legendplex™ data analysis software...2017/05/16 · legendplex data analysis...

LEGENDplex™ Data Analysis Software-Help

LEGENDplex™ Data Analysis Software

Version 7.1

Mac版ユーザーガイド

Copyright © 2015 VigeneTech. All rights reserved.


Contents はじめに ................................................................................................................ 3

Overview ............................................................................................................ 3System Requirements & Recommendations ............................................................ 3Installation .......................................................................................................... 4Start LEGENDplex™ ........................................................................................... 8Toolbar ............................................................................................................... 9Files ................................................................................................................. 11

Status File ..................................................................................................... 11FCS-VG File ................................................................................................. 12

データ解析 ...................................................................................................... 13定量的解析 ...................................................................................................... 13

定量的解析ウィザード ................................................................................. 13

定量的解析の設定 ..................................................................................... 13Wizard Step 1 ............................................................................................. 16Wizard Step 2 ............................................................................................. 21Wizard Step 3 ............................................................................................. 23

定量的解析のオプション機能 ...................................................................... 24

Quantitative FCS Files List とは................................................................... 24スタンダードファイル ............................................................................. 25サンプルファイル..................................................................................... 26Modify Standard Concentration Dialog box ................................................... 26FCS ファイルの追加 ................................................................................. 27

FCS ファイルの削除................................................................................. 28サンプル名変更........................................................................................ 29希釈倍率の決定......................................................................................... 31Flag Data ................................................................................................... 31データソーティング ................................................................................. 32スタンダードカーブの設定 ....................................................................... 32手動でのスタンダードカーブの設定 ........................................................ 33スタンダードカーブの初期化 ................................................................... 34スタンダードカーブの編集....................................................................... 34サンプルへのコンバート .......................................................................... 37スタンダードカーブへのコンバート......................................................... 37レプリケート_反復について..................................................................... 38Standard Curve-Set Standard Well Dilution Order.......................................... 38Parameters-Set for the Highest Standard Concentration .................................. 40測定因子の設定変更................................................................................. 41ゲーティング............................................................................................ 41

定量的解析　解析結果................................................................................. 46Concentration ............................................................................................. 47Median ...................................................................................................... 48Median CV ................................................................................................ 49Count ........................................................................................................ 50Bar Chart ................................................................................................... 51


Standard Curve ........................................................................................... 53Clustering .................................................................................................. 54Output ....................................................................................................... 58

定性的解析....................................................................................................... 59定性的解析ウィザード.................................................................................. 59定性的解析の設定 ..................................................................................... 59Wizard Step 1 ............................................................................................. 61Wizard Step 2 ............................................................................................. 63Wizard Step 3 ............................................................................................. 64定性的解析のオプション機能 ...................................................................... 65

Qualitative FCS Files List ............................................................................ 65Files .......................................................................................................... 66Qualitative Gating....................................................................................... 68

Qualitative Result ........................................................................................... 68Output ....................................................................................................... 69

オプション .......................................................................................................... 71Curve Option ..................................................................................................... 72Data Analysis Option ......................................................................................... 75View Option ...................................................................................................... 76Standard Curve Fitting Model ............................................................................. 76

Index ................................................................................................................... 79

LEGENDplex™ Data Analysis Software-Installation Guide

1

WelcomeLEGENDplex™ データ解析ソフトウェアはフローサイトメーターからのデータを定量的に解析する為のソフトウェアです。簡便な操作で正確なデータを得られ、自動的にレポートが出来ます。

LEGENDplex™ 特長

Easy-to-use user interface Simple wizard for repetitive tasks required for FCS data analysis generated from

flow cytometers Automated curve-fitting and sample concentration calculations Robust curve-fitting algorithm Detection limit determination Integrated data visualization within original data, calculated data and curve

mapping Standardized data reports Support both quantitative and qualitative analysis Normalization options for control analytes or control samples

関連トピックス:

System Requirement

Start LEGENDplex™

Toolbar

Installation

Wizard Step 1


3

はじめに

Overview

LEGENDplex™ データ解析ソフトウェアは一般的なフローサイトメーターから出力されたFCSファイルの解析用ソフトウェアです。 FCS 2.0, FCS 3.0, FCS 3.1

および list mode files (.LMD)形式のファイルを解析することが可能です。

System Requirements & Recommendations

ソフトウェア: Mac OS X version 10.7 (Lion) and later. Mono 4.0 or higher


Welcome

Installation

Start LEGENDplex™

Toolbar

Wizard Step 1


4

Installation

VigeneTechのウェブサイトより、ソフトウェアをダウンロードします。(http://www.vigenetech.com/LEP7register.asp) ダウンロード後、ソフトウェア・パッケージをPCへ保存してください。

ソフトウェアのインストールに先立ち、PCが適切なネット環境下にあること、Mono 4.0i以上がインストール済みであることをご確認ください。

インストール方法

1. LEGENDplex解析ソフトウェアインストールのため、PC上に保存したソフトウェア・パッケージをダブルクリックすると、解凍され、アイコンが表示されます。

2. LEGENDplexアイコンをクリックすると、下記ウィンドウが表示されます。ユーザー情報（ユーザー名、メールアドレス、ご所属名）を英語で入力し、OKをクリックしてください。

3. Trial Licenseのウィンドウが出てきます。トライアル版を実行する場合は、Yesをクリックします。

4. ソフトウェアのセットアップを行う場合は、Noをクリックします。

http://www.vigenetech.com/LEP7register.asp


5

5. すでにVigenetech社のライセンスファイルをお持ちの場合は、Loadボタンをクリックし、ダイアログボックスを表示させます。表示されたダイアログボックスにVigeneTech社より支給された有効なソフトウェアライセンスを入れてください。ライセンスの保存場所が異なる場合は、Openボタンをクリックし、適切なライセンス保存場所を選択してください。

6. ライセンスをお持ちでない（特に新規）ユーザー様の場合は、Requestボタンをクリックしてください。


6

7. Requestボタンをクリックしてください。

8. ライセンス受領後にライセンスを保存予定のディレクトリを選択後、Saveボタンを押して、 LEGENDplex.lxr ライセンスファイルの保存場所を指定してください。下記に表示されている内容とお手持ちのキットのロット番号をVigeneTech社（本ガイドの末尾にアドレスがあります）へ送り、ライセンスを請求してください。


7

9. Vigenetech社よりライセンスファイル(LEGENDplex.lxsx またはLEGENDplex.lxx )

を受領されましたら、上記で指定しましたディレクトリへ保存してください。

10. LEGENDplex™ データ解析ソフトウェアを起動すると、再びライセンスについて確認されますので、ライセンスファイルを保存したディレクトリを開いて、Openボタンをクリックしてください。

11. ライセンスが認証され、ソフトウェアが開きます。


System Requirement

Start LEGENDplex™

Toolbar


8

Start LEGENDplex™

LEGENDplexTM データ解析ソフトウェアでの解析方法は以下の通りです。

デスクトップにあるこのアイコンをクリックします。

LEGENDplexTM データ解析ソフトウェアが開かれます

左上の　　　　アイコンをクリックし、new wizard を開きます。以前解析した

status file を開きたい場合は、この　　　アイコンをクリックします。status file とは、解析データと解析設定を含む過去に解析したデータファイルのことを指します。


System Requirement

Toolbar


9

Toolbar

LEGENDplexTM データ解析ソフトウェアのツールバーは、解析段階に応じて表示されます。例）下記はWizard Step 3 で表示されるツールバーです。

基本的な各ボタンの機能を下記にご紹介します。

メニューアイコン内容

New

wizard

保存したStatus fileのロードもしくは新規解析セッションの開始

Step 1 Step 1 (データファイル読込、検量線濃度設定、ゲート設定).

Step 2 Step 2 (curve fitting Options and Standard Curve Optionsの確認).

Step 3 Step 3 (解析結果閲覧、検量線表示、データレビュー、レポート出力).

Open 保存した Status (.blpx) fileのロード

Save

アイコンをクリックした場合: すべてのデータの保存

ドロップダウンメニューより選択した場合: FCS-VGfiles、Status files 、Result Data Filesの別保存

Save

Result

Data

解析結果のみの保存.

Option スタンダードカーブオプションの変更、アウトライナーの設定と表示オプション

Flag選択したサンプルかデータポイントへのフラグ付元データには影響しない。

UnFlag フラグのキャンセル


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Auto Flag データへの自動フラグ

Clean All

Flag全てのフラグの無効化

Run データ解析の開始もしくは再開

Gate ゲート設定の開始

Standard

Curve個別の Standard Curve を表示

Bar ChartBar Chartの表示。選択した結果を２Dバーチャートとして視覚化できる。

Heatmap 選択したデータレンジでのヒートマップ表示

Clustering 選択した結果のクラスタリングマップ表示

About ソフトウェアバージョン情報の表示


System Requirement

Installation

Start LEGENDplex™


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ファイルについて

Status File

Status file には、PCステイタスやファイルの動作環境（オプション設定、ファイル、レイアウト、データセットの解析状況など）の情報が含まれます。解析結果は、 status (*.blpx) fileとして保存され、後ほど開くことが可能です。動作環境はソフトウェアを閉じるとリセットされますが、status file はデータ解析時の動作環境を記憶しています。

Status file (*.blpx) にはFCSファイル (or .lmd files)や、フラグ情報、オプション設定などの情報も含まれます。この特長はデータの定量的、定性的な解析をサポートします。

Status Fileの保存

矢印をクリックし、保存したい Status File をドロッアイコン横の

Status Fileのロード

このアイコンをツールバーよりクリックし status fileをロードします。

関連トピックス: FCS-VG File Start LEGENDplex™ Installation Wizard Step 1

プダウンリストより、選択します。


12

FCS-VG File

The FCS-VG files はレポート作成時もしくは解析データを保存すると作られます。The FCS-VG files はドングルのポイント消費無しに再解析することが可能です。

FCS-VG fileのロード方法に関しては、 Add Files をご参照ください。

関連トピックス: Status File Start LEGENDplexTM

Installation Wizard Step 1 FCS Files List Add Files


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データ解析

定量的解析

定量的解析ウィザード

定量的解析の設定

定量的解析の設定項目には、sample IDs, ファイルネーム, 解析物名, スタンダード濃度などが含まれます。

定量的解析の設定はraw dataの解析に使用されます。これらの設定は、FCSファイルロード後にWizard Step 1 の右側に表示されたパネルで行います。

Type横のドロップダウンメニューより、Quantitative を選択してください。quantitative analysisの設定項目は下記のとおりです：


14

Data Analysis

Quantitative --- スタンダードカーブを使用したサンプルの濃度計算手法

Background (“Bkgd”) subtraction --- データ解析前に、raw dataからバックグラウンドノイズを引くことが可能です。濃度０であるスタンダー

ドカーブ「C0」を測定している場合、残りのスタンダードを含む全てのファイルの蛍光強度からそれぞれ、C0の蛍光強度が引かれます。引いた後、もし測定サンプルの濃度がネガティブになってしまった場合は、オリジナルデータと同値の蛍光強度は０～１として表示されます。

注意: ある解析対象物（サイトカインなど）でスタンダードカーブの濃度が下がってしまった場合は、background subtractionは行われず、解析対象物名がポップアップ表示されます。

Auto Save ---Auto Save の選択を行います(初期設定では、Noneになっています)。Auto Save に設定すると、自動的にライセンスファイル内

のポイントを消費し、結果や測定後のStatus fileの保存を行います。

o None: 解析完了後、解析結果は何も自動保存されません。o Data: 解析完了後、結果のみが保存されます。o Report: 解析完了後、raw dataが入っているフォルダにDefault

reportが保存されます。o Both: 解析完了後、raw dataが入っているフォルダに結果とDefault

reportの両方が保存されます。 Auto Gate --- auto gatingが ON 設定の場合、各ファイルに自動でゲー

ティングが行われます。 OFF設定の場合、最初に設定したゲートがテンプレートとなり、同時に解析される他のサンプルに適用されます。ON 設定のほうがデータ解析に時間がかかります。

Max Load Time ---ロードにかかる再長時間

Standard Curve

Highest Conc. --- スタンダードカーブの最も濃度の濃い値。解析対象物によって最も濃いときの濃度が異なる場合は、適用される解析物が

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多い方の濃度を記載してください。個々の解析物の濃度は、解析前に

Modify Standard Concentration より、変更していただけます。

# of Curve Points ---バックグラウンドを含めた測定されたスタンダードカーブが何ポイントあるか、そのポイント数。 5 もしくは 4-parameter

logistic curve-fitting methodsを使用するためには５点以上のスタンダードカーブ測定が必要です。

Background (C 0) --- スタンダードカーブ作成とサンプル濃度計算においてバックグラウンドノイズを含めるかどうかを選択出来ます。

Dilution Factor --- スタンダードの段階希釈時の希釈倍率 Direction --- スタンダードカーブ段階希釈の並び順. Increasing か

Decreasingかの選択をします。本解析ソフトにアップロードしたスタンダードのFSCファイルの並びが、上から順にC0～C7となっている場合は「Increasing」を、C7～C0となっている場合は「Decreasing」を、それぞれ選択してください。

# of Replicates --- スタンダード測定の反復回数の設定です。サンプル

Replicate Mode --- スタンダードの反復方法を選択できますo AABBCC: このAABBCC モードでは、反復しているサンプルファ

イル同士が連続して並んでいます。 (例 sample 1, sample 1; sample 2,

sample 2 …).

o ABCABC. このABCABC モードでは、サンプルはグループごとに反復しています。 (例sample 1, 2, 3, 4…; sample 1, 2, 3, 4…).

View

Decimal Places --- 本プログラムによって計算された全ての数値の小数第何位まで表示するかを設定します。

Unit --- サイトカイン濃度計算時のユニット表示を選択できます。サイトカインごとにユニットが異なるときは Gate settings.より、選択できます。

ファイルの反復回数の設定はファイルリスト上で行うことが出来ます。


16

関連トピックス: Wizard Step 1 Wizard Step 2 Wizard Step 3 Start LEGENDplexTM

Edit Standard Curve

Wizard Step 1

1. をクリックして、新しいウィザードセッションを開始します。

2. マイコンピュータをクリックし、ドロップダウンメニューを表示させます。


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3. 解析対象となるFSCファイルの入ったフォルダを選択し、ファイルを画面左のファイル欄へドラッグします。フォルダ内のファイルは自動的に展開されます。フォルダを開いてから、解析したいファイルのみを選択しドラッグすることも可能です。


18

4. Nextをクリックします。画面右側にダイアログ設定ボックスが表示されます。実験プロトコルや設定に合わせて各パラメータを調整します。

5. 調整後、再度Nextをクリックします。スタンダードファイル設定のため"File Name" または "Data Created"をクリックするか、もしくは、ファイルをドラッグし "Shift"をクリックしてファイルを選択し、Apply CurveOptiionsをクリックします。


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6. スタンダード濃度が上記で選択したファイルに追加されます。各ファイルに追加された濃度が正しいかを確認してください。濃度が異なる場合は、Remove Curve ボタンをクリックし、追加した値を削除してください。

7. 確認後Nextをクリックすると、ビーズゲーティングウインドウが表示されます。ゲーティングに用いるサンプルを左欄より選択し、必要に応じて右側のGate Settingを調整します。その後、をクリックし、 Gating. を行います。


20

8. ゲーティングが終了しましたら、 OK をクリックします。

9. 画面右側より、curve-fitting optionsなどの設定を行います。 “Calculate Option”

と “Modify Standard Concentration” のタブを使ってスタンダードカーブその他の設定も変更できます。変更でき次第 Runをクリックします。

関連トピックス Wizard Step 2 Wizard Step 3 Quantitative Settings


21

Wizard Step 2

1. 本ステップでは、画面右の Calculate Option と Modify Standard Concentration

タブを使って、オプションやスタンダード設定の編集が出来ます。

Edit Standard Curve

Edit Options

Flag Data


22

2. 必要な変更を行った後、Runをクリックします。

関連トピックス Quantitative Settings Wizard Step1 Wizard Step 3


23

Wizard Step 3

下記のように解析結果が表示されます。

特定のファイルでビーズゲートがずれていることなどがわかった場合には、そのファイルをハイライトし、 gating をおこなうことで、ビーズゲートをかけなおすことができます。

関連トピックス: Wizard Step1 Wizard Step 2 Quantitative Settings

24


定量的解析のオプション機能について

Quantitative FCS Files Listとは

The Quantitative FCS Files は、スタンダードやサンプルファイルが表示された場所にあります。リストには、FSCファイル情報（File Name, Name, Type,Concentration, Dilution Fold, Data Created Size, File Directory）が記載されています。

リストのトップには、ファイルを取扱うためのアイコンがございます。

Remove Files Define Names Define Dilution Factor Remove Curve

リストのファイル上で右クリックしていただくと下記のようなメニューが表示されます。


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Set Type As: ファイルのサンプルタイプ (S, Background, C0, C1, C2...) の設定 Apply Curve Options Copy: 選択中のデータのコピー Paste: サンプルタイプと濃度の貼付け Paste with Names: サンプルタイプと濃度およびコードの貼付け Remove: 選択中のファイルの削除

スタンダードファイル

スタンダードファイルは定量的解析前に、 Quantitative Settings において”C "typeであることを定義付けておく必要があります。

スタンダードファイルを右クリックしポップアップメニューを表示します。

Step 1 Step 2

Set Type As: ファイルのサンプルタイプ (Sample, Background, C0, C1, C2...) の設定 Flag, Unflag, Clean All Flags Copy: 選択中のデータのコピー Paste: サンプルタイプと濃度の貼付け Paste with Names: サンプルタイプと濃度およびコードの貼付け


Wizard Step 1 Edit Sample ID


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Set Standard Curve Edit Standard Curve

サンプルファイル

FCSファイルをリストにロードした直後は、全てのファイルのデフォルトタイプは “S” 、つまりサンプルだと認識されます。スタンダードのデータはファイルタイプの変更を行い希釈濃度の設定を Settingsより行う必要がございます。Type欄に、Sと記載されたファイルはサンプルファイルであることを、Cと記載されたファイルはスタンダードファイルであることを示します。必要な場合は、下記も変更してください:

Name --- サンプル名をまとめて変更したいときはDefine Namesより変更可能。 Dilution Fold --- サンプルが希釈されているときはDefine Dilution Factor

より変更可能

Modify Standard Concentration Dialog box

Wizard Step 2においてCurve Tab をクリックし Modify Standard

Concentration 設定ダイアログボックスを下記のように表示させます:

このタブは3つのセクションに分かれています: Standard Curve List, Parameters, Analyte Lists.


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関連トピックス: Remove Standard Curve Set Standard Curve Edit Standard Curve

FCSファイルの追加

をクリックし、FCSファイルの入っているフォルダを選択します。.fcsファイルを選択した場合は、FCS Filesリストへドラッグします。File TypeでFCS-VG Fileのロードを選択した場合は、FCS-VG Files(.vg)を選択できます。

.fcsファイルを含んだフォルダを選択し、画面左側へドラッグするとフォルダ内の全てのFCSファイルがロードされます。FCSファイル以外は自動でフィルタリングされます。


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画面左より、全ファイルもしくは解析したいファイルのみを選択します。


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FCSの削除Wizard Step 1において、FCS Files listよりひとつ以上のファイルを選択し、Remove ボタンをクリックすることで、選択したファイルを削除できます。


Sample Files Remove Standard Curve Edit Standard Curve

サンプル名変更

デフォルト設定では、サンプル名は元ファイル名として設定されています。このサンプル名を変更することが可能です。Wizard Step 2において、FCS Files List の一つ以上のファイルをハイライトし、Calculate Optionより、Prefix, Replicate Mode, Replicate Number and Start Number を設定し、画面上部にあるファイルリスト表のDefine Names ボタンをクリックすることで変更されます。


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Prefix --- サンプル名の共通部分を入力(デフォルト設定ではSample) Start Number --- 一連のサンプル名共通部分を入力 Replicate Mode --- Replicate Modeの選択: AABBCC もしくはABCABC

AABBCC は、同サンプルが連続して測定された場合の繰返し方法。ABCABC は、サンプルグループセットが複数回測定された場合の繰返し方法。

Replicate Number --- 選択したサンプルの繰返し回数

関連トピックス: Sample Files FCS Files List Wizard Step 2 Wizard Step 1


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希釈倍率の決定

Select a file or multiple files in the Quantitative FCS Files List もしくは QualitativeFCS Files List, にてファイルを選択し、Calculate Optionの Dilution Fold より設定します。 Define Dilution Factor ボタンをクリックすると希釈倍率が設定できます。

Dilution Fold: 希釈倍率の入力

関連トピックス: Sample Files FCS Files List Wizard Step 2 Wizard Step 1

Flag Data （フラグ：特定サンプルデータを解析から外すこと　の設定）

ファイルのフラグ化には2種類の方法があります: Flag もしくはAuto Flag

Flag: 選択したサンプルのFCSファイルをフラグ化することが出来ます。フラグ化されたファイルは解析されません (測定値が外れ値になるかどうかに関わらず、解析されなくなります)。外れ値となったデータはマニュアルでフラグ化し解析データから除去できます。

Auto Flag: Curve Option の設定によって、外れ値となったファイルが自動的にフラグ化されます

フラグ化されたデータは蛍光強度の中央値（ Median ）のみ結果に表示されます。

データのフラグ化:

サンプルを選択後、右クリックし、ポップアップメニューより Flag

を選択します。

フラグの外し方:

フラグ化されたサンプルを選択後、右クリックし、UnFlag を選択します。

Auto Flag 状態からの状態リセット方法:

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サンプルを選択し後、右クリックし、ポップアップメニューよりAuto Flag を選択します。

データソーティング

FCS File list の中にある File Name, Data Created やSize といったカラムは、そ

れらの昇順／降順にソートしていただくための機能です。カラムのソーティング機能はスタンダードカーブ用ファイル等をソフトの仕様に合わせて正しく計算できるように並べ替えていただくための機能です。また、マウスを使ってドラッグしていただくことにより、ファイルの位置を動かすことも可能です。

スタンダードカーブの設定

Settings　でスタンダードカーブ用のFCSファイルを正しく並べ、関連パラメータの設定が完了しましたら、スタンダードカーブ用ファイルを全て選択し、　　　　　　　をクリック、もしくは、右クリックしてApply Curve Optionsを選択し、Settingsのところで設定した関連パラメータの情報を適用させます。


33

Click "File Name" か"Data Created" をクリック、または、必要ファイルをドラッグして"Shift" を押して、ファイルを選択し、“Apply Curve Options”をクリックします。もしくは、ファイルごとに C0, C1, C2, …C7 の用にスタンダードカーブの設定を行うことも可能です。


Standard Curve Files FCS Files List Modify Standard Concentration Dialog Box Remove Standard Curve Set Standard Curve Manually

手動でのスタンダードカーブ設定

スタンダードカーブ用のファイルがリスト中に正しく並んでいない場合、もしくは、特定のファイルのみをスタンダードとしたい場合などでは、ファイルを個別に選択し、 C0, C1, C2…. とタイプ付していくことが可能です。タブでス . タンダードの濃度の設定も行っていただけます。


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もしくは、settingタブでファイルタイプをCと選択し、濃度を入力頂くことも可能です。

スタンダードカーブ設定の初期化

FCS Files リストの上部にある　　　　　　　をクリックし、スタンダードカーブ設定を一度初期化し、再度新しい設定を行うことも可能です。

スタンダードカーブの編集

Modify Standard Concentrationタブより、スタンダードカーブについて希釈濃度によるファイルのグループ化や、希釈段階ごとのスタンダードカーブファイルのソート、スタンダードカーブの希釈開始時の濃度の設定などを編集できます。


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Step1: Edit Standard Curve タブを開く画面右上にあるModify Standard Concentration ボタンをクリック

し、 Edit Standard Curve タブを開きます。

Step2:

左のパネル（Standard Curve)スタンダードカーブ情報を見直します。

ファイルIDの中央にあるチェックボックスを選択します。ボックスがが灰色となっている場合は、直前のファイルのreplicateであることを示します。

Step3:

最も高濃度のスタンダードの値、希釈倍率、小数点第何位までサンプル濃度をキャリブレーションするか、などを入力します。


36

バックグラウンドファイルを含めてスタンダードカーブを設定する場合、Background (C0) チェックボックスをチェックします。バックグラウンドファイルを含めない場合は、チェックを外します。

Directionの確認:

Increasing：スタンダードカーブサンプルファイルが濃度の昇順（低濃度⇢高濃度）で並んでいる場合は、Increasingをチェックして希釈倍率を当てはめます。 Decreasing：降順（高濃度⇢低濃度）で並んでいる場合は、Decreasing にチェックをします。

もし、全サンプル濃度が等しい場合は、Apply To All Analytesチェックボックスを選択し、　　　　　　をクリックします。

もし、サンプルごとに濃度が異なる場合は、 Apply To All

Analytesチェックボックスのチェックを外した後、同濃度のサンプルのみを選択し、 Highest Concentration 欄にその濃度を入力し、　　　　　をクリックします。他の濃度のサンプルも同様に濃度指定し、全てのサンプルの濃度指定後にRUNを押します。

入力した希釈濃度が合っているかをDilution tableで確認します。


Set Standard Curve Set Standard Curve Manually Modify Standard Concentration Dialog Box


37

サンプルへのコンバートスタンダードカーブのファイルを選択し、右クリックしてポップアップメニューを表示させSet Type as -> S を選択することで、選択したファイルをサ

ンプルファイルに変更できます。


Calibrator Files Sample Files FCS Files List

スタンダードカーブへのコンバード

サンプルファイルを選択し、右クリックしてポップアップメニューを表示させSet Type as を選択し、さらに C0, C1, ..., C7 toを選択することで選択したファイルをスタンダードカーブ用ファイルへ変更できます。Note: C0, C1, ..., C7 に関しては、 # of Curve Pointsをご参照ください。


38


Calibrator Files Sample Files FCS Files List

レプリケート_反復について

サンプルのレプリケートは下記のように設定できます:

サンプルをハイライトし、 Define Namesをクリックします。 Replicate

Mode や Replicate Numberの設定を行います。

Standard Curve-Set Standard Well Dilution Order

画面中央にあるModify Standard Concentration Dialogボタンを押し、Modify

Standard Concentration Dialog boxを開きます。Standard Curve セクションに関

しては、以下の通りです：


39

スタンダードカーブ欄にある　　をクリックすると、下記のメニューが表示されます。

Reverse Orders --- スタンダードカーブ濃度設定を逆転させます。 Two for Each Replicate --- スタンダードカーブの各濃度のファイル数

を２つずつに設定します。 3 for Each STD Point --- スタンダードカーブの各濃度のファイル数を３つず

つに設定します。下のEnter Replicate Count でファイル数設定を行うことが出来ます。

Enter Replicate Count --- タンダードカーブの各濃度のファイル数をご自分で設定することが出来ます。


Edit Standard Curve Calibrator Files Wizard Step 2


40

Replicates

Parameters-Set for the Highest Standard Concentration

Edit Standard Curve dialog box.を開きます。パラメータセクションに関しては、下記

Highest Concentration --- スタンダードカーブの最も高濃度時の濃度を入力します。

Dilution Factor --- 希釈倍率を入力します。 Decimal Places --- 定量解析濃度計算時に出力される濃度を小数点以下何位まで表示するか（6位まで）を入力します。

Background (C0) --- スタンダードカーブサンプルに濃度０がある場合はチェックします。

Direction: Decreasing --- スタンダードカーブ濃度が高濃度→低濃度と続いているときにはチェックします。低濃度→高濃度となるときはチェックを外します。

注意: 濃度が > 100となる場合は、小数点以下は表示されません。


Edit Standard Curve Calibrator Files Wizard Step 2 Replicates Standard Curve-Set Standard Well Dilution Order Analyte List-Apply Settings To Analytes

のとおりです:

41


測定因子の設定変更

Edit Standard Curve dialog boxを開きます。

ボックスの下部に測定する因子のリストがあります:

全ての因子への設定変更リスト上の全因子への設定変更のため、本セクションの Standard Curve List や

Parameters のチェックボックスをチェックし　　　　　をクリックします。個別の設定をしたい場合は、Apply to All Analytes チェックボックスのチェッ

クを外し、個別に設定を行います。変更したい因子のみ選択し、をクリックします。


Edit Standard Curve Calibrator Files Wizard Step 2 Replicates Parameters-Set Standard Highest Concentration Standard Curve-Set Standard Well Dilution Order

Gating 　（ゲーティング）


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ビーズゲーティングウィンドウ

任意のサンプルを選択し、Step 1の画面左下隅にある　　　をクリックするか、

on the left bottom corner of your screen at Step 1 or

Toolbar にあるマークをクリックすると下記画面が表示されます。

Gate Toolbar はゲーティングプロセスに必要なツールが表示されています。Gate Settings では、ゲート作成に必要なパラメータを設定できます。Size Plot と Bead Plot とに、ゲーティング結果が表示されます。

関連トピックス: Wizard Step 1 Calibrator (Standard Curve) Files FCS Files List Gating Procedure Gate Settings

Wizard step 3 の


43

ゲート設定

Bead Gating window の右側にあるのがGate Settingsです。

画面左側にはファイル情報が並んでいます。ゲーティングが終わったら、ファイル名をクリックし、各ファイルのゲーティング結果を、確認し、ゲーティングが正しいかを確認できます。

下記画像は、ゲーティングのパラメータ情報です。

a. Auto gate: 通常はOFF設定になっています。解析する全ファイルが同じFCM機器で測定され、かつ全てのサンプルに異なるゲートがかけられているときのみ ON にします。ON設定だと解析に時間がかかります。

b. # of Bead Size: マルチプレックスアッセいイで使用されたビーズサイズの種類を入力します。

c. Min Density: ビーズサイズゲートの大きさを入力します。数値が低いほどゲートは大きく成ります。推奨値は5です。０の場合は、ゲーティングが起きません。

d. Compensation: コンペンセーション設定です。e. Bead Size X: ビーズサイズプロットのX軸のパラメータ名設定(e.g. FSC-A)f. Bead Size Y: ビーズサイズプロットのY軸のパラメータ名設定 (e.g. SSC-A)


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g. Bead Classification: 各ビーズ選別に使用するパラメータ名(e.g. APC-A etc.)h. Report Signal: 濃度計算に使うパラメータ名(e.g. FL2, PE-A, etc.).i. # Bead: 各ビーズサイズのビーズが何因子に使われているかを入力j. Bead ID: 右クリックし、ビーズIDを入力します。 1,2,3...に対して、

A4, A5, A6 …B3, B4, B5... が通常入力されます。(ビーズIDの詳細に関しては、キットに添付されているマニュアルでご確認ください)

k. Analyte: 右クリックし、各因子名を入力します (e.g. TNF-α, IL-6,etc.) 。詳細はキットに添付されているマニュアルをご参照ください。

関連トピックス: Gate Toolbar Gating Procedure Bead Gating Window

Gating Toolbar （ゲーティングツールバーについて）

Bead Gating window の上部には下記の様なゲーティングツールバーがあります。

自動的にゲーティングプロセスを開始します。

ツール選択を行います。

手動でゲーティングします。

ゲートを削除します。うまくゲーティングが行えなかったときに使用します。

プロット図の特定の場所を拡大表示します。通常ビーズサイズゲート　作成時(FSC vs. SSC plot)に用います。　

拡大表示のリセットを行います。


45

表示するプロット図を選択します。

Gating Procedure　（ゲーティングの手順）

1. をクリックし、Bead Gating windowを表示します。ビーズサイズ数、ビーズAおよびビーズBの因子数などを入力し、各プロットの軸のパラメータ名を選択します。必要に応じて、Bead ID と Analyte（因子名）を入力します。入力しない場合は、ビーズサイズの小さい順、ビーズ区別に使用する蛍光強度の弱い順に表示されます。

2. 測定に使用した機器によって、FCSファイルのバージョンは異なります。各プロット図ので使用するパラメータ名を正しく選択してください。

3. Bead Gating windowの上部　　　をクリックすると、自動的にビーズゲートが作成されます。デブリなどの目立つデータの場合は、マニュアルゲート作成が推奨されます。

4. コンペンセーションなど、推奨プロトコルに従って実験していただいているほとんどの場合、オートゲーティングが機能しますが、うまくいかない場合は、以下のことをお試しください:

a. Min Densityの変更

b. のズーム機能を使い、ビーズ集団がうまくゲーティングできるように調整してから、　　をクリックします

c. マニュアルゲート作成: をクリックし、ビーズ集団の周りに手動でゲーティングできます。1つのサンプル上で作成したゲートは自動で他のサンプルに適用されます。もしゲートを修正したい場合は、を選択し、ゲートを消すことが出来ます。再度　　をクリックし、ゲートを作り直します。


46

ご注意：ゲート作成後に、　　をクリックしてしまいますと、マニュアルゲートが消えてしまいますので、ご注意ください。

d. 違うサンプルでオートゲーティングを試すと、うまくいくことがあります。5. ゲートが完成しましたら、　　　　をクリックします。

関連トピックス: Wizard Step 1 Calibrator(Standard Curve) Files FCS Files List Gating Procedure Gate Settings Bead Gating Window

定性的解析　解析結果

データ解析後、サンプルとスタンダード情報が表示されます。

左側のパネル: Median, Median CV, Concentration Countが表示されています


47

右側のグラフ : スタンダードカーブと Sample Detailより、サンプルの詳細をご確認いただけます。Show individual curve をクリックし、個々のスタンダードカーブをご確認いただけます。

各サンプルの濃度は、スタンダードカーブ上に表示されます。

スタンダードカーブフィッティングについて:

R2 --- 詳細は R2 をご参照ください。 CV --- The Coefficient of Variation of sample replicates. (CV% = 100 x Std

Dev / Mean )

LEGENDplex™ の他の機能: Bar Chart, Standard Curve, Clustering, Heatmap. それぞれタブをクリックし、結果を閲覧できます。右クリックして各図の保存も可能です。

関連トピックス: Wizard Step 3 Options Toolbar Bar Chart Standard Curve

Concentration

The Concentration tab は各サンプルの濃度をスタンダードカーブより計算して表示します。

mk:@MSITStore:C:/VIGENE~1/LEGEND~1/Help/LEGEND~1.CHM::/Sample_Detail_Data.htm


48

関連トピックス: Median Median CV Count Bar Chart Standard Curve

Median

The Median tab は、各ビーズ集団の蛍光強度の中央値を表示します。


49

赤字は、auto-flagged もしくは、手動でflaggされたファイルを意味します。C0 は常にフラグされています。

Median CV

The Median CV tab は、レプリケートされたサンプルのCVを表示します。


50

Count

The Count tab は、各ビーズ集団のゲート内のビーズ数を表示します。


51

Bar Chart

必要な濃度もしくは蛍光強度中央値にハイライト後 Toolbarの　　　をクリックすることで、以下のように棒グラフを表示できます。棒グラフは、Mac PCの“Command key + Shift key + 4 Key” を押して、スナップショット画像としてお使いいただけます。

ハイライトした数値が多すぎる場合、棒グラフが適切に表示しきれない場合がありますが、その場合は、表示画面を拡張し、図が適切に載るように調整してください。ツールバーにある "+" をクリックすることで画面の拡張を、"-" をクリックすることでそのリセットを、それぞれ行うことができます。

52


サンプルや解析因子によるグループ化を行うことが出来ます。


53

Standard Curve

Concentration タブを選択後、 Toolbarの　　　をクリックすると、全ての因子のスタンダードカーブを個別に表示出来ます。検量線の相関係数、測定可能最小・最大濃度などは各スタンダードカーブの上部に表示されます。

スクロールして全因子のスタンダードカーブを確認できます。

関連用語：

CV --- 変動係数　 (CV = 100% x Chi/ Ymean) R2 --- 決定係数　モデルの当てはまりの良さを示す指標

(R2 = 1.0であれば、測定時がモデルに完璧に当てはまった状態を示す.)4 parameter logistic fittingでの数式は、y = a + (b – a)/[1 + exp(d(x – c))]　となる。x を v と置換すると、Vは以下のように示されるため、v = 1/[1 +exp(d(x – c))]　つまり、y = a + (b – a)*v. R^2を計算するため、線形回帰に当てはめると以下のように表示できる:


54

標本数をN、従属変数をy、yの平均値をy-bar, モデルによる推定値をy-hat、とする。5-parameter や他のカーブフィッティング手法でも同様のアプローチを行っている。非線形回帰での偽R２の定義では、このアプローチは簡略化されすぎる可能性があります。R2は最小二乗回帰でのみ有意であるため、決定係数の最大値の決定には有用ではありません。

関連トピックス: Median CV Count Bar Chart Wizard Step 3 Toolbar Sample Detail

Clustering

Clustering or Heat Map

Toolbarにある　　　をクリックすると一つ以上のデータをハイライト下記が表示されます。


55

左上にサンプルリストが表示され、チェックボックスにチェックを入れ、　　をクリックすることで、選択を表示データの選択が行なえます。

Clustering Options

　　をクリックすると、Clustering Options ダイアログボックスが開きます。


56

Clustering Color: クラスタリングの色設定

Show Category: Show Categoryモードの選択 No: 非表示 Value Only: {value}のように、サンプルの数値のみの表示 All: {name:value}のように、サンプルの名称と数値を表示

Algorithm: クラスタリングのアルゴリズムの選択 Hierarchical: 階層的手法、ここでは、凝集型階層的手法を意味します。 K-means: 非階層的手法。K-means とは、データとクラスタの重心の平方和の距離が最小値となるように指定したK個のクラスタ数に分類するアルゴリズムのことです。

注意: K-meansアルゴリズムを選択するときは距離関数も選択する必要があります。

Transform: クラスタリング解析時のLog変換の有無を指定

None: raw dataを使用


57

Log2: raw dataを Log2にして使用 Ln: raw dataを Lnにして使用

Color Scale: クラスタリングの色スケールの基準を下記より選択

Scale by global: 全ての因子の最大値・最小値を基準としてヒートマップの色を決定する

Scale by biomarker: 該当する因子の最大値最小値を基準としてヒートマップの色を決定する

Color Map: 蛍光強度や濃度を表示するときの色の選択

Auto Scale: データセットをもとに、最大値と最小値を全色で表示Min Scale: 濃度の最小値をカラーレンジのトップと設定するMax Scale: 濃度の最大値をカラーレンジのトップと設定する

Internal Distance: 似たデータを一群にグループ化するアルゴリズムの選択. Euclidean: ユークリッド距離 Pearson correlation: 1-r Pearson squared: 1-r2

External Distance: ２群以上に分ける場合のアルゴリズムの選択 Average: 全てのペアの平均の距離 Average group: 各各群の平均値を算出し、その平均値の差をクラスター間の距離とする

Single: もっとも近いサンプル間の距離 Complete: もっとも遠いサンプル間の距離

Clustering Toolbar

アイコン名称機能Run 解析開始

Save PDFファイルとして保存

Options Clustering Optionsの表示

Clustering クラスタリングボックスの表示


58

Clustering table

クラスタリングテーブルの表示

関連トピックス: Median CV Count Bar Chart Standard Curve Wizard Step 3 Toolbar Clustering or Heat Map Clustering Toolbar

Output

レポートにはDetail とSummaryの２種類があります。ツールバーの　　　をクリックすると、全ての結果が保存されます。

Detail: 検量線情報、検量線画像、サンプル濃度情報、測定因子詳細、ビーズカウント数、FCSファイル情報

Summary: 検量線情報、検量線画像、サンプル濃度情報、スタンダード情報、蛍光強度のMFI、測定因子詳細、ビーズカウント数、FCSファイル情報


59

定性的解析

定性的解析ウィザード

定性的解析の設定

Qualitative Settings では、サンプル名や解析因子名、サンプルファイルなどの変更を行うことが出来ます。一般的に設定にはraw dataを使用します。WizardStep1で事前に設定することも可能です。

データアナリシスのドロップダウンメニューよりQualitative を選択すると、下記のようにパラメータが表示されます。

Data Analysis

Qualitative --- リファレンスサンプルに対するテストサンプル、もしくは、コントロールもしくはノーマライゼーション用因子に対する測定因子の定量

Background Subtraction --- バックグラウンドファイル (BKG) サブトラクション: 各サンプルファイルからバックグラウンドを除く。 Qualitative

assayでは、各因子の蛍光強度のMFIからバックグラウンドファイルのMFIを引くことを意味します。バックグラウンドは設定可能です (define

Background).

Neg-Ctrl Subtraction --- ネガティブコントロールアナライトサブトラクション: 各解析因子のMFIからネガティブコントロールの因子のMFIを引くことによって各ファイルの数値が調整されます。


60

Control Type より、ネガティブコントロールを設定する必要があります。注意: Background Subtraction (sample) とNegative Control Subtraction

(analyte) は同時に行うことが出来ません。 Pos-Ctrl Analyte Global Normalization --- ポジティブコントロールアナ

ライトグローバルノーマライゼーション: 各ファイルにおいて、ポジ

ティブコントロール因子のMFIが標準化されます。各因子のMFI値は標準化されたポジティブコントロールの倍率によって表示されます。ポ

ジティブコントロール値の標準化は、プレート上の最も高値を示したMFIで割ることで行われます。Control Type より、ポジティブコントロールを設定する必要があります。

Pos-Ctrl Analyte Normalization --- ポジティブコントロールアナライトノーマライゼーション: 各因子の蛍光強度のMFIが同ファイル内の陽性因子のMFIによって標準化されます。注意: Positive Control Analyte Global Normalization と Positive Control

(Analyte) Normalization は同時に行うことが出来ません。Control Type より解析因子の幾つかをポジティブコントロールとして設定する必要があります。

Pos-Ctrl Sample Normalization --- 各サンプルファイルがポジティブコントロールによって標準化されます (POS Well)。各サンプルの解析因子の蛍光強度MFIはポジティブコントロールの同因子のMFIによって標準化されます。サンプルファイルタイプP (Positive)を設定する必要があります。

Auto Gate --- Auto Gate はOFF にすることを推奨します。 Auto Save --- 自動保存設定: (デフォルト設定はNone)

o None: 解析完了後は保存されません。o Data: 解析完了後のデータベース内の解析データが保存されます。o Report: 解析完了後にraw dataファイル内にデフォルトレポートが

保存されます。o Both: 解析完了後に解析データとデフォルトレポートの両方が保

存されます。View


61

Decimal Places --- プログラム上の数値の少数点以下の表示関連トピックス:

Wizard Step 1 Wizard Step 2 Wizard Step 3 Quantitative Settings

Wizard Step 1

1. をクリックして、新しいウイザードセッションを始めます。

2. Add File をクリックして。解析すべきFCSファイルをロードします。FCSファイル以外は自動的に除かれます。


62

3. Nextをクリックして、 Settingsより、Qualitative as Typeを選択します。

4. Next をクリックしてgating procedureを始めます。


63

5. OKをクリックして次のステップへ進みます。

関連トピックス: Qualitative Settings Wizard Step 2 Wizard Step 3

Wizard Step 2

1. 必要なら以下のステップを行います。

Define Name

Edit Calculate Options


64

2. Runをクリックします。

関連トピックス: Wizard Step3 Qualitative Settings Wizard Step1

Wizard Step 3

下記のように結果が表示されます。


65

Qualitative Resultもご参照ください。

関連トピックス: Qualitative Settings Wizard Step 1 Wizard Step 2

定性的解析のオプション機能について

Qualitative FCS Files List

Qualitative FCS Files list ではポジティブコントロールとサンプルファイルが表示され編集する事ができます。リストには Name, Type, File Name, Data

modified, Size やFile Directoryが表示されています


66

Wizard Step 1のファイル上で右クリックを行い、下記のメニューを表示させます:

Set Type As: 選択中のファイルのtypeを選択します (S, Background, Positive) 。 Copy: 選択したデータをコピーします. Paste: Typeを貼り付けます Paste with Code: type とcodeを貼り付けます Remove: ファイルを削除します

関連トピックス: Add Files Quantitative FCS Files List

Files


67

FCS Files listへFCSファイルをロードした後、全ファイルのType欄には、デフォルトでSと表示されます。これはサンプルファイルであることを意味します。 Qualitative assayには４つのタイプがあります: C (Control), S (Sample), B

(Background), P (Positive)。これらは変更可能です。必要に応じて以下の手順を行ってください:

1. Wizard Step 1で、必要であれば新しいサンプル名を入力してください。

Qualitative FCS Files Listでファイルを選択し、Define Names アイコンをクリックすると一斉にサンプル名を変更できます。

2. Wizard Step 1 とWizard Step 2において、Qualitative FCS Files List 上で右クリックしてサンプルタイプ変更を行い、ドロップダウンリストよりSet Type

As を選択します。

3. Wizard Step 2においてファイルをクリックし、下記のようなメニューを表示させます。

Set Type As: 選択中のファイルのtypeを選択します(Sample, Background,C0, C1, C2...)。 Flag, Unflag, Clean All Flags Copy: 選択したデータをコピーします。 Paste: TypeとConcentrationを貼り付けます。


Convert To Samples Convert To Standard Curve Calibrator(Standard Curve) Files


68

Qualitative Gating

Qualitative gating は Quantitative Gating Procedureとにています。違いは下記のGate Settings です:

Control Typeのドロップダウンリストをクリックし、コントロールタイプを選択します: Sample, Positive, Negative.

関連トピックス: Bead Gating Window Gate Settings Gating Procedure Qualitative FCS Files List

Qualitative Result

解析後結果が下記のように表示されます:


69

Normalized MFI, Count, Median CV, や Medianタブが表示され、クリックして表示できます。

Normalized MFI や Median data は、 Bar Chart やClustering or Heat Map でも確認できます。

関連トピックス: Wizard Step 3 Options

Output

レポートにはDetail とSummaryの２種類があります。Summary: ノーマライズされた MFI, MFI, カウント, ファイル情報, Detail: ノーマライズされた MFI, MFI詳細, カウント, ファイル情報,


71

オプション

Options dialog boxでは解析パラメータ設定やオプション選択を行います。

ツールバーにあるをクリックしてOptions dialog boxを開きます。

Curve Option, Data Analysis Option や View Option セクションが表示されます。

Optionsでパラメータを変更した後はLEGENDplex™ は自動的に再解析されます。

Quantitative とQualitative analysisとでは異なるパラメータが表示されます

Figure 1. Quantitative Options


72

Figure 2. Qualitative Options

Default Setting をクリックしてデフォルト値をロードします。Resetをクリックしてロードした値をリセット出来ます。


Wizard Step 2 Edit Standard Curve Curve Option Data Analysis Option View Option Standard Curve Fitting Model Toolbar

Curve Option

Options を開きカーブオプションを確認できます。


73

パラメータレンジ意味

Curve

Fitting 0.01-10

カーブフィッティングのCV値の高いポイントに対してスレッシュホールドを設定する。フラグアウトされる数値が多い場合は、より大きい数値を入力する。デフォルト値＝ 2

CV% 0.1 -

100

(%)

カーブフィッティングCV in % にスレッシュホールドを設定し、データ精度を調査する。フラグアウトされる数値が多い場合は、より小さい数値を入力する Status: Good, if Curve CV < Threshold CV

Status: Warning, if Threshold CV < Curve CV <

2*Threshold CV

Status: Poor, if Curve CV > 2*Threshold CV

デフォルト値＝ 30Fitting

Model / フィッティングモデルの選択 Standard Curve Fitting Model.

Hook -100 -

100

(%)

検量線に対して上下にずれたときのMFI値スレッシュホールド設定。Hookがスタンダードカーブに影響するかどうかを調査するための垂直線。Hookと規定するためのスレッシュホールドは最も高値もしくは低値とエンドポイントの差の最小値。デフォルト値＝ 2例）最後の点 (A) から次の(B)までの差は Yという％レンジを上回る, |Ya-Yb|>Hook*(Ymax-Ymin).そうでない場合はHookにはならない


74

もし最初または最後の2点でHookが見つかり、そのスレッシュホールドが >= 0であった場合は、最初もしくは最後の1点を削除する。もしくはカイ二乗によりどちらを削除するかを決定する。

Replicate

Value 0.01 -

100

レプリケートCVが大き場合のデータポイントを除去するための、レプリケートの蛍光強度の平均値のCVスレッシュホールド設定上部の最大CV値で増大する。( max CV =

Threshold Replicate Data * Threshold CV)

デフォルト値＝30

Slope 0 - 1

真っ直ぐな検量線を防ぐためのIC50でのスロープに対するスレッシュホールド設定。屈曲点でのスロープに対するスレッシュホールド。 Status: Good, if Curve Slope > Threshold Slope

Status: Warning, if Threshold Slope / 2 < Curve

Slope < Threshold Slope

Status: Poor, if Curve Slope <Threshold Slope /2

デフォルト値＝0.1

Individual Curves: Individual Curves チェックボックスをチェックすると、選択した検量線の再計算が行われます。カーブオプション設定を個々で行いたいときは、各因子名をクリックします。


75


Wizard Step 2 Edit Standard Curve Data Analysis Option View Option Standard Curve Fitting Model Toolbar Flag Data

Data Analysis Option

Options を開き Data Analysis Option.を確認します。

Auto Gate Auto Save


76

Background Subtraction Neg-Ctrl Subtraction Pos-Ctrl Analyte Global Normalization Pos-Ctrl Analyte Normalization Pos-Ctrl Sample Normalization

View Option

Options を開き、View Optionを確認します。

Decimal Places --- 小数点表示の設定


Wizard Step 2 Edit Standard Curve Curve Option Data Analysis Option Standard Curve Fitting Model Toolbar Median Quantitative Result

Standard Curve Fitting Model

Curve Option にあるドロップダウンリストよりStandard Curve Fitting Model を選

択します。

Standard Curve Fitting Model: Linear curve fitting (log scale) --- 2 parameters linear curve fitting model with

log(x) and log (y) scale, the model is .


77

Cubic spline fitting (log scale) --- 3 parameters cubic spline curve fitting model

with log(x) and log(y) scale.

Four-parameter curve fitting (log scale) --- 4 parameters non logistic curve

fitting model with log(x) and log (y) scale.

Five-parameter curve fitting (linear scale) --- 5 parameters logistic curve fitting

model with log(x) and y linear scale.

Five-parameter curve fitting (log scale) --- 5 parameters logistic curve fitting

model with log(x) and log (y) scale.


Options Curve Option Edit Standard Curve Dialog Box Set Standard Curve Set Standard Curve Manually


79

Index

.

.blpx 11

A Add fcs files 29

B Bar Chart 52

C Clustering Options 55 Clustering or Heat Map 54 Concentration 49Count 51

E edit standard curve dialog box 28

M Median 50Median CV 50

O Open files 29

Q Qualitative Bead Gating 68Qualitative FCS Files list 65Qualitative Settings 58Qualitative Wizard Step 1 60Qualitative Wizard Step 2 63Qualitative Wizard Step 3 64

Quantitative Bead Gating 44 Quantitative FCS Files list 26Quantitative Settings 13Quantitative Wizard Step 1 17Quantitative Wizard Step 2 23Quantitative Wizard Step 3 25

R Ribbons and Tabs 9S Select files 29Standard Curve 52status file 11

legendplex™ data analysis software...2017/05/16 · legendplex data analysis...

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