ACTUALIZACIÓN Revista de la Facultad de MedicinaUniversidad Nacional de Colombia1999 - Vol. 47 N°2 Págs. (89 - 97)

Las pruebas serológicas en el diagnóstico de la enfermedad infecciosa

Miguel A. Guzmán U_rreg~,MD_.Profesor Asociado. Departamento de Microbiología. Maye Bernal Rivera Be. Profesora Asistente.Departamento de Microbiologia, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia.

Las pruebas serológicas basadas en lareacción antígeno anticuerpo constitu-yen una valiosa herramienta en el diag-nóstico y manejo de la enfermedad in-fecciosa. Su introducción como ayudasdiagnósticas se inició a finales del siglopasado y tuvo uno de sus momentos es-telares hacia 1905 cuando August VonWassermann O), adaptó la fijación decomplemento desarrollada por JulesBordet (2,3) al diagnóstico de la sífilis(4), convirtiéndola en un procedimientoclásico que hasta hace pocos años cons-tituía el pilar fundamental de laborato-rio para el diagnóstico de esta enferme-dad, fue la famosa reacción deWassermann. De entonces a nuestrosdías las pruebas serológicas han reco-rrido un largo camino buscando la pre-cisión del diagnóstico de la enfermedadinfecciosa. Cientos de investigacioneshan contribuido al desarrollo y perfec-cionamiento de estos procedimientosprocurando siempre conseguir que ten-gan una gran sensibilidad y una gran es-pecificidad, cualidades muy difíciles dealcanzar. En los últimos años, se preten-de además, que los procedimientos seansimples de realizar y que el resultado seproduzca rápidamente; la medicina con-temporánea parece estar llegando a estadeseada meta.

CLASES DE PRUEBASSEROLÓGICAS

Desde el punto de vista de aquello queinvestigan, se dividen en dos grandescategorías, pruebas directas y pruebasindirectas.

PRUEBAS DIRECTAS

Son aquellas que basadas en el princi-pio de la reacción antígeno anticuerpoinvestigan la presencia del antígeno. Enel caso de la enfermedad infecciosa equi-vale a decir que investigan la presenciadel agente etiológico o, uno de sus com-ponentes.

PRUEBAS INDIRECTAS

Son aquellas que basadas en la reacciónantígeno anticuerpo, investigan no ya, elagente en sí, sino la huella que dejó ésteal pasar por su huésped en términos deuna respuesta inmune puesta en eviden-cia por el hallazgo de anticuerpos espe-cíficos contra el agente o alguno de suscomponentes y que, indirectamente per-mite suponer que el agente en cuestiónestuvo presente en el huésped en algúnmomento.

Las pruebas serológicas de acuerdo conel procedimiento que utilicen para evi-denciar la reacción antígeno anticuerpose dividen también en dos grandes gru-pos: primarias y secundarias.

PRUEBAS SECUNDARIASSon aquellas en las cuales la reacciónantígeno-anticuerpo da lugar a una ma-nifestación visible lo cual- permite unalectura visual macroscópica. Su realiza-ción usualmente es simple. Este tipo depruebas incluyen la precipitación y laaglutinación.

PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN

Las pruebas de precipitación, cuya di-námica fue estudiada por Heildelbergerhacia 1.930 (5), constituyen una de laspruebas secundarias más versátiles. Lacaracterística fundamental de ésta, es queel antígeno está siempre en dilución enuna solución tampón la cual generalmen-te es solución salina. Heildelberger (5)encontró que el fundamento visible dela reacción antígeno-anticuerpo ocurreen las reacciones de precipitación sola-mente cuando los dos componentes es-tán en proporciones óptimas y que estefenómeno puede evidenciarse claramen-te en la llamada curva de precipitación;cuando se coloca una serie de capilarescon concentraciones descendentes deanticuerpos dirigidos contra una concen-tración constante del antígeno homólo-go en dilución, se produce, luego de unperíodo de incubación, el fenómeno vi-sible y se puede determinar la presenciade tres zonas claramente diferenciables:en los tubos iniciales en donde la con-centración de anticuerpos predominasobre la concentración de antígeno nose observa ningún fenómeno visible, amedida que la dilución de los anticuerposprogresa se llega a una zona en que laconcentración de anticuerpo y antígenoes óptima produciéndose una precipita-ción franca, cuando la concentración deanticuerpos continúa disminuyendo pre-domina, entonces, la concentración deantígeno y en esta zona tampoco hay nin-gún fenómeno visible. La primera zonarecibe el nombre de prozona, la segunda

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en donde el fenómeno es visible se de-nomina zona de proporciones óptimas yla tercera zona se llama postzona. La di-námica de las reacciones de precipita-ción es siempre la misma. En el pasadola reacción de precipitación fue adapta-da como recurso diagnóstico utilizandosistemas de tubo capilar para observarel fenómeno, ejemplo de esa aplicaciónfue la determinación de la proteína Creactiva. La reacción de VDRL y sus mo-dificaciones son típicas reacciones deprecipitación (4).

Una modificación al sistema de precipi-tación en tubo consistió en colocar en-tre el suero que contenía los anticuerposy la dilución del antígeno una capa deagarosa fundida que al solidificarse for-ma un tapón que separa los dos reactivoslos cuales difunden a través de la agarosaen forma tal que al encontrarse en pro-porciones óptimas forman un anillo deprecipitación claramente visible en laagarosa, sin embargo, técnicamente estetipo de reacción era difícil y Oudin lamodificó en el sentido de fundir laagarosa mezclándole una determinadacantidad de antisuero y colocándolo enun tubo de ensayo para dejarla solidifi-car y luego colocar el antígeno en dilu-ción en la parte superior; esta modifica-ción permitió conocer que cuando elantígeno es una mezcla de compuestosantigénicos al difundirse unidireccio-nalmente en la agarosa estos se difun-den a mayor o menor velocidad segúnsu peso molecular y reaccionan con suanticuerpo homólogo formándose tantosanillos de precipitación cuantas fraccio-nes antigénicas existan lo cual puso demanifiesto que la reacción de precipita-ción era una valiosa herramienta de aná-lisis inmunológico.Un gran desarrollo de esta idea lo cons-tituyó el sistema propuesto porÓuchterlony (6), de utilizar la agarosafundida en caja de Petri, colocar losreactivos anticuerpo y antígeno en orifi-cios equidistantes en forma tal que di-fundieran en la agarosa en una doble di-fusión y la zona de proporciones ópti-

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mas apareciera en forma de un precipi-tado lineal en el espacio entre el orificioque contiene el antígeno y el orificio quecontiene el antisuero, esta reacción co-nocida como doble inmunodifusión deÓuchterlony ganó gran aceptación comoherramienta de análisis inmunoquímicoy se adaptó para diagnóstico de algunasentidades clínicas, siendo particular-men-te útil en el diagnóstico serológico de algu-nas entidades micóticas sistémicas comoHistoplasmosis, Coccidioidomicosis yParacoccidioido-micosis entre otras (7);otra de las grandes aplicaciones de lareacción de precipitación en agarosa loconstituyó la elegante reacción desarro-llada por Mancini, Carbonara yHeremans (8) para cuantificación de pro-teínas plasmáticas conocida comoinmunodifusión radial, estos autores de-mostraron que diluyendo un anticuerpohomólogo en agarosa y colocándose enun orificio hecho en la agarosa una mez-cla de antígenos en donde esté presenteaquella proteína para la cual esta presenteel anticuerpo homólogo, la difusión sehace en forma radial dando un francoanillo de precipitación alrededor del ori-ficio, con la circunstancia, de que el diá-metro de este anillo es directamente pro-porcional a la concentración de la pro-teína en estudio; el procedimiento ganórápida aceptación y es en la actualidadampliamente utilizado en todo el mun-do para la cuantificación de proteínasplasmáticas tales como albúmina, IgG,IgA, IgM, C3, C5, ceruloplasmina,inhibidor de Cl esterasa y haptoglobinas,entre otras.

Un sistema de cuantificación similar perocombinando un procedimiento electrofo-rético fue el desarrollado por Laurell (9)conocido como técnica del "Rocket" porla forma que la precipitación asume enel agar, simulando un cohete espacial.La técnica de Laurell utiliza una fina capade agarosa fundida mezclada con unantisuero que contiene anticuerpos con-tra una determinada fracción del suerohumano, esta capa de agarosa fundidase coloca en una lámina de vidrio y esta

se dispone en una cámara electrofo-rética, en la parte central se hacen orifi-cios en línea para colocar los controlesde concentración conocida de la proteí-na en estudio y en los otros los sueroshumanos en los cuales se desea cuanti-ficar la proteína, se somete a separaciónelectroforética en forma que la proteínapor su carga eléctrica relativa migra ha-cia el ánodo o, hacia el cátodo y en estamigración ira reaccionando con su anti-cuerpo homólogo dando una precipita-ción en forma de cohete, al término deltiempo de corrido se mide la distanciaentre el vértice del cohete y el centro delorificio correspondiente, esta distanciaes directamente proporcional a la con-centración de la proteína en estudio.Aunque esta técnica es sumamente exac-ta, es muy dispendiosa y requiere unacámara de electroforesis; por tales razo-nes no tuvo mucha aceptación como re-curso diagnóstico.

La combinación de electroforesis einmunodifusión en agarosa permitió aWilliams y Grabar desarrollar el sistemadenominado inmunoelectroforesis comouna herramienta muy útil para el estudiode mezclas antigénicas tal como ocurreen el suero humano. El sistema desarro-llado por Williams y Grabar (lO) consis-te en realizar un fraccionamientoelectroforético de suero humano en unacapa de agarosa colocada en unportaobjeto microscópico, colocando elsuero humano en un pequeño orificiohecho en la capa de agarosa y que puedecontener entre 5-10 microlitros de suerohumano, la placa se coloca en cámaraelectroforética de manera que un extre-mo esté en contacto con el ánodo y elotro extremo con el cátodo y se aplicauna corriente continua de 150 voltios por20 minutos, las proteínas plasmáticas seseparan electroforéticamente según sucarga eléctrica relativa de modo queaquella proteína electronegativa marchaal ánodo y aquellas menos electronega-tivas marchan al cátodo; terminando eltiempo de separación electroforética sehace una pequeña zanja frente al orifi-

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cio donde se colocó la muestra en formatal que la zanja tenga la longitud casi delporta objeto, esta zanja se llena con unantisuero antihumano, obtenido usual-mente en cabra o en conejo y se dejaincubar por 18 horas para que ocurra ladoble difusión, por cada proteína pre-sente en el suero se producirá un arcode precipitación muy definido, permi-tiendo un análisis de la mezclaantigénica; la aplicación al diagnósticoclínico de esta técnica es muy limitadareduciéndose al estudio del mielomamúltiple, y a unas pocas situacionesneurológicas en que el estudioinmunoelectroforético del LCR puedearrojar alguna luz.

Una adaptación de la inmunoelec-troforesises la llamada contra inmunoelectroforesis(ClE) o electroforesis de contracorriente;inicialmente introducida por Cullfordpara estudios médico legales, pronta-mente se vio que podría conveniente-mente aplicarse a estudio de situacionesclínicas, particularmente a la investiga-ción de infecciones de sistema nerviosocentral causadas por microorganismoscapsulados cuyo polisacárido capsularhidro soluble pueda investigarse en elLCR, constituyendo su presencia allí,prueba irrefutable de la etiología del pro-ceso infeccioso; procesos tales comomeningitis por Klebsiella pneumoniae,Haemophilus influenzae Serotipo b,Streptococcus pneumoniae, Neisseriameningitidis serotipos A y C,Cryptococcus neoformans pueden serconvenientemente diagnosticados. Bá-sicamente el procedimiento consiste encolocar una capa de agarosa fundida enun porta objeto, hacer dos orificios quepuedan contener 5-10 microlitros sepa-rados por una distancia no mayor de5mm,colocar el porta objeto contactandoun extremo al ánodo y un extremo alcátodo, colocar el LCR que se suponecontiene el polisacárido en el orificiocercano al cátodo así que al migrar elpolisacárido, que es electronegativo, 10traerá dirigiéndose hacia el ánodo, elsuero antipolisacárido se coloca en elorificio cerca al ánodo para que los

anticuerpos que son relativamente pocoelectronegativos migren hacia el cátodoy reaccionen dando una línea de precipi-tación, la prueba se realiza en un tiempode lOa 20 minutos, puede hacerse ensangre, orina o suero. Esta técnica es al-tamente específica pero poco sensible,de suerte que si la prueba es positiva tie-ne un valor diagnóstico incuestionable,pero si es negativa no excluye el diag-nóstico, debiéndose utilizar otro proce-dimiento; las técnicas de precipitaciónpueden ser leídas muy rápido y con unalto grado de precisión por procedimien-tos de turbidimetria utilizando unnefelómetro, existen casas comercialesque producen reactivos de óptima cali-dad para la cuantificación de proteínasplasmáticas, apolipoproteínas, polisacá-ridos, etc.; pero el costo de tales reactivosy la necesidad de un Nefelómetro sonlimitan tes frente a los otros procedimien-tos descritos.

PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN

La reacción de aglutinación fue desarro-llada hacia finales del siglo pasado porDurham en esta reacción el antígenosiempre esta en suspensión (11), pues setrata de partículas; para que la reacciónde aglutinación ocurra se requiere los si-guientes componentes:

1- Antígeno en suspensión2- Sistema buffer3- Dilución de anticuerpos

La reacción puede utilizarse como prue-ba directa o indirecta El mecanismo deesta reacción es simple: si en un sistemabuffer, usualmente solución salina buffer,se coloca una apropiada dilución de unsuero que contenga anticuerpos especí-ficos contra determinados gruposantigénicos del antígeno en suspensión,las moléculas de anticuerpos reaccionancon los grupos antigénicos de las partí-culas del antígeno y actúan como puenteproduciendo grumos fácilmente visibles.Las técnicas directas de aglutinación sonampliamente utilizadas en Bacteriologíapara la identificación serológica de los

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microorganismos género y especie. uti-lizan sueros monoespecíficos produci-dos comercialmente. Las pruebas dehemoclasificación son típicas pruebas deaglutinación directa.

Las técnicas indirectas de aglutinaciónfueron introducidas como herramientasdiagnósticas para investigar la presenciade anticuerpos dirigidos contra un de-terminado agente, el hallazgo de talesanticuerpos, visualizado por una reac-ción de aglutinación, frente a una sus-pensión pura del microorganismo sospe-choso de ser el agente causal del cuadroclínico en estudio, confirma indirecta-mente que ese microorganismo estuvopresente en el huésped y estimuló unarespuesta inmune en términos deanticuerpos circulantes; las técnicas in-directas de aglutinación han sido amplia-mente utilizadas como recurso diagnós-tico en entidades como las fiebresentéricas: fiebre tifoidea y fiebreparatifoidea, tifus y brucelosis ; grupode reacciones de aglutinación que seconocen como prueba de los "AntígenosFebriles" (12-13) ; este tipo de reaccio-nes, adecuadamente estandarizadas, concontroles apropiados son de utilidad clí-nica, permiten hacer una cuantificacióncon base en la aglutinación presente enun suero diluido progresivamente, el in-verso de la dilución que presente francaaglutinación se llama "Titulo de agluti-nación"; para cada antígeno investigadohay un título de referencia por encimadel cual un resultado empieza a tener sig-nificación clínica; como todas las prue-bas de laboratorio estas aglutinacionestienen su utilidad y sus limitaciones lascuales deben ser conocidas por quien lasusan como recurso diagnóstico.

MODALIDADES DEAGLUTINACIÓN

Las técnicas de aglutinación son muyversátiles y se han podido modificar parapermitir la investigación de anticuerposcontra grupos antigénicos que puedenser solubles y por tanto no darían unamanifestación visible de aglutinación ;

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sin embargo, muchas de estas sustanciasson componentes de los microorga-nismos que pueden adherirse por mani-pulación química sobre partículas iner-tes, el reactivo así obtenido se suspendeen un sistema buffer el cual se puedehacer reaccionar con un suero que con-tenga anticuerpos contra los grupos ad-heridos a la partícula inerte sirviendo depuente entre las partículas y presentan-do el fenómeno visible de la aglutinación.Dos tipos de partículas han sido amplia-mente utilizadas, los glóbulos rojos hu-manos o de algunas especies animales ypartículas de látex de un diámetro muyregular 0.85 micras, a estas partículas se lespuede adherir proteínas, polisacáridos, áci-dos nucleicos y hormonas, produciendovariados tipos de antígeno con fines diag-nóstico, como la partícula cumple unpapel de portador pasivo de los gruposantigénicos el tipo de aglutinación, sellama aglutinación pasiva, si la partículausada es un glóbulo rojo la reacción re-cibe el nombre de hemoaglutinación pa-siva, si la partícula es látex la reacciónrecibe el nombre de aglutinación de lá-tex. Por la facilidad de su realización yla interpretación éstas pruebas juegan undestacado papel como recurso diagnos-tico, no solo de enfermedades infeccio-sas, sino en otras condiciones; ejemplode estas técnicas son la investigación defactor reumatoideo, la cuantificación deanticuerpos antitiroglobulina, antimicro-somales, entre otros. Las pruebas deaglutinación han sido modificadas parala investigación directa de antígenosbacterianos, micóticos, parasitarios y aúnvirales, cuyo hallazgo en un paciente tie-ne el mismo valor del aislamiento delagente etiológico, en este caso, la partí-cula inerte glóbulo rojo o partícula delátex se recubre con un anticuerpomonoespecífico que se adhiere por sufracción Fe sobre la superficie de la par-tícula dejando libres los grupos de com-binación específica del anticuerpo enforma tal, que el antígeno investigadosirve de puente y el fenómeno visible esuna aglutinación, este tipo de aglutina-ción recibe el nombre de aglutinaciónpasiva reversa.

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Pruebas tales Como investigación deantígenos de hepatitis B, proteína Creactiva, polisacáridos bacterianos ymicóticos en LCR, pruebas de embara-zo, investigación de Streptococcuspyogenes, tipificación de grupos del gé-nero Streptococcus utilizan este tipo dereacciones. Son herramientas sencillas,rápidas, y en su mayoría de una alta es-pecificidad.

COAGLUTINACIÓN

La coaglutinación es una modalidad dela aglutinación pasiva reserva en la cualla partícula indicadora utilizada es unacepa de Staphylococcus aureus, particu-larmente la cepa Cowan (14). Esta cepatiene dentro de los componentes de supared bacteriana una proteína denomi-nada proteína A, la cual tiene la propie-dad biológica de unirse químicamente ala fracción Fe de la molécula de IgG hu-mana y de conejo de forma que elStaphylococcus queda convertido en unapartícula recubierta de moléculas espe-cíficas de anticuerpos contra aquellosantígenos bacterianos, parasitarios omicóticos que se desean investigar. Elreactivo así obtenido es un reactivo degran especificidad, muy estable y muyeconómico, que puede ser utilizado co-mercialmente para diagnóstico.

PRUEBAS PRIMARIAS

Son aquellas en las cuales la reacciónantígeno anticuerpo no da lugar a nin-guna manifestación visible, requirién-dose, para evidenciar que la reacción haocurrido, procedimientos técnicos com-plejos y en ocasiones equipossofisticados y costosos. Las pruebas pri-marias pueden ser directas o indirectasy de gran sensibilidad y especificidad,que las acercan al ideal de una pruebadiagnóstica. Dentro de esta categoría te-nemos:

1- Fijación de complemento2- Inmunofluorescencia3- Radioinmunoensayo4- Pruebas Inmunoenzimáticas5- Inmunoelectrotransferencia6- Inmunocromatografía

'.FUACIÓN DE COMPLEMENTO

Esta técnica fue desarrollanda por Bordet(2) a principios de siglo y tiene comofundamento la utilización de una canti-dad precisa de complemento sérico,usualmente obtenido del curí, el cual seutiliza de manera total en presencia dela reacción de un antígeno con su anti-cuerpo homólogo. Bordet decidió intro-ducir en la reacción una segunda faseutilizando un sistema indicador que per-mitiera determinar que el complementohabía sido utilizado en la primera fasede la reacción indicando que evidente-mente en la primera fase un anticuerpohabía reaccionado con el antígeno, lasegunda fase o sistema indicador queBordet utilizó fue una suspensión de gló-bulos rojos de carnero sensibilizados conun anticuerpo anti - glóbulo rojo de car-nero los cuales con el complemento pro-ducen la hemólisis del glóbulo rojo dan-do un fenómeno claramente visible, enesta forma, si en la primera fase de lareacción el complemento presente se uti-liza, en la segunda fase no hay comple-mento y el fenómeno hemolítico no ocu-rre; a su tumo, si en la primera fase elcomplemento no se utiliza porque no hayreacción antígeno anticuerpo el comple-mento queda libre y se utiliza en la se-gunda fase dando un fenómeno visiblede hemólisis. Esta reacción por su ex-quisita sensibilidad y especificidad fuerápidamente incorporada como recursodiagnóstico por August VonWassermann (1), para el diagnóstico dela sífilis. De entonces a nuestros días latécnica ha sido perfectamente valoraday estandarizada como prueba cuantitati-va en el diagnóstico de la infección viral,parasitaria, bacteriana y micótica. Es unatécnica dispendiosa, requiere una perfec-ta evaluación de los reactivos utilizadosy este hecho hace que quede confinadaa los laboratorios de referencia para es-tudios muy específicos. A nivel de en-fermedades infecciosas es muy útil en eldiagnóstico serológico de la enfermedadde Chagas (Reacción de Guerrero Ma-chado), en el diagnóstico de micosissistémicas, como la histoplasmosis,

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coccidioidomicosisy paracoccidioi-domicosis, entidades en las cuales per-mite hacer un diagnóstico, controlar eltratamiento y establecer un pronóstico.

INMUNOFLUORESCENCIA

El desarrollo de la técnica deinmunofluorescencia se debe a AlbertCoons de la Universidad de Harvard (15).La posibilidad de marcar un anticuerpo conuna sustancia química para poder seguirel curso de este anticuerpo y así podertambién poner de manifiesto un antígenofue un deseo largamente acariciado porlos investigadores; varios intentos se hi-cieron con distintos compuestos y colo-rantes ; en 1940 Coons utilizó un com-puesto fluorescente, la fluoresceína,compuesto que podía conjugarse quími-camente con los grupos NH2 de las mo-léculas de anticuerpo sin afectar la espe-cificidad del anticuerpo; este compues-to podía ser excitado por la luzultravioleta presentando el fenómeno dela fluorescencia, es decir que al ser exci-tado por la luz ultravioleta, estas radia-ciones de onda muy corta activan loselectrones del compuesto fluorescente,emitiendo una radiación de onda máslarga dentro del espectro visible, en estaforma un anticuerpo marcado al fijarseespecíficamente al antígeno, por ejem-plo una bacteria, se verá fluorescente.Desde su inicio se vislumbró la gran po-sibilidad de este procedimiento comoherramienta en investigación y en diag-nóstico, posteriormente, se encontró queun isómero de la fluoresceína, elIsotiocianato (16), era superior comomarcador fluorescente, desde entonceseste fluorocromo se viene utilizando paramarcar los anticuerpos.

Las técnicas de inmunofluorescenciapueden aplicarse como técnicas directaspara investigar la presencia de antígenosvirales, parasitarios, bacterianos omicóticos en muestras clínicas; tiene unaamplia aplicación clínica en diagnósti-co de Rabia, infección por Cytomega-lovirus, Herpes simplex 1 y 2, EpsteinBar y virus Sincicial Respiratorio, entre

otros. Las técnicas de inmunofluo-rescencia también se utilizan en su mo-dalidad indirecta, es decir, para investi-gar la presencia de anticuerpos contra de-terminado antígeno, esta técnica, de granversatilidad y aplicación al diagnósticopresupone contar con un anticuerpo mar-cado con fluoresceína, anticuerpo diri-gido contra la inmunoglobulina huma-na, este anticuerpo marcado recibe elnombre de conjudago y puede unirse ala inmunoglobulina humana indepen-dientemente de la especificidad de esta.Las técnicas de inmunofluorescencia in-directa requieren que para su ejecuciónse cuente con el sustrato, cuyosanticuerpos específicos se desean inves-tigar en un suero problema; esta técnicatiene una gran aplicación en diagnósti-co, las técnicas más usadas son la investi-gación de anticuerpos antinucleares,anticuerpos anti-Toxoplasma, anticuerposanti- Treponema pallidum, anticuerposanti- VIH; estas técnicas correctamenteestandarizadas constituyen valiosas herra-mientas de diagnóstico. Infortunadamentelos reactivos son costosos y se requiere unmicroscopio de fluorescencia que es unequipo muy costoso por la combinaciónde filtros necesarios y por la fuente deluz que es una lámpara de vapores demercurio (17). A pesar de estas limitacio-nes las pruebas de inmunofluorescencia tie-nen un lugar importante como pruebadiagnóstica.

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)

Un avance muy grande en las pruebasprimarias lo constituyó el desarrollo delRadioinmunoensayo hecho hacia 1958por Yalow y Berson (19), desarrollo porel cual se le otorgó el premio Nobel deMedicina; básicamente este procedi-miento basado en la exquisita especifi-cidad de la reacción antígeno-anticuer-po introdujo para rastrear la reacción unasustancia radioactiva que pudiera con-venientemente combinarse químicamen-te con la molécula de anticuerpo en for-ma tal que este pudiera ser fácilmenterastreado por la radiación emitida por elmarcador radioactivo utilizado. La sus-

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tancia radiactiva que mostró mayor fa-cilidad para marcar los anticuerpos fueun isótopo de Iodo, inicialmente, Iodo131 y posteriormente Iodo 125. La téc-nica fue introducida básicamente comouna técnica directa para la cuantificaciónparticularmente de hormonas ya que suespecificidad y sensibilidad permitíacuantificar éstos compuestos en concen-traciones tan bajas del orden de lospicogramos: la endocrinología ganó coneste desarrollo una poderosa arma dediagnóstico. posteriormente se desarro-llaron técnicas de radioinmunoensayopara investigación de marcadorestumorales tales como alfafetoproteína,antígeno carcinoembriónico, antígenoprostático específico. La aplicación delRadioinmunoensayo en el diagnóstico dela enfermedad infecciosa fue realmentemuy pobre, limitándose a la investiga-ción de anticuerpos contra el virus de laHepatitis y VIH entre otros.

La necesidad de utilizar isótopos radio-activos constituyó siempre una granlimitante toda vez que se trataba dereactivos muy costosos con una vidamedia muy corta y además la lectura re-quería necesariamente un contador deradiaciones gamma. El advenimiento delas técnicas Inmunoenzimáticas fue gra-dualmente limitando su radio de acción,quedando en la actualidad reducido alcampo de la investigación y apenas sí,algunas pruebas de diagnóstico.

PRUEBASINMUNOENZIMÁ TICAS

Las pruebas inmunoenzimáticas fuerondesarrolladas hacia 1975 por Engvall yPerlmann (19), quienes decidieron mar-car los anticuerpos con una enzima, deforma tal, que al usar el sustrato especí-fico de la enzima se pudiera determinarla presencia del anticuerpo; varios tiposde enzimas fueron utilizados siendo lasmás usadas, ureas a, fosfatasa alcalina yperoxidasa. La prueba inicialmente co-nocida por la sigla ELISA por EnzymeLinked Inmunosorbent Assay y ahorasimplemente como EIA (Enzyme

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Irnmune Assay), mostró la posibilidad deser utilizada como técnica directa parainvestigar la presencia de antígenos par-ticulares o como prueba indirecta parainvestigar anticuerpos específicos. Muyprecozmente se vio que ésta era una téc-nica ideal por la posibilidad de utilizarreactivos de gran estabilidad y vida útillarga, además de estandarizar los siste-mas en microprocedimientos de fácil lec-tura visual o fotocolorimétrica, con equi-pos sencillos. En la historia del desarro-llo de las pruebas serológicas ningunaha producido tan gran impacto comoestas pruebas inmunoenzimáticas, ellasintrodujeron una revolución en los re-cursos diagnósticos tanto de la enferme-dad infecciosa como de las enfermeda-des autoinmunes, endocrinas y en la in-vestigación de marcadores tumorales.Fueron rápidamente estandarizadascomo procedimientos directos cualita-tivos y cuantitativos y como procedi-mientos indirectos cualitativos y cuanti-tativos.

En el campo de las enfermedades infeccio-sas uno de los grandes impactos ha sido eldiagnóstico de la enfermedad viral; hastasu aparición, eran bien limitados los recur-sos que el clínico tenía para comprobar eldiagnóstico, a partir del desarrollo de lastécnicas inrnunoenzimáticas el panoramacambió radicalmente permitiendo la in-vestigación directa de agentesetiológicos tales como, rotavirus,adenovirus, virus sincicial respiratorio,componentes antigénicos de virus dehepatitis B. Las técnicas indirectas abrie-ron toda una serie de posibilidades paradiagnóstico de infecciones tales comosarampión, rubeola, varicelazoster infec-ción por Epstein Bar, cutomegalovirus,herpes 1 y 2 Y VIHl y 2; el hecho depoder investigar la respuesta inmune entérminos de IgG e IgM convirtió estatécnica en una poderosa herramientapara definir la situación de infecciónaguda o infección pasada, definición de lamayor trascendencia en situaciones comorubeola y embarazo y toxoplasmosis y em-barazo. En el campo de la enfermedad pa-rasitaria las pruebas inmunoenzimáticas

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han tenido también un gran impacto enel diagnóstico de entidades tales comotoxoplasmosis, enfermedad de Chagas,leishmaniasis, amebiasis, giardiasis,neurocisticercosis, toxocara canis.

Como prueba de tan amplia aplicaciónclínica y tan universalmente empleadascientos de casas comerciales se han lan-zado a la producción de los reactivos enestuches que contienen todo lo necesa-rio para realizar las pruebas con un es-tricto control de calidad interno asegu-rando un grado de confiabilidad alto.Las técnicas inmunoenzimáticas hansido adaptadas en múltiples procedi-mientos tales como técnicas de captura,técnicas competitivas y técnicas indirec-tas; cada casa comercial tiene sus proto-colos que deben seguirse en forma rigu-rosa.

En el campo de las enfermedades infec-ciosas los procedimientos más comunesson la técnica de captura para la investi-gación de antígeno y la técnica indirec-ta para investigación de anticuerpos.

Técnicas de Captura: Son utilizadaspara la investigación de un agenteetiológico por ejemplo, si se desea sabersi un paciente tiene circulante el AgsHB(antígeno de superficie del virus de laHepatitis B) el sistema trae entonces, unaplaca de poliestireno con una serie depozos, cada pozo es en realidad un pe-queño tubo de ensayo, en cada pozo seha colocado un anticuerpo monoclonalespecífico contra el AgsHB, este anti-cuerpo se adhiere muy intensamente porsu fracción Fe al poliestireno dejandolibre los grupos de combinación del an-ticuerpo, el suero del paciente quepresuntivamente contiene el AgsHB secoloca, adecuadamente diluido en elpozo, y se incuba por un tiempo deter-minado, para permitir que el anticuerpo"capture" el AgsHB, si realmente estápresente; luego de lavar intensamentetodo los componentes sérico s son remo-vidos, se coloca entonces un segundoanticuerpo producido en otra especieanimal el cual viene marcado con la en-

zima, es el llamado conjugado, este an-ticuerpo es específico contra AgsHB, portanto se unirá a las partículas capturadasen la primera reacción, luego de un pe-ríodo de incubación apropiado se lavanlos pozos para remover todo aquello queno haya reaccionado; en el pozo no per-manecerá más que el primer anticuerpo,el AgsHB capturado y el conjugado ad-herido al AgsHB ; para poder saber queello es así, es la enzima que está mar-cando el conjugado quien revelará esehecho, para ello, será necesario colocarel substrato correspondiente, si supone-mos que la enzima marcadora esperoxidasa el substrato es agua oxige-nada, la cual al ser interactuada por lapero xidas a producirá una reacción so-bre un compuesto que se adiciona a lareacción dando un color cuya intensidadse mide en un fotocolorimetro para ob-tener una lectura de la densidad óptica.Las lecturas de los controles positivos ynegativos y los sueros problemas permi-tirán establecer un índice de lectura paraestablecer la positividad o negatividadde la reacción.

Técnicas indirectas: Estas investiganla presencia de anticuerpos IgG, IgM oIg A para un determinado antígeno seaeste un virus, parásito, bacteria u hon-go; para ello, los sistemas traen las pla-cas de poliestireno sensibilizadas con losantígenos respectivos. Por ejemplo, sideseamos investigar anticuerpos contrael virus de la inrnunodeficiencia huma-na (VIH), para establecer un diagnósti-co de infección por VIH, el sistema co-mercial trae la placa de poliestireno encada uno de cuyos pozos tiene adheri-dos los componentes antigénicos delVIH; en los pozos respectivos se colo-can los controles y los sueros en estudioy después de la incubación apropiada,se lavan intensamente. Si el suero enestudio contiene anticuerpos anti -VIHestos se fijan específica e intensamentesobre el antígeno, luego se coloca el con-jugado que es un anticuerpo antigama-globulina humana obtenido usualmenteen cabra y además marcado con unaenzima, este anticuerpo se une

LASPRUEBASSERÓLOGICAS

específicamente con la Inmunoglo-bulina humana fija a su vez sobre elantígeno, luego de los lavados, se agre-ga el sustrato y se revela el color por lareacción de la enzima sobre el sustrato.La reacción se lee fotocolorimé-tricamente para determinar la densidadóptica y establecer los índices que de-terminarán la positividad o negatividadde la reacción.

Las distintas casas comerciales han de-sarrollado sistemas muy variados desdeequipos de lectura manuales, semi auto-matizados y automatizados simples, has-ta equipos de la más alta sofisticación.En materia de procedimientos inmuno-enzimáticos se podría decir que hay paratodos los gustos (20). Estas pruebas tam-bién han sido adaptadas en sistemas rá-pidos para investigación de Strepto-coccus pyogenes, AgsIHB, Anticuerposanti- VIH y pruebas de embarazo, entreotras.

INMUNOELECfROTRASFERENCIA

En 1980 Southem (21), desarrolló unprocedimiento para estudio de DNA,para lo cual después de someter ahidrólisis selectiva el DNA procedía asometer la muestra a una electroforesisen gel de poliacrilarnida para separar lafracción de acuerdo a y peso molecular;como los geles de acrilarnida son muyfrágiles y difíciles de manipular consi-deró posible transferir a un papel de ni-trocelulosa todas aquellas bandas sepa-radas en el gel de poliacrilamida y ha-cerlo mediante una electroforesis en lacual el gel colocado cerca al cátodo y elpapel de nitrocelulosa cerca al ánodo alrecibir la corriente continua permitía quecada banda que está presente en el gelfuera transferida al papel, ocupando lamisma posición, a la manera de lo queen fotografía un negativo se transfiere aun positivo; en esta forma el papel denitrocelulosa podía cortarse en peque-ñas tiras, cada una de las cuales conte-nía exactamente el mismo patrón de dis-tribución de bandas del gel original. Esteprocedimiento fue considerado como

una poderosa herramienta de análisis conuna gran potencialidad en su ampliación aldiagnóstico en el campo de infectología. Laprimera aplicación masiva de esta técnicase introdujo para demostrar anticuerposcontra el virus de la inmunodeficiencia hu-mana VIH, siguiendo exactamente el desa-rrollo de Southem, el virus era sometidoa una digestión enzimática, sus compo-nentes separados electroforéticamenteen un gel de poliacrilarnida, transferidosa un papel de nitrocelulosa y cortado enpequeñas tiras, cada tira al ponerse a re-accionar con el suero de personas su-puestamente infectadas con el VIH cuyosuero contiene anticuerpos específicoscontra cada una de los componentes delvirus, reacciona específicamente, al la-varse las tiras, todos aquellos componen-tes séricos que no hayan reaccionado selavan, quedando solo los anticuerposespecíficos; para saber que ellos están allífijados se utiliza un anticuerpo antigama-globulina humana marcada por una enzi-ma, usualmente peroxidasa, luego de lareacción se coloca el substrato respecti-vo desarrollándose una banda nítida decolor por cada fracción del virus, para lacual el suero en estudio tenga anticuerpos.Usualmente los componentes visualizadosson Glucoproteína 160- 120- 41 Y proteí-na 66 - 55 - 31 - 24 - 17.

El CDC (Centro para el Control de en-fermedades de USA) considera comocriterio para confirmar un diagnóstico deinfección por VIH la presencia de lasbandas 160/120 o 41/24 Esta técnica porsu alta especificidad y sensibilidad seconvirtió en la prueba de referenciaconfirmatoria de diagnóstico de infecciónpor VIH y recibió el nombre de"Westemblot" por similitud a la técnica deSouthem, conocido como "Southemblot"y no porque tuviera algo que ver con lospuntos cardinales (22). También hay téc-nicas "Eastemblot" y "Northemblot" Ensíntesis el Westemblot es una pruebainmuno-enzimática sobre papel y de tipoindirecto. Técnicas similares se han de-sarrollado para el diagnóstico indirectode otras infecciones virales, tales comolas paraparesia espástica tropical causa-

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da por virus HTLV-1, bacterianas, comofiebre tifoidea, parasitarias comoneurocisticercosis y micóticas como laparacoccidioidomicosis. Una de sus limi-taciones es el alto costo de los reactivos co-merciales.

~UNOCROMATOGRAFM

En los últimos años se han desarrolladouna serie de pruebas serológicas rápidasque combinan el principio de la separa-ción cromatográfica con la reacción es-pecífica antígeno-anticuerpo, permitien-do visualizar la reacción mediante la uti-lización de un marcador de oro coloidal(23).Estas reacciones se han estandarizado comopruebas directas o indirectas y en algunasocasiones como pruebas semicuantitativas.Las reacciones inmunocromatográficas hansido comercializadas en sistemasminiaturizados para ser utilizadas inclu-sive a nivel de consultorio médico, lalectura es visual macroscópica constitu-yendo ayudas diagnósticas simples.La prueba ha sido ensamblada en unaplaca plástica del tamaño de unportaobjeto, en su interior la placa tienehacia un extremo una pequeña almoha-dilla y hacia el otro extremo una peque-ña tira de papel de celulosa que hacecontacto directo con la almohadilla; almirar la placa por su cara superior seobserva tres ventanas; la primera se abredirectamente sobre la almohadilla absor-bente y es el sitio en donde se coloca lamuestra clínica, la segunda se abre sobreuna zona de la membrana cromatográficay es el sitio donde se lee el resultado positi-vo o negativo de la prueba y la tercerase abre sobre una zona de la membranacromatográfica en donde se lee el con-trol interno de la reacción. Debido alhecho que los reactivos colocados en lazona de lectura de la prueba y en la zonade lectura del control interno han sidocolocados en forma linear, la reacciónse evidencia en una y otra ventana comouna banda intensamente rosada.

Estas técnicas se han estandarizado parainvestigación de la hormona gonado-

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GUZMÁN M Y COL

tropina coriónica humana como pruebade embarazo con una sensibilidad de 20mUI/ml, para investigación de antígenoprostático específico con una sensibili-dad de 5 ng/ml, para la investigación deAgsHB (Antígeno de superficie del Vi-rus de Hepatitis B), para la investigaciónde la hormona Luteinizante LH comoprueba de ovulación, como prueba paraidentificación de Streptococcus pyogenesen nuestras clínicas o en cultivos y comopruebas para drogas de abuso como co-caína, morfina, heroína, marihuana yanfetamina.Hay varios tipos de pruebas inmunocro-matográficas entre las cuales tenemos:

1- Prueba de Captura2- Prueba de Bloqueo3- Prueba indirecta

Prueba de Captura: En pruebas de tipodirecto la disposición de los reactivos esla siguiente: en la almohadilla viene ab-sorbido un anticuerpo monoclonal diri-gido contra el antígeno que se desea in-vestigar este anticuerpo además vienemarcando con oro coloidal (23); en lazona de la prueba, sobre la membranacromatográfica, ésta colocado en formalineal un anticuerpo policlonal contra elantígeno que se desea investigar y en lazona del control interno, sobre la mem-brana cromatográfica, esta colocado enforma lineal un anticuerpo obtenido enconejo dirigido contra el anticuerpomonoclonal.

Si suponemos que se desea investigar enun paciente el AgsHB, se toma la sangredel paciente, se obtiene el suero, con dis-pensador se colocan 4 a 5 gotas del sue-ro y 4 a 5 gotas de un diluente (Buffer)provisto dentro del estuche de reactivo;estos sueros y diluente, se colocan en laventana de la muestra, rápidamente ellosson absorbidos y aIJí encuentran el anti-cuerpo monoclonal anti-AgsHB, marca-do con oro coloidal, si realmente hayAgsHB este se une a los grupos de com-binación específico del anticuerpomonoclonal y continúan migrando haciala membrana cromatográfica en la zona

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de prueba encuentran fijados un anti-cuerpo policlonal contra AgsHB, el cualcaptura el AgsHB que tiene pegado alconjugado (anticuerpo monoclonal, mar-cado con oro coloidal) dando una líneaaparente rosada, el conjugado que noreacciona continúa migrando hacia lazona del control interno, en donde en-cuentra un anticuerpo, policlonal dirigi-do contra el anticuerpo monoclonal mar-cado dando una banda rosada indican-do que el sistema funcionó bien, la reac-ción en este ejemplo es positiva: tendre-mos banda en la zona de la prueba y ban-da en la zona de control. En caso de quela prueba sea negativa, el conjugadomigra sin ser capturado en la banda deprueba y será atrapado en la banda decontrol, esta debe aparecer siempre, encaso de no aparecer indica que el siste-ma no funcionó porque el reactivo estaalterado y deberá hacerse una nuevaprueba.

Prueba de Bloqueo: Es la más utilizadapara la investigación de drogas de abuso.En esta prueba, en la almohadilla se en-cuentra un anticuerpo monoclonal dirigi-do contra la droga que se investiga y quetiene ya copados los sitios de combinacióncon dicha droga; además, está marcado conoro coloidal; al colocarse la muestra clíni-ca en la ventana para la muestra si la drogaestá presente pasa muy rápidamente a lamembrana cromatográfica y llega a la zonade la prueba en donde la membranacromatográfica tiene fijos una banda deanticuerpos monoclonales contra la drogaen cuestión, copando todos los grupos es-pecíficos de combinación, el conjugadoque es una molécula más pesada migramás lentamente, llega a la zona de laprueba y encuentra que todos los gruposde combinación específica del anticuer-po allí fijado están copados por la drogacapturada de la muestra clínica y pasaderecho continuando hacia la zona decontrol en donde la membranacromatográfica tiene una banda deanticuerpos policlonales antigamaglo-bulina monoclonal conjugada reaccio-nando con ella dando una banda inten-samente rosada indicando que el siste-

ma funcionó bien. La prueba se llamade bloqueo porque la droga presente enla muestra clínica bloquea la reaccióncon la droga ligada al conjugado. La re-acción positiva no dará, entonces, nin-guna banda en la zona de la prueba, sólodará una banda en la ventana de control.En el caso contrario, cuando en la mues-tra no hay la droga que se investiga, elconjugado es atrapado por losanticuerpos libres en la zona de la prue-ba dando una banda rosada de reacciónlas moléculas no captadas continúanmigrando siendo captadas en la zona decontrol dando una banda nítida de reac-ción, en este caso la presencia de bandaen la ventana de la prueba y la presenciade banda en la ventana de control indi-can que la prueba es negativa.

Prueba indirecta: Las pruebasinmunocromatográficas han sido tam-bién adaptadas para la investigación deanticuerpos específicos contra determi-nados antígenos microbianos y así po-der establecer un diagnóstico indirecto,pruebas para VIH, Trypanosoma cruzi,Dengue y Brucella, han sido yaestandarizadas y comercializadas. Eneste tipo de pruebas indirectas se tieneen la almohadilla un suero monoclonalespecífico contra la IgG humana ademásconjugado con oro coloidal; en la zonade la prueba están fijos sobre la mem-brana cromatográfica grupos antigénicosdel microorganismo cuyos anticuerposespecíficos se desean investigar, en lazona de control se encuentra una bandade un anticuerpo policlonal dirigido con-tra el anticuerpo monoclonal conjugado.Pongamos por ejemplo que deseamos in-vestigar si el suero de un paciente tieneanticuerpos contra el VIH, entonces, setoma la muestra de sangre, se obtiene elsuero, 4 a 5 gotas de este se colocan enla ventana de la muestra y luego se colo-ca una cantidad similar de buffer; en laalmohadilla el anticuerpo monoclonalconjugado antigamaglobulina humanacaptura una apreciable cantidad de mo-léculas de la IgG contenida en el suero,este gran complejo migra a la membra-na cromatográfica y llegará a la zona

LASPRUEBASSERÓLOGICAS

donde se encuentra el antígeno y allí losanticuerpos específicos dirigidos contrael VIH, si los hay, y que vienen captadasen el conjugado reaccionarán dando unabanda de reacción intensamente colorea-da, el exceso de conjugando continúamigrando hacia la zona de control endonde el suero policlonal anticonjugadoestá fijo, reaccionando con el conjugan-do para dar una banda intensamente co-loreada indicando que la prueba funcio-nó bien y el reactivo esta bien.

En consecuencia si la prueba es positivatendremos 2 bandas, una en la ventanade la prueba y otra en la ventana del con-trol, si la prueba es negativa tendremosuna banda única en la ventana de con-trol, si la prueba es inválida la banda enla ventana de control no aparece.

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CALIDAD DE LOS SUEROS

Los sueros que deban ser sometidos aestudios serológicos deben ser obteni-dos a partir de una muestra de sangretomada con todas las normas de asep-sia y antisepsia en pacientes preferi-blemente en ayunas. Unicamente lossueros límpidos, transparentes y nohemolizados, deben ser utilizados parala realización de las pruebasserológicas. Para conservar los sueroslo ideal es repartir las muestras enalícuotas de 0.5 mi, identificar correc-tamente y congelar a 20QC, dejandouna alícuota a 42C para realizar laspruebas. Nunca se debe congelar ydescongelar y volver a congelar por-que ese procedimiento altera lareactividad de los sueros.

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CONCLUSIÓN

Las pruebas serológicas han tenido ungran desarrollo en las últimas décadas,constituyen poderosas herramientas dediagnóstico; en el campo de lainfectología son insustituibles. Sedebe, sin embargo, tener en cuenta quecomo todo procedimiento de laborato-rio tienen una utilidad y una limitación,pueden dar resultados falsos positivoso negativos y por tanto los resultadosdeben ser valorados dentro del con-texto de una correlación clínica.

Como la mayoría de los procedimientosserológicos están disponibles comercial-mente, los protocolos de la realizaciónde las pruebas deben ceñirse estricta-mente a lo indicado por el productor.

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