe the compound, the associated number if required, should be in bold and parenthesis, e.g. “compound (1)”.
Structure Drawing Preferences:
[As according to the ACS style sheet]
Drawing Settings:
Chain angle 120o
Bond spacing 18% of width
Fixed length 14.4 pt (0.500cm, 0.2in)
Bold width 2.0 pt (0.071cm, 0.0278in)
Line width 0.6 pt (0.021cm, 0.0084in)
Margin width 1.6 pt (0.096cm)
Harsh spacing 2.5 pt (0.088cm, 0.0347in)
Text settings:
Font Times New Roman / Helvetica
Size 10pt
Under the Preference Choose:
Units points
Tolerances 3 pixels
Under Page Setup Use:
Paper US letter
Scale 100%
Structures: The chemical structures must be drawn in ChemDraw (any version) and should be provided as separate file and submitted both on disk and printed formats. The structures should fit into a width of 8 cm (for structures to be inserted within single column widths) or a width of 18 cm (for structures or schemes to be inserted in double column widths).
References: All references must be numbered in the text in square brackets, e.g. [4], or [7,10-15], in order of citation in the text. Titles of journals are abbreviated according to the Chemical Abstract Service Source Index, example:
[1] Robertson, M.P. and Ellington, A.D. (1999) Nat. Biotechnol., 17(1), 62-66.
[2] Meyer, M.C.; Straughn, A.B.; Mhatre, R.M.; Shah, V.P.; Williams, R.L. and Lesko L.J. (1998) Pharm. Res., 15(11), 1787-1791.
[3] Bebbington, C.R. (1995) in Monoclonal Antibodies - The second generation, (Zola, H., Ed.), Bios Scientific Publishers, Oxford, pp. 165-181.
Abstracts, unpublished data and personal communications (which can be only included if permission has been obtained) should not be given in the references section but they may be mentioned in the text and details provided as footnotes. All authors of referenced papers must be cited and there must be no use of the short hand version of et al. when citing authors.
Manuscript Submission: Two copies of the manuscript must accompany the original along with the soft copy of the manuscript on a computer floppy disk(s) in MS Word file format (or created in any other well-known word processing software) should be submitted. To achieve rapid publication authors are encouraged to e-mail or fax their submission to the appropriate editorial office (see above) at the same time that they mail the manuscript. For even faster publication, authors are encouraged to submit their entire manuscript via Bentham’s online
131
submission service (see below). Authors must provide their full address, telephone and fax numbers with e-Mail address with all submissions.
For expedient and speedy reviewing of author's manuscripts, authors are strongly advised to include the PDF file of their manuscript on a floppy or zip disk, into the mailing material. At the same time the package is mailed, please also send by e-mail a copy of the PDF file of the manuscript to the editorial office.
Online Manuscript Submission: (preferable)
To facilitate speedy and cost-effective submission of abstracts and manuscripts, an online submission and tracking service via internet is being offered. Once the Editor-in-Chief of the journal has accepted your abstract, we would prefer that you submit your full manuscript online via our online submission service available at www.bentham-mps.org
For online submission, please provide your complete manuscript in the form of a single zipped folder containing all the material (main text, figures/ illustrations, scanned photographs, tables, chemical structures drawn in ChemDraw) as separate files and a PDF version of the entire manuscript with all the figures / illustrations / tables / chemical structures etc., embedded in the text exactly in the manner as they should appear in printing. Authors are required to proofread the PDF version of their manuscript before submission. The article will be published exactly as received and the Publishers will not be responsible for any error occurring in the manuscript in this regard.
You may, however, still submit your abstracts and manuscripts through conventional surface mail.
Page Charges: No page charges will be levied to authors.
Proofs: Authors are sent page proofs. To avoid delays in publication, proofs should be checked immediately for typographical errors and returned within 48 hours. Major changes are not acceptable at the proof stage.
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