lerat h parthogénèse 2014
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PATHOGENÈSE DES LÉSIONS
HÉPATIQUES DU VHC :
Mécanismes moléculaires
Dr. Hervé LERAT, PhD.
INSERM U955 Département de Virologie Moléculaire et Immunologie
Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)
Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.
Viral
Proteins
Host & Environmental factors
Steatosis Diabetes
Liver Tumor
Chronic viral infection
Cirrhosis
Fibrosis
Pathogenèse associée au VHC
Infection VHC
Réponse immunitaire de l’hôte Protéines virales
Hépatocarcinomes viro-induits :
rôle direct et/ou indirect des protéines virales?
Lésions
hépatiques
Cirrhose CANCER
?
Nécessité de développement de
modèles animaux
Contexte d’un organe entier
dans un animal vivant.
Pathologies viro-induites:
contribution du virus?
Modèles animaux pour l’étude des
pathologies induites par le VHC
Primates non-humains
Chimpanzé
Ouistiti
Modèles d’infection
Problème de disponibilité et de coût.
Modèle in vivo de souris transgéniques pour le VHC (FL-N/35)
Lerat et al., Gastroenterology 2002
ARN VHC +
FOIE
micro-injections
C57Bl6J x C3H/HeJ
X C57BL6J ou C3H
ADN HCV +
FL-N E1 E2 core
NS
4a
NS3 NS4b NS5a NS5b NS2 p7
Promoteur Albumine SV40 PolyA
Génotype 1b
FL-N/35
Lerat et al., Gastroenterology 2002
ARN VHC +
FOIE
micro-injections
C57Bl6J x C3H/HeJ
X C57BL6J ou C3H
ADN HCV +
FL-N E1 E2 core
NS
4a
NS3 NS4b NS5a NS5b NS2 p7
Promoteur Albumine SV40 PolyA
Génotype 1b
Stéatose
CHC
fibrogenèse
+CCl4
Modèle in vivo de souris transgéniques pour le VHC (FL-N/35)
CHC induit par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?
Hepatocellular Carcinomas
A
Lerat et al., Gastroenterology 2002.
1 cm
1 cm FL-N/35-170UNC
FL-N/35-171UNC
1 cm FL-N/35-102CERFE
APOPTOSE
caspase 3 caspase 9
cytochrome C
caspase 8
Fas
FasL
Bid
Membrane cellulaire
mitochondrie
VHC
(NS2)
CIDE-B
fragmentation ADN
VHC (NS5A)
calpaïne
Etape vers le
cancer
Inhibition de la voie apoptotique FAS dans le foie des souris VHC
GADD45g GADD45b GADD45a GADD153 GADD34
Senseurs de stress
Q
M
G1 G2
S
G0
CyclinB1
Cdc2
Arrêt du cycle
cellulaire (G2/M)
GADD45β Lésions de
l’ADN
Lésions de l’ADN – La famille GADD
P
P
P
Histone H3
Histone H1
Lamine
Les protéines du VHC induisent la méthylation du promoteur de GADD45β:
inhibition de sa transcription : évasion du point de contrôle.
VHC
Effects of c-Myc over-expression
c-Myc
M
G1 G2
S
G0
Normal Cancer
Genomic instability DNA damage
SSB DSB
ROS production (reactive oxygen species)
Abnormal
G1-S progression
VHC c-Myc
c-Myc c-Myc
Signalling events activating Akt – Downstream effects
Huh7 Huh7
+ SGR
Rela
tive A
kt activity
(%)
0
50
100
150
200
250
300 p = 0.01
Human
hepatoma cells
Hepatic lysates Primary cells
Rela
tive A
kt acitvity (
%)
0
wt
FL-N/35
p=0.02
p=0.02
50
100
150
200
250
300
Mice
0
100
200
300
400
EtOH HBV + HCV +
Non-tumoral tissueP
-AK
T/tota
l A
KT
(E
tOH
= 1
00%
)
p = 0,006
p = 0.003
Human liver
AKT is activated in the context of HCV infection and HCV protein expression.
Higgs et al. Oncogene, 2013
DNA damage
Bid
Diminished
apoptosis Genomic instability
HCV infection
NS5A
Viral protein
expression
Metabolic syndrome
(IR,steatosis)
Non structural proteins
Pi3K/P-AKT
GADD45b promoter
Abnormal
cell-cycle checkpoints
Defective
DNA repair
CH3 CH3
Gadd45b
Mitochondrial dysfunction
c-Myc
promoter
b-catenin b-catenin
c-Myc
c-Myc c-Myc c-Myc
Oxidative
Stress
Stem cell
recruitment
Cell cycle
Blockade
Gastro 2002, 2004, 2006, 2008
JBC 2003
JBC 2009
Hepato 2009
Cancer Res 2010
J Hepatol 2012
Oncogene 2013
Evènements pro-carcinogènes
Stéatose induite par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?
Microvesicular steatosis
Non TG HCV TG
HCV TG HCV TG
Lerat et al., Gastroenterology 2002.
Stéatose micro-vésiculaire
coloration Oil Red O
analyse in silico
HCV TG
NON TGM
F
M
0
5
10
15
20
25
12.5 ± 0.4
13 ± 0.8 14.4 ± 0.8
14.1 ± 0.3
n=12
n=12 n=10
n=7
p<0.001
% d
e l’a
ire
to
tal
PERK ATF6
IRE-1
Stress RE RE
Epissage ARNm XBP1 P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
Résumé
SREBP1c Domaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lip
ogenèse
ACC
FAS
SCD1
VLDL MTP Exportation TG
ApoB
Accumulation TG intracellulaires STEATOSE
HEPATIQUE
=
=
Potential mechanisms of HCV-induced steatosis
Lerat et al., Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 5(3):341-52, (2011)
Fibrose induite par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?
Fibrosis is enhanced in CCl4-treated FL-N/35 mice
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
FL-N/35 WT
+ CCl4 - CCl4
WT
p<0.005*
Are
a o
f fi
bers
(%
)
n 5 5 13 17
FL-N/35
*Mann-Whitney test Scale bars : 100µm.
WT FL-N/35
- CCl4
+ CCl4
HPC
Altération de
la prolifération
hépatocytaire Fibrogenèse
périportale
Réaction
Ductulaire
Lésion hépatique chronique
Chouteau et al. J Hepatol. (2012)
Fibrogenèse
The hepatocyte cell cycle is deregulated in HCV mice during liver repair.
HCV, liver fibrosis and regeneration:
0
50
100
150
200
250
0h 24h 40h 48h 60h
Brd
U +
hep
ato
cyte
s /
µm
2
wt
FL-N35
- CCl4 + CCl4
p<0.0001
p<0.0001
n= 4/4 4/4 8/8 4/4 4/4
wt FL-N/35
40h
48h
60h
24h
0h
+ C
Cl 4
CCl4 injection (IP, 795mg/kg)
24h 40h 48h 60h 72h 120h
Quiescent liver / Liver damage / Hepatocyte proliferation / Liver repair
0h
Sacrifice, liver sections, BrdU staining
FL-N/35 WT
Higgs et al. Cancer Research, 2010
Chouteau et al. J Hepatol 2012
Higgs et al. Oncogene, 2013
HCV infection
HCV protein
expression
DNA
damage
Hepatocyte
cell cycle
perturbation ?
HCV, liver fibrosis and regeneration:
The modulation of the oxidative stress-DNA damage-cell cycle axis by HCV protein expression results in a
delayed G1/S phase.
cdc25a Ub
E2F
Rb
Rb
P
E2F
S phase genes
(Cyclin A)
Cdk2
Cyclin E
ATM
Chk 2 p53
p53 p21
P
Degradation
cdc25a
Delayed
Ub Ub
Chk 2 P
Chk 1 P
ATR
HCV, liver fibrosis and regeneration:
ROS HCV
Chk 1
Modèle reproduisant les principales pathologies induites par le VHC
Niveau d’expression similaire à l’infection chronique chez l’homme
Absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation ni de cirrhose)
La cirrhose n’est pas un pré requis au développement de CHC : en accord avec données cliniques (méta-analyse, Maisonneuve 2009)
Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines virales en absence de cirrhose.
Inhibition de l’apoptose (voie FAS)
Inhibition de l’expression du suppresseur de tumeur GADD45β
Stimulation de l’expression de l’oncogène c-myc
Activation de la kinase AKT
Inhibition de la sécretion des VLDL (MTP)
Stimulation de la lipogenèse
Fibrogenèse associée à une réaction ductulaire due à une inhibition de la prolifération hépatocytaire (ROS, lésion de l’ADN)
Conclusions
• Main objective: To induce liver inflammation in HCV mice. HCC incidence?
PERSPECTIVES:
Co-morbidity (non-viral) factors in virally-induced HCC
MCD or DIO FLN/35 or HLE mice
FLN/35 or HLE mice Mdr2 KO
HCC incidence
and mechanisms