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Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central. Lahouari AMAR. LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur Jacques MALLET. Le transfert de gène dans le SNC Les vecteurs lentiviraux - caractéristiques - PowerPoint PPT Presentation

TRANSCRIPT

  • Dveloppement de vecteurs lentiviraux rgulables pour le transfert de gne dans le Systme Nerveux CentralLGN - UMR 7091sous la direction du Docteur Jacques MALLETLahouari AMAR

  • Le transfert de gne dans le SNCLes vecteurs lentiviraux- caractristiques- avantages et mthode de production- applicationsRsultatsDveloppement dun seul vecteur lentiviral pour:1) lexpression rgule dun facteur protique2) lexpression rgule de shARNConclusion gnrale et perspectives

  • Transfert de gne dans le SNCGne thrapeutique: protine ou squence nuclotidique (siARN)In vivoEx vivoCellules transduites

  • Spcificits du systme nerveux central relatives au transfert de gnePrsence de la barrire hmatoencphaliqueLimite le passage de molcules thrapeutiquesNcessit du transfert de gne

    La majorit des cellules du SN sont quiescentesPossibilit dutilisation de vecteurs intgratifs ou pisomauxVecteurs non viraux peu efficaces long termeprfrentiellement viral

    Diversit cellulaireNcessit dexpression restreinte ou largie du facteur thrapeutiquePossibilit de ciblage dune structure ou noyau particulier dans le SNTransport rtrograde ou antrograde dans les neurones avec un vecteur dont le tropisme est modulable.Vecteurs lentiviraux particulirement adapts

  • Avantages des vecteurs lentiviraux

    Transduction des cellules quiescentes et en divisionExpression stable et long terme du transgne dans le SNC Faible toxicit Facilit de production haut titre dnue de RCR Pseudotypage ais

  • Vecteurs lentiviraux : mthode de productionParticules virales pseudotypes avec la protine G du virus de la stomatite vsiculaire (VSV-G)

  • Applications des vecteurs lentivirauxThrapie gniqueProduction danimaux transgniques (modles de maladies)Etude de fonction de gnes (surexpression ou inhibition par siARN)

  • Ncessit dun systme rgulableEtudes cliniquesModuler lexpression du facteur thrapeutiqueArrt du traitement en cas de complication graveEtudes fondamentalesContrle temporel du transgne Contrle du niveau dexpression

  • Le systme de rgulation inductible par la Tetracycline (Tet-on)

  • 1. Dveloppement dun seul vecteur lentiviral pour lexpression rgule dune protine thrapeutique

  • Ncessit dun vecteur uniqueRduction de la quantit de vecteur administre:Rduction du risque de mutagense insertionnelleRduction du risque dimmunognicit li au vecteurPermettre lexpression du transgne et du transactivateur dans la mme cellule

  • Un vecteur lentiviral unique pour lexpression rgule dun transgne Lucifrase - Tyrosine hydroxylase

  • Expression rgule de la lucifrase in vitro Transduction dune culture primaire dastrocytes+ Dox- Dox

  • Rversibilit in vitroDose optimale in vitro Effet de la doxycycline sur lactivit lucifraseCintique dinduction in vitro

  • Injection du vecteur lentiviral exprimant de faon rgule la lucifrase dans le striatum de rat+ Dox- Dox

  • Un vecteur lentiviral exprimant de faon rgule la tyrosine hydroxylase+ Dox- DoxEvaluation in vitro

  • Un vecteur lentiviral exprimant de faon rgule la tyrosine hydroxylaseEvaluation in vivo+ Dox- DoxContrle non inject

  • RsumConstruction dun seul vecteur lentiviral portant un systme de rgulation Tet-onValidation in vitro et in vivo Niveau dinduction fort Fuite non dtectable en absence dinducteurDose dinducteur leve in vivo

  • Applications, limites et voies damliorationApplication de ce vecteur Tet-on Utilisation in vitro Utilisation chez lanimalExemple : stratgie de neuroprotectionLimites dans une stratgie de remplacement?Utilisation en clinique exclue

    Nombre faible de cellules exprimant le transgne in vivo aprs inductionQuantit de vecteur utilise sous optimaleDfaut de retrotranscription dun gnome vecteur longCo-expression du transactivateur et du transgne

    Un vecteur versus deux vecteurs?

  • 2. Dveloppement dun seul vecteur lentiviral permettant lexpression rgule de shARN

  • LARN interfrence

  • Expression des siARN

  • Un promoteur dARN Polymrase IIILe promoteur U6 Lexpression des shARN ncessite lutilisation dun promoteur dARN polymrase III

    Dbute la transcription un nuclotide dfini (G) Arrt de la transcription par 5 thymidinesSite de dmarrage de la transcription ESDESP TATAGTTTTTcoreshARN

  • Sans inducteur : inhibition de la synthse des siARNStratgie ngative : encombrement strique inductible dun promoteur polymrase IIIProtineSNAPcTBP

  • Avec Doxycycline : synthse des siARNdoxycyclineSans Doxycycline : inhibition de la synthse des siARNEncombrement strique inductible du promoteur U6 par le systme ttracyclinerpresseur TetESDESPshARNTATATet0SNAPcTBP

  • Un promoteur U6 rgulable :Stratgie ngative

  • Inhibition de lexpression de la GFP dans des cellules HEK 293T-GFP

  • Stratgie positive : adaptation du systme Tet-on un promoteur dARN polymrase III Utilisation dun transactivateur de lARN polymerase III

    Utilisation dun promoteur polymrase III minimal inductible par la ttracycline

  • Dveloppement dun transactivateur de promoteur polymrase III inductible par la doxycyclineUn nouveau transactivateur rtTA-Oct2rtTADomaine de liaison lADN du rtTA2-M2

  • Un nouveau promoteurESPBote TATADveloppement dun promoteur U6 minimal inductible par la doxycyclineDSE

  • Un promoteur dARN Polymrase III inductible par la doxycycline+1SNAPcTBPDox

  • Un vecteur lentiviral pour lexpression rgule de shARN dirig contre la GFP- dox+ doxPas dexpression de shGFPSynthse de la GFPExpression de shGFPInhibition de la GFP

  • Une expression de shGFP rguleNorthern BlotTransduction de cellules HEK293T-GFP avec diffrentes quantits de vecteur lentiviral exprimant de faon rgule un shGFP

  • Expression de shGFP en fonction de la concentration de doxycycline

  • Cintique dexpression du shARN- Dox+ Dox+ Dox- Dox

  • Application du systme pour la rgulation dun gne endogne : p53 HEK293TA549MCF-7

  • RsumConstruction dun systme de rgulation qui permet une expression contrle par la doxycycline de shARNValidation du contrle dun gne endogneForte inductibilitSystme rversibleForte concentration de doxycycline

  • Limites et perspectives Dose de doxycycline

    Validation in vivoExpression de shARN par promoteur pol III versus promoteur pol II

  • Conclusion gnraleConstruction dun seul vecteur lentiviral pour lexpression rgule par le systme Tet-on dune protine thrapeutique.Dveloppement dun systme de rgulation de lexpression de shARN inductible par la ttracycline et sa vectorisation. Problme de limmunognicit du transactivateur pour utilisation clinique

  • Perspectives pour une utilisation cliniqueSe tourner vers un systme de rgulation dorigine humaine ou humanis pour la cliniqueRapamycineZFP synthtiqueRgulation PhysiologiqueLa rgulation en cas de complicationAlternatives :excision du vecteur ou suicide des cellules transduites