LAS BARRERAS A LAS INVESTIGACIONES PRECLÍNICAS DE LA INMUNIDAD CONTA EL DENGUE Y LA PATOGÉNESIS DEL DENGUE

El dengue se ha convertido en un importante problema de salud pública mundial en las últimas cuatro décadas. Estrechamente ligado al crecimiento de la población humana sin precedentes, la urbanización, la globalización y la falta de control de vectores eficaces, tanto los virus causantes y los mosquitos vectores que transmiten los han extendido a nivel mundial en los trópicos, lo que resulta en un aumento de la frecuencia y la magnitud de las epidemias y la aparición de la forma grave de la enfermedad, el dengue hemorrágico (DHF). En 2013, unos 3,6 millones de personas, más de la mitad de la población mundial, viven en zonas que están en riesgo de infección por el virus del dengue (DENV). No existen vacunas ni tratamientos antivirales específicos disponibles para esta enfermedad.

La investigación que ha definido a nuestra comprensión de la patogénesis y la inmunología de la infección por DENV se puede segregar predominantemente en tres tipos de estudios: los que examinan a los pacientes con dengue, para describir la presentación clínica; en estudios in vitro para definir el ciclo de vida viral o investigar las interacciones directas entre DENV y células cultivadas; y de hipótesis impulsando experimentos con animales controlados para analizar los mecanismos que subyacen DENV a patologías inducidos. Los primeros estudios claves que dilucidaron el curso de la infección, la incidencia de complicaciones patológicas y los síntomas característicos se llevaron a cabo en sujetos humanos infectados experimentalmente.

Hoy en día, existen limitaciones en la experimentación humana debido a las preocupaciones éticas y regulatorias, y debido a los gastos de la realización de los grandes estudios en poblaciones genéticamente diversas. Además, los estudios en humanos utilizando poblaciones de pacientes (en oposición a las infecciones experimentales) puede mostrar una correlación, pero no muestran la relación causal inequívoca, ya que estos estudios carecen de la capacidad para medir las respuestas de los pacientes en comparación con los controles exactos. Para dengue, variables adicionales podrían incluir factores no identificados que pueden influir en la susceptibilidad del hospedero a la enfermedad, además de influir en el curso de la enfermedad. Aunque los modelos animales han complementado nuestro conocimiento, lamentablemente un único modelo animal no ha sido capaz de reproducir fielmente todos los aspectos de la infección por DENV humano.

En este artículo de opinión, destacamos los aspectos clave de la inmunidad contra el dengue y patogénesis molecular del DENV que han sido particularmente difíciles de entender y el uso de las metodologías experimentales actuales. También discutimos la paradoja de que los avances más importantes en el campo podría ser posible sólo a través de la experimentación con animales controlados, que tiene limitaciones inherentes porque los modelos animales no reproducen con precisión la enfermedad humana. Proponemos que esta contradicción puede conciliarse con la elección de modelos animales adecuados para responder a las preguntas experimentales específicas y con una interpretación cautelosa de los resultados, teniendo en cuenta la complejidad multifacética de las interacciones entre DENV y el hospedero humano.

Infección por el virus del dengue en humanos

DENV es un miembro de la familia Flaviviridae (TABLA 1), que contiene varios otros patógenos humanos notables. Existen cuatro serotipos DENV antigénicamente distintos (DENV1-DENV4), que tienen una distribución en todas las regiones tropicales del mundo, similar a la de su mosquito vector directo, Aedes aegypti. La respuesta del hospedero a la infección fisiopatológico clave del DENV se manifiesta en forma con el aumento de la permeabilidad vascular, la pérdida de plasma, sangrado microvascular y la reducción de funcionamiento de la cascada de coagulación. Las estimaciones actuales indican que entre el 1% y el 70% de los individuos que experimentan infección por el DENV pueden tener manifestaciones hemorrágicas leves, como petequias, púrpura, equimosis y epistaxis (hemorragia nasal) (fig. 1). Dengue grave, conocida como dengue hemorrágico DHF y síndrome de shock por dengue (SCD), ocurre en <1% de infecciones y puede ser potencialmente mortal.

Durante DHF-DSS, el sangrado implica múltiples órganos, incluyendo frecuentemente el tracto gastrointestinal, y los fluidos pueden agruparse dentro de las cavidades del cuerpo (Fig. 1); No se han observado lesiones en los vasos sanguíneos o signos de necrosis, incluso en los casos fatales. DSS, la forma más grave de dengue hemorrágico, se caracteriza por ser rapido, pulso débil y caída repentina de la presión arterial, que es el resultado del colapso del sistema vascular debido a la hipovolemia causada por la fuga vascular. No se entiende completamente por qué la mayoría de las personas tratan resolver infecciones por DENV rápidamente y sin complicaciones, mientras que otras experimentan un síndrome de fuga vascular potencialmente mortales o incluso hemorragia total grave. Los factores de riesgo para la enfermedad severa incluyen la presencia de anticuerpos heterólogos de una infección anterior, ciertas cepas o subtipos de virus infectante, la edad y los antecedentes genéticos del hospedero humano.

Preguntas clave para la inmunidad del virus del dengue

El dengue sigue siendo una enfermedad con muchas preguntas sin respuesta. Hay varios niveles de interacción huésped/DENV desde el momento en que las partículas del virus se inyectan por los mosquitos, con el establecimiento de la infección sistémica, para su resolución. Cada etapa requiere consideraciones especiales para el diseño experimental eficaz, para investigar los mecanismos de la enfermedad subyacente.

El curso de las interacciones hospedero-virus

Células diana iniciales de la infección.

Poco se sabe con respecto a los primeros acontecimientos siguientes a la inoculación del DENV en la piel, incluyendo la respuesta inmune en el sitio de la inoculación y el impacto de la cepa o subtipo viral que infecta, los cuales podrían determinar el éxito de la acogida en la infección viral.

A continuación se examina el papel de la cepa viral infectante. Al Inyectar por vía subcutánea el virus potencialmente puede encontrar varias células del sistema inmune, incluyendo las células de los tejidos residentes células dendríticas (DCs), macrófagos y mastocitos (Fig. 2). Los tipos de

células que están infectadas por primera vez en la piel no se han estudiado ampliamente, pero se piensa que los macrófagos y las CD son objetivos iniciales, y los receptores que identifica el DENV para su adsorción por ambos tipos de células son : el receptor de manosa en macrófagos y DC-SIGN (DC-específica ICAM-3-acaparamiento no integrina 1) en células dendríticas (Fig. 2). Aparte de la demostración de que las células de Langerhans son permisivas a la infección por el DENV en explantes de piel humana, un análisis detallado de la DC y subconjuntos de monocitos que sostienen la infección dentro de la piel no se ha llevado a cabo. La mayoría de los esfuerzos para definir los tipos de células humanas infectadas por el DENV han tratado de identificar la replicación viral en una etapa posterior de la infección: en la sangre durante el pico de viremia. En monos y ratones, el antígeno se ha detectado en células que son morfológicamente consistentes con los fagocitos mononucleares (que se cree que son uno de los principales objetivos de la infección por el DENV), pero esto no está bien documentado en la infección humana. Potencialmente existen diferencias fenotípicas entre las células diana para la infección en la piel (infección temprana), en los órganos linfoides (durante la diseminación viral) y en diversos tejidos cuando se ha establecido la infección sistémica.

Liquidación de virus del dengue del sitio de inyección.

Temprano en la infección por el DENV, las células inmunes son objetivos de la infección, pero también promueven eliminación del DENV de la piel. Se pone mucho énfasis en el papel de anticuerpos neutralizantes específicos en la eliminación del virus. Sin embargo, durante la infección primaria, los niveles sustanciales de anticuerpos neutralizantes no deben estar presentes hasta las etapas posteriores de la enfermedad, debido que la respuesta inmune adaptativa requiere tiempo para desarrollarse. Esto sugiere que en los primeros días de la infección adicional, se requieren mecanismos de anticuerpos independientes de la eliminación del virus desde el sitio de inyección. Es posible que, como ocurre en la infección por el virus del Nilo Occidental, células T γδ juegan un papel en la eliminación viral de la piel.

En los ratones, las células asesinas naturales (NK) y células T NK (reclutamiento de los cuales se promueve por los mastocitos activados residente de la piel) han sido implicados en el aclaramiento viral en el sitio de inyección en la piel y en ganglios linfáticos de drenaje. Las células estromales y endoteliales también pueden producir citocinas, particularmente cuando estas células son activadas por factores pro-inflamatorios derivados de las células inmunitarias vecinas. Aunque la mayoría de las células inmunes liberan mediadores proinflamatorios cuando están infectadas con el DENV, algunos, como los mastocitos, puede detectar directamente y responder al virus sin estar infectados.

Esto pone de relieve el hecho de que no es probable que sean mecanismos adicionales del reconocimiento estructural del DENV por el sistema inmune más allá de la detección de anticuerpos. Para las células que están infectadas, las respuestas pro-inflamatorias a la replicación del DENV son iniciadas por los receptores de reconocimiento de patógenos intracelulares, incluyendo receptores tipo toll 3 asociados a vesículas 3 (TLR3) y la proteína sensores citosólicas ácido retinoico-inducible genes I (RIG-I) y melanoma diferenciación asociada a la proteína 5

(MDA5; también conocido como IFIH1). Estas vías conducen a la producción de citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo el factor de necrosis tumoral (TNF), interferones de tipo I (IFN), IFN y la interleucina-6 (IL-6).

Infección sistémica por el virus del dengue.

Como el DENV se difundió en un hospedero, se detecta por primera vez en el drenaje de los ganglios linfáticos y en los ganglios linfáticos distantes. En los seres humanos y los primates no humanos, esto resulta en viremia (que puede ser detectable 24-48 horas antes de la aparición de los síntomas clínicos), el DENV se puede aislar de la sangre durante la fase aguda de la enfermedad. En esta etapa, se producen cambios sustanciales a la celularidad del sistema hematopoyético, como sería de esperar durante la infección viral sistémica; estos cambios incluyen leucopenia, neutropenia, trombocitopenia y, en ocasiones, eosinofilia (Fig. 2).

Infección con el DENV se caracteriza también por la celularidad de la médula ósea alterada, pero los mecanismos o las consecuencias de estos cambios son desconocidos. Patología vascular, incluyendo la permeabilidad microvascular de las células endoteliales, se produce a medida que disminuye viremia. Aunque las células endoteliales infectadas se han observado en la infección humana, no se sabe con qué frecuencia ocurre esto, debido a la escasez de las autopsias de pacientes humanos con dengue. Células endoteliales humanas pueden ser infectados en cultivo celular, y la infección de las células sinusoidales del hígado se produce en animales inmunocomprometidos.

Aunque controvertido, se ha sugerido que las células endoteliales no están infectadas comúnmente durante la infección humana con el DENV y que la ruptura de la barrera de células endoteliales es consistente con otros mecanismos de la permeabilidad vascular. Debido tanto a la falta de evidencia de que las células endoteliales están dirigidos directamente a el DENV y la respuesta pro-inflamatoria masiva que es detectable en el suero de pacientes con dengue, se ha postulado que los factores inmunológicos actúan como intermediarios en la respuesta de las células endoteliales a el DENV. En particular, cascada de citocinas (niveles elevados de muchas citoquinas en el suero) se ha identificado como un posible mecanismo subyacente de la patología vascular.

Durante la infección por el DENV, grandes cantidades de ciertas citoquinas pro-inflamatorias y vasoactivos, incluyendo TNF y factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA), se producen. Sin embargo, a pesar de estos factores son frecuentemente elevados en el suero de pacientes con dengue, algunos estudios han cuestionado su papel directo en la patología del dengue. Por ejemplo, a pesar del papel bien establecido de TNF en la promoción de la pérdida vascular en otras enfermedades y contextos experimentales, no se ha demostrado ninguna correlación clara entre los niveles de TNF y la manifestación de la fiebre del dengue en comparación con DHF-DSS en los seres humanos.

Algunas pruebas se hayan obtenido por estar ahí tanto menor expresión de receptores de TNF en granulocitos durante FHD-DSS y una asociación entre el DH-DSS y ciertos polimorfismos del TNF.

En un estudio, TNF en suero se elevó durante no se detectó tanto DHF-DSS y la fiebre del dengue en comparación con los niveles en controles sanos, pero una diferencia significativa en los niveles de TNF entre DHF-DSS y los grupos de la fiebre del dengue. Por lo tanto, es posible que el TNF tenga un papel en la infección por DENV, pero si es (o puede ser, en algunos casos) una causa significativa de DHF-DSS en los seres humanos todavía no está clara. Múltiples factores pro-inflamatorias pueden actuar en conjunto para promover la vasculopatía.

Inconvenientes de análisis in vitro.

En última instancia, los mecanismos de muchos de los cambios inmunológicos que ocurren en respuesta a la infección por el DENV, y las funciones de estos cambios inmunológicos en la protección frente a la patología, no se explican todavía. Desafortunadamente, la complejidad de las interacciones entre el DENV y el anfitrión no pueden ser modelados adecuadamente porla manipulación in vitro de células humanas y productos biológicos fuera de los órganos y sistemas que gobiernan sus respuestas a la infección. No sólo son las células diana específicas del DENV no claramente conocidos, sino también el análisis in vitro no captan las respuestas de las células que no se infectan, pero, no obstante, podrían responder al DENV ya los productos inflamatorios en su microambiente en vivo. Como una complicación adicional, las interacciones entre el DENV y células huésped pueden cambiar en el transcurso de la infección, que comienza como una infección cutánea localizada con la activación del sistema inmune innato y el desarrollo de una infección sistémica caracterizada por la replicación viral en los órganos diana (incluyendo el sistema linfoide) y títulos virales elevados en la sangre. Las patologías más graves asociadas con el DENV son infecciones manifiesta con frecuencia en los pacientes que resuelve viremia y la fiebre comienza a disminuir, pero no está claro en qué etapa de la infección se inician estos procesos patológicos.

El papel de la memoria inmunológica

La infección primaria por el DENV resulta en la inmunidad de larga duración para el serotipo infectante y, potencialmente, una inmunidad parcial a la infección subsiguiente con otros serotipos. Muchas personas en los países donde el dengue es endémico han experimentado infección por el DENV previamente.

Anticuerpos preexistentes neutralizantes deben tener un papel importante en la prevención de la infección posterior con el mismo serotipo del DENV. La infección secundaria con un serotipo heterólogo puede causar un amplio espectro de enfermedades, que van desde la infección asintomática hasta la enfermedad hemorrágica severa. Por ejemplo, algunos estudios epidemiológicos han demostrado que los pacientes con una infección por el DENV secundaria y los bebés nacidos de madres que han sido previamente infectadas con el DENV tienen más probabilidades de desarrollar una enfermedad grave. Una teoría de por qué ocurre esto fue descrita por primera vez en referencia a otros flavivirus (Encefalitis del Valle de Murray, el virus del Nilo Occidental y los virus de la encefalitis japonesa) y se denomina mejora dependiente de anticuerpos de la infección (ADE). ADE implica la unión de complejos inmunes de anticuerpo no

neutralizante y el virus infeccioso a los receptores Fc de las células inmunes y se ha demostrado para mejorar la infectividad del DENV in vitro en células humanas. Estudios del DENV in vitro en primates infundidos con la mejora de anticuerpo han mostrado que puede aumentar la infección de los monocitos mediante la promoción de la adsorción viral y la replicación intracelular. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta mejora se produce sólo en una pequeña fracción de infecciones secundarias y con sólo ciertas cepas de virus. Otro concepto inmunológica que se identificó por primera vez en el contexto de otro virus en este caso, virus de la gripe y más tarde demostrado ser relevante a la infección por el DENV es pecado(sin) antigénico original. Esta teoría se describe cómo amplificación de linfocitos específicos de patógenos durante exposición secundaria heteróloga puede constituir una mala asignación de recursos para el sistema inmune si esos linfocitos no son tan eficaces en la promoción de la liquidación de la cepa de exposición secundaria como lo fueron para la cepa primaria.

Se ha informado de que las respuestas de células T en niños que experimentan una infección secundaria con el DENV tiene una especificidad a baja tensión, lo que resulta en la anergia de células T y la apoptosis, y, posiblemente, los títulos virales más altas debido a la falta de limpieza viral óptima por las células T. En otros modelos experimentales resultantes en pecado antigénico original, las respuestas de células T son por lo general altamente específicas para la cepa de desafío principal, y esto también podría ser el caso de DENV. ADE y el pecado antigénico original, ambos se han ofrecido como explicaciones para la asociación de la infección por DENV secundaria con una mayor incidencia de DH-DSS, ya que ambas teorías proporcionan una comprensión de cómo la memoria inmunológica podría ser perjudicial para el host cuando un desafío secundaria es muy similar a, pero antigénicamente distinta de, el virus infectante primaria.

Cada teoría proporciona un mecanismo potencial para lograr altos títulos virales en vivo. Aunque los niveles de viremia se han asociado con la gravedad de la enfermedad, las personas con infecciones secundarias con frecuencia no tienen mayores niveles de viremia o enfermedad grave. Además, contrariamente a la opinión generalizada, ADE (como un mecanismo específico para explicar la infección secundaria como un factor de riesgo para el DH-DSS) no se ha demostrado que se producen in vivo en los seres humanos, aunque puede conseguirse con productos humanos en un entorno experimental ex vivo. DH-DSS se diagnostica a menudo en pacientes con infección primaria, y la fuga capilar se ha informado de acompañar con mayor frecuencia primaria infección de la infección secundaria en ciertos estudios. La infección secundaria por lo tanto no es un requisito para el DH-DSS y no debe ser un requisito para el diseño experimental para comprender la patogenia del dengue. La comprensión de los procesos diferenciales que conducen a la patogenia del dengue durante la primaria frente a la infección secundaria es un objetivo importante para el campo.

El papel de la patología inmune

Algunos de los énfasis en el papel de los anticuerpos en la patogenia del dengue provienen de la demostración experimental de que el anticuerpo solo o suero post-inmune es suficiente para mejorar la patología de la infección por el DENV en modelos animales. Aún se necesitan estudios

similares que demuestran causalidad para las respuestas de acogida que, sobre la base de los estudios en humanos, se asocian con síndrome de vascular fuga, tales como cascada de citocinas. Los factores que pueden estar correlacionados con la gravedad del dengue incluyen TNF y VEGF, pero estudios en animales no han establecido claramente el papel de estos factores del hospedero en la progresión de la enfermedad, la fuente celular de estos factores, o si los factores identificados liberados a lo largo de un tiempo similar podrían ser más consecuente con la patología. Datos recientes muestran que las proteasas de mastocitos como la quinasa salen temprano durante la infección aguda, la promoción del DENV pérdida vascular inducida en ratones, y los niveles séricos de la quinasa se han correlacionado con la severidad de la enfermedad en pacientes humanos. Este es un ejemplo de un producto inmunomodulador que se libera junto con citoquinas temprano durante la infección aguda del DENV. Otro grupo de productos lipídicos vasoactivos, los leucotrienos, también parecen mejorar inducida DENV fuga vascular en el modelo de ratón inmunocompetente. El bloqueo de TNF puede reducir vascular patología en animales inmunocomprometidos durante la enfermedad terminal, pero su papel en el desarrollo de DHF-DSS en los seres humanos sigue siendo poco clara. Tormenta de citocinas también puede ocurrir como resultado de infecciones de totalmente diferente etiología sin lograr los síntomas muy específicos que se atribuyen a la infección por el DENV, lo que sugiere que se requiere más información si queremos plenamente comprender los mecanismos subyacentes patología vascular inducida por el DENV.

Factores intrínsecos del virus asociado al hospedero

Factores intrínsecos del virus pueden influir en la capacidad de ciertas cepas de replicarse e inducir patología grave. Por ejemplo, las mutaciones en el DENV polimerasa no estructural de proteínas 3 (NS3) y proteína de la envoltura viral y mejorar la aptitud promueven neurovirulencia, potencialmente alterando viral la unión a receptores de la superficie celular o aumentar la eficiencia de NS3. Hay muchos ejemplos de interacciones entre proteínas y productos DENV inmunes (por ejemplo, NS1 se une a complementar C4 componente, y NS5 se une a la señalización STAT2 intermediario (transductor de señal y activador o transcripción 2) para antagonizar la vía de IFN). Los análisis filogenéticos han demostrado que la aparición de una nueva variante DENV puede correlacionar con una mayor probabilidad de DH-DSS en los seres humanos.

Ciertos cambios dentro de las proteínas estructurales DENV podrían alterar la unión de anticuerpos a epítopos virales, pero algunas regiones que han mostrado variación no corresponden a la superficie epítopos de viriones maduros DENV. Evolución de genes no estructurales también se ha asociado con la gravedad de la enfermedad potencial y reducido aumento de la epidemia, apoyando la existencia de un componente de DENV intrínseca a la virulencia que requiere una evaluación adicional.

Por el contrario, algunos de los factores genéticos de acogida o bien se asocian con o protectora contra el desarrollo de DH-DSS. Además de TNF, ciertas isoformas de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I moléculas, moléculas MHC de clase II, II (Fc? RII) moléculas de inmunoglobulina del receptor de G región Fc, la proteína de los linfocitos T citotóxicos 4

(CTLA4) y de crecimiento transformante β1 factores (TGFß1) han sido relacionados con el DH-DSS13,60-63, mientras que en algunos casos, las isoformas particulares parecen tener un efecto protector. Ciertos polimorfismos en TAP1 y TAP2, los genes asociados con la presentación de antígenos y la carga de péptido en el MHC, también tienen correlaciones positivas o negativas con DH-DSS. Estos estudios han identificado host de destino factores que podrían influir en la patogenia del dengue; sin embargo, como muchos de estos factores han sido identificados en una población individuo o brote, requieren la corroboración en estudios independientes y posterior validación experimental. Interacciones virus-huésped no son los mismos para todos los pacientes o cepas de infectados virus. Este hecho se pone de manifiesto por el amplio espectro de los resultados clínicos para los pacientes infectados con DENV, desde una infección asintomática hasta la fiebre del dengue clásico y, en ocasiones, complicaciones letales de la hemorragia y / o descarga. Estos factores complejos y observaciones aparentemente contradictorias probablemente conciliarse solamente con la investigación experimental controlado, que requeriría estudios preclínicos con modelos animales y una gran variedad de cepas virales no adaptados.

Los modelos animales de infección por el virus del dengue

Muchos modelos animales se han utilizado en la investigación DENV, incluyendo múltiples cepas de ratones inmunocompetentes e inmunodeprimidos, Nuevo Mundo y el Viejo Mundo primates, e incluso animales humanizados. En la búsqueda de un modelo ideal, sin embargo, los límites autoimpuestos han surgido con respecto a la aceptable en la experimentación in vivo utilizando las herramientas que están disponibles actualmente. Los primates no humanos se han infrautilizado, en parte porque los resultados han sido muy variables, dependiendo de las especies de primates y la infección de la cepa viral utilizada. En algunos estudios, los primates han mostrado síntomas leves de la infección por DENV o fuga vascular. Primates también se han utilizado para probar la seguridad, inmunogenicidad y capacidad protectora de vacunas candidatas antes estos candidatos son probados en ensayos clínicos humanos. Esta etapa de los ensayos preclínicos en primates es prácticamente inevitable para candidatos a vacuna de dengue y en sí merece mayor estudio de los cambios fisiopatológicos causados por DENV en el modelo de primates.

Animales inmunocompetentes (incluidos los primates, pero especialmente los ratones de tipo salvaje) se consideran una mala elección para la investigación DENV, incluso en estudios relacionados con la función inmune directamente, debido a su resistencia relativa a la infección en comparación con los humanos. Cabe señalar, sin embargo, que cada modelo tiene diferentes ventajas y limitaciones. Además, muchas de las limitaciones aceptadas de algunos modelos (como la expectativa de que los ratones inmunocompetentes no apoyaría las infecciones con virus replicantes) no están representados adecuadamente en la literatura con los datos, sino más bien, se discuten de manera anecdótica.

Esto hace que la evaluación de otras posibles causas de modelo 'fracaso', tales como la elección de la cepa viral, difícil. Algunos de estos conceptos en relación con la resistencia de ciertas especies hasta la fecha la infección de nuevo a los primeros estudios in vivo realizado con DENV, y los escasos datos de apoyo han sido publicados en el tiempo intermedio. Como las nuevas técnicas se

han convertido en los medios disponibles, más sensibles de medición de los resultados virales e inmunológicos también pueden ser útiles. Ejemplos que en la actualidad se están aplicando en algunos estudios incluyen cuantitativa en tiempo real PCR de transcripción inversa (QRT-PCR), que puede ser utilizado como un sustituto sensible para ensayos de placa (aunque esto tiene la advertencia de que qRT-PCR no mide con precisión infecciosa DENV), y citometría de flujo, que se puede utilizar en lugar de inmunohistoquímica para cuantificar rara las poblaciones infectadas.

Por lo tanto, es nueva visita que vale la pena modelos menos utilizadas para determinar si la información adicional acerca de la patogenia del dengue y de la respuesta inmune del huésped puede ser obtenido utilizando técnicas modernas y una gama más amplia de cepas virales de bajo pasaje. En respuesta a la dificultad de evaluar Virología DENV en animales inmunocompetentes, y en un esfuerzo para lograr la gravedad de la infección y uniforme resultados claramente interpretables, la mayoría de estudios recientes en animales han gravitado hacia el uso de modelos inmunocomprometidos (tales como el modelo de ratón deficiente en IFN GA129) e infección 'anticuerpo mejorada' (a menudo usando anticuerpos monoclonales para DENV, junto con adaptada a ratón DENV). Estos sistemas tienen ventajas claras para responder a ciertas preguntas.

Por ejemplo, las investigaciones con el objetivo de identificar fármacos antivirales podrían ser más definitiva en ratones inmunodeficientes, en el que la replicación DENV casi sin restricciones puede ocurrir y hay gravedad de la enfermedad uniforme. Sin embargo, debemos tener cuidado de no excederse en las conclusiones de tales experimentos. En muchos aspectos, especialmente en relación con la inmunidad del huésped y potencialmente también a la patología inmune, puede haber diferencias entre la respuesta inmune del ratón y la respuesta que se desarrolla durante la infección humana. Por otra parte, no sabemos si los mecanismos subyacentes de eventos patológicos clave como la pérdida vascular serían los mismos en ratones como en las enfermedades humanas o si los mismos tipos de células que se infectan en los seres humanos se infectan en animales inmunocomprometidos.

La ausencia de vías inflamatorias clave podría permitir lo contrario células de ratón resistentes a ser permisiva para la replicación DENV. En nuestra opinión, los modelos animales que se han prestado al estudio de la virología básica de DENV, como ratones inmunodeprimidos, podrían no ser la más adecuada para el estudio de la inmunidad o patogénesis inmune. No abogamos por la adopción de cualquier modelo existente como el estándar de oro, porque cada uno tiene sus pros, contras y advertencias. Más bien, como se indica a continuación, los investigadores deben seleccionar el modelo existente más adecuado, con estas consideraciones en mente, para hacer frente a una pregunta experimental único.

Las investigaciones que tienen como objetivo comprender el desarrollo de la inmunidad anti-dengue eficaz y utilizar ese conocimiento como base para el diseño racional de vacunas requieren un sistema inmunológico intacto para abarcar plenamente la respuesta inmune. Ratones inmunocompetentes se cree que son relativamente resistentes a DENV en comparación con los seres humanos, pero este hecho también nos brinda la oportunidad de estudiar la inmunidad anti-

dengue eficaz en un host que pueda responder a, y claro, la infección. Utilizando ratones knockout selectivos podría proporcionar una comprensión mecanicista de cómo los tipos de células o factores inflamatorios únicos contribuyen a la inmunidad y patogénesis. No es probable que sea una compleja interacción entre los procesos de inmunidad anti-dengue y la patología inducida DENV-como el apoyo de la asociación de la infección secundaria con gravedad de la enfermedad variable durante los brotes de dengue.

El estudio de la patología inmune mecánica ha sido difícil porque ratones con sistemas inmunes funcionales raramente recapitular plenamente la gravedad del dengue hemorrágico humano. Sin embargo, desafiamos la premisa de que la plena recapitulación de la evolución temporal de la enfermedad o fenotipo patológico es una necesidad. Los cambios que se producen in vivo en respuesta a la infección por DENV no necesitan ser igualmente perjudicial para la supervivencia de los animales y los seres humanos para revelar información sobre el avance de la enfermedad, y dicha información podría ser crucial para la identificación de una estrategia terapéutica o profiláctica. El uso de animales modelos que han caído en desgracia para la investigación del dengue, como los ratones inmunocompetentes de tipo salvaje y los primates no humanos, para estudiar los cambios fisiológicos requerirá un cuidadoso diseño experimental, un realista evaluación de la probabilidad de que las conclusiones pueden extenderse a la enfermedad humana, el uso de cepas virales unpassaged seleccionados y subtipos, y el uso de medidas más sensibles de la patología que los resultados extremos de la hemorragia, la viremia prolongada o la muerte. Algunos sustitutos potenciales de la patología en fase terminal incluyen métodos más sensibles para medir objetivamente la permeabilidad vascular o la señalización de las células inmunitarias, estadísticamente cambios significativos en el número de células hematopoyéticas (por ejemplo, pérdida de plaquetas o la proliferación de linfocitos), los niveles de factores inmunes aguas arriba de la fuga vascular (tales como niveles elevados de citoquinas o de otros factores vasoactivos), y los puntos de tiempo alternos de evaluación a aquellos cree que es análoga a la del curso de la infección humana.

Por lo tanto, los modelos animales individuales para el dengue podrían tener limitaciones, pero no debe descartarse como defectuoso inherentemente. Cabe señalar que el dengue severa no se manifiesta de manera uniforme en los seres humanos, por lo que la falta de gravedad en un modelo no debe impedir que el estudio del dengue en modelos variados. Por el contrario, como las limitaciones de los modelos animales para el dengue son bien conocidas, los resultados de estos estudios deben ser utilizados para informar a nuestro conocimiento colectivo de DENV virología, patogénesis e inmunidad a fin de introducir nuevas teorías y conceptos para el campo, pero no para limitar el potencial de las investigaciones similares en los humanos. Por ejemplo, parece que hay diferencias en la capacidad de los seres humanos y ratones para desarrollar anticuerpos neutralizantes a ciertos epítopos de proteínas DENV. Para los ratones inmunodeficientes, los medicamentos podrían reducir la patología del dengue, pero nunca permitir que la supervivencia a largo plazo de los animales que no se puede eliminar la infección. Por lo tanto, las limitaciones en el grado en que podemos ampliar conclusiones de los estudios en

animales no deben inhibir nuestra búsqueda de la comprensión de este patógeno en una gama de modelos animales, así como en los ensayos en humanos motivados.

Conclusiones

El campo de la investigación del dengue ha hecho grandes progresos en los últimos 50 años, particularmente en cuanto a la definición del dengue clínicamente, determinando cómo identificar y tratar el dengue con la atención de apoyo, y la comprensión de la epidemiología y biología básica de DENV, incluyendo la estructura y la replicación viral. Los modelos animales se han desarrollado para pruebas de drogas antivirales, y muchos grupos han diseñado vacunas candidatas prometedoras. Es importante destacar que muchos de los restantes preguntas sobre DENV como un centro de patógeno en cómo el sistema inmune, tanto innata y adquirida, percibe y responde a la infección DENV, la variación genética en la forma en el host y la influencia del virus esta percepción, y donde la fina línea que se encuentra para la protección frente a la patología. Estas preguntas no pueden responderse definitivamente en el contexto de un sistema inmunodeprimido solos, pero deben abordarse directamente con diseño experimental audaz de los estudios preclínicos, incluso en animales inmunocompetentes, para definir completamente la inmunidad anti-dengue. Nosotros creen que responder a este reto será un requisito previo a la identificación de los más eficaces terapias específicas y estrategias de vacunas contra el dengue.