linz 2004: abstracts der vorträge und poster · resulted in 100% and 64% lethality for 15 and 3...

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Under conventional static cell culture it isnot possible to conduct true chronic toxi-city testing, defined as repeated or contin-uous exposure over a prolonged period oftime. Therefore, we utilised a perfusionculture apparatus (EpiFlow, Felder et al.,2002) to test the toxic effects of CdCl2

occurring during an administration periodof 4 days. CdCl2 is well known to inducechronic toxicity in the kidney.

Using static culture of LLC-PK1 cells,the NOEL and the EC50 of CdCl2 weredetermined to be 3 µM and 15 µM, re-spectively, after 72 h incubation by therelease of LDH (lactate dehydrogenase)and AK (adenylate kinase).

Therefore, perfusion experiments ofLLC-PK1 cells cultured on solid sub-

strates in the EpiFlow with 0 µM, 3 or 15 µM CdCl2 in continuously oxygenat-ed DMEM containing 1% FCS were performed over 4 days. Samples werecollected at regular intervals and anal-ysed for the activity of LDH and AK re-leased. In addition, glucose consumptionand lactate production were monitored.The viability of the cells was evaluatedusing a resazurin based assay at the endof the experiments.

Under perfusion conditions, CdCl2

resulted in 100% and 64% lethality for15 and 3 µM, respectively, as assayed by resazurin.

Administration of 15 µM CdCl2 in-creased LDH and AK release, as well as lactate production, showing peak con-

centrations after 12 h of perfusion, and a subsequent decrease to values signifi-cantly below control.

These results indicate a greater suscep-tibility of the LLC-PK1 cells to CdCl2

in perfusion culture than under staticconditions. Furthermore, the feasibilityof on-line monitoring of the lactate production as a novel indicator of celltoxicity under perfusion conditions wasshown.

Felder, E., Jennings, P., Seppi, Th. and Pfaller,W. (2002). LLC-PK1 Cells Maintained in aNew Perfusion Cell Culture System Exhibit anImproved Oxidative Metabolism. Cell. Physiol.Biochem. 12, 153-162.

Linz 2004:

Abstracts der Vorträge und Poster(alphabetisch nach Erstautor/inn/en geordnet, bei Vorträgen ist der Vortragende zuerst genannt)

Poster

Evaluation of perfusion culture using the EpiFlow for long term toxicity testing of chemicalsThomas Abberger, Paul Jennings and Walter PfallerDepartment of Physiology, Medical University, A-Innsbrucke-mail: [email protected]

Since metabolomics and proteomicshave become a permanent growing domain, miniaturisation of analyticalsystems and their coupling to mass spectrometry (MS) is one of the most im-portant issues in analytical chemistry.Most interesting analyses are often avail-able in small amounts and therefore,multidimensional liquid-chromatogra-phy offers the possibility of sample

purification and pre-concentration alsofor in vitro analysis.

Columns and packing materials,porous, non-porous, monolithic and encapsulated are the core of the separa-tion column. Capillary columns packedwith 2 µm non-porous poly-(styrene-divinylbenzene (PS/DVB), with a PS/DVB or poly-(glycidyl methacrylate/divinylbenzene) (GMD/DVB) monolith

of the stationary are especially favor-able for the fabrication of capillarycolumns having 20 up to 300 µm i.d..Due to the presence of micro-, meso-and macro-pores capillaries packed with a PS/DVB monolith allow high ef-ficiencies (up to 250,000 plates), betterpeak shapes (halved peak width < 2s),reduced analysis time and improved pH-stability. Furthermore, monolithic

Vortrag/Lecture

Metabolomics and proteomics for the analysis of in vitro samplesGünther K. Bonn, Günther Stecher and Christian W. Huck Institute of Analytical Chemistry and Radiochemistry, Leopold-Franzens University, A-Innsbrucke-mail: [email protected]

LINZ 2004: ABSTRACTS

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PS/DVB discs (3 mm x 10.6 mm i.d.)can be used for the selective pre-con-centration of bio-molecules using 2-dimensional liquid chromatography.The efficiency of this system will beshown by the separation of a protein andphenolic compound standard mixture.Encapsulation of silica particles (300 Å,3 µm) with monolithic PS/DVB in capillary columns enables the separa-tion of proteins and peptides with im-proved resolution. Comparable efficien-

cies were achieved using GMD/DVBmonolithic capillary columns. Due tothe low flow rate of 2-3 µl/min the coupling to a mass spectrometer (MS)via an ESI interface after separation into 2 dimensions is extremely efficient.As an alternative fractions can also bespot on a target plate for further analysisby MALDI-Tof (MS). GMD and cellu-lose derivatised with iminodiacetic acid(IDA) and loaded with copper (II) offeran excellent target for the search of

biomarker proteins and metabolites forthe early detection and diagnosis of certain diseases by surface enhancedlaser desorption ionisation (SELDI)time of flight (TOF) mass spectrometry(MS).

The efficiency of both technologies using the above described stationaryphases also in 2 dimensions will bedemonstrated by the analysis of a num-ber of real applications in metabolomicsand proteomics.

Die Fachdatenbank AnimAlt-ZEBET für Ersatz- und Ergänzungsmethoden zu Tierversuchen ist darauf ausgerichtet,aktuelle Themen aufzugreifen, kompaktaufzubereiten und inhaltlich strukturiertanzubieten, um einen einfachen Zugangzu Information zu ermöglichen.

AnimAlt-ZEBET wird von ZEBET,der Zentralstelle für Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungs-methoden im Bundesinstitut für Risiko-bewertung (BfR), erstellt und seit Februar 2000 über das Deutsche Institutfür Medizinische Dokumentation und In-formation (DIMDI, http://www.dimdi.de)kostenfrei im Internet angeboten. DIMDIermöglicht durch eine spezielle Re-cherchetechnik den Zugriff zu den Da-tenbeständen von mehreren Datenbankengleichzeitig und erzielt dadurch ein rasches Auffinden von Information.

Im aktuellen Bestand der AnimAlt-ZEBET befinden sich 115 Dokumente,in denen überwiegend Alternativmetho-den zu behördlich vorgeschriebenenTierversuchen übersichtlich in englischerSprache beschrieben werden. Die Dar-stellung gliedert sich in Hintergrundin-formationen zum Anwendungsbereich,Beschreibung von Prinzip und Durch-führung der Methode und eine zusam-menfassende Bewertung mit einer Listeder relevantesten Literaturstellen. In jedem Dokument wird der derzeitigeStand der Entwicklung und der wissen-schaftlichen und behördlichen Aner-kennung der Methode im nationalen undinternationalen Rahmen vermerkt. EineBesonderheit von AnimAlt-ZEBET istdie wissenschaftlich begründete Ein-stufung jeder Alternativmethode nachdem 3R-Konzept von Russel & Burch

(Grune et al., ATLA 32, Suppl. 1B, 573-582).

AnimAlt-ZEBET dokumentiert Me-thoden aus allen Gebieten der Biomedi-zin, u.a. Toxikologie, Pharmakologie,Molekularbiologie, Biophysik, Medizin,Impfstoffkunde, Lebensmittelhygieneund Parasitologie. Beispiele für aktuelleThemenbereiche sind in vitro Hautmo-delle, in vitro Phototoxizitätstestung,RNA-Interferenz, Clostridium-Vakzine,Ersatz von Kälberserum in der Zell-kultur, Biosensorik und nicht-invasivebildgebende Verfahren.

Anhand einer kleinen Auswahl vonDokumenten wird demonstriert, wie diesystematische Suche in AnimAlt-ZEBETauf den Nutzer zugeschnittene fach-spezifische Information vermittelt undRecherchen in allgemeinen Datenbankenund damit Zeit ersparen kann.

Poster

[Information on alternative methods provided on the internet by the database “AnimAlt-ZEBET”]Informationsangebot der ZEBET-Datenbank „AnimAlt-ZEBET“ im Internet zu aktuellen Themen auf dem Gebiet der Alternativmethoden zu TierversuchenRainer Box, Barbara Grune, Antje Dörendahl, Susanne Skolik, Heinz Wohlgemuth und Horst SpielmannZentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch (ZEBET), Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), D-BerlinE-Mail: [email protected]


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Nachdem der Fischeitest mit Eiern des Zebrabärblings (Danio rerio) im Rahmen eines DIN-Verfahrens für diePrüfung der toxischen Wirkung von Abwässern genormt worden war (DIN38415, Teil 6: „Bestimmung der nichtakut giftigen Wirkung von Abwasser aufdie Entwicklung von Fischeiern überVerdünnungsstufen”, wurde dieses Ver-fahren bereits im Jahr 2002 in der Ab-wasserverordnung der BundesrepublikDeutschland als gleichwertig mit demklassischen Fischtest (DIN 38412 L31:„Bestimmung der nicht akut giftigen

Wirkung von Abwasser gegenüber Fischenüber Verdünnungsstufen”) verankert.

Im Abwasserabgabengesetz verbliebder klassische Fischtest jedoch zunächstals das einzig zulässige Referenzver-fahren für die Bemessung der Abwasser-abgabe. Nur in Bayern wurde der Fisch-eitest in der routinemäßigen Abwasser-überwachung routinemäßig eingeführt,wobei bei Überschreitung der zulässigenImmissionshöchstwerten zunächst nachwie vor der Fischtest zur Festlegung derAbwasserabgabe durchgeführt werdenmusste.

Im Frühjahr 2004 folgte jedoch eineanaloge Änderung des Abwasserab-gabengesetzes, so dass mit Ablauf einerÜbergangsfrist bis zum 1.1.2005 der Fischeitest den klassischen Goldorfen-test vollständig ersetzt. Als Begründungwerden neben tierschutzrechtlichenÜberlegungen eine bessere Reproduzier-barkeit und eine verbesserte statistischeSicherheit genannt. Das Verfahren desFischeitests wurde international in mo-difizierter Form mittlerweile sowohl alsISO-Norm für die Prüfung von Abwäs-sern als auch als Vorschlag für eine

The presented studies were performed inorder to examine whether the in vitromodel of the isolated perfused bovineudder is suitable for predictive examina-tions on the bioavailability of drugs ad-ministered sublingually or orally in hu-mans. For this investigations, theabsorption of intracisternally adminis-tered test formulations, namely glyceroltrinitrate (GTN) – the active ingredient in sublingual sprays – and d-limonene, 1,8-cineole as well as a-pinene (ingredi-ents of Myrtol® standardised, Pohl-Boskamp) was studied.

The organs used in this examinationswere obtained at the slaugtherhouse from

healthy and lactating Holstein-Frisiancows. Thirty minutes after slaughter, udder perfusion was re-established withgassed milk/tyrode solution (1:1) for ex-periments with Myrtol®, and with tyrodecontaining phosphatidyl choline for ex-periments with GTN formulations.

Significant differences in the absorp-tion of GTN were found for the sublin-gual formulations. These data are in accordance with bioavailability studiesperformed in humans. After intracister-nal administration of Myrtol®, about 7 mg 1,8-cineole were absorbed within a perfusion period of four hours. In contrast, d-limonene and a-pinene were

not always detectable in the perfusate.These data also correlate with resultsfrom studies in humans.

In conclusion, the use of the isolatedperfused bovine udder for studies on the absorption of intracisternally admin-istered compounds is possible. The results of the presented studies reflect acorrelation with bioavailability studies in humans and seem to be of predictivevalue. By using this in vitro model incomparable pharmacokinetic studies, the isolated perfused bovine udder maycontribute to a reduction of animal inves-tigations.

Poster

The isolated perfused bovine udder – a predictive model for mucous membrane absorptionMichael Braun1, Heidi Horst2, Alexandra Hahn2, Thomas Wittig 2, Kathrin Maurer 3, Bernhard Scheidel 3 and Manfred Kietzmann1

1Dept. Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, University of Veterinary Medicine Hannover Foundation, D-Hannover, 2Pohl-Boskamp GmbH & Co, D-Hohenlockstedt, 3ACC GmbH, D-Leidersbache-mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

[The German egg test as an alternative to the fish test? Development, routine use and application beyond acute toxicity]Der Fischeitest als Alternative zum Fischtest – Entwicklung, Einsatz als Routinetest und weitereAnwendungsmöglichkeitenThomas BraunbeckAquatische Ökologie und Toxikologie, Institut für Zoologie, Universität D-HeidelbergE-Mail: [email protected]


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OECD Guideline für die Prüfung vonChemikalien eingebracht.

Der Vortrag stellt zunächst detailliertdas Verfahren des Fischeitests in der routinemäßigen Anwendung nach DINvor. Anwendungsbeispiele sollen jedoch

im Anschluss zeigen, dass der Fischeitestnicht nur für die Ermittlung akuter undsubakuter Toxizität geeignet ist, sonderndass das Modell Fischei z.B. auch für dieUntersuchung der toxischen Wirkungvon Sedimenten eingesetzt werden kann.

Die Integration neuer Endpunkte ge-stattet schließlich auch die Bestimmungspezifischerer Endpunkte wie Gentoxi-zität oder dioxinähnliche Aktivität mitHilfe von Fischeiern.

The Embryonic Stem Cell Test (EST)represents a promising in vitro assay forthe detection of the teratogenic/embryo-toxic potential of chemicals and drugs.The scientifically validated EST takesadvantage of the capacity of embryonicstem cells (ES cells) to differentiate intoseveral cell types. In the validated ESTprotocol, the inhibition of differentiationof undifferentiated ES cells into con-tracting myocardial cells is evaluated bymicroscopic analysis. In combinationwith the detection of the cytotoxic potential of the same test compound andby the use of a biostatistical predictionmodel (PM), the EST is able to discrim-

inate between three classes of embryo-toxicity with high accuracy.

In a joint BMBF project the EST hasbeen successfully improved by imple-menting molecular endpoints of differen-tiation to replace the microscopic analy-sis and to reduce the test duration. Wehave examined the expression of cardiac-specific proteins in ES cell cultures by indirect flow cytometry analysis. The results obtained during a pre-validationstudy using 10 different chemicals willbe presented.

To expand the field of application newattempts will be made considering fol-lowing key aspects: (1) For evaluation

and consolidation of the PM the enlarge-ment of the database is required. (2) Ametabolic system as an adjunct to thevalidated EST protocol has to be devel-oped because in its present form, the ESTis only applicable for compounds that donot need metabolic activation. (3) In or-der to avoid false negative classificationsand to improve the precision of the EST,other cell-type-specific endpoints of differentiation have to be established inaddition to the cardiac differentiation.

In summary, the improved EST willrepresent an important tool for hazardidentification in the risk assessment pro-cess.

Bei der Prüfung auf toxische Stoffe nachDIN EN 71-3 (Sicherheit von Spielzeug,Migration bestimmter Elemente/Schwer-metalle) wird unter Bedingungen extra-hiert, die einem Verbleib im Verdauungs-

trakt nach dem Verschlucken entspre-chen. Dazu wird eine zweistündige Inku-bation bei 37°C in 0,07 M Salzsäure mitnachfolgender chemisch-analytischerBestimmung der Konzentration der ge-

lösten und somit bioverfügbaren Einzel-komponenten durchgeführt. Die Prüfungist dann bestanden, wenn die Grenzwerteunterschritten werden. Dabei unberück-sichtigt bleibt jedoch, dass das Verfahren

Vortrag/Lecture

[Mobilisation of hazardous substances in the digestive tract model: cell biological screening of bioavailability and acute toxicity]Digestionsmodell und Schadstoffmobilisierung:Zellbiologisches Screening von Bioverfügbarkeit undAkuttoxizitätPeter C. Dartsch1, Elke Lacher1 und Ursula Kleinteich2

1Institut für zellbiologische Testsysteme (IZT), Dartsch Scientific GmbH, D-Horb a.N., 2Institut für angewandte Forschung (iaf), FH Heilbronn, D-HeilbronnE-Mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

Current improvements in the embryonic stem cell test (EST)Roland Buesen, Anke Visan, Birgitta Slawik, Katharina Schlechter, Elke Genschow, Horst Spielmann and Andrea SeilerNational Center for Documentation and Evaluation of Alternative Methods to Animal Experiments (ZEBET), Federal Institute for Risk Assessment (BfR), D-Berline-mail: [email protected]


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lediglich den Einfluss der Magensäureund nicht des gesamten Verdauungstrak-tes erfasst und zudem mögliche toxischeKombinationswirkungen der Einzel-komponenten, deren Konzentrationen im subtoxischen Bereich liegen, nicht er-fasst werden.

Basierend auf der E DIN 19738 (2000-05) wurde ein Modell des Verdauungs-traktes (Digestionsmodell) entwickelt,das erlaubt, die Schadstoffmobilisierungin den verschiedenen Teilabschnitten(Speichel, Magen, Darm) zu untersu-chen. Diese drei verschiedenen Stufenbesitzen im Modell nicht nur den spe-zifischen pH-Wert, sondern auch die charakteristischen Elektrolyt-, Schleim-substanz- und Enzymkonzentrationen.

Vergleichend wurde entsprechend derDIN EN 71-3 ausschließlich mit 0,07 MSalzsäure extrahiert.

An Wachsmalstiften und abgebundenenKlebstoffen wurde beispielhaft die Schad-stoffmobilisierung, Bioverfügbarkeit unddie toxische Kombinationswirkung der solubilisierbaren Komponenten durch zell-biologisches Screening mit etabliertenZelllinien (Nieren- und Leberzellen; A-498 und Chang Liver) untersucht.

Die Ergebnisse zeigen, dass in allendrei Stufen des Digestionsmodells keineSchadstoffmobilisierung stattfindet oderbioverfügbare und akuttoxisch wirkendeSubstanzen extrahiert werden. Dies giltebenfalls für die Verwendung von 0,07 MSalzsäure als Extraktionsmedium. Die

dreitägige Inkubation der Zellen beiderZelllinien ergab mit allen getesteten Extrakten keine signifikante Verminde-rung der Zellvitalität oder Wachstums-rate im Vergleich zu den entsprechendenKontrollkulturen. Obwohl in diesen beiden Beispielen kein Unterschied zwischen den Ergebnissen des Digesti-onsmodells und der Salzsäureextraktionfestgestellt werden konnte, ist die Durch-führung der Untersuchungen zur Schad-stoffmobilisierung, Bioverfügbarkeit und toxischen Kombinationswirkung ineinem zellbiologischen Modell eine sinn-volle Ergänzung zu der vorgeschriebenenDIN EN 71-3 und hilft, die Anwender-sicherheit bei den verschiedensten Pro-dukten zu erhöhen.

Im zahntechnischen Labor werden beider mechanischen Bearbeitung von Metallen, Legierungen, Mineralstoffen,Sinterkeramiken, Gips, Einbettmassenund Kunststoffen komplexe Gemischegesundheitsgefährdender Stäube frei-gesetzt. Ziel dieser Studie war, das Gefährdungspotenzial verschiedenerMischstaubproben, die aus dem Parti-kelabscheider der Absauganlage ge-wonnen wurden, durch ein zellbiologi-sches Screening zu untersuchen undeine Abschätzung des gesundheitlichenRisikos vorzunehmen.

Es wurden fünf Mischstaubprobenuntersucht: (1) Strahlsand kontaminiertmit Einbettmasse; (2) Nicht-Edelme-tall/Edelmetall/Kunststoff; (3) Edelme-tall/Keramik; (4) Nicht-Edelmetall und(5) Mischstaubprobe aus der zentralen

Absauganlage. Die Extraktion der Pro-ben (1 g Testsubstanz auf 5 ml Extrak-tionsvolumen) erfolgte für 24 h bei37°C mit Kulturmedium (pH 7,4), syn-thetischer saurer Schweißlösung nachEN ISO 105-E04 (pH 5,5) zur Simula-tion der dermalen Belastung, und Speichelersatzlösung nach ISO 10271(pH 2,3) zur Simulation der oralen Aufnahme. In Anlehnung an DIN EN10993-5 wurden Fibroblasten der Zell-linie L-929 drei Tage mit den sterilfil-trierten Extrakten in den Verdünnungen1:5 bis 1:40 inkubiert. Die Bestimmungder Zellvitalität bzw. Wachstumsrate er-folgte durch Zellzählung.

Alle untersuchten Mischstaubprobenzeigten eine dosis- und pH-abhängigetoxische Wirkung. Der Vergleich derED50, d.h. der Konzentration, die zu

einem 50%-igen Verlust der Zell-vitalität führt, ergab folgende Reihen-folge der Zytotoxizität: (2)>>(5)>(3)>(4)>(1). Damit ist das gesundheitlicheRisiko bei einem universellen zahn-technischen Arbeitsplatz mit Abstandam größten.

In die Mundhöhle von Patienten eingesetzte Dentalmaterialien werdeneinem Test auf Biokompatibilität unter-zogen. Hingegen wird die Gefährdungdes zahntechnischen Personals durchdie bei der Bearbeitung von dentalenWerkstoffen freigesetzten feinstenStaubpartikel in der Regel vernachläs-sigt. Aufgrund der komplexen Stoff-gemische in zahntechnischen Laborssind gesetzliche Staubgrenzwerte nurbedingt anwendbar, da sie nur für reineEinzelsubstanzen gelten und toxische

Poster

[Dust in dental laboratories: risk assessment by cell biological screening of its toxic potential]Staubbelastungen im zahntechnischen Labor: Abschätzung des gesundheitlichen Risikos durch zell-biologisches Screening des toxischen PotenzialsPeter C. Dartsch1, Klaus Drysch2, Ursula Kleinteich3 und Kurt Zubler4

1Institut für zellbiologische Testsysteme (IZT), Dartsch Scientific GmbH, D-Horb, 2Institut für Arbeits- und Sozialmedizin der Universität, D-Tübingen, 3Institut für angewandte Forschung (iaf), FH Heilbronn, D-Heilbronn, 4Zubler Gerätebau GmbH, D-Ulm-JungingenE-Mail: [email protected]


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Kombinationseffekte nicht berücksich-tigen. Dagegen erlaubt es ein zellbio-logisches Screening mit einem ent-sprechend konfigurierten Testverfahren,

die Gesamttoxizität aller vorhandenenEinzelsubstanzen zu bewerten und zudokumentieren. Aus diesen Unter-suchungen geht auch hervor, dass eine

effiziente und regelmäßig gewarteteAbsaugeinrichtung im zahntechnischenLaborbereich dringend erforderlich ist.

The roundworm C. elegans is widely usedfor genetic studies. In addition, some pub-lications describe its use as living biomon-itor in ecotoxicology. We were interestedto test its suitability as a pre-screeningmodel to assess toxicity of pharmaceuticalcompounds. Advantages of C. elegans are:it can be handled easily, is inexpensive, re-produces fast, and has a high progeny. Weused the epithelial growth factor receptor(EGFR) inhibitors BIBU1361, falnidamoland the inactive analogue BIBU1476. Forthese compounds rodent toxicity data wereavailable.

Two parameters were used to determinetoxicity: 1) lethality induced by the com-pounds, 2) stress response after exposureto compounds. The stress responses werestudied in the transgenic strain PC72which carries a lacZ/hsp-16 construct.Stress induces hsp-16 induction leading toß-galactosidase expression which can bevisualised by histochemical staining withX-Gal.

We found the following rank order forlethality: BIBU1361 > falnidamol >>BIBU1476. A similar ranking was ob-tained for the induction of ß-galactosidase

in PC72. The induction of ß-galactosidasewas concentration dependent for eachcompound. Our data demonstrate that thecompounds induced hsp16-mediatedstress responses and lethality in C. elegans.The toxic potencies of the compoundswere similar as observed in rodent toxicitystudies. Therefore C. elegans and its trans-genic strain PC72 may be suitable as a fastand simple pre-screening model for toxi-city. This approach may allow a more rational choice of compounds for pre-clinical development and therefore a re-duction of animal tests.

Poster

Caenorhabditis elegans as pre-screening model to test toxicity of pharmaceutical compoundsMarlene DenggA-Viennae-mail: [email protected]

Humane Zelllinien sind heute fester Bestandteil in den Laboratorien der bio-technologischen und biomedizinischenForschung. Ein signifikanter Teil von Ergebnissen dieser Forschung kann sichals irreführend herausstellen, wenn Zellennicht (mehr) ihrer ursprünglichen Her-kunft entsprechen. Diese Kreuzkontami-nation von Zellkulturen ist ein chroni-sches und nach wie vor unterschätztesProblem in Forschung und Wissenschaft.

Verschiedene Techniken zur Bestim-mung des genetischen Fingerabdruckswurden Anfang der 90er Jahre eingesetzt,um die Identität und Authentizität von

Zelllinien zu überprüfen. Jüngste Studienhaben ergeben, dass der Prozentsatz humaner Zelllinien, die während des Etablierungsprozesses kreuzkontaminiertwurden, mit durchschnittlich 15% uner-wartet hoch ist. Um die Identität und Authentizität von humanen Zelllinien zugewährleisten, setzt die DSMZ heute dieverfeinerte Technik der sogenannten Fluoreszenz PCR Technik ein, die die Ver-vielfältigung von variationsreichen Ortenin der Erbsubstanz ermöglicht und somiteine robuste Technik zur Qualitätsüber-wachung darstellt. Die Phänomene derMikrosatelliteninstabilität (MSI) und der

Verlust der Heterozygosität (LOH) stellenSonderfälle in der kontinuierlichen Zell-kultur dar, die ausführlich geschildertwerden. Mit Hilfe der Oberflächenanaly-sen von Zellen und insbesondere durchcytogenetische Analysen der Chromo-somen bestehen innerhalb der DSMZ weitere technische Möglichkeiten, die zurIdentitätsfindung einer Zelllinie beitragenkönnen. Abschließend werden Maßnah-men und Verhaltensregeln vorgestellt, dieeiner Kreuzkontamination vorbeugen underforderliche Standards in der Zellkultureinführen.

Vortrag/Lecture

[Short tandem repeat (STR) DNA typing as an international reference technique for human cell lines]Short tandem repeat (STR) DNA Typisierung alsinternationale Referenztechnik für humane ZelllinienWilhelm Dirks, Silke Fähnrich, Isabelle Estella und Hans G. DrexlerDSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, D-BraunschweigE-Mail: [email protected]


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Most animal studies concerning tissueengineered autografts are still conductedusing FCS supplemented culture media.Honestly they should be referred to asxenografts! Serum free cell culture repre-sents an adequate alternative, but re-quires careful adaption of sensitive celllines and often shows lower proliferationrates. As the usage of autologous serumhas become state of the art in human tis-sue engineering applications, but is stilluncommon in animal trials, the authorscompared cell characteristics under FCS-supplemented, autologous serum supple-mented or serum-free conditions usingsheep primary meniscus cells.

Primary cells were cultured in DMEM/F12 supplemented with 0,05 mg/mlAscorbic Acid, 100 U/ml Penicillin and100 µg/ml Streptomycin and either 10%FCS, 10% autologous serum or 2% (v/v)

Insulin-Transferrin-Selenium-Supple-ment. Cell Proliferation and cell mor-phology were evaluated. Histologic char-acterization was performed using AlcianBlue, Azan, Safranine O and antibodiesagainst Collagen Type I and II. After expansion in monolayer, pellets werecreated and DNA content and the syntheses of glycosaminoglycans wereevaluated.

Cell culture was successful under all tested conditions, but morphologicappearance was clearly different. Thebest proliferation results could be ob-tained with autologous serum, followedby FCS expansion. Serum free culturedprimary cells showed a slower prolifera-tion rate, but maintained a differentiatedphenotype during monolayer expansion.In contrast, FCS supplemented cultureslost their differentiated phenotype after

a couple of days. Cells maintained in autologous medium showed a more dif-ferentiated phenotype compared to FCSsupplemented cultures. Glycosaminogly-can (GAG) production was highest inserum free cultured cells and lowest inFCS supplemented cultures.

The usage of autologous serum can re-duce dedifferentiation phenomenons incells derived from avascular tissues dur-ing primary culture. Additionally, autolo-gous cell culture increases proliferationrate and GAG production while evadingthe risk of an immunological reaction ordisease transmission. Histologic appear-ance, proliferation rate and GAG produc-tion clearly differ under each culture con-dition, so that the results obtained duringFCS supplemented culture can not auto-matically be assigned to autologous culture conditions.

Vortrag/Lecture

Usage of autologous serum instead of Foetal Calf Serum (FCS): does it make a difference?Claudia Eder 1, Erwin Falkner 2, Michael Mickel3, Günter Brand1, Ronald Dorotka1, Udo M. Losert 2 and Stefan Nehrer 1

1Dept. of Orthopaedic Surgery, Medical University A-Vienna, 2Institute of Biomedical Research, Medical University A-Vienna,3Ludwig Boltzmann Institute for Applied Cardiovascular Surgery, A-Viennae-mail: [email protected]

The HET-CAM (Hen Egg Test-Chorioal-lantoic Membrane) test has originallybeen developed for toxicity and irritationstudies by the pharmaceutical industries.As an intermediate in vivo/in vitro sys-tem, it is not considered an animal ex-periment and can serve as additionalsource of information prior to cell-scaffold transplantation into an animalmodel. Biocompatibility of the scaffoldmaterial, angiogenesis, cell survival and

proliferation can be tested using in vivoconditions. Due to the easy access to theCAM and the rapid vessel development,the transplanted materials can be ob-served permanently and significant re-sults are obtained after a couple of days.Aim of our study was to test meniscus fibrochondrocytes seeded onto a collagenmembrane using the HET-CAM assay.

Sheep primary meniscus cells were iso-lated by collagenase digestion. Cells were

expanded in monolayer culture and seed-ed onto collagen scaffolds. Fertilised, spe-cial pathogen free (SPF) white leghorneggs were supplied by cooperation withBaxter vaccine industries. The CAM wasexposed and a 5x5 mm collagen scaffoldseeded with 106 cells was placed on top ofthe CAM on the 7th breeding day. Sam-ples were incubated for 3 days, document-ed and explanted for histological evalua-tion and SEM evaluation.

Poster

The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a testingenvironment for meniscus tissue engineering constructsClaudia Eder 1, Erwin Falkner 2, Michael Mickel3, Günter Brand1, Ronald Dorotka1, Udo M. Losert 2 and Stefan Nehrer 1



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Macroscopic examination indicated aconnection of the implant to the vesselsystem of the CAM after three days inova. Various haemangiomas in the sur-rounding of the scaffold demonstrated anangiogenetic stimulus of the implantedbiomaterial. Histological evaluation

showed the formation of numerous capil-laries around the implant. The transplant-ed cells had survived and started with tis-sue formation. The newly formed tissuestained positive to Safranine O, CollagenType I and II indicating a fibrocartilagephenotype.

The findings that transplanted menis-cus fibrochondrocytes can survive in ovaand maintain a fibrocartilage-like pheno-type make the chick chorioallantoicmembrane a suitable testing environmentfor meniscus tissue engineering.

Antibiotic supplementation is state of theart in cell culture routine for research andclinical applications. Usually Penicillin,Streptomycin or Gentamycin are appliedin combination with Amphotericin B orother fungicidal substances to avoid con-tamination of cultures. The routine appli-cation of antibiotics carries several disad-vantages: Besides of the induction oftolerance due to insufficient dosage or in-correct waste disposal and the possibilityof side effects/allergic reactions if celltransplantation is performed, the antipro-liferative effect on ALL living cellsshould be taken into account. Aim of thepresented study is to test the suitability ofantibiotic/fungicide free cell culture in aroutine (non GMP) research lab.

Adult sheep meniscus cells, lambmeniscus, mesenchymal stem cells,chondrocytes and synovial fibroblastswere obtained from cadavers. Tissue was

decontaminated prior to cell isolation.Freshly isolated cells were cultured inDMEM-F/12 either supplemented with10% FCS and 0,05 mg/ml Ascorbic Acidor serum free using 2% ITS (v/v) andAscorbic Acid as a supplement. Adultsheep meniscus cells cultured in mediumadditionally supplemented with 100U/ml Penicillin and 100 µg/ml Strepto-mycin were used as control. Morpholog-ic features and the influence of antibioticomission on cell proliferation, cell at-tachment and cell viability were evaluat-ed and mycoplasma testings were per-formed regularly.

Cells could be maintained antibioticfree for more than 6 month without con-tamination within the lab. Bacterial con-tamination occurred only after transportto another lab due to leakage of culturevessels (well plates). No funghal contam-ination occurred and routine mycoplas-

ma screening was negative. Populationdoubling time of serum free cultures de-creased from 72 hours to 19,6 hours afteromission of antibiotics and cell attach-ment and cell viability were markedlyimproved. While cells tended to grow inmonolayer during antibiotic supplemen-tation and showed rapid dedifferentia-tion, cultures maintained antibiotic freepreferred a three dimensional prolifera-tion and expressed typical differentiationmarkers even at higher passages.

Antibiotic free culture of primary cellsis possible even under non GMP condi-tions. The advantages of improved cellproliferation and morphologic featuresas well as cost reduction and the avoid-ance of side effects should motivate tocritically assess whether prophylacticantibiotic supplementation of cell cul-ture media is really necessary in the in-dividual situation.

Poster

Antibiotic supplementation of cell culture media: necessity or habit?Claudia Eder 1, Erwin Falkner 2, Michael Mickel3, Günter Brand1, Catharina Chiari1, Udo M. Losert 2 and Stefan Nehrer 1



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Gentoxische Substanzen wirken krebs-auslösend und führen zu Erbkrankheitensowie reduzierter Fertilität. Daher wer-den Chemikalien (Pharmaka, Industrie-chemikalien) entsprechend internationa-len Richtlinien (OECD) routinemäßigauf DNA-schädigende Eigenschaften hinuntersucht. Hauptproblem derzeit ver-wendeter in vitro Testverfahren ist, dass den Indikatorzellen Enzyme fehlen,die die Ausgangssubstanzen zu DNA-reaktiven Metaboliten umwandeln bzw.deren Entgiftung katalysieren. Aus diesem Grund werden mit einer Reihevon Substanzen falsch positive oder negative Resultate erhalten, sodass Tier-versuche erforderlich sind. Im Rahmeneines EU Projektes (HEPADNA) wurdeam Institut für Krebsforschung eine humane Leberzelllinie auf ihre Eignunghin untersucht, DNA-reaktive Kanzero-gene zu detektieren. Die wichtigsten Er-gebnisse unserer bisherigen Forschungensind: Die Zellen besitzen eine Vielzahlwichtiger Fremdstoff-metaboliserender

Enzyme (Phase I und Phase II Enzyme),die an der Verstoffwechslung DNA-reaktiver Kanzerogene beteiligt sind. Sieweisen in qualitativer Hinsicht ein denprimären humanen Leberzellen ähnlichesEnzymmuster auf. Die Effekte von Ver-tretern aller derzeit bekannten Klassenvon gentoxischen Kanzerogenen, wieNitrosamine, polyzyklische aromatischeKohlenwasserstoffe, heterozyklischearomatische Amine, alkylierende Agen-zien und Aflatoxine, können mit dieserZelllinie detektiert werden. Mit „Pro-blemsubstanzen”, d.h. Verbindungen, mitdenen in herkömmlichen in vitro Testsfalsch negative Ergebnisse erhalten werden, die jedoch in TierexperimentenDNA-Schäden und Krebs auslösen, wer-den in Experimenten mit HepG2 Zellenpositive Ergebnisse erhalten. TypischeBeispiele sind Pyrrolizidinalkaloide, Pestizide (Hexamethylphosphoramid),Gewürzinhaltsstoffe (Safrol), Mytotoxi-ne (Fumonisin B1, Ochratoxin A) undkanzerogene Schwermetalle (As, Cd).

Mit Tamoxifen (ein Hormonantagonist)werden im Tierexperiment falsch positi-ve Resultate erhalten (diese Substanz löstim Menschen nicht Leberkrebs aus);auch in HepG2 Zellen wurden keine Ef-fekte gefunden. Bei Tests mit strukturel-len Analoga (Pyren-Benzo(a)pyren,2AAF-4AAF) in HepG2 Zellen ergebennur solche positive Resultate, die in vivoDNA-reaktiv und kanzerogen wirken. Eine derartige Unterscheidung ist mitkonventionellen in vitro Tests nicht mög-lich. Anhand von Gentoxizitätstests wer-den auch DNA-schützende Substanzen(z.B. sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe), diedie Auslösung von Krebs verhindern,identifiziert. Wir konnten nachweisen,dass detoxifizierend wirkende Enzyme inHepG2 Zellen in induzierbarer Form vor-liegen. Auch co-mutagene Substanzen(Moschusketon) können in HepG2 Zellendetektiert werden. Gentoxizitätstests mitHepG2 Zellen stellen derzeit das vielver-sprechendste Alternativmodell zu Muta-genitätstests mit Tieren dar.

Vortrag/Lecture

[Application of a human hepatoma cell line (HepG2) as an alternative to laboratory animal testing in genetical toxicology]Einsatz einer humanen Leberzelllinie (HepG2) als Alternative zu Tierexperimenten in der genetischenToxikologieVeronika A. Ehrlich1, Bernhard J. Majer1, Maria Uhl 1, Firouz Darroudi 2, Volker Mersch-Sundermann3, Sylvie Rabot 4, Wolfgang Huber 1 und Siegfried Knasmüller 1

1Medizinische Universität Wien, Institut für Krebsforschung, A-Wien, 2Department of Radiation Genetics and ChemicalMutagenesis, University of Leiden, NL-Leiden, 3Institut für Toxikologie und Ökotoxikologie, Universität D-Trier, 4Institut National de la Recherche Agronomique, Unité d’Ecologie et de Physiologie du Système Digestif, F-Jouy-en-JosasE-Mail: [email protected]

Poster

Replacement of sera for cell culture purposes: a survey with up to date product guide 2004Erwin Falkner 1, Harald Schöffl 2, Helmut Appl 2, Claudia Eder 3, Karin Macfelda 1, Udo M. Losert 2 and Walter Pfaller 2

1 IBF-Institute for Biomedical Research, Medical University of Vienna, A-Vienna, 2ZET-Center for Replacement- andComplementary Methods to Animal Testing, A-Linze-mail: [email protected]

Introduction: Aim of our work was an upto date study on aspects of animal serumusage for cell cultivation tasks and alter-

native approaches of nutrition mediumsupplementation. The final report includ-ing regularly updated guide on products

in the field should support researchers inmaking their best choices for specific invitro studies.


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Material and methods: Data sheets,product descriptions, cell culture manu-als and published papers on the subjectwere gathered/analysed by literature sur-vey and contacting scientists working in the field at universities and industry research centers.

Results: A growing number of alterna-tives exists for cell lines and primary cultures derived from a broad range oftissues: e.g. chemically defined media,

complementation of non-serum origin,non-animal derived proteins and also op-timised sampling/processing protocolsand production systems/bioreactors forserum-free usage of all scales. A litera-ture search structured for cell type/fieldof application was performed and paperabstract/citation-shortcuts were collect-ed. The final document including thenewly updated product guide 01/2004 isavailable at http://www.zet.or.at resp.

http:www.cellculture.at. Further updates,regularly every 6 months, are planned.

Discussion: In recent years variouseasily available alternatives to animalsera have been reported and are on sale.For optimal cell performance in vitro, to limit costs and, last but not least, fol-lowing animal welfare considerations,the authors advise the gathering of exactinformation to make qualified choicespossible.

Introduction: The CAM angiogenesistest system, originally conceived as analternative method for toxicity and irri-tation studies, has for some time beensuggested to have potential for tissueengineering tasks, biocompatibility test-ing and also as a cell transplantationmodel. Published reports show that inmost of these cases incubation of theeggs was performed for up to 15 days.This time-point is long past neural tubefusion at about day 11, resulting in thepossibility of embryo pain conduction.Therefore rating of such tests as proper

animal tests has been discussed previ-ously. The aim of the presented studywas to investigate the feasibility of al-tering existing CAM-test protocols byterminating experiments at incubationday 10 to achieve satisfactory data qual-ity while following animal welfare con-siderations.

Material and methods: An example ofpublished testing schemes of biomaterialtesting and hetero/autologous cell trans-plantation approaches using the CAMonset of angiogenesis assay was per-formed but terminated at day 10. Histo-

logical/electromicroscopical analysis wasconducted.

Results: The authors believe the result-ing data matched that of the original ex-periments regarding quality and repro-ducibility sufficiently, proving that theshorter observation time is sufficient.

Discussion: The CAM-angiogenesis-assay can also be used for innovative ex-periments in the field of biomedical engi-neering, even with a total duration of only10 days. Thus its quality as an alternativemethod to animal testing remains intactwithout undue loss or result quality.

Poster

Modification of the chorionallantoic membran (CAM)testsystem: data interpretation at incubation day 10Erwin Falkner 1, Claudia Eder 3, Helmut Appl 2, Barbara Kapeller 1, Karin Macfelda1, Udo M. Losert 1, Walter Pfaller 2 and Harald Schöffl 2

1IBF-Institute for Biomedical Research, Medical University of Vienna, A-Vienna, 2ZET-Center for Replacement- andComplementary Methods to Animal Testing, A-Linz, 3Department of Orthopaedic Surgery, AKH, A-Viennae-mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

[Standardisation of human whole blood for in vitro applications bycryoconservation: optimisation of the in vitro Pyrogen Test (IPT) as an alternative tothe rabbit experiment]Standardisierung von humanem Blut für in vitro Applika-tionen mittels Kryokonservierung: Optimierung des in vitroPyrogentests (IPT) als Alternative zum KaninchentestStefan Fennrich, Stefanie Schindler, Ilona Kindinger, Silvia Asmus und Thomas HartungBiochemische Pharmakologie der Universität D-KonstanzE-Mail: [email protected]

Humanes Vollblut hat in vitro zunehmen-de Bedeutung, um Immunfunktionenoder pyrogene Kontaminationen zu testen.

Die Vorteile der einfachen Verfügbarkeiteines physiologischen Zellmaterials hatzentrale Bedeutung. Die Handhabung ist

durch Abnahme von frisch gewonnenemBlut, potenzielle Infektiosität des Spen-ders oder individuelle Variabilität oft


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limitiert. Um diese Einschränkungen zulösen, wurde ein Verfahren entwickelt,um Blut kryokonserviert in vorgetesteterund zertifizierter Form verfügbar zu machen. Das Verfahren ermöglicht eindirektes Auftauen ohne aufwändigeWaschschritte. Mittels FACS-Analysewurde nachgewiesen, dass dabei die mononukleären Zellen intakt bleiben;nach Induktion mit verschiedenen immu-nologischen Stimuli werden Zytokine

ausgeschüttet. Im Vergleich zu Frischblutwerden im Gegensatz zu IL-6 z.B. höhereMengen an Interleukin-1ß (IL-1ß) frei-gesetzt. Eine mögliche Ursache ist dieAnwesenheit des Kryoprotektivs DMSO(Dimethylsulfoxid). Es können größereMengen kryokonserviertes Blut her-gestellt werden, indem das Blut vonmehreren Spendern unabhängig von derBlutgruppe gepoolt wird.

Das Detektionslimit des WHO-Endo-

toxin-Standards (EC-6) liegt für die Ausschüttung von IL-1ß bei 0,5 EU/ml.In der Europäischen Pharmakopoe fest-gelegte Endotoxin-Grenz-Konzentratio-nen werden damit mit kryokonserviertemBlut im In vitro Pyrogentest (IPT) er-kannt. Für spezielle Pharmaka (z.B. öligeArzneien) konnte sogar ein Vorteil deskryokonservierten Blutes gegenüberfrisch gewonnenem Blut gezeigt werden.

Vortrag/Lecture

Determination of hormonal activities of environmentalchemicals in vitroKarl Fent 1 and Petra Kunz 2

1University of Applied Sciences Basel, Institute of Environmental Technology, CH-Muttenz and Swiss Federal Institute ofTechnology (ETH), Department of Environmental Science, CH-Zurich, 2Institute of Limnology, University of CH-Zuriche-mail: [email protected]

Chemicals having hormonal activitiesenter aquatic ecosystems either directlyor via wastewater. Currently, about 150different compounds have been demon-strated to exhibit hormonal activity in vitro and in vivo. Chemicals in wastewa-ter are an important source resulting inestrogenic effects in fish. Estrogenic ef-fects may both occur during the embry-onic life stage when sex developmenttakes place, and in the adult life stage.Fish may develop intersex gonads duringembryonic exposure or even sex changewhen exposed to estrogenic compoundsduring the sensible period. In addition,induction of the yolk precursor protein,vitellogenin, is taking place in juvenileand male fish.

Whereas in vivo exposure experimentsare common tools for assessing hormon-

al effects, in vitro systems are not yet ful-ly recognised as important. However,fast, economic and meaningful in vitrosystems are highly needed for the assess-ment of a large number of chemicals tobe analysed for hormonal activity, and in vitro systems may play an importantrole in the initial screening. Here, two invitro systems are presented for assess-ment of estrogenic environmental chem-icals, a reporter gene system based ontransfection of fish cell lines (RTG-2),and a recombinant yeast reporter genesystem (YES). With both systems, estro-genic compounds are reliably determinedand both are applied for the assessmentof pure compounds and environmentalsamples. The YES is particularly usefulas it is easy to use and provides repro-ducible results.

A case study is presented on UV ab-sorbing organic compounds (UV filters),which are very persistent and lipophilic,leading to contamination of surface waters and bioaccumulation. Our resultsindicate that many UV filters exhibit estrogenic activity, and others are anti-estrogenic. Combinations of 2 UV filtersin mixtures show both synergistic andantagonistic interactions, and all followthe model of concentration addition.These results clearly indicate that UV filters possess hormonal activities in vitro. The use of in vitro systems is concluded to be very important in thefirst assessment of hormonal activities of chemicals and in the determination oftheir interactions in mixtures.


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Poster

[Cryopreservation of cells cultered in serum free media: first results withchemically fully defined freezing media]Kryokonservierung von serumfrei kultivierten Zell-linien: Erste Erfahrungen mit verschiedenen chemischdefinierten KonservierungsmedienRené W. Fischer 1, Anaida Osoria Perez 2, Yanela Gonzalez Hernandez 2, Ferruccio Messi 3, Susanne Scheiwiller 4 und Franz P. Gruber 4

1ETH CH-Zürich, 2Centro de Investigaciones Biomedicas, CU-La Habana, 3Messi Cell Culture Technologies, CH-Zürich,4FFVFF, CH-ZürichE-Mail: [email protected]

Poster

Cell-growth promoting material isolated from sheep’s blood clotBratko Filipic 1, Srecko Sladoljev 2, Ferenc Somogyvari 3, Sandor Toth 4, Eva Ruzic-Sabljic’1

and Srecko Koren 1

1Institute of Microbiology and Immunology, Medical Faculty, SLO-Ljubljana, 2Institute of Immunology, CRO-Zagreb, 3Institute of Clinical Microbiology, Medical Faculty, University of Szeged, H-Szeged, 4Bekes County Hospital, Blood transfusion unit, H-Oroshazae-mail: [email protected]

A natural blood clot contains 95% redblood cells, 5% platelets, less than 1%white blood cells, and numerousamounts of fibrin strands. A PRP bloodclot contains 4% red blood cells, 95%platelets, and 1% white blood cells.Since 1990, medical science has recog-nised several components in blood,which are part of the natural healing process and if added to wounded tissuesor surgical sites, they have the potentialto accelerate healing controls. It has alsoshown to increase the density of the boneformed by 19 to 25% when measured at4 months and 6 months. The specificcomponents of PRP are Platelet DerivedGrowth Factors (PDGF) and Transform-ing Growth Factors b. Both of these are contained in the alpha granules ofplatelets. Fibronectin and vitronectin arealso components of PRP. They are cell

adhesion molecules found in plasma andfibrin itself.

The experiments presented herein,were aimed to isolate, characterise and totest in vitro on different cell cultures thematerial from sheep’s blood clot. Sheep’sblood was collected and allowed to clot.Afterward the whole content was cen-trifuged at 2500 RPM for 20 minutes,and supernatant was aspirated off. Thesediment (“clot”) was quickly washedwith the sterile PBS pH=5.8 for 10 min-utes, and centrifuged for 25 minutes at2500 RPM for 25 minutes. The super-natant (Fraction I) was collected andfrozen. To the “clot” the PBS pH=7.2was added and left for 1 hour. After thecentrifugation of the supernatant at 2500 RPM for 25 minutes the Fraction IIwas collected. To the “clot” the PBSpH=7.2 was than added for 18 hours

(Fraction III) and for 5 days (FractionIV). All the fractions were sterilised by0.2 filtration. The content of the fractionswas analysed by PAG-SDS and IEF.

The cell growth promoting activity ofdifferent fractions in comparison to theSR-2.055P (Serum replacement) wastested on the: Chicken embryonal fibro-blasts, WISH, HAC-3/T2 (Human amni-otic cell lines), Caco (Colon carcinomacell line), PLA-2 (Adult pig kidney cellline), IPEC-T2 (Porcine intestinal cellline) and WiREF (Wistar rat embrionalfibroblastoid cell line). For the men-tioned cells/cell lines the active fractionswere II, III and IV. Fraction I was toxic.The optimal content of fractions wasfrom 5-10% in Eagle's medium. In thisrange up to 90% of SR-2.055P could beobtained.

Bei der Durchführung des Projekts „Welche Zellen können in definiertemsynthetischen Medium kultiviert wer-den?“ haben wir festgestellt, dass bei der Kryokonservierung von Säugerzellenviele verschiedene Protokolle ihre An-

wendung finden. Eine Vielzahl davonverwenden FBS (Fetal Bovine Serum)oder Gemische mit Substanzen tierischenUrsprungs als Einfriermedium.

Es macht wenig Sinn, erfolgreich anein chemisch definiertes Medium adap-

tierte Zellen mit undefinierten Zusätzenzu versetzen, um sie einfrieren und kon-servieren zu können.

In der Literatur (Lakey, 2001) findetman denn auch Rezepturen für chemischdefinierte Einfriermedien frei von tieri-


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schen Komponenten. „Hypothermosol“ist ein beschriebenes Medium, welchesauch kommerziell erhältlich ist (BioLifeSolutions, USA). Im veröffentlichten Rezept findet man allerdings auch (ab-sichtlich?) versteckte Fehler. Nachdemwir die nötigen Korrekturen vorgenom-men und die Osmolarität überprüft ha-ben, verglichen wir dieses Hypothermo-

sol mit den häufig angewendeten Medienwie: 90% FBS, 10% DMSO; 45% konditioniertes Medium, 45% frischesMedium und 10% DMSO. Als Testzellenverwendeten wir Hybridoma Zellen, wel-che in chemisch definiertem MediumTurbodoma HP-1 (Messi Cell CultureTechnologies, Schweiz) kultiviert wurden.Untersuchte Parameter sind: Vitalität der

Zellen vor und nach dem Einfrieren sowie das Anwachsverhalten nach demAuftauen. Das Poster beschreibt ersteResultate.

Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Fedorow, C. A.and Taylor, M. J. (2001). Islet cryopre-servation using intracellular preservationsolutions. Cell Transplantation 10, 583-589.

Poster

Serum replacement in the culture medium of the embryonic stem cell test (EST)Burkhard Flick and Stephan KlugInstitute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Dept. of Toxicology, Charité – Universitary Medicine, D-Berline-mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

A new in vitro method for testing developmentalneurotoxicityEllen Fritsche, Michaela Moors, Jason E. Cline and Josef AbelInstitut für umweltmedizinische Forschung GmbH, D-Düsseldorfe-mail: [email protected]

According to the INVITTOX ProtocolNr. 113, which is used for the EST, theculture of ESC is performed with a culture medium containing 20.0% fetalbovine serum (FBS). In order to optimisethis protocol we aimed to establish aserum-reduced or even serum-free culture medium which supports prolifer-ation and differentiation of the ESC. Thismodification would lead to the followingbenefits: (1) exclusion of serum-chargevariability, (2) no interference of un-known serum components with the testsubstances and (3) possibility to evaluatehormone-like compounds without abackground level of hormones.

The influences of cell culture supple-ments were investigated individually andin combination. Hereby, the serum concentration was reduced stepwise and

growth factors, proteins, carbohydrates,lipids, amino acids, vitamins, trace elements, antioxidants and buffers wereadded to the culture medium in differentcombinations. The different serum reduced and serum free culture mediawere tested in comparison to the controlusing the standard culture medium with20.0% FBS in the proliferation and dif-ferentiation assay of the EST describedin the INVITTOX protocol Nr. 113.

A basic culture medium composed ofIscove’s modified Dulbecco’s mediumsupplemented with bovine serum albumin, fetuin, chemical defined lipidconcentrate, transferrin, insulin, epider-mal growth factor, bone morphogeneticprotein-2, basic fibroblast growth factorand a complex mixture of trace elementsallows one to reduce the serum content

down to 0.5% in the culture medium.This modified medium allowed consis-tently reproducible results for the pro-liferation and differentiation of ESC intocardiomyocytes comparable to control. A serum-free culture medium exhibitedreproducible results in the differentiationcomparable with control; however, thegrowth rate of the cells and reproducibil-ity in the proliferation assay still requiresimprovement.

So far, complex mixture of supple-ments can almost replace the serum inthe culture medium of the EST. The culture medium containing only 0.5%serum may significantly increase the level of standardisation of the test and expands the applicability of the EST totest hormone-like compounds.

It is a common opinion that there is aneed for in vitro models for testing developmental neurotoxicity. Therefore,we established a human cell culture mod-el that consists of normal human neuralprogenitor cells (NHNP cells) and allows

us to study the impact of chemicals onneural development. NHNP cells grow asneurospheres and can be kept in culturefor several months. Upon growthfactorwithdrawal they differentiate into neu-rons, astrocytes and oligodendrocytes.

Furthermore, they express a variety ofgenes involved in drug metabolism.Thus, this cell system seems to be an excellent model to study influences of chemicals on differentiation of thesecells.


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Epidemiological evidence has beenbrought that polychlorinated biphenyls(PCBs) disturb brain development inchildren. Therefore, our goal was to investigate the mechanisms leading todisturbance of human brain developmentin our human in vitro model. Because of the suspicion that disruption of thethyroid hormone system is involved inthe impairment of intellectual develop-ment by PCBs and because timing ofoligodendrocyte development seems tobe dependent on thyroid hormone, we

investigated the occurrence of oligoden-drocytes during differentiation of NHNPcells. Therefore, undifferentiated neuro-spheres were treated with T3 for oneweek. After two further days of differen-tiation, we found a significant increase inthe number of oligodendrocytes formed.Treating neurospheres with PCB118 alsolead to an increase in oligodendrocyteformation, while PCB126 had no effect.We could identify that PCB118 disruptsthe thyroid hormone system by co-treating the cells with PCB118 or T3 and

the thyroid hormone receptor antagonistNH-3 and thereby antagonise the development of oligodendrocytes. Thus,we observed a congener-specific thyroidhormone-like effect of PCBs in NHNPcells.

We are the first ones who have estab-lished an in vitro system from primaryhuman cells for studying the influence of endocrine disrupting chemicals of thethyroid hormone system on neural development.

Vortrag/Lecture

[Replacement of experiments on vertebrates in regulatory ecotoxicology]Ersatz von Wirbeltierversuchen in der regulatorischen ÖkotoxikologieAndreas GiesUmweltbundesamt, Institut für Risikobeurteilung, D-BerlinE-Mail: [email protected]

Der Ersatz von Wirbeltierversuchengehört auch bei der ökotoxikologischenChemikalienprüfung zu den Prioritäten.Besonders angesichts der aktuellen Re-organisation des europäischen Chemika-lienrechts (REACH-System) gewinntdieses Ziel weiter an Bedeutung. Der un-bestrittene Zweck von Chemikalien-prüfungen in der regulatorischen Ökoto-xikologie ist die Bereitstellung von Da-ten über die möglichen Wirkungen dieserStoffe auf Umweltorganismen. Nur mitausreichenden Daten hierzu lassen sichaussagekräftige Risikobewertungen er-stellen, die ihrerseits sinnvolle und effizi-ente Maßnahmen zum Schutz vor un-akzeptablen Chemikalienrisiken für Um-welt und Gesundheit begründen. Dasneue europäische REACH-System istdarauf ausgelegt, die gegenwärtigen Datenlücken zu schließen, die noch be-sonders Abbaubarkeit, Anreicherung undWirkungen vieler Stoffe betreffen.

In der Ökotoxikologie sind als Wir-beltierversuche vor allem Tests mit

Fischen verbreitet. Ihren Ersatz ver-folgen alle Beteiligten auf mehrerenparallelen Wegen. So bemüht sich dasUmweltbundesamt im OECD-Prüfricht-linienprogramm um internationale Ak-zeptanz für einen Fischei/Embryotestals Alternative zum akuten Fischtestnach OECD Test Guideline 203. Gleich-zeitig sollen moderne Prüfstrategienmöglichst maßgeschneidert anstreben,vorhandene Testdaten und anderestoffspezifische Informationen (wie z.B.aus geeigneten QSAR-Modellen ab-geleitete Erkenntnisse) maximal zu nutzen, um die Notwendigkeit von Testsmit Wirbeltieren zu minimieren. Diesgilt auf der einen Seite für eine großeZahl von Stoffen, zu denen noch grund-legende Daten fehlen und bei denen esdarauf ankommt, diese essenziellenStoffinformationen nur dort mit Wirbel-tierversuchen zu generieren, wo andereDaten und alternative Testmethoden fürden nötigen Basisdatensatz nicht aus-reichen. Auf der anderen Seite gibt es

eine überschaubarere Zahl von Stoffen,zu denen bereits vorliegende vorläufigeInformationen Besorgnisse begründen,zum Beispiel Hinweise auf endokrineWirkungen. Hier kommt es darauf an,die für eine abschließende Risikobe-wertung notwendigen Informationenfallspezifisch und möglichst genau zubenennen, um aufwändige Studien wieFull Life-Cycle Tests auf das absolutnotwendige Mindestmaß zu beschrän-ken und ihre maximale Aussagekraft fürdie Risikobewertung sicherzustellen.

In den nächsten Jahren bleibt es eine der großen Herausforderungen im Tagesgeschäft der regulatorischen Ökotoxikologie, gleichzeitig 1) den Ersatz von Wirbeltierversuchen auszu-weiten, 2) fehlende Stoffinformationenschnell und wirtschaftlich zu erzeugensowie 3) Umwelt und Gesundheit aufder Basis adäquater Daten wirksam zuschützen.


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The aim of the present study was to establish an influenza A virus/egg modelaccompanied by a high mortality rate in 2-weeks-old chick embryos. Furtherinvestigations should assess the effect ofantiviral drugs on the survival of infectedchick embryos. After the preparation ofan artificial air chamber into the eggshell, influenza A virus was placed on

the chorioallantoic membrane of embry-onated hen’s eggs. When 1 EID50 (50%egg infective dose) of influenza A viruswas used nearly 100% of infected chickembryos did not survive the infection up to the day 8 post inoculation. The survival rate of chick embryos could besignificantly increased when the anti-viral drugs rimantadine, amantadine or

zanamivir were administered into the albumen immediately before or after vi-ral inoculation. While rimantadine andamantadine were effective at relativelyhigh doses of 12.5 mg/kg and 25 mg/kg,zanamivir showed a significant antiviralefficacy at concentrations of 2 mg/kg.After pre- and post-treatment with zana-mivir, 54% to 58% of the influenza

Vortrag/Lecture

[Indexing of scientific information on alternative methods to animal experiments]Indexierung biowissenschaftlicher Informationen zuAlternativmethodenBarbara Grune1, Antje Dörendahl1, Dorothea Köhler-Hahn1, Céline Feuerstein2, Rainer Box und Horst Spielmann1

1Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch (ZEBET), Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), D-Berlin, 2Fachhochschule Potsdam, Fachbereich Informationswissenschaften, D-PotsdamE-Mail: [email protected]

Die Europäische Tierschutzgesetzgebung(EU Richtlinie 86/609/EWG), die in dasnationale Recht aller EU-Mitglieds-staaten überführt wurde, fordert die Prü-fung der Unerlässlichkeit von Tier-versuchsvorhaben. Ein Tierversuch darfdemnach nicht durchgeführt werden,wenn der verfolgte Zweck eines geplan-ten Versuchs durch andere Methodenoder Verfahren als den Tierversuch er-reicht werden kann. Alle Wissenschaftlersind deshalb verpflichtet, zur Vorbe-reitung eines Tierversuchsvorhabens Recherchen nach Informationen und Literatur zu Alternativmethoden durch-zuführen. Im Internet stehen dem Wissenschaftler eine Vielzahl von Infor-mationsquellen online zur Verfügung.Dazu gehören Literatur- und Fakten-datenbanken und spezielle Webseiten fürAlternativmethoden. Dennoch müssenWissenschaftler die besten Datenbanken

auswählen und sich durch geeigneteSuchstrategien Zugang zu den Informa-tionen verschaffen. Die Anbieter von Informationen müssen neben der Qua-lität der Informationen auch ihre Auffindbarkeit für die Nutzer sichern.Eine gute Indexierung von Literatur mit Deskriptoren (Schlagwörtern) wirdgrundsätzlich als eine Voraussetzung fürdas Auffinden von Informationen be-trachtet. Beim Indexieren wird der Inhalteines Dokuments mit Hilfe von Schlag-wörtern (Deskriptoren) gekennzeichnet,damit sie durch Suchabfragen besser gefunden werden.

In einem Sonderforschungsprojekt, gefördert durch das BfR, untersuchteZEBET die Indexierungssysteme von 6 biomedizinischen Datenbanken hin-sichtlich der Indexierung von Alternativ-methoden. Es wurden in den Daten-banken MEDLINE, EMBASE, CAB

Abstract, AGRIS, AGRICOLA und AnimAlt-ZEBET Recherchen nach Alternativmethoden mit ausgewähltenSuchbegriffen durchgeführt. Die verwen-deten Suchbegriffe wurden den Thesauribzw. Schlagwortlisten der jeweiligen Datenbank entnommen. Dazu gehörtenallgemeine Begriffe wie „Animal TestingAlternatives“ und spezielle Begriffe für Alternativmethoden wie „LimulusAmebocyte Lysate Test“.

Die Auswertung der Ergebnisse zeigte,dass in den Thesauri der DatenbankenMEDLINE, EMBASE, CAB Abstract,AGRIS, AGRICOLA zutreffendeSchlagwörter für die Indexierung von Alternativmethoden vorhanden sind,dass jedoch die Vergabe dieser Begriffe,d.h. das eigentliche Indexieren, proble-matisch zu sein scheint.

www.bfr.bund.de; www.fh-potsdam.de

Poster

Influenza infection of the embryonated hen’s egg – an alternative model for in vivo evaluation ofantiviral compoundsAlbert Härtl 1, Andreas Sauerbrei 2 and Peter Wutzler 2

1Hans-Knöll Institute for Natural Products Research, D-Jena, 2Institute for Antiviral Therapy, Friedrich-Schiller University, D-Jenae-mail: [email protected]


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A virus-infected chick embryos survived.The therapeutic effect of amantadine aswell as the prophylactic and therapeuticeffect of rimantadine was significantlylower. While the survival rate of chick

embryos was between 8% and 17% aftertreatment with rimantadine, between29% and 33% of embryos survived theinfection when amantadine was adminis-tered. In conclusion, the described chick

embryo model can be used for the reli-able in vivo evaluation of potential anti-influenza inhibitors. It offers a realisticalternative in comparison to experimentswith small laboratory rodents.

Poster

[Choice tests with pairs of mice: preference for nesting material, nestbox and tubes]Wahlversuche mit paarweise gehaltenen Labormäusen zur Ermittlung der Präferenz für unterschiedliche KäfigeinrichtungenVeronika Heizmann 1, Michael Nathaniel 2 und Sandra Högler 3

1Department für Naturwissenschaften, Veterinärmedizinische Universität Wien, A-Wien, 2Tierärztliche Praxis, A-Schwadorf,3Department für Pathobiologie, Veterinärmedizinische Universität Wien, A-WienE-Mail: [email protected]

Die Forderung nach artgemäßer Ruhe-,Bewegungs- und Beschäftigungsmög-lichkeit für Labortiere ist auch in derösterreichischen Tierversuchsverordnung2000 enthalten. Präferenzuntersuchun-gen sind geeignet, die Bedeutung ver-schiedener Umweltfaktoren für Labor-tiere zu untersuchen. Es wurden Prä-ferenzuntersuchungen mit gruppenweiseund paarweise gehaltenen Labormäusendurchgeführt. 12 juvenile weibliche, 12juvenile männliche und 12 adulte weibli-che Him:OF1 Auszuchtmäuse wurdenpaarweise getestet. Das Testsystem be-steht aus 4 Makrolonkäfigen vom Typ III,die über Plexiglasrohre miteinander ver-bunden sind. Der unstrukturierte Käfig Denthielt ausschließlich Einstreu, eineSchüssel mit Pellets und eine Trinkwas-serflasche, die strukturierten TestkäfigeA, B und C zusätzlich Nestmaterial,Nestbox und Kartonrollen in unter-

schiedlicher Kombination. Die Verhal-tensbeobachtung erfolgte mittels Video-aufzeichnung und skandierender Moment-beobachtung an 2 aufeinanderfolgendenTagen für jeweils 2 mal 4 Stundenwährend der Dunkel- und Hellphase.Nachdem die Mäuse einen der Testkäfigeals Nestplatz gewählt hatten (Testsituati-on 1), wurden in diesem Käfig die zu-sätzlichen Strukturen entfernt und dieTiere abermals an 2 aufeinanderfolgen-den Tagen beobachtet (Testsituation 2und 3).

In der 1. Testsituation wählten 8 adulteweibliche, 4 juvenile weibliche und 2 juvenile männliche Mäuse den TestkäfigA mit Nestmaterial, Nestbox und Kar-tonrolle. 8 juvenile männliche, 4 juvenileweibliche und 4 adulte weibliche Mäusewählten den Testkäfig C mit Nestmateri-al und Nestbox. 2 juvenile weiblicheMäuse wählten den Testkäfig B mit Nest-

material und Kartonrollen. In der 2. Test-situation wurden ausschließlich Käfigemit Nestbox (A oder C) gewählt, in der 3. Testsituation mit wenigen Ausnahmender Testkäfig B. Während der Hellphaseruhten die Mäuse überwiegend gemein-sam im bevorzugten Nest. Während derDunkelphase nutzten sie das gesamteTestsystem zur Exploration, Lokomoti-on, Nahrungssuche, Körperpflege und für Nestbauaktivitäten, und so gab eswährend der Aktivitätszeiten keine Käfigpräferenz.

Die vorliegenden Ergebnisse unter-stützen die Forderung nach Nestmaterialund Versteckmöglichkeit als Mindestan-forderung für Labormäuse. Um dieseForderung in die Praxis umzusetzen,müssen hygienisch und arbeitstechnischakzeptable Lösungen gefunden werden.

Vortrag/Lecture

Potentials of ‘-omics’ technologies in terms of replacement,reduction and/or refinement of animal experimentationCoenraad F. M. Hendriksen, Marian Moelands and Marjolein M. F. van BoxelNetherlands Centre Alternatives to Animal Use (NCA), Dept. Animals, Science & Society, Utrecht University, NL-Utrechte-mail: [email protected]

Within only a few years, biomolecularengineering has become one of the most promising scientific disciplines inbiomedical research, integrating ele-

ments of cell biology, molecular biology,bio-informatics and applied research.Advanced genomic and proteomic high-troughput technologies enable simultane-

ous monitoring of the expression of large numbers of individual genes andproteins, leading to a more profoundmechanistic insight in (patho-) physio-


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logical processes. Therefore, so-called ‘-omics’ technologies hold great oppor-tunities in a wide range of biomedical re-search areas, such as for drug discovery(pharmacogenomics), vaccine develop-ment (immunogenomics) and safety as-sessment of chemicals (toxicogenomics).Animal welfare organisations often criti-cise biomolecular engineering, believingit will lead to an increase of animal use.Indeed, some technologies may initiatescientific questions that require (addi-tional) studies using laboratory animals.However, particularly ‘-omics’ technolo-gies have potential for the replacement,reduction and/or refinement of animalexperiments, as they will allow scientific

progress while maintaining and improv-ing our moral principles about laboratoryanimal use. Combining ‘-omics’ tech-nologies with 3Rs means connecting theholistic approach of animal welfare to itsopposite, the reductionist approach ofstudying complex organisms at gene level. Although the potential of ‘-omics’to replace animal experimentation willnot be extensive, there are many opportu-nities for reduction and refinement. Better general setup of animal experi-ments and a science-based selection ofanimal species will lead to more and scientifically relevant data out of feweranimals. Furthermore, ‘-omics’ technolo-gies will lead to reduction of animal use

by means of e.g. predictive screens, early biomarkers and implementation ofgonogo decisions in research strategies. Increased predictability of tests enablesthe application of earlier, more humaneendpoints, shifts of animal tests to laterstages of the drug development process,and allows the use of low, subclinicaldoses of the chemical/drug to be studied.Furthermore, experimental procedurescan become less invasive. Until todaythese 3Rs potentials were hardly ex-plored. A report will be given of the recently performed inventory study onthe potentials of ‘-omics’ as a 3Rs tool.

Vortrag/Lecture

The concept of reduction of animal use in biomedicalsciencesCoenraad F. M. Hendriksen and Jasmijn de BooUtrecht University, NL-Utrechte-mail: [email protected]

Over time, different philosophies have af-fected our thinking about animals. A con-ceptual evolution regarding the use of animals and alternative methods is de-manded by new developments in researchand testing strategies. Russell and Burchfirst introduced the concept of the 3Rs,where reduction was defined as “reduc-tion in the numbers of animals used to ob-tain information of a given amount andprecision”. In surveying the statistics onanimal experimentation we found that thetrend in the number of animals used in

biomedical research in Europe was down-wards since the early eighties, but levelledout in recent years. Scientific progress, theinterplay between reduction, replacementand refinement and the ethical benefitsand implications of reduction should alsobe taken into account when balancing theneed for an animal model against the ad-verse consequences for laboratory ani-mals. There is much room for improve-ment of experimental design, educationand training in statistical methods and inrefinement of procedures, harmonisation

of guidelines and new research and pro-duction strategies. Reduction may beachieved at the individual experimentallevel, at a higher level in which decisionsare made about a series of experiments, oras a side-effect of economic or otherseemingly unrelated developments. Con-sideration of all three levels led to our revision of the definition of reduction,which now includes any approach thatleads to a reduction of the numbers of animals used, regardless of impacts on experimental precision.

Poster

Humane endpoints in biomedical research: an interactive CD ROMCoenraad F. M. Hendriksen and Iris BoumansNetherlands Centre Alternatives to Animal Use (NCA), Utrecht University, NL-Utrechte-mail: [email protected]

The CD ROM “Humane endpoints inbiomedical research” is an interactive program for educational and training pur-poses. A humane endpoint is a refinementalternative to animal experiments. The

goal of this CD ROM is to increase theawareness about and the implementationof humane endpoints. It is suitable for investigators, animal welfare officers, animal technicians and animal caretakers.

In order to implement “humane end-points” researchers first need to knowhow to recognise normal and abnormalbehaviour of mice and rats. The first partof the CD ROM contains chapters on


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normal behaviour, pain and distress, andrecognition of clinical signs. Generalclinical signs such as body weight andwater intake, clinical changes related toan organ system, measurable clinicalchanges as body temperature and abnor-mal spontaneous behaviour are dealtwith. For a few specific areas in biomed-ical research, those in which animals areoften seriously suffering, an overview isgiven about accompanying clinical signs.

Another part of the CD ROM also con-tains information about pathology, whichmay help with the correct assessment ofsuffering, and with taking measurementsfor follow-up experiments. The last andthe most important part describes the notion “humane endpoints”, reasons forapplying humane endpoints and anoverview of parameters which can beused when applying humane endpoints.The validation of humane endpoints and

responsibilities are discussed and rele-vant laws, guidelines and reports are alsoincluded. The CD ROM further offersmany additional images and videos. It isexpected that the CD ROM becomes partof the training programme for laboratoryanimals science intended for researchers,animal welfare officers, animal techni-cians and animal caretakers in theNetherlands. The CD ROM will be trans-lated in English later on.

Vortrag/Lecture

A reproducible co-culture model of the human distal lung barrier: 24-well-screening for pulmonarytoxicology in vitroMaria Iris Hermann, Sabine Fuchs, Ron E. Unger, Kirsten C. Peters and James KirkpatrickInstitute of Pathology, Johannes Gutenberg-University, D-Mainze-mail: [email protected]

In order to study toxic effects on the twomain cell types at the distal lung barrier,the epithelium and endothelium, we havedeveloped a co-culture system based on ahuman lung cell line with characteristicsof type II pneumocytes and Clara cells(NCI H441) and a human dermal microvascular endothelial cell line (ISO-HAS-1). The in vitro bilayer modelconsists of NCI H441 in co-culture with ISO-HAS-1 on opposite sides of apermeable 24-well filter plate (Polycar-bonate, Costar). Co-cultures were treatedwith dexamethasone from day 3 of co-cultivation to generate a polarised epithelial cell monolayer. Functional barrier properties were investigated bymeasuring trans-bilayer electrical resis-tance (TER) and paracellular transport of sodium-fluorescein. Immunofluores-cence of cell-cell adhesion moleculeswas performed using standard tech-niques.

In co-culture with microvascular EC(ISO-HAS-1) NCI H441 establishedcontact inhibited monolayers, showing a continuous, circumferential immuno-staining of the tight junctional protein,ZO-1 and the adherens junction protein,E-Cadherin. In addition to a contact in-hibited monolayer, ISO-HAS-1 demon-strated constitutive and inducible pheno-typic features most akin to primarycultivated human pulmonary micro-vascular endothelial cells. A pheno-typically stable co-culture could bemaintained for up to 14 days. Maximumreproducible TER-values of about 550Ohm*cm2 for H441/ISO-HAS-1 werefound after 10 to 12 days of co-culti-vation. This time period should permitexamination of the effects of toxic compounds and related metabolites onbarrier properties. Apical exposure to 50-500 µM CdCl2 resulted in an increasein TER to values about 830 Ohm*cm2

during 4 h. Basolateral exposure to 500 µM CdCl2 caused a rapid decrease in TER-value to values about 133Ohm*cm2 after 2 h and 25 Ohm*cm2

after 4 h. This effect coincided with theloss of E-cadherin (NCI H441) and VE-cadherin (ISO-HAS-1) from the cell-cell contacts and a reorganisation of theactin cytoskeleton. We are currently investigating the influence of cadmiumon cytokine release in co-culture.

In conclusion, our co-culture system ofNCI H441 with microvascular EC shouldprovide a suitable in vitro model to examine the effects of toxic compoundson the distal lung barrier. Additionally,the 24-well setup will enable multiplescreening of toxic effects on both lung epithelium and microvascular endothelium, including a possible co-stimulatory impact on the bicellularsystem.


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Die Bestimmung des korrosiven oder irritativen Potenzials bestimmter Stoffeist unverzichtbar, um den Vorschriftendes Arbeitsschutzes und der Transport-sicherung gerecht zu werden. Zur Klassi-fizierung dieser Stoffe kommen vermehrtin vitro Testsyteme zum Einsatz, die zunehmend die bislang üblichen Tierver-suche ersetzen sollten. In verschiedenenValidierungsstudien ist gezeigt worden,dass sich Hautmodelle sehr gut eignen,um den Einsatz von Labortieren zu mini-mieren. Deutliche Vorteile bietet dieserAnsatz aufgrund der größeren Repro-duzierbarkeit der Ergebnisse auch ge-genüber Versuchen mit Zellmonolayern.Weiterhin ermöglicht die Verwendungrekonstituierter Haut die Testung einesgrößeren Substanzspektrums.

In dieser Studie präsentieren wir Datenzu Epidermal Skin Test 1000 (EST-1000), einer neuen, humanen, organo-typischen Epidermis, die unter anderem

speziell zur Einschätzung des Gefahren-potenzials bestimmter Stoffe entwickeltwurde. Morphologisch zeigt EST-1000eine hohe Vergleichbarkeit zur Situationin vivo. Die Expression verschiedenercharakteristischer Marker wie Ki-67, CK 1/10 bzw. 5/14, Transglutaminase,Kollagen 4, Involucrin, Beta 1 Integrinund Laminin konnten duch immunhisto-chemische Untersuchungen eindeutignachgewiesen werden. Eine funktionelleBarriere – vermittelt durch das StratumCorneum – konnte darüber hinaus über die Toleranz gegenüber 1% SDS(ET50 > 90 min) und 1% Triton X-100(ET50 > 180 min) demonstriert werden.Die topische Applikation von irritativenSubstanzen wie z.B. Nickelsulfat indu-zierte, entsprechend der Physiologie derbeteiligten Zelltypen in ihrer nativenUmgebung, die Freisetzung proinflam-matorischer Mediatoren wie IL-1 α undIL-8.

Im Mittelpunkt dieser Untersuchungenstand die interne Validierung von EST-1000 für die Korrosionstestung be-stimmter Substanzen gemäß der OECDRichtlinie TG 431. Die von der OECDvorgegebenen 12 Referenzsubstanzenwurden topisch auf das Hautmodell auf-getragen und die Vitalität der Zellenanschließend mit dem Standard MTT-Test bestimmt. Alle Testsubstanzenkonnten mit EST-1000 reproduzierbarrichtig klassifiziert werden. Die vor-liegenden Ergebnisse zeigen, dass EST-1000 alle Kriterien der OECD TG431 erfüllt und sich damit für die Testung potenziell korrosiver Substanzenhervorragend eignet. Zusätzlich veran-schaulichen die gezeigten Zytokin-expressionsdaten, dass EST-1000 zurAufklärung umfangreicher toxiko-logischer und pharmakologischer Fra-gestellungen (Irritation, Sensibilisierung)eingesetzt werden kann.

Vortrag/Lecture

[In vitro skin corrosion testing with Epidermal Skin Test 1000 (EST-1000) – a new reconstructed epidermis] Bestimmung korrosiver Substanzen mit Epidermal Skin Test 1000 (EST-1000) – einer neuen rekonstituierten,humanen EpidermisJens J. Hoffmann, Eckard Heisler, Sonja Karpinski und Horst Wilhelm FuchsCellSystems Biotechnologie Vertrieb GmbH, D-St. KatharinenE-Mail: [email protected]

Poster

Assessment of the human epidermis model SkinEthic RHE™for in vitro skin corrosion testing according to OECD TG 431Helena Kandárová1, Manfred Liebsch 1, Horst Spielmann 1, Elke Genschow 1, Elisabeth Schmidt 1,Dieter Traue 1, Robert Guest 2, Andrew Whittingham 2, Neil Warren 2, Armin O. Gamer 1, MartinaRemmele 3, Tanja Kaufmann 3, Elke Wittmer 3 and Bart De Wever 4

1ZEBET, Federal Institute for Risk Assessment (BfR), D-Berlin, 2Safepharm Laboratories, UK-Derby, 3Experimental Toxicology and Ecology of BASF AG, D-Ludwigshafen, 4 Skinethic Laboratories, F-Nicee-mail: [email protected]

In the year 1998 the EPISKIN™ andTER in vitro corrosivity test were suc-cessfully validated and met the accep-tance criteria previously defined by theManagement Team of the ECVAM International Validation Study. Subse-

quently an ECVAM funded “Catch up”validation study was performed with thehuman epidermal model EpiDerm™ (MatTek, Ashland, USA) and also this methodand model met acceptance criteria.

In 2002 the National Co-ordinators

of OECD Test Guideline Programme(WNT) endorsed New Draft Test Guide-lines TG 430 (TER) and TG 431 (HumanSkin Model) for In Vitro Skin CorrosionTesting. In Guideline TG 431 generalfunctional and performance criteria were


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defined if other (or new) skin or epider-mis models are used in the context of thisguideline.

To show that this concept works, in2003 ZEBET tested several chemicalsfrom the ECVAM validation trial withthe SkinEthic reconstituted human epidermal (RHE) model (SkinEthic, F-Nice), applying the validated Epi-Derm™ skin corrosion test protocol andprediction model. After minor technicaladaptations, classifications obtained

were in accordance with those obtainedpreviously with the validated human skinmodels EPISKIN™ and EpiDerm™.

From December 2003 to February2004 a blind trial was conducted at ZEBET (D), Safepharm (UK) and BASF(D) with the 12 reference chemicalsspecified in OECD Test Guideline 431.In each laboratory three independent de-terminations were performed. Resultsobtained with the SkinEthic epidermalmodel were reproducible, both within

and between laboratories, and over time.Concordance between the in vitro predic-tions of skin corrosivity potential ob-tained with the SkinEthic epidermalmodel and the predictions obtained withthe accepted tests of OECD TG 430 andTG 431 was very good. The new test wasable to distinguish between corrosive andnon-corrosive chemicals for all of thereference chemicals.

Seit Beginn der 90er Jahre gehen dieFischbestände an der oberen Donau signifikant zurück. Besonders die Äscheist trotz intensiver Besatzmaßnahmen inihrem Bestand stark gefährdet, obwohlsich Abwasserbelastung und Gewässer-güte deutlich verbessert haben.

Die offensichtliche Diskrepanz zwi-schen Verbesserung der Gewässergüteund Fischrückgang wurde seitdem nichtgelöst. Die Abwasserbelastung wurdezwar durch Aus- und Neubau der Kläranlagen deutlich verbessert, jedochgibt es zahlreiche Substanzen, die durchKlärung des Wassers nicht eliminiertwerden können. Viele Schadstoffein-träge sind kaum im Wasser gelöst, son-dern werden dem Wasser durch Adsorp-tion an Schwebstoffe und Sedimenterasch entzogen. Diese Chemikalien gefährden nicht nur die im Sediment

lebenden Organismen, sie können auchaus dem Sediment durch z.B. Hoch-wasserereignisse remobilisiert und somit wieder bioverfügbar werden. ImRahmen der vorliegenden Studie wurden daher zur Abschätzung der öko-toxikologischen Gefährdung vier Sedi-ment-, zwei Schwebstoff- und fünf Wasserproben aus dem Bereich aus-gewählter Klärwerke in verschiedenenExpositionspfaden (native Wasser- undSedimentproben, acetonische Sediment-extrakte und XAD-Wasserextrakte) inden folgenden Biotests auf ihr öko-toxikologisches Potenzial untersucht:(1) Zytotoxizitätstest (zelltoxische Wirkung), (2) Comet-Assay mit RTL-W1-Zellen (Gentoxizität), (3) Bakteri-enkontakttest (Bakterientoxizität), (4) Yeast Estrogen Screen (endokrineWirksamkeit), (5) Fischeitest mit Danio

rerio (Embryotoxizität, Teratogenität)und (6) Ames-Test (Mutagenität).

Trotz hoher Verdünnungen einzelnernativer Sediment- und Schwebstoff-proben wurde z.B. häufig eine hohe embryotoxische Wirkung beobachtet.Im Hefe-Assay konnte bei allen Wasser-extrakten eine signifikante endokrineWirksamkeit mit 17ß-Estradiol-Äquiva-lentkonzentration von bis zu 2,3 ng/Lnachgewiesen werden. Zusammenfas-send konnte in den Biotests gezeigt werden, dass im Untersuchungsgebietdurchaus Belastungsschwerpunkte vor-liegen. Auf der Basis der vorliegendenin vitro Befunde muss auf eine ver-gleichsweise hohe Belastungssituationin der Donau geschlossen werden; einZusammenhang mit dem Rückgang derFischpopulationen kann nicht ausge-schlossen werden.

Poster

[In vitro investigations into sediment, particulate suspended matter and watersamples to explain the decline in fish populations of the upper Danube river]In vitro Untersuchungen von Sediment-, Schwebstoff- und Wasserproben zur Erklärung des Fischrückgangs in der DonauSteffen Keiter 1, Thomas Kosmehl 1, Andrew Rastall 2, Klaus Aföldi2, Lothar Erdinger 2, Karl Wurm 3, Thomas Braunbeck 1 und Henner Hollert 1

1Institut für Zoologie, Universität Heidelberg, D-Heidelberg, 2Hygiene-Institut, D-Heidelberg, 3Gewässer-ökologisches Labor, D-StarzachE-Mail: [email protected]


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In der vorliegenden Studie wurde dasgentoxische und mutagene Schädigungs-potenzial acetonischer Sedimentextraktevon Ober- und Hochrheinproben in denbeiden permanenten Fischzelllinien

RTG-2 und RTL-W1 untersucht. Durchden Einsatz unterschiedlicher Test-systeme (Ames-Test mit den StämmenTA98 und TA100 jeweils mit und ohneexogene S9-Supplementierung, Comet-

Assay mit den Zelllinien RTG-2 mit undohne exogene S9-Supplementierung sowie RTL-W1) konnten erste Rück-schlüsse auf die Art der gentoxischen Belastung gezogen werden. Insgesamt

Sedimente stellen Senken für gelösteWasserinhaltsstoffe dar, die eine hoheAffinität zu Schwebstoffen besitzen.Durch Remobilisierung hochkontami-nierter Altablagerungen können Sedi-mente aber auch zur Quelle einer erneu-ten Belastung werden. Die StaustufeLauffen am Neckar ist ein Muster-beispiel für Staustufen mit klarer Diffe-renzierung in hochkontaminierte Alt-und geringer belastete Jungsedimente.Vor diesem Hintergrund wurde das Dioxin-ähnliche Schädigungspotenzialvon Sedimenten aus der Neckarstau-haltung Lauffen analysiert.

Verschiedene Sedimentbohrkern-proben der Stauhaltung Lauffen wurdenin Anlehnung an die Methode von Bracket al. (2000) auf ihre Fähigkeit unter-sucht, das Entgiftungsenzym Ethoxyre-

sorufin-O-Deethylase (EROD) in derpermanenten Fischzelllinie RTL-W1 zuinduzieren. Die Überprüfung auf Dioxin-ähnliche Wirksamkeit ergab eine signifi-kante Untergliederung in oberflächen-nahe Jungsedimente mit geringeremEROD-Induktionspotenzial und tiefer-gelegene Altsedimente mit einem sehrhohen Dioxin-ähnlichen Potenzial. Einsprunghafter Anstieg der EROD-Akti-vität ist dabei genau in der Tiefe einerErosionsdiskordanz in 25 cm Tiefe zu beobachten, die im Rahmen einerfrüheren Studie ermittelt worden war(Hollert et al., 2003). Für die Bohrkern-segmente unterhalb dieser Tiefe konnteeine sprunghafte Zunahme der ökotoxi-kologischen Belastung sowohl in Formeines Anstiegs der Schwermetall- undPCB-Konzentrationen um einen Faktor

10 bis 50, als auch in Form einer signifi-kanten Zunahme des zytotoxischen undmutagenen Potenzials nachgewiesenwerden.

Ein Vergleich der Dioxin-ähnlichenWirksamkeit der Sedimente des unter-suchten Standorts mit denjenigen in Sedimenten und Schwebstoffen andererpotenziell belasteter deutscher Flüsselässt auf einen sehr hohen Kontaminati-onsgrad der Altsedimente des StandortsLauffen schließen.

Brack, W., Segner, H., Moder, M. andSchüürmann, G. (2000). Environ. Toxicol.Chem. 19 (10), 2493-2501.Hollert, H., Haag, I., Dürr, M. et al. (2003).UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 15, 5-12.

Poster

[Dioxin-like activities in the permanent fish cell line RTL-W1 – depth profiles in Neckar river sediments at the lock area of Lauffen]Dioxin-ähnliche Wirksamkeit in der permanentenFischzelllinie RTL-W1 – Tiefenprofile von Sedimentbohr-kernen der Stauhaltung Lauffen am NeckarStefanie Knauert 1, Matthias Dürr 2, Ingo Haag 3, Thomas Braunbeck 1 und Henner Hollert 1

1Zoologisches Institut, Universität Heidelberg, D-Heidelberg, 2 Institut für Hygiene, D-Halle, 3 Institut für Wasserbau der Universität Stuttgart, D-StuttgartE-Mail: [email protected]

Poster

[Comparative investigations into the genotoxic potential of Rhine river sediments by means of the comet assay with RTG-2- and RTL-W1-cells]Vergleichende gentoxische Untersuchungen von Sedimenten des Rheins mit RTG-2- und RTL-W1-Zellen mit Hilfe des Comet-AssaysThomas Kosmehl 1, Jan Wölz 1, Volker Garke 1, Falk Krebs 2, Lothar Erdinger 3, Thomas Braunbeck1

und Henner Hollert 1

1Institut für Zoologie der Universität Heidelberg, D-Heidelberg, 2 Bundesanstalt für Gewässerkunde, D-Koblenz, 3 Hygiene-Institut, D-HeidelbergE-Mail: [email protected]


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12 der untersuchten 18 Sedimentprobenzeigten eine gentoxische Aktivität imComet-Assay mit den wenig biotrans-formationskompetenten RTG-2-Zellen,wogegen alle Sedimente im Comet-Assay mit der Zelllinie RTL-W1 signifi-kant gentoxisch wirkten. In den RTL-W1-Zellen mit ihrer hohen Biotransfor-mationskapazität konnten deutlicheUnterschiede im gentoxischen Potenzialder Sedimente nachgewiesen werden, sodass bei einer abschließenden Bewertungdie Effekte in beiden Zelllinien unter-schiedlich interpretiert wurden.

Der Einsatz eines S9-Mix im Comet-Assay mit den RTG-2-Zellen zeigte, dassin vielen Fällen Schadstoffe, die einer

Cytochrom P450-abhängigen Bioaktivie-rung bedürfen, für das gentoxische Schädigungspotenzial verantwortlich ge-macht werden konnten (vergleichbar hohe Effekte im RTG-2-Test wie bei denRTL-W1-Zellen). Die Befunde imAmes-Test korrelierten in über 50% derFälle gut mit den Befunden des Comet-Assays. Große Differenzen zeigten sichjedoch insbesondere für die Oberflächen-sedimente des Hochrheins, die im Comet-Assay deutlich mehr positive Befunde erbrachten.

Ein Vergleich der Bohrkern- und Ober-flächenproben ergab für die Gesamtheitder Proben im Comet-Assay keinen signifikanten Unterschied zwischen dem

gentoxischen Schädigungspotenzial, sodass auch für die oberflächennahen (rezenten) Sedimente im Rhein ein ver-gleichsweise hohes gentoxisches Poten-zial dokumentiert werden konnte. Hin-gegen wurde im Ames-Test für denGroßteil der (tieferen) Bohrkernprobenein höheres Schädigungspotenzial als jenes der Oberflächenproben nachge-wiesen. Insgesamt belegen die Daten,dass zur umfassenden Untersuchung vonUmweltproben beide Testsysteme ver-wendet werden müssen, um eine falsch-negative Bewertung gentoxischer Probenzu vermeiden.

Undifferentiated embryonic stem cells(ESC) are characterised by pluripotencyand a nearly unlimited self renewal capacity. The pluripotency has to bemaintained by differentiation inhibitingstrategies and is prerequisite for the possibility of the ESC to differentiate in-to different cell types and thereby fortheir applicability, e.g. in the embryonicstem cell test (EST). This in vitro assaypredicts the embryotoxic potential of testsubstances by determining their effectson the differentiation of ESC into cardiomyocytes. The aim of the studywas to evaluate strategies to inhibit differentiation in the culture of pluripo-tent ESC D3.

The ESC were cultured for 50 pas-sages under different culture conditions:supplementation with either leukaemiainhibitory factor (LIF) (1000 and 2000

U/ml) or oncostatin-m (OsM) (20 ng/ml)or co-culture with STO-fibroblasts aloneor in combination with LIF (1000 U/ml).Every fifth cell passage was investigatedfor the markers of pluripotency, stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA-1)and high alkaline phosphatase activity,using FACScan analysis and an enzymeactivity assay. The potency of the ESC to differentiate into cardiomyocytes was morphologically evaluated by theappearance of the contracting cardiomy-ocytes.

The pluripotency markers in the differ-ent ESC populations decreased duringthe 50 passages after different number of passages. The decrease of the markerscorrelated with a decreasing capacity to differentiate into cardiomyocytes. Butonly the decrease of SSEA-1 was observed before or at the same time

when the capacity of ESC to differentiatedecreased. Over the first 28 passages,each strategy maintained the differentia-tion capacity of the ESC. After 33 pas-sages cells cultured with LIF and after 43 passages cells cultured with OsM orSTO-feeder-layer in combination withLIF had a reduced capacity to differenti-ate into cardiomyocytes. The cells cul-tured with STO-feeder cells maintainedunchanged differentiation capacity up to 48 passages.

The differentiation inhibiting strate-gies using the supplementation of OsMor STO fibroblasts as feeder cells aloneor in combination with LIF were signifi-cantly more efficient to conserve the capacity of mouse ESC D3 to differenti-ate into cardiomyocytes than the com-monly used LIF.

Poster

Strategies to maintain pluripotency of mouse embryonic stem cells D3Vivian Kral, Burkhard Flick and Stephan KlugInstitute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Dept. of Toxicology, Charité-Universitary Medicine Berlin, D-Berline-mail: [email protected]


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Akute Durchfallerkrankungen durchE.coli-Keime stellen ein großes Problemin der Schweinehaltung dar. DurchImpfstoffe, die an die Zuchtsauen ver-abreicht werden, kann der Antikörper-gehalt gegen die bakteriellen Haftanti-gene im Kolostrum und in der Milcherhöht werden. Das Wirkprinzip derImpfstoffe beruht ausschließlich aufdem Transfer dieser mütterlichen Anti-körper an die Saugferkel. Im Rahmender Zulassung werden noch immer In-fektionsversuche an Ferkeln gefordert.

Serologische Testmethoden sind bisherim Europäischen Arzneibuch nur für dieWirksamkeitsprüfung von Chargen amLabortiermodell erlaubt. Um eine Ab-lösung dieser sehr belastenden Tierver-suche durch in vitro Methoden zu er-reichen, wurden verschiedene Enzym-immunoassays zur Untersuchung aufAntikörper gegen die HaftantigeneF4ab, F4ac, F6 und F41 in Serum- undKolostrumproben entwickelt. Insgesamtwurden 8 in Deutschland zugelasseneImpfstoffe in die Untersuchung einbe-

zogen. In zwei ausgesuchten Betriebenwurden jeweils 10 Muttersauen mit einem Produkt nach Herstellerangabengeimpft. Zwei Gruppen mit je 10 un-geimpften Tieren dienten als stallinterneKontrolle. Dabei zeigten sich bei dengeimpften Sauen in Blut und Kolostrumsignifikant höhere Antikörpertiter imVergleich zu den Kontrolltieren. Damiterscheinen alle vier Alternativmethodenzur Ablösung der Infektionsversuche beiSchweinen geeignet.

Two studies were performed to analysecomplex protein mass spectra, derivedfrom Surface Enhanced Laser Desorp-tion/Ionization Time Of Flight (SELDI-TOF) mass spectrometry (MS), in orderto discover protein expression signatures/biomarkers related to hepatoxicity andliver cancer. Wistar rats were treated in ahigh dose and a low dose study with either the hepatocarcinogen NNM (N-Nitrosomorpholine) or a vehicle control.Liver biopsies were taken and SELDI-TOF-MS was performed with protein extracts. Biomarkers were revealed in the data set by univariate analysis using

Ciphergen Software, as well as librariesof the BioConductor Project. Intensityvalues of several m/z values (proteins)differ significantly between control and treated samples, as well as betweentumor and non tumor tissue. Protein signatures were identified by decisiontree analysis. Principal Component Anal-ysis (PCA) and Self Organizing Maps(SOM) were used to visualise differencesin protein expression due to treatment aswell as expression patterns at differenttime-points. The results revealed thattreatment related protein expressionchanges are detectable at early time-

points, while later time points showedless changes, with exception for the tumor endpoint. Discrimination abilitybetween treated and untreated animals atearly time-points increases with dose.

Some of the differentially expressedproteins could be identified by combina-tion of fractionation and mass spectro-metry (Fatty acid binding protein, Super-oxide dismutase, Ubiquitin, Acyl-CoAbinding protein, 10 kDa Heat shock pro-tein). All results were correlated withhistopathology data and biological rele-vance could be determined.

Vortrag/Lecture

SELDI approaches for liver cancer analysisMichaela Kröger 1, Suse Beyer 1, Kerstin Fella 1, Matthias Glückmann 2, Annette Kopp-Schneider 3, Carina Ittrich 3 and Peter-Jürgen Kramer 1

1Institute of Toxicology, Merck KGaA, D-Darmstadt, 2Applied Biosystems, D-Darmstadt, 3German Cancer Research Institute, D-Heidelberge-mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

[Serological test methods to replace challenge procedures in piglets aftermaternal immunisation with E. coli vaccines]Serologische Testmethoden als Ersatz für Infektionsversuchean Ferkeln bei E.coli-MuttertierimpfstoffenMarion Krug, Dorothea Hausleithner, Regine Taddey, Peter Volkers, Babett Kobe und Klaus CußlerPaul-Ehrlich-Institut, D-Langen E-Mail: [email protected]


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After a successful refinement, followingan unsuccessful outcome of a pre-validation study, three in vitro tests foracute skin irritation are currently evaluat-ed in a validation study (VS) funded by the EU validation centre ECVAM:two commercially produced human epi-dermis models, EPISKIN (EPISKINSNC, Lyon, France) and the EpiDerm(MatTek, Ashland, USA) are evaluated ina common protocol which is the outcomeof a co-operation between L’OREAL andZEBET. In addition, the SIFT (skin integrity function test) using rat skin exvivo is evaluated. The study is managedby ZEBET at the BfR. Each of the tests

will be validated in three laboratories under blind conditions according to in-ternational recommendations for the ex-perimental validation of toxicity tests.

In phase 1, during March 2004 - May2004 20 chemicals (10 irritant (I) and 10non-irritant (NI)) were tested in the leadlaboratories only. In case of a successfuloutcome, in phase 2, 60 chemicals, 30 Iand 30 NI, will be tested in 3 laboratoriesper test (Sept. 2004 - Jan. 2005).

The following performance criteriawere defined for the 3 tests:1. Reproducibility-overall mean CVshould be < 0.3; ANOVA and other statistical analyses should indicate no

statistically significant differences be-tween laboratories;2. predictive ability: sensitivity ≥ 80%(false negatives ≤ 20%) and specificity ≥ 80% (false positives ≤ 20%).

The proposed acceptance criteria forpredictive ability will need to be con-firmed by additional statistical analysesusing in vivo rabbit data. In addition, the data generated during the VS will beanalysed post-hoc to evaluate the perfor-mance of the tests according to the 3 categories of the GSH (globally har-monised classification system) of the UN.

Es wurden zwei bereits validierte Test-systeme, welche Stoffwechselprozesse inden Zellen quantifizieren (Neutralrot undMTT/WST-8 Assay) und zwei Testsyste-me, die auf der strukturellen Integritätder Zellmembran basieren (elektronischeZellzahlbestimmung mittels CASY-Technologie und Trypanblaufärbung),zur Bestimmung der in vitro Toxizitätausgewählt und über Dosis-Wirkungs-

Beziehungen die IC50-Werte von insge-samt 50 ausgewählten Prüfsubstanzen ermittelt. Der Vergleich dieser Ergebnis-se mit Werten aus der Literatur zeigt einehohe Übereinstimmung, wobei die elektronische Zellzahlbestimmung amsensitivsten die in vitro Toxizität derSubstanzen evaluierte. Die Empfindlich-keit der Testsysteme nahm vonMTT/WST-8 über Neutralrot bis Try-

panblau kontinuierlich ab. Es konnte gezeigt werden, dass die Aussagekraftder Ergebnisse aus der elektronischenZellzählung auf dem hohen Auflösungs-vermögen der CASY-Technologie basiert, so dass nicht nur die chemischinduzierte Schädigung der Zellen (Per-meabilität der Zellmembran), sondernauch schon erste Anzeichen von Nekroseerkannt werden konnten.

Poster

[Evaluation of in vitro effects of 50 toxic reference chemicals using an electronic cell counting and sizing system versus MTT- and NRU- assay]Evaluierung zytotoxischer Effekte von 50 ausgewähltenChemikalien auf Mausfibroblasten (Linie L929). EinVergleich: WST-8, NRU, Trypanblau und elektronischeVitalitätsbestimmungBirgit Lewandowski und Toni LindlI.A.Z. Institut für angewandte Zellkultur, D-MünchenE-Mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

The ECVAM validation study of three in vitromethods for acute skin irritation – interim report of the validation management teamManfred Liebsch1, Philip Botham2, Julia Fentem3, Jon Heylings3, Roland Roguet 4, Thomas Hartung 5, Chantra Eskes 5, Sebastian Hoffmann 5, Tom Cole6, Andrew Worth5, Valerie Zuang5 and Horst Spielmann1

1ZEBET im BfR, D-Berlin, 2Syngenta Macclesfield UK-Cheshire, 3Unilever SEAC, Sharnbrook, UK-Bedfordshire, 4L’Oréal Life Science Research, F-Clichy, 5ECVAM, IHCP, JRC I-Ispra, 6ECB, IHCP, JRC, I-Isprae-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04166

After many years of experimental workwith animals of diverse species, the author felt confronted with the questionwhether the great expenditure of sacri-ficed animal life would pay off whencompared with the results gained. Byself-critically considering his work, hegradually experienced a conversion froman unconcerned experimenter to a manfeeling a deep sympathy with his fellowcreatures. This motivated him to ponderthe true nature of animals. Instead of applying ethics – though justified in itsown realm – the author preferred to lookat the problem using the General Sys-tems Theory (GST), which can describe“the other side” of any system, the side

into which any system may occasionallyor necessarily transform. It occurred tohim to assume that – provided we see aliving organism as a system (as Ludwigvon Bertalanffy, the founder of GST, did)– the “other side” of the animal wouldcorrespond to an innocent “genius” whosuffers for man (thereby assuming aChrist-like position), whereas in its transitory life the true essence of the ani-mal is hidden. Thus, by fancifully view-ing the role of animals destined to suffer,a connection between GST and theologyor religion arises. The consequence forus would be to pay honour to the test an-imal, irrespective of whether or notpainful experiments could be avoided.

The differentiation between a sacrifice(spiritually surrendering for a greatergood) and a victim (involuntarily subject-ed to suffering) reveals that the experi-mental animal primarily belongs to thelatter. But it can be elevated to the formerwhen the full meaning of its suffering becomes obvious. The same holds truefor “human testing”, if, in contrast to the formidable atrocities, e.g. of concen-tration camps, the momentum of volun-tariness is guaranteed, as pioneers ofmedical research frequently demonstrat-ed by carrying out experiments on themselves.

One aim of ecotoxicological risk assess-ment is to predict effects of toxicants innatural systems. For this, various test-systems from the cellular to the commu-nity level are used as surrogates. The pre-sentation will inform about the potentialand shortcomings of test-systems at lowlevels of biological organisation in pre-dicting the effects of toxicants in naturalsystems. In addition it will be presented

how the information gathered from test-systems with a higher level of biologicalorganisation can be used to enhance real-ism in aquatic risk assessment. The useof such systems – as micro- and meso-cosms, as well as monitoring studies –enables to reduce the level of uncertaintywhen predicting impacts of toxicants ona landscape scale. Towards this end, thepresentation shows the importance of

considering environmental stressors, in-tra and inter-specific biological interac-tions and demonstrates the advantages toconsider metapopulations when assess-ing effects of toxicants on natural com-munities. Using this knowledge increasesthe accuracy in predicting effects of tox-icants in natural systems and can help toreduce the amount of animal experi-ments.

Vortrag/Lecture

Improving environmental risk assessment using test-systems of various complexityMatthias Liess Arbeitsgruppe Effektpropagation, Umweltforschungszentrum, D-Leipzige-mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

Animal testing ethics and human testingThoughts on our conduct with and our relationship to animals

Alfred Locker A-Vienna

Vortrag/Lecture

REACH: problems and solutions from the chemical industry’s viewpointMichael LuleiVerband der Chemischen Industrie e.V. (VCI), D-Frankfurt/Maine-mail: [email protected]

The future chemicals policy (REACH)will have great consequences on the entire industry at all stages of the supply

chain and also has a direct effect on itscapability for innovations and competi-tiveness. REACH will lead to a consoli-

dation of the product portfolios. The registration costs of many low-volumesubstances produced for special uses will


ALTEX 21, 3/04 167

be too high. Chemicals with an un-favourable ratio between registrationcosts and profit will disappear from themarket.

Because of this, the chemicals policyshould not only be measured with regardto the question of whether it can ensure ahigh level of protection for human healthand the environment, but also in respectof how much it promotes competitive-ness and innovation in companies andstrengthens their own degree of responsi-bility. It must also support the ease ofcommunication in the supply chain, en-sure clarity and legal security for thecompanies concerned and be compatiblewith procedures in other regions of theworld.

The draft Regulation proposed by theCommission for the registration, evalua-

tion and authorisation of chemicals(REACH) does not fulfil these prerequi-sites. Economic impact assessments con-ducted in various EU member states aswell as a pilot trial in which the worka-bility of REACH was tested in four sup-ply chains revealed major problems andshortcomings. Without a simplificationof the legal requirements many compa-nies will be overburdened and will not beable to cope.

In order to achieve a balanced andworkable Regulation the following stepsare necessary in the legislative proce-dure:1) Impacts of the proposed provisions inparticular on the competitiveness of theEuropean industry, on economic growth,employment and innovation must be examined thoroughly by a neutral party

before the proposal for a Regulation goesin the final phase of the legislative proce-dure. 2) The workability of the REACH sys-tem and the efficiency of its proceduresmust be fully examined and tried out bycompanies and public authorities. Thisshould be done in Europe-wide pilot projects jointly with the Commission,competent national authorities and theconcerned companies.

A strong need remains for improve-ments and simplifications to reliablybring about workable and efficient provi-sions. The VCI has worked out severalsuggestions for improvements; i.e. toavoid unnecessary bureaucratic and expensive procedures, superfluous tests,and losses of time for new productionsand products.

Homocysteine (Hcy) is a sulfur contain-ing amino acid produced from thecatabolism of essential amino acid me-thionine and remethylated to methioninein the presence of methylsynthase usingVit-B12 or Cyanocobalamine as a cofactor and methylene tetrahydrofolatereductase as a co-substrate. Alteration in level of Hcy found to be related tomany disorders including cancer.

High Hcy level have been reported incancer patients but it is not certain thathow it is related to cancer. As the muta-tion plays an important and active role in the development of tumor, so the fac-tor responsible for high rate of mutationwould be responsible for cancerous

growth. Study therefore, comprises thecollection of blood of the individual having high homocysteine level. TheDNA damage was observed by using micronucleus test in the cultured bloodcells of the individuals having high level(16.6, 38.7, 54, 78.65 µmol/l) of Hcy.There was a significant (P<0.01) induc-tion in the number of micronuclei foundwhen compared to control sample (indi-vidual having the normal level of Hcy).The induction in the number of micro-nuclei was dependent to the level of Hcyin the individuals means the sample ofthe individual having highest level ofHcy showed the highest number of micronuclei.

We were also interested to perform invitro investigations. So, blood cells werecultured with different concentrations (0, 10, 20, 50, 100 µm) of Hcy. Interest-ingly the results of this study was in parallel of the in vivo findings means asignificant enhancement in the frequencyof micronuclei was observed and the increment was concentration dependentwhen compared to control sample (having 0 µm of Hcy). The highest number of micronuclei noted in the sam-ple with highest concentration (100 µm)of Hcy. The results of present study suggest that high homocysteine levelcauses DNA damage which may lead tomutations and cancer.

Poster

An in vivo and in vitro investigation to assess the role of high homocysteine in DNA damageAli Mehboob and Ahmad Khan Sageer Ecotoxicology and Immunotoxicology Lab., Department of Medical Elementology and Toxicology, Hamdard University, IN-New Delhie-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04168

Even today a continuous demand existsfor developing novel analgesics for painrelief. Traditional behavioural pain examinations in animals are highlystressful and subjective. Non invasiveimaging approaches like fMRI in anes-thetized animals would significantly re-duce the stress for animals and simulta-neously refine and improve objectivemeasurements of analgesic effects.Moreover, a model which would allowthe investigation of (chronic) pain processes would open a new avenue inpain research. Therefore, we establisheda heat pain paradigm in a rat-model resulting in reliable and quantifiableBOLD responses in pain related brain

areas nicely comparable to human stud-ies. Moreover a morphine dose responsecurve as the analgesic gold standard wasachieved.

FMRI was performed on a 4.7 T MRIanimal scanner. The initial 120 scans,each covering the whole brain, recordeda 4 minutes period without stimulation,the next 60 scans covered 2 minutes oftopical heat stimulation followed by 60 scans of no-stimulation and so on.Computer adjustable current outputs(MRI-ThS1-2ch) stimulated the rat hindpaw at given temperatures of 35, 40, 45and 50°C. The set of four different temperatures was repeated 2 times. After that morphine was applied at

dosages between 0.125 to 2 mg/kg and recording proceeded for another 4 stimuli sets. Functional analysis was performed using MRIan or BrainVoy-ager.

Brain areas, already known to be involved in sensory and pain processingwere significantly increased in volumeand activation (thalamus, somatosenso-ry cortex, cingulate cortex, insula, hypothalamus). Morphine was able toreduce the activity in nearly all struc-tures. The morphine doses response profile appeared to be brain structuredependent and complex.

In conclusion, our computer con-trolled topical heat stimulation of the rat

VACTRAIN ist ein EU-Projekt im 5.Rahmenprogramm, das mit Hilfe vonWorkshops und Trainingskursen zumverstärkten Einsatz von Alternativen zuTierversuchen in der Qualitätskontrollevon Impfstoffen beitragen soll. Im Zeitraum von November 2002 bis März2004 fanden ein Workshop und 5 Trai-ningskurse statt. An den Trainingskursennahmen insgesamt 44 Personen aus 16europäischen Ländern teil.

Es wurden folgende Themen behandelt:● Trainingskurs 1 (Mai 2003) IVI:Geflügelimpfstoffe – Fremdvirusaus-schluss mittels PCR

● Trainingskurs 2 (Mai 2003) PEI:Bakterielle Impfstoffe ad us. vet. ● Trainingskurs 3 (September 2003)NVI: DPT-Impfstoffe: SerologischeModelle● Trainingskurs 4 (März 2004) IVI:Tollwut-Impfstoffe ● Trainingskurs 5 (März 2004) NVI:DPT-Impfstoffe: Neue Technologien inder Qualitätskontrolle

Der Aufbau und die Durchführung derTrainingsprogramme werden beispielhaftanhand von Kurs 2 erläutert. Durch dieselbständige Durchführung der Laborme-thoden, von der Testvorbereitung bis zur

statistischen Auswertung der Ergebnisse,konnten sich die Teilnehmer von der Prak-tikabilität und der Reproduzierbarkeit derin vitro Testsysteme überzeugen. Die prak-tischen Arbeiten wurden durch zahlreicheVorträge ergänzt, für die auch externe Re-ferenten, unter anderem von EDQM undECVAM, gewonnen werden konnten. DieTeilnehmer erhielten umfangreiche Ar-beitsunterlagen zu den Vorträgen und La-bormethoden, einschließlich der Arbeits-anweisungen. Alle Teilnehmer haben diePräsentationen und die bereitgestelltenArbeitsmittel sowie die Organisation undDurchführung der Laborarbeiten als aus-gezeichnet bewertet.

Vortrag/Lecture

[VACTRAIN a training programme to introduce the 3R methods into vaccines quality control]VACTRAIN – Ein Trainingsprogramm zu 3R-Methoden in der Qualitätskontrolle von ImpfstoffenAlexander Mergel 1, Elisabeth Balks1, Lukas Bruckner 2, Coenraad F. M. Hendriksen 3 und Klaus Cußler 1

1Paul-Ehrlich-Institut, D-Langen, 2Institut für Viruskrankheiten und Immunprophylaxe, CH-Mittelhäusern, 3Niederländisches Vakzine Institut, NL-BilthovenE-Mail: [email protected]

Poster

New animal model for stressfree and objective pain researchNicole Motzkus, Lubos Budinsky, Marina Sergejeva, Kay Brune and Andreas HessInstitute for Pharmacology, Pharmacological imaging and image analysis, D-Erlangene-mail: [email protected]


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hind paw is robust leading to reliableBOLD activation of sensory and painrelated pathways. The results can bequantified with respect to brain area,size, and intensity in relation to the tem-

perature applied. Morphine can blockthese responses. Therefore, this non invasive pain model at minimal animalstress level due to the anaesthesia of the animal is highly objective and well

suited for testing new analgetics andfurthermore to study pain chronifica-tion.

The European Union decided a gradualrestriction of the majority of safety toxi-cological animal tests and a substitutionof these tests by validated non-animal invitro methods. The dermatological test-ing of cosmetics and ingredients in animal experiments will no longer be allowed in the near future. An in vitromethod making use of biotechnological-ly produced, artificial human skin hasbeen approved as an in vitro test for skincorrosion. In this context, three-dimen-sional skin models become more andmore important for dermatological test-ing of passive or active ingredients, for-mulations and ready-to-use cosmetics.

In this study, different ready-to-usecosmetics were tested with regard to

their skin compatibility. Therefore, twodifferent three-dimensional skin modelswere used. Moreover, toxicity was as-sessed on the basis of the Vibrio fischeribioassay.

The reconstituted human skin modelInSkin-SP was produced by generating acollagen matrix containing primary dermal fibroblasts. Primary keratinocyteswere seeded and cultured on this artifi-cial dermis, and proliferation and differ-entiation of keratinocytes resulted in anepidermis with a fully functional hornylayer. This skin equivalent was applied in comparison to the ex vivo skin model InSkin-V, a skin explant. The Vibrio fischeri bioassay is a well-establishedand prescribed method rather applied

for detection of toxic components inwaste water (ecotoxicity). The naturallylight emitting bacteria respond with ameasurable reduction in light emissionupon exposure to a toxic sample.

For testing of skin compatibility, different ready-to use cosmetics were applied to the skin models which weresubsequently analysed by histologicalmethods. Furthermore, expression ofvarious differentiation markers was assessed. Variance in skin compatibilitycould be observed for different cosmet-ics. The independent Vibrio fischeribioassay provided good correlation withdata obtained from the three-dimensionalskin models.

Poster

Biotechnologically produced three-dimensional skin models provide an in vitro method for dermatological testsof cosmeticsSonja Otten, Marion Lempp, Jörg Riedel, Sabine Greiner, Katharina Kiepfer and Marion MappesIn Vitro Biotec GmbH, D-Stuttgarte-mail: [email protected]

There is increasing evidence that toxi-cologic rather than immunologic pro-cesses may be primarily responsible for the development of occupationalasthma following exposure to chemicalirritants. The analysis of effects of inhalable substances by using cultivatedcells of the target organ (i.e. lung) requires the introduction of new in vitrotechniques in order to achieve adequate

cultivation and exposure. Epithelialdamage is common to all forms of asth-ma and other chronic airway diseases.The direct toxic effects of respiratoryhazards to epithelial cells are significantas an initiating event in the developmentof chronic airway diseases.

We developed a new in vitro test system for the evaluation of substancescausing lung damage. This in vitro

model is based on lung epithelial cellsreleasing inflammatory mediators uponchemical irritation. Furthermore, otherbiomarkers were established to estimatethe toxic profile of substances. This invitro model and biomarkers were vali-dated with well known toxic com-pounds. We adapted this in vitro modelto a new fully automated system forsubstance testing in 96-well plates. In

Poster

Development of a high throughput in vitro system for lung toxicity testing of substancesAndreas Pahl, Ruzica Puljic and Kay BruneDepartment of Pharmacology and Toxicology, University of Erlangen, D-Erlangene-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04170

this automated system, biomarkers aredetermined in 384-well plates using real-time quantitative one-tube RT-PCR.

These results suggest that this epithe-

lial cell culture model may allow theevaluation of potentially lung damagingcompounds in vitro in a high throughputmanner. This approach may result in

replacing animal experimentation intoxicity testing of chemicals for lungdamage.

The Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experimentson Animals (CPCSEA) in India is one ofits kind in the world. It is the statutorybody of the Government of India formedby an act of the Indian Parliament. It isbody of nominated members and re-presentatives from national regulatoryagencies, Ministry of Health and FamilyWelfare, Ministry of Environment andForests, national academic and researchcouncils, premier research institutes, eminent scientists and animal welfare organisations. The CPCSEA draws itspowers from PCA Act 1960 which statesthat the duty of the committee “is to takeall such measures as may be necessary to ensure that animals are not subject tounnecessary pain or suffering before,during or after the performance of exper-iments on them”.

With the power to promulgate its ownlaws, to ensure the humane and ethicaluse of animals in research and education,the CPCSEA has in 1998 notified in thegazette of India the Breeding of and

Experiments on Animals (Control andSupervision) Rules 1998.

The CPCSEA is unique in that the lawin itself has enabled the creation of acommon platform for recourse and dis-cussion for scientists and animal activistsand in this front the CPCSEA works for humane and progressive solutions inthe use of animals in experimentation.Interestingly in a country that is caughtin a paradox – in violence and sunk in aculture enmeshed in rich cultural and religious traditions, it is a country thatyet draws a lot of its power from its belief in “ahimsa” (the philosophy of non violence). It was observed that it wasnot different in laboratories that used animals. Unethical practices, inhumaneand unscientific practices, ignorance tothe use of alternatives were a way of science till 1999, when CPCSEA wasmade functional. For four years theCPSEA waged a battle, rescued thou-sands of animals brutalised in laborato-ries, fought legal battles to victory, enforced for the first time in the country

good laboratory practices, guidelines forthe use of animals in the production ofimmunobiologicals, introduced the credoof 3Rs, trained and taught scientific per-sonnel the credibility of humane scienceand most importantly brought in the concept of the fourth R, “rehabilitation”of used laboratory animals .Today CPC-SEA has made it a national policy basedon the principle that personnel using experimental animals have a moral responsibility for animals after their use.And costs of after care/rehabilitation ofanimals post experimentation are to be apart of research costs and should be ascaled in positive correlation with thelevel of sentience of the animals.

This paper is about Indian law and animal experimentation, the success story of the CPCSEA in India, the battlewaged and its victory in inculcating thecredo of 4Rs - Reduction, Refinement,Replacement and Rehabilitation of ani-mals used in experimentation.

Vortrag/Lecture

Ahimsa and alternatives – the concept of the 4th R. The CPCSEA in IndiaShiranee PereiraConsultant, Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals, Animal Welfare Division, Govt. of India, IN-Chennaie-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04 171

Die Etablierung von Verfahren zur lokalen Medikamentenapplikation an dasInnenohr als Alternative zur systemi-schen Therapie von Innenohrerkrankun-gen erfordert die Durchführung prä-klinischer pharmakokinetischer Studien.Aufgrund der sehr kleinen Flüssigkeits-räume und der damit verbundenen tech-nischen und analytischen Schwierig-keiten waren bisherige Untersuchungenmit jeweils einer Volumenprobe pro Tiersehr Tierversuchs-aufwändig. Computer-simulationen können helfen, die Anzahlvon Tierversuchen bei pharmakokineti-schen Studien am Innenohr deutlich zureduzieren.

Mit Hilfe eindimensionaler Modellekann die Wirkstoffdiffusion in derCochlea mit geringem Rechenaufwand

zunächst abgeschätzt werden. Das ist besonders für inverse Parameterbestim-mungen, die zahlreiche Vorwärtssimula-tionen erfordern, von Nutzen. Mehr-dimensionale Modelle können die realengeometrischen Verhältnisse besser re-präsentieren. Speziell im basalen Bereichder Cochlea sind auf Grund der geo-metrischen Verhältnisse die Voraus-setzungen einer eindimensionalen Mo-dellierung – die Konstanz der Konzentra-tionsverteilung über dem cochleärenQuerschnitt – nicht gegeben. Auf derGrundlage eines dreidimensionalen ANSYS-Simulationsprogramms wurdendie bisher beobachteten Unterschiede inden Wirkstoffverteilungen mit Hilfe vonein- und dreidimensionalen Modellenuntersucht und durch Einführung geo-

metrischer Korrekturfunktionen approxi-miert. Des Weiteren wird dargestellt, wie die typische Spiralform der Cochleadie Diffusion beeinflusst und wie dies beider dreidimensionalen Simulation be-rücksichtigt wird.

Als Schlussfolgerungen aus dem qualitativen und quantitativen Vergleichein- und dreidimensionaler Modelle undder Beschreibung der Möglichkeiten undGrenzen einer Modellreduktion lassensich Konzepte für die Nutzung der Computersimulationen im Rahmen des3R-Prinzips bei präklinischen pharma-kokinetischen Untersuchungen am Innen-ohr ableiten.

Unterstützt durch das Bundesinstitut fürRisikobewertung (BfR), ZEBET

Vortrag/Lecture

[Replacement of the in vivo neutralisation test for efficacy demonstration oftetanus vaccines ad us. vet. for marketing authorisation procedures]Ersatz des in vivo Neutralisationstests bei der Wirksamkeitsprüfung von Tetanusimpfstoffen ad us. vet. im Rahmen der ZulassungUte RosskopfPaul-Ehrlich-Institut, D-LangenE-Mail: [email protected]

Poster

[Development and mathematical testing of a three-dimensional model ofsubstance distribution in the cochlea after local application]Weiterentwicklung und mathematische Testung eines Modells zur 3D-Computersimulation der Wirkstoffverteilung in den Innenohrflüssigkeiten bei lokaler Pharmaka-ApplikationStefan Plontke1, Norbert Siedow2, Raimund Wegener 2, Alec N. Salt 3, Hans-Peter Zenner 1

1Universitätsklinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und Hörforschungszentrum (THRC), D-Tübingen, 2Fraunhofer-Institut für Techno- und Wirtschaftsmathematik, D-Kaiserslautern, 3Department of Otolaryngology, Washington University School of Medicine, USA-St. LouisE-Mail: [email protected]

Im Rahmen der Zulassung von Tetanus-impfstoffen für Pferde und Schafe wirdbislang eine indirekte serologische Bestimmung der Wirksamkeit durchge-führt. Entsprechend der Europäischen

Arzneibuch-Monografie „Tetanusimpf-stoffe für Tiere“ soll die Wirksamkeitvon Tetanusimpfstoffen ad us. vet. durchden Nachweis der Induktion protektiverAntitoxintiter im Zieltier belegt werden.

Eine Testmethode ist jedoch nicht fest-geschrieben. Derzeit wird das Serumgeimpfter Pferde und Schafe in der Regelin vivo in Labortieren (Maus oder Meer-schweinchen) in einem so genannten


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Toxinneutralisationstest (TNT) geprüft.Dafür werden den Tieren nach Verab-reichung entsprechender Serumverdün-nungen letale Dosen an Tetanustoxininjiziert und die Wertigkeit des Impfstof-fes über die Überlebensraten ermittelt.

In eigenen Untersuchungen wurdenzehn Gruppen à 10 Pferde sowie achtGruppen à 10 Schafe mit verschiedenenTetanusimpfstoffen immunisiert und dieSeren untersucht. Hierdurch konnte derVerlauf der Tetanus-Antitoxintiter in Seren beider Tierarten über einen

längeren Zeitraum verfolgt werden. DieSeren wurden dabei in zwei verschiede-nen ELISA-Systemen getestet: einem Tierart-unabhängigen Doppelt-Antigen-ELISA und einem Tierart-spezifischenindirekten ELISA. In beiden Testsyste-men wurde gereinigtes Tetanustoxoid alsAntigen verwendet. Für die Bestimmungder Antikörpertiter im Doppelt-Antigen-ELISA wurde der Internationale WHO-Standard vom Pferd als Referenzserumeingesetzt. Im indirekten ELISA erfolgtedie Berechnung der Titer anhand mitge-

führter interner Referenzseren vom Pferdbzw. vom Schaf, die gegen den WHO-Standard kalibriert und zusätzlich in vivomittels TNT getestet wurden.

Der Doppelt-Antigen-ELISA erwiessich gerade im niedrigtitrigen Bereich alssehr spezifisch und daher geeignet, denAntitoxinstatus beim Pferd oder Schaf zu überprüfen. Er stellt damit eine er-folgsversprechende in vitro Alternativefür den Ersatz des TNT zum Wirksam-keitsnachweis von Tetanusimpfstoffenim Zieltier dar.

Unter Leitung der Europäischen Kom-mission beschäftigt sich seit März 2003eine Arbeitsgruppe mit Interessens-vertretern (OECD, Industrie, Verbrau-cherschutz, Tierschutz) damit, den Er-satz der Tierversuche im Bereich Kos-metik termingerecht nach den Vorgabender 7. Änderung der EU-Kosmetikricht-linie zu realisieren. Ende August 2003wurden dafür „ad hoc groups“ mit Experten eingerichtet, die für die elf für Kosmetika relevanten Bereiche derSicherheitsprüfung von Chemikalien Inventarlisten von viel versprechendenAlternativmethoden und deren Status inBezug auf Entwicklung, Validierungund behördliche Akzeptanz zusammen-stellen sollten. Darüber hinaus sollendie Expertengruppen einschätzen, wannmit dem möglichen vollständigen Ersatzder Tierversuche in den genannten Be-reichen gerechnet werden könnte.

Anfänglich wurden die Arbeiten der„ad hoc groups“ durch das Fehlen eines

klaren Arbeitsauftrags, Zeitmangel undgeringe Beteiligung vor allem seitensder Industrie verzögert. Im Mai 2004 konnte letztendlich ein umfangreicherBericht vorgelegt werden, der nunmehrder Kommission dazu dienen wird, eigene Zeitpläne für den Ersatz vonTierversuchen aufzustellen.

Der Bericht gibt einen umfassendenÜberblick über den wissenschaftlichenStand der Alternativmethodenforschungim Bereich der Sicherheitsprüfung von Chemikalien und verdeutlicht, inwelchen Bereichen welche Aktivitätenzum Ersatz von Tierversuchen erforder-lich sind.

Aus der Sicht des Deutschen Tier-schutzbundes müssen nunmehr umge-hend Anstrengungen unternommen wer-den, um die in dem Bericht formuliertenVorschläge aufzugreifen. Dazu solltensinnvolle Prüfstrategien mit der Fest-legung von „key tests“, die bevorzugtentwickelt und validiert werden müs-

sten, erarbeitet werden. Um das enormeArbeitspensum möglichst schnell zu bewältigen, sollte nicht nur die kosmeti-sche, sondern vor allem auch die chemische Industrie stärker in diePflicht genommen werden. Die EU-Kommission ist aufgefordert, ausrei-chende finanzielle Mittel für die Entwicklung und Validierung von Alter-nativmethoden und für ECVAM bereit-zustellen.

Der Bericht liefert wichtige Anregun-gen für weitere Schritte hinsichtlich desErsatzes von Tierversuchen. Er darf je-doch keinesfalls dazu benutzt werden,die Termine für das Inkrafttreten derTier- und Vermarktungsverbote der 7.Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie in Frage zu stellen: Die Termine für die Verbote wurden festgelegt und sind unabhängig von der Verfügbarkeitvon tierversuchsfreier Methoden umzu-setzen.

Vortrag/Lecture

[EU-Cosmetics: timetables for the replacement of animal experiments – commentsfrom the point of view of the German Animal Welfare Federation]EU-Kosmetik: Zeitpläne für den Ersatz von Tierversuchen – Anmerkungen aus der Sicht desDeutschen TierschutzbundesIrmela W. RuhdelDeutscher Tierschutzbund e.V./Akademie für Tierschutz, D-Neubiberg E-Mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04 173

Da Muscheln Algengifte enthalten kön-nen, die beim Menschen Magen-Darm-oder sogar bisweilen tödlich verlaufendeneurologische Erkrankungen verursa-

chen können, ist EU-weit vorgeschrie-ben, dass derartige Meeresfrüchte vor derVermarktung auf ihre Unbedenklichkeithin geprüft werden müssen. Derzeit ist

hierfür als Standardmethode der so ge-nannte Mouse Bioassay vorgeschrieben,mit dem Tod der Tiere als Endpunkt. Jeweils drei Mäusen wird dabei in einer

Im Oktober 2003 hat die EuropäischeKommission den ersten Entwurf für eineneue EU-Chemikalienverordnung vorge-legt. Während zu begrüßen ist, dass ange-strebt wird, durch die neuen Regelungenden Umwelt-, Verbraucher- und Arbeits-platzschutz zu verbessern, sind aus Sichtdes Tierschutzes umfangreiche Nach-besserungen im Verordnungsentwurf ge-nauso erforderlich wie angemessene Begleitmaßnahmen, um sicherzustellen,dass das von der Kommission formulier-te Ziel, Tierversuche in der neuen Che-mikalienpolitik zu vermeiden, erreichtwerden kann.

So sollte in der Verordnung verpflich-tend vorgeschrieben werden, dass im Zu-ge der Registrierung, Evaluierung undAutorisierung alter und neuer chemi-scher Substanzen alle verfügbaren toxi-kologischen und ökotoxikologischen Daten ohne Ausnahme offen gelegt und

von den Unternehmen gemeinsam ge-nutzt werden müssen. Die Prüfanforde-rungen in den Anhängen der Verordnungsollten so ausgestaltet werden, dass sichergestellt ist, dass nur solche Datenerhoben werden, die für die sichereHandhabung der betreffenden Substanzerforderlich sind. Zudem sollten alle bereits verfügbaren tierversuchsfreienVerfahren in diese Prüfanforderungenaufgenommen und wirkungsvolle Rege-lungen verankert werden, damit auchzukünftig neu entwickelte tierversuchs-freie Verfahren unverzüglich in die An-hänge aufgenommen werden und zumEinsatz kommen.

Um weiter zu erreichen, dass bis In-krafttreten des neuen Systems alle für dieSicherheitsprüfung relevanten Endpunk-te mit aussagekräftigen tierversuchsfrei-en Prüfstrategien ermittelt werden kön-nen, sollten sowohl auf nationaler als

auch auf europäischer Ebene die För-deraktivitäten zur Entwicklung und Va-lidierung tierversuchsfreier Verfahren intensiviert und gezielt im Hinblick aufdie Bereitstellung von Methoden zur Erfüllung der Prüfanforderungen derneuen Chemikalienverordnung ausge-richtet und koordiniert werden.

In Verfolgung dieser Ziele können sowohl die Abgeordneten des Europä-ischen Parlamentes als auch die Mitglie-der der zuständigen Ministerräte sowienationale und europäische Behörden mitihren jeweiligen Einflussmöglichkeiteneinen wesentlichen Beitrag leisten. An-hand konkreter Beispiele und Erfah-rungsberichte wird ausgeführt, welcheErwartungen der Deutsche Tierschutz-bund in diesem Zusammenhang an diejeweiligen Verantwortlichen stellt.

Vortrag/Lecture

[Efforts of politicians and authorities to include animal welfare related provisionsinto the new EU Chemicals Regulation – experiences and expectations from thepoint of view of the German Animal Welfare Federation]Aktivitäten von Politik und Behörden bei der tierschutz-gerechten Ausgestaltung der neuen EU-Chemikalien-verordnung – Erfahrungen und Erwartungen aus Sicht desDeutschen TierschutzbundesUrsula G. SauerDeutscher Tierschutzbund, D-NeubibergE-Mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

[Efforts in the EU to replace animal experimentation for the determination ofshellfish toxins from the point of view of the German Animal Welfare Federation]Aktivitäten in der EU zum Ersatz von Tierversuchen zur Bestimmung von Muscheltoxinen aus der Sicht desDeutschen TierschutzbundesUrsula SauerDeutscher Tierschutzbund, D-NeubibergE-Mail: [email protected]


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sehr schmerzhaften Prozedur Muschel-extrakt in die Bauchhöhle injiziert.Anschließend wird anhand der Zeitdauer,die bis zum letzten keuchenden Atemzugder Mäuse verstreicht, die Menge Mu-scheltoxine in dem Extrakt berechnet.Dieser äußerst belastende Tierversuch istbislang nie standardisiert oder validiertworden. Zudem gibt es wissenschaftlicheBelege dafür, dass er weder aussage-kräftig noch zuverlässig ist. Regelmäßigtreten sowohl falsch positive als auchfalsch negative Testergebnisse auf, zumalbestimmte Toxine in der Maus erst ober-halb für den Menschen gefährlicherSchwellenwerte erfasst werden können.

Daher gibt es in verschiedenen EU-Mitgliedsstaaten Bestrebungen, denMaustest zu ersetzen oder die Tierzahlen

und die Belastung für die Tiere zu re-duzieren. So wird der Versuch im Vereinigten Königreich mit zwei anstellevon drei Mäusen durchgeführt, die Tierewerden vor der Verabreichung des Muschelextraktes anästhesiert und ver-bleiben bis zu ihrem Tod in der Narkose.In Deutschland hingegen wird seit Jahrenohne Einschränkung des Verbraucher-schutzes gänzlich auf den Maustest ver-zichtet. Stattdessen werden die Toxinehier mit physikalisch-chemischen Ver-fahren nachgewiesen. Derartige Maß-nahmen sind nach den Regelungen derEuropäischen Versuchstierrichtlinie ge-setzlich vorgeschrieben. Dennoch wur-den Deutschland und das Vereinigte Königreich von der Europäischen Kom-mission angemahnt, dass ihre Prüfpro-

gramme nicht mit den Vorschriften zumMuscheltoxin-Nachweis in Überein-klang stehen.

Offensichtlich besteht hier ein Ge-setzeskonflikt zwischen zwei gültigenEU-Richtlinien. Obwohl aber dieses Problem seit Jahren bekannt ist, ist nachwie vor nicht ersichtlich, dass die Eu-ropäische Kommission alle Anstrengun-gen unternimmt, den Konflikt zu lösen.Im Vortrag wird dargelegt, wie Muschel-toxine tierversuchsfrei nachgewiesenwerden können, welche Probleme derzeitdie EU-weite Abschaffung des MouseBioassay behindern und welche Voraus-setzungen geschaffen werden müssen,um die bestehenden Engpässe über-winden zu können.

Neuentwickelte Medikamente bedürfenvor der klinischen Prüfung der sicher-heitspharmakologischen Testung gemäßder Richtlinie ICH-S7A. Sie sieht Tierver-suche oder in vitro Testsysteme vor, sofernsie relevante und statistisch abgesicherteAussagen zur Pharmakologie und Toxiko-logie neuer Wirkstoffe liefern. Um dieZahl von Versuchstieren gering zu halten,sollte hier ein Testverfahren entwickeltwerden, das im Hochdurchsatz-Screeningdie Einschätzung der pharmakologisch-toxikologischen Wirkungen neuartigerMedikamente und anderer Xenobiotikaerlaubt. Hierzu wurden primäre Ratten-leberzellen verwendet, die im 96-well-Format über maximal 9 Tage kultiviertwurden. In definierten Zeitabständen wur-den dem serumfreien Medium verschiede-ne Testsubstanzen wie alpha- oder beta-Naphthoflavon, Phenobarbital, Resveratrol

u.a. zugesetzt und der Einfluss auf die Me-tabolisierungskapazität von Ethoxy- bzw.Pentoxyresorufin durch Cytochrom P450-Isoenzyme der Subfamilien 1A bzw. 2Bfluorimetrisch bestimmt. Die Ergebnissewurden auf die Proteinkonzentration in deneinzelnen wells normiert. So konnte nach-gewiesen werden, dass die kurzzeitige In-kubation mit alpha- oder beta-Naphthofla-von die CYP1A1-Aktivität hemmt, Lang-zeitinkubationen jedoch die EnzymeCYP1A1 und CYP2B1 aktivieren. DieErgebnisse zeigen, dass mit diesem Test-system eine zeit- und dosisabhängige Wir-kung der getesteten Substanzen nachge-wiesen werden kann. Diese stehen imEinklang mit aus der Literatur bekanntenDaten. Mit dem Test konnte auch die kon-zentrationsabhängige Schädigung der Zel-len als Maß für die zytotoxische Wirkungder getesteten Substanzen gezeigt werden.

In weiterführenden Untersuchungenwurde der Test an eine PCR-Analytik(quantitative Real-time PCR) angepasst.So ist es möglich, die Wirkung einer Sub-stanz auf jedes beliebige Protein als po-tenzielles pharmakologisches Target zuuntersuchen.

Das hier vorgestellte Kultursystemprimärer Hepatozyten im 96-well-Formatermöglicht die schnelle und zuverlässigeTestung der zeit- und konzentrationsab-hängigen Wirkung neuartiger Stoffe. Esstellt somit eine kostengünstige in vitroMethode zur Abschätzung der pharmako-logischen und toxikologischen Potenzialeeines Wirkstoffes für die Anwendung inder pharmazeutischen, chemischen sowieKosmetikindustrie dar und bietet eineethisch vertretbare Alternative zu Tierver-suchen im Sinne des 3R-Konzeptes.

Poster

[Primary rat hepatocytes in 96-wells as a basic system for pharmacologicaltesting by high-throughput screening]Primäre Rattenhepatozyten im 96-well-Kulturformat als Basis für die pharmakologische Testung im Hochdurchsatz-ScreeningInes Schäffner, Julia Petters und Bruno ChristM.-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I, Bereich Molekulare Hepatologie, ZAMED, D-HalleE-Mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04 175

Um das komplexe Zusammenspiel vonPhase I- und Phase II-Enzymen, ins-besondere den NAT2-Polymorphismusdarzustellen, wurden zur Erweiterungder V79-Zellbatterie® die humanen polymorphen NAT2-Formen *4, *5B,*6A und *13 sowie humanes CYP1A2 ineinen Expressionsvektor kloniert undstabil in V79 Zellen integriert und ko-exprimiert. Die Integration intakter

DNA und Transkription dieser DNA inRNA wurden durch verschiedene PCR-Verfahren verifiziert. Die Expressionwurde durch in situ-Immunfluoreszenz inden Zellen nachgewiesen. Mit Marker-substraten wurden charakteristische Enzymwerte ermittelt. Ausgewählte Klone mit physiologisch relevanten Enzymaktivitäten wurden zur meta-bolischen und toxikologischen Unter-

suchung verschiedener aromatischerAmine eingesetzt. Die NAT2-Polymor-phismus abhängige N-Acetylierung des2-Aminofluorens zum N-Ac-Amino-fluoren wurde ermittelt. Die Prüfung deskooperativen Effektes von CYP1A2 und NAT2 auf die mutagene Wirkung des2-Aminofluorens ergab eine deutlicheReduzierung der Mutationsrate durchNAT2. Die physiologische Relevanz

DNA Profiling (synonym: DNA Finger-printing) dient in der Gerichtsmedizinder Identifizierung von menschlichenTatortspuren, aber darüber hinaus vonDNA-haltigem Material aller Art. Analy-siert werden in erster Linie Primaten-spezifische Short Tandem Repeats(STR). Die Technik ist, wie gerade Arbeiten aus jüngerer Zeit zeigen,grundsätzlich auch für die Authentizie-rung und die Überprüfung auf Kontami-nation von humanen Zelllinien geeignetund damit ein gutes Mittel zur Qualitäts-kontrolle.

Die forensische Standard-Methodik istgeeignet, mit 1-3 ng DNA z.B. 11 oder16 STRs zu analysieren. Die Verwen-

dung von kommerziell erhältlichen Kitshat, abgesehen von den Kosten, zahl-reiche Vorteile: Die Loci und Allele sindsequenziert, die Allelfrequenzen undMutationsraten sind bekannt und es wirddie international anerkannte Nomenkla-tur verwendet. Damit sind die Ergebnisseinternational vergleichbar und der Gedanke, STR Analysen routinemäßignicht nur zur internen Qualitätskontrolleeinzusetzen, sondern auch zur Errichtungeiner Referenz-Datenbank, ist nahe liegend.

Eine Methode zur Qualitätskontrollemuss jedoch erst einmal selbst ihre Validität unter Beweis stellen, und hierist noch weitere Forschung nötig. Die

Mutationsrate der in der Forensik analy-sierten Loci kann statistisch berück-sichtigt werden. Zusätzliche Problemefür die Zelllinien Überwachung sind aberaus der hohen genetischen Instabilitätvon Krebszellen zu erwarten. Vorgestelltwerden dazu die Daten einer kürzlich ab-geschlossenen Studie. Die Ergebnissezeigen, dass die Auswertung die Definiti-on von Algorithmen und erhebliche Erfahrung erfordert.

Danksagung: Die Förderung der Ko-Expression vonCYP1A2/NAT2 durch BfR/ZEBET seidankbar erwähnt.

Vortrag/Lecture

[DNA fingerprinting for the authentication and coding of human cell lines]DNA Fingerprinting zur Authentizierung und Kodierung von humanen ZelllinienRichard Scheithauer 1, Walther Parson1, Stefan Schmidt 2 und Reinhard Kofler 2,3

1Institut für Gerichtliche Medizin, Medizinische Universität, A-Innsbruck, 2Tiroler Krebsforschungsinstitut, MedizinischeUniversität, A-Innsbruck, 3Division für Molekulare Pathophysiologie, Medizinische Universität, A-InnsbruckE-Mail: [email protected]

Vortrag/Lecture

[New GenPharmTox technologies : - Coexpression of CYP1A2 and polymorphic NAT2 - High throughput screening for CYPs]Neue Technologien aus der GenPharmTox: - Ko-Expression von CYP1A2 und NAT2 (polymorph)- Hochdurchsatzverfahren für CYPSJürgen Scheuenpflug, Niels Krebsfänger und Johannes DöhmerGenPharmTox BioTech AG, D-Planegg/MartinsriedE-Mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04176

der Ergebnisse im Vergleich mit anderenExpressionssystemen wird diskutiert.

Basierend auf einer 96-Lochplatte mit integriertem Fluoreszenzfarbstoff alsO2-Sensor wurde ein Hochdurchsatz-Verfahren zur Messung des CYP-abhän-gigen Metabolismus von Fremdstoffen

entwickelt. Der gemeinsame Nenner aller CYP-abhängiger Reaktionen ist O2-Verbrauch, der zur Messung des Metabolismus genutzt wurde. Damit lassen sich aufwändige Analytik-Ver-fahren zum Nachweis CYP-spezifischerMarkerreaktionen ersetzen. Die Repro-

duzierbarkeit des Verfahrens wurde anhand 10 verschiedener CYP-spezifi-scher Substrate geprüft und bestätigt. Die Entwicklung des Verfahrens bis zumProof of Concept wird ausführlich dar-gestellt.

The Embryonic Stem Cell Test (EST) isa scientifically validated in vitro methodto assess the teratogenic/embryotoxic potential of chemicals and drugs. The assay benefits from the fact that underspecific culture conditions embryonicstem (ES) cells display the develop-mental process of early myocardial dif-ferentiation. To evaluate the embryotoxicpotential of a test compound, the inhibi-tion of differentiation is observed by microscopic analysis of contracting myocardial cells. This toxicological endpoint is compared to the cytotoxic effects of the same substance. Using abiostatistical prediction model (PM) theEST is able to categorise a test chemicalas strongly, weakly, or non-embryotoxic.

The EST is a well established and

standardised in vitro assay. However, thecell culture medium has to be supple-mented with fetal calf serum (FCS) toprovide a proper myocardial differentia-tion. FCS has a great lot to lot variabilitywith regard to its composition, e.g. quantity of proteins, hormones and cy-tokines. which has an important influ-ence on ES cell differentiation in vitro.Although selected FCS batches performvery well in the EST, serum-free cultureconditions would provide several advan-tages: (1) Totally defined culture condi-tions would simplify the establishment of the EST in other laboratories. (2) Constant amounts of ingredients, e.g. albumin, could afford a reproduciblebioavailability of substances and wouldminimise the variation of results. (3)

Highly standardised culture conditionsprovide the basis for applying thismethod in automated screening systems.

In our project several attempts havebeen made to replace the undefined“black box” FCS in the EST. Chemical-ly-defined substitutes have been tested in combination with different growth factors known to be important for car-diogenesis in vivo. First results on the successful induction of myocardial dif-ferentiation without the use of FCS willbe presented.

In conclusion, a well-defined cell culture medium is an important pre-requisite for applying the EST in high-throughput screening systems.

Poster

Reduction and replacement of fetal calf serum in theEmbryonic Stem Cell Test (EST)Katharina Schlechter, Roland Buesen, Birgitta Slawik, Horst Spielmann and Andrea SeilerNational Center for Documentation and Evaluation of Alternative Methods to Animal Experiments (ZEBET), Federal Institute for Risk Assessment (BfR), D-Berline-mail: [email protected]

Poster

Histochemical examination of the effects of drugs, detergents and other agents on leukocytes – induction of apoptosisHans SchmidtInstitut f. Physiologische Chemie, Medizinische Fakultät, Martin-Luther Universität D-Halle (Saale)e-mail: [email protected]

Systemic morphological changes inleukocytes after exposure to chemicallyrather different compounds (like e.g.,drugs and detergents) are studied anddescribed. These changes are recordedby the cytochemical detection of phe-

noloxidase (EC 1.14.18.1). They can beranged into the initial stages of apopto-sis. To it belong the formation of smallvesicles and their coalescence as well asthe development of so-called eye-likecells with variably sized “eyes”. Both

phenomena correlate with the fragmen-tation of the cell nucleus. It is in disputeat present whether the protuberances of eosinophiles in the small intestine ofrats correspond to apoptotic alterations.At least these protuberances which


ALTEX 21, 3/04 177

contain in addition to cytoplasm andeosinophil granules fragments of the nucleus remind of amitotic cell divi-sions. Thus, the phenoloxidase reaction

makes feasible the detection of in vitroand in vivo apoptotic processes. It reveals that the apoptosis of leukocytesserves mainly the defence. Simultane-

ously, the enzymatic reaction allows invitro to gain insight into the biologicaleffects of compounds when acting onleukocytes.

In 2002, the finding of Swedish re-searchers of considerable levels of acry-lamide in food triggered a worldwide effort of research in research laborato-ries, the food industry and National FoodAuthorities. The goal was to identify thesources and mechanism of formation ofthis chemical in food, to develop appro-priate analytical methods, to determinelevels in food, to evaluate the toxicity ofthe compound, to estimate the exposureof consumers and, finally, to assess apossible health risk to the consumer.These efforts are still ongoing and will beused early in 2005 by the JointFAO/WHO Expert Committee on FoodAdditives for a final risk assessment.

Acrylamide is formed in food from the reaction of the free amino acid

asparagine with reducing sugars uponheating to high temperatures, mostly incarbohydrate rich foods (French fries,potato crips, roasted coffee, cereals etc.).Analogous to the mechanism of acry-lamide formation, other vinylogous com-pounds can potentially be formed fromany of the other free amino acids presentin food.

An approach will be presented that allows the priorisation of potential pro-cessing contaminants with respect to toxicity, exposure and safety based onthe following model estimations:

Exposure will be estimated by (i) computational modelling of contami-nant formation, identification of potentialcontaminants, (ii) estimation of formation based on

precursor levels in raw materials and estimated conversion rates (iii) estimation of exposure based onconsumption data.

Toxicity will be assessed by (i) information on chronic toxicity andcarcinogenicity from publicly availabledatabases (ii) in the absence of Information, use ofQSAR programs to estimate toxicityand/or mutagenicity (iii) application of the “Threshold ofToxicological Concern” approach.

We demonstrate in this study that under certain conditions, in the absenceof information, a primary evaluation of a safety concern and priorisation of re-search needs is feasible without the useof animal experiments.

Vortrag/Lecture

Chemical food safety assessments: a targeted approach for process related contaminants without the use of toxicological studiesGabriele ScholzNestlé Research Center, Quality & Safety, CH-Lausannee-mail: [email protected]

Recent changes in legislation affectingsafety assessment, i.e. the EU White Paper and the 7th Amendment to the EC Cosmetic Directive stimulate the development of in vitro tests for risk

assessment. In 2004 the OECD testguideline 428 has been adopted to standardise experiments on cutaneousabsorption of cosmetic ingredients andindustrial chemicals. Since there is,

however, a clear shortage of human skinfor safety testing a current BMBF sup-ported validation study compares essen-tial in vitro methods for testing percuta-neous absorption to identify the model/s

Vortrag/Lecture

Validation study on percutaneous absorption via human skin modelsSylvia Schreiber 1, Ashraf Mahmoud1, Alexander Vuia1, Maria Rübbelke 2, Martin Schaller 2, Hans Christian Korting2, Elisabeth Schmidt 3, Manfred Liebsch3, Frank Netzlaff 4, Ulrich Schäfer 4,Claus-Michael Lehr 4, Frank Niedorf 5, Manfred Kietzmann5, Udo Bock 6 and Monika Schäfer-Korting1

1Institut für Pharmazie, Freie Universität, D-Berlin, 2Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Allergologie der Ludwig-Maximilians-Universität, D-München, 3Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) – ZEBET, D-Berlin, 4Saarland University,Dept. of Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, D-Saarbrücken, 5Institut für Pharmakologie, Toxikologie undPharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule, D-Hannover, 6Across Barriers GmbH, D-Saarbrückene-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04178

of best validity, reproducibility, and predictive value with respect to in vivoabsorption in man. Organotypic humanskin models (EpiDermTM, EpiSkin®,Skinethic®) are in the specific scope of this study.

The start-up phase (protocol develop-ment) of the study covered the settingand first refinement of test conditions for

the OECD test substances testosterone,caffeine and benzoic acid in human andanimal skin as well as in the skin models.Experiments under identical and moststrictly controlled test conditions (proto-col transfer) clearly demonstrated an improvement of reliability of the results.Moreover, there is a slight tendency to ahigher consistency of the data obtained

by the human skin models. This lead to the current prevalidation phase. An increased number of test substances covering a large range of logP andmolecular weight as well as additional finite dose experiments will generate additional data which should result in avalidated method for skin absorptiontesting.

The Olympus cell family – analySIS^B,analySIS^D, cell^M and cell^R – is afamily of imaging stations with user-friendly software environments for allfluorescence microscopy applications inthe cell and molecular biology field.analySIS^B is the basic platform whilecell^R is the most extensive system,meeting the most demanding require-ments for experiments in real time. Justlike a real-life family, the members ofthis product family resemble one another

in appearance. They all have the same“look & feel” and the packages are mutually upgradeable.

cell^R is the modular imaging work-station for a broad range of life scienceexperiments for use with the Olympusmicroscopes of the IX and BX series.The unique all-in-one MT20 illuminationsystem was specially designed for fastwavelength switch and attenuation,meeting requirements for experimentsinvolving real-time acquisition via

highly sensitive digital cameras. Allhardware (including peripheral devices)is synchronised by an extremely precisereal-time control board. This ensures thegreatest accuracy for experiment timing.The cell^R software is a powerful andcomprehensive platform that features anintuitive and user-friendly graphicaldrag&drop interface. This makes settingup even complex experiments efficientand convenient.

Vortrag/Lecture

Olympus cell^R – imaging station for life cell microscopy Christian SeelOlympus BioSystems, D-Planegge-mail: [email protected]

The New Chemicals policy of the Euro-pean Commission (REACH = Registra-tion, Evaluation and Authorisation ofChemicals) suggests to replace animaltests for the assessment of acute humanhealth hazards by using informationbased on (Q)SARs and in vitro test results within substance-tailored testingand assessment schemes in order to re-duce the costs of testing and the numberof test animals employed.

At the BfR, the Competent Authority(CA) for the regulation of the health effects of chemicals in Germany, the authors have compiled a regulatory

database using data on chemicals with apurity >95%, which were submittedwithin the current notification proce-dure for New Chemicals of the Euro-pean Union. We have used this databaseto develop (Q)SAR rules for the predic-tion of acute local lesions and for theprediction of skin sensitisation to beused within the new REACH system ofthe EU.

Some of the(Q)SARs for the predic-tion of local irritation/corrosion and the SARs for prediction of sensitisationpotential were published together withdetailed description of the methods used

for their development. These (Q)SARsand an expert system supporting theiruse will be submitted for official valida-tion and application within regulatoryhazard assessment strategies to the European Centre for the Validation ofAlternative Methods (ECVAM).

Main features of the BfR (Q)SARprediction rules are:● two sets of structural alerts for the prediction of skin sensitisation hazardclassification as defined by the Euro-pean risk phrase R43, comprising 15 rules for chemical substructureswhich are sensitising by direct action

Vortrag/Lecture

Regulatory use of (Q)SARs in toxicological hazardassessmentHorst Spielmann, Ingrid Gerner, Thomas Hoefer, Manfred Liebsch and Matthias HerzlerZEBET (National Center for Documentation and Evaluation of Alternative Methods to Animal Experiments) at the BfR (Federal Institute for Risk Assessment), D-Berline-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04 179

with cells or proteins, and 3 rules for substructures acting indirectly, i.e.requiring biochemical transformation.● a decision support system (DSS) forthe prediction of skin and/or eye lesion

potential built from information extract-ed from our database. This DSS com-bines SARs defining reactive chemicalsubstructures relevant for local lesionsto be classified, and QSARs for the

prediction of the absence of such a po-tential.

The impact of a potential use of(Q)SARs on current EU testing strate-gies will be discussed.

In the 4th edition of the European Phar-macopoeia, animal experiments are de-scribed, which are required for the quali-ty control of pharmaceuticals. This refersto investigations regarding both biologi-cal activity and safety aspects of themedication. The latter include investiga-tions to find contaminations with his-tamines and pyrogenic substances andtests for abnormal toxicity. Even thoughthe safety of medical drugs is of greatimportance, it should be examinedwhether these tests are still indispensable(in terms of § 7 of the German Animal

Protection Law of 2002). The determina-tion of histamine content may also bepossible by chemical-analytical methods,which could represent an alternative tothe animal experiment. The testing of ab-normal toxicity should be scientificallyquestioned due to its lack of specificity.Although the in vitro test detecting bac-terial endotoxins is mentioned in manymonographs, the in vivo test on rabbits to test for pyrogenicity is still mentionedin some other monographs. The in vivotest should be rechallenged as to whetherit can be replaced. In light of the global

trade in medications, which must alsofulfill national quality standards, a reduc-tion in animal experiments can only be reached by fruitful cooperation be-tween pharmaceutical companies, healthauthorities and the commissions of thepharmacopoeias, leading to the forma-tion of a consensus. The InternationalConference on Harmonization couldprove an auspicious panel to take up thissubject and to contribute to an interna-tionally accepted and scientifically basedreduction of animal experiments.

Poster

Animal experiments in the context of quality control of medical drugs Review of the European Pharmacopoeia, 4th edition, 2002

Gisbert Sponer and Franz P. GruberSET, D-Mainze-mail: [email protected]

The toxic effect has been tested onmonolayer culture of cells NIH 3T3(ECACC ) (fibroblasts of mouse embryo)for the following solutions: 1. Solution for ocular lens MULTISON(M), made by Henson Ltd. 2. Solution in which the lenses are kept(K-), made by Ocular Sciences Inc.3. Phenol (K+) 50 mg/ml was tried tothe positive control.

The testing of the toxic effect wasmade according to the Guidance Docu-ment on Using in vitro Data to Estimatein vivo Starting Doses for Acute ToxicityBased on Recommendations from an International Workshop organised by the

Interagency Coordinating Committee onthe Validation of Alternative Methods(ICCVAM) and the National ToxicologyProgram (NTP) Interagency Centre forthe Evaluation of Alternative Toxicologi-cal Methods (NICEATM) National Toxi-cology Program.

The results are following: Solutions K- is not toxic, and solution M has slighttoxicity, inhibitions coefficient IC50 is 37 ml; if solution M is diluted by 20times, it loses its toxic effect. IC50 forphenols (K+) is 0.6 mg/ml. Solutions K- do not make any effect on cells andmorphology. Solution M (50.0 and 15.8ml) causes the death of cells, but does not

change their morphology. Phenol (K+)increases the death of cells, and changestheir morphology.

Irritation effect of solutions for lenses“MULTISON” has been tested on threealbino rabbits (body weight of 2-3 kg)according to EN ISO 10993-10 “Biolog-ical evaluation of medical devices. Part10: Tests for irritation and delayed-typehypersensitivity B.3 Ocular irritationtest”. The conditions for keeping the animals during the test were according toISO 10993-2 and general animal require-ments. After the dropping of solutionsboth eyes of the animals were tested.They were observed after an hour, then

Poster

Toxicity evaluation of ocular contact lens solutionsDagmara Sprudza 1, Leontine Antonovica 1, Marite Bake 1 and Irina Sestakova2

1Rigas Stradins University, Institute of Occupational and Environmental Health Laboratory of Hygiene and OccupationalDiseases, LR-Riga, 2Latvia Institute of Organic Synthesis, LR-Rigae-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04180

after 2, 48, 72 hrs and during the periodof 21 days. Grade of any reactions wasobserved in accordance with special sys-tem for grading (4 scale) ocular lesions.The following was observed: cornea,area of cornea involved, iris, conjuncti-vae, chemosis discharge. Ophthalmo-scope was used for testing the eyes.

Results: After the testing we havecome to conclusion that solution MUL-TISAN is slightly toxic which corre-sponds to its disinfectant feature. The solution’s leftovers on the lenses cannotmake any harm to the eye, as the amountof the solution is naturally diluted intothe eyes’ mucous membrane. It was

confirmed with the rabbit experiment – during the experiment there was no stateof lacrimation, photophobia, swelling oflids, sap and pain in the eyes, opacity of cornea, as well as other inflammatorysigns of the eyes or their conjunctives.

SEFREC is a interactive database to register so much information as possibleabout serum free cell lines. Periodic updates will be done in order to refreshthe database. From different sources data will be collected, controlled and approved for using. In the SEFRECdatabase all information like cell line,medium, suppliers are linked.

The poster shows an example of theprocess of an input and output of infor-mation.

The collected data are cell line, cellbank, applications, media, medium sup-pliers, kind of medium and scientific re-ports.

The data will be collected in a new

database management system: SEFREC(=SErum FRee Cell).

SEFREC was created with the soft-ware Firebird 1.5.

Firebird is a relational database offer-ing many ANSI SQL-92 features thatruns on Linux, Windows, and a variety of Unix platforms. Firebird is a commer-cially independent project of C and C++ programmers, technical advisorsand supporters developing and enhanc-ing a multi-platform relational databasemanagement system based on the sourcecode released by Inprise Corp.

To get the newest information contactwill be taken with medium and cell linesuppliers. Data from existing database

will be integrated if they are updated, for example the database of FOA, InVit-rogen and JRH Biosciences.

During the project the database is located on a local server. At the end ofthe project the whole database will betransferred on a new server. Registrateduser could use SEFREC as free. As a interactive database, SEFREC will becontinuously refreshed thanks to the co-operation with ALTEX.

Acknowledgement: This project issponsored by Foundation Research 3R,Project number 87-03, duration: 1,5years. End of the project 2005.

Poster

SEFREC: First steps of an interactive database about serum free cell linesClaudio StrebelCePower GmbH, CH-Wädenswile-mail: [email protected]

It’s a matter of common knowledge thatpreclinical drug development is abso-lute essential. Useful test systems weredeveloped for high throughput or forhigh content screening. We developed acell based system BIONAS®2500 forhigh content screening that allows to

predict pharmacological and cytotoxicproperties of potential new drugs.

Oxygen consumption, acidificationand adhesion showed to be important parameters in cell metabolism. Changesof these parameters in dependence of testcompounds are evident for metabolic

cell behaviour or for cytotoxic effects.The combination of biological cells andsilicon chips with Interdigitated Elec-trode Structures, Ion Sensitive Field Effect Transistors and Clark-type oxygensensors create a new living analysingsystem. The assay can be performed

Poster

New cell based analysing system for reduction of animal testsElke Thedinga 1, Axel Kob 1, Heiko Holst 1, Andreas Keuer 1, Heiko Palzer 1, Sabine Drechsler 1,Ricarda Niendorf 1, Werner Baumann 2, Ingo Freund 3, Mirko Lehmann 3 and Ralph Ehret 1

1Bionas GmbH, D-Rostock, 2Biophysics Institute, Bioscience Department, University Rostock, D-Rostock, 3Micronas GmbH, D-Freiburge-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04 181

from a few hours to several days. Its ad-vantage is that physiological parameterscan be detected continuously and onlineduring the entire assay time. It is alsopossible to change the concentration ofthe test substances during the test phase,e.g. regeneration/recovery effects can

be monitored after displacement of the substance. Therefore, with ourBIONAS®2500 analysing system we cangenerate more information per cell assaythan accepted endpoint assays.

A validation for drug screening hasbeen started with some reference chemi-

cals of the MEIC list. Of course, IC50 val-ues can be determined with our analysingsystem. But the BIONAS®2500 systemallows a more detailed overview of phys-iological cell culture experiments.

The technology of gene expression anal-ysis by microarrays is well suited tocharacterise immune function and im-munopathological processes with specialimpact in allergy, both for the identifica-tion of sensitising agents and the devel-opment of new therapeutics. The ARCSeibersdorf research developed differentslides for application in biochip technol-ogy with unique, propriety hydrophobicand hydrophilic coatings ensuring a highdensity of reactive groups binding an op-timum amount of oligonucleotides orDNA fragments. Our lab concentrated onthe development of a pilot array for im-

munotoxicity testing consisting ofoligonucleotide probes for 20 differentcytokine and chemokine genes. For everygene, three probes at different locationsin the coding regions, but as close as possible to the 3´ end were designed as50mer oligonucleotides. The probes werespotted in four replicates per array. Several target labelling methods, differ-ent labelling dyes and various slide surfaces were tested. With the 3DNAdendrimere labelling system from Geni-sphere the gene expression of targetgenes could be determined in as little as 2 µg of total RNA. The array was

validated by real-time PCR of the samecytokine genes in dendritic cells treatedwith different low molecular weightchemicals as a model for chemical sensi-tisation. The transcriptional activation ofIL-1α, IL-1ß, MIP-1 α, and MIP-2α bymodel allergens was detected.

An improved chip is now under devel-opment containing oligonucleotides ofabout 60 immune relevant genes and isbeing validated in the screening for the immunotoxic potential of chemicals.Results obtained with THP-1 cells andmonocyte-derived dendritic cells will bereported.

Vortrag/Lecture

Gene expression monitoring in immunotoxicology – DNAarrays and real time PCRHelga Tuschl, Christa Nöhammer and Waltraud K. NovakARC Seibersdorf Research GmbH, A-Seibersdorf e-mail: [email protected]

Several studies have proved Ekwall’sconcept of “basal cytotoxicity” showingthat human toxicity can be predicted bya test battery of in vitro methods. Oneprincipal demand for such in vitroscreening tests is their ease of perfor-mance and a high throughput. These objectives are met by flow cytometry asthis technique offers the possibility ofmultiparameter assays of a high numberof cells within short time. A protocol on

the determination of cell cycle andapoptosis by propidium iodide staining,apoptosis by annexin V binding, mito-chondrial membrane potential with the fluorescent probe JC-1 and DNAstrand breaks in apoptotic cells with theTUNEL (= terminal deoxynucleotidyl-transferase dUTP nick end labelling) as-say was applied. HepG2, YAC-1 andAHH-1 cells were exposed to six compounds (acetaminophen, isoniazid,

digoxin, malathion, paraquat and 2,4-dichlorophenoxy acetic acid) for 24 hand 48 h. In addition, the effect of long-term application of acetaminophen,paraquat and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on cell numbers and induc-tion of apoptosis/necrosis was evaluatedin HepG2 cells.

IC50 values obtained in the presentstudy were similar to those reported inthe MEIC study and the Registry of

Poster

Flow-cytometric methods used for in vitrocytotoxicity screeningHelga Tuschl and Christina E. SchwabARC Seibersdorf Research GmbH, A-Seibersdorfe-mail: [email protected]


ALTEX 21, 3/04182

Cytotoxicity. The determination of celldeath by apoptosis and necrosis during a 28 days repeated dosage testing re-vealed a high rate of apoptosis inductionby the test chemicals.

The results showed that flow cyto-metric methods are well suited to screenfor the cytotoxicity of chemicals, bothin adherent cells and in cells grown in suspension. Furthermore, flow-cyto-

metric assays are valuable means forstudying mechanisms of toxicity.

Skin irritation is the most common, en-vironmentally based, adverse reactionin humans. Symptoms are signs of acomplex chain of biochemical andmolecular responses following contactto a multitude of various substances.Even though considerable attention hasbeen invested in attempts to understandthe underlying mechanisms of skin irri-tation, to date, the biological responsesare still poorly understood. The aim ofthis study was to evaluate cellular mech-anisms of skin irritation in vitro usingskin equivalents by investigating theroles of cytokines in the onset and regu-lation of skin irritation. As IL-1α is im-

portant for the onset of cutaneous in-flammation, we treated in vitro skinmodels systemically with recombinanthuman IL-1α and examined the super-natants for released, secondary cy-tokines by ELISA. Thereby, we detecteda specific and dose-dependent release ofIL-8. Following exposure of epidermismodels to surfactants, the secretion pro-files and the intracellular abundance ofcytokines were monitored at varioustime-points from 1 to 96 hours. In paral-lel, we analysed the differential gene expression by two semi-quantitativeMultiplex RT-PCR-systems. In summa-ry, 18 hours post-stimulus we deter-

mined an IL-1α threshold dependent release of the secondary cytokine IL-8.Furthermore, we suggest a molecular recovery phase in vitro: after a maximalrelease of IL-8 at 18 to 24 hours, theepidermis models significantly dimin-ished the release of IL-8, although theconcentration of IL-1α was effectual toinduce IL-8 release. Further anti inflam-matory responses seem to be involved inthe regulation of secondary inflammato-ry cytokines.

This studies were supported by anaward of COLIPA.

Vortrag/Lecture

Skin irritation: mechanistic studies using reconstructedhuman epidermisThomas Welss and Klausrudolf SchröderVTB-Skin/Hair Physiology, Henkel KGaA, D-Düsseldorfe-mail: [email protected]

An objective of our institution is to establish a virtual laboratory to allow fora reliable in silico estimation of harmfuleffects triggered by drugs, chemicals and their metabolites. In the recent past,we have developed the underlying technology (multi-dimensional QSAR:Quasar and Raptor) and compiled a pilotsystem including the 3D models of three

receptors known to mediate endocrine-disrupting effects (the aryl hydrocarbonreceptor, the estrogen receptor and theandrogen receptor, respectively) and validated them against 345 compounds(drugs, chemicals, toxins). Within thisset-up we could demonstrate that ourconcepts are able to both recognise toxiccompounds substantially different from

those used in the training set as well as to classify harmless compounds clearlyas being non-toxic. This suggests that ourapproach can be used for the predictionof adverse effects of drug molecules andchemicals.

www.biograf.ch

Vortrag/Lecture

In silico prediction of receptor-mediated environmentaltoxic phenomena – application to endocrine disruptionMarkus A. Lill, Max Dobler and Angelo VedaniBiographics Laboratory 3R, CH-4056 Basel

linz 2004: abstracts der vorträge und poster · resulted in 100% and 64% lethality for 15 and 3...

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