laporan tetap formal asam amino
TRANSCRIPT
I. NOMOR PERCOBAAN : IV
II. NAMA PERCOBAAN : TITRASI FORMAL ASAM AMINO
III. TUJUAN PERCOBAAN : Untuk Mempelajari cara kerja enzim pada asam
amino melalui titrasi formaldehyde
IV. LANDASAN TEORI :
Molekul protein merupakan rantai panjang yang tersusun oleh mata rantai asam –
asam amino. Asam amino merupakan senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus
karboksilat (-COOH) dan satu atau lebih gugus amina (-NH2), yang salah satunya terletak
pada atom C tepat disebelah gugus karboksilat (atau C-α ). Protein dapat dihidrolisis
menjadi asam amino menggunakan enzim protease melalui titrasi formal asam amino.
Titrasi formal asam amino merupakan suatu metode titrasi dengan menggunakan larutan
basa setelah penambahan formaldehid untuk menghilangkan kebasaan gugus amino. Titrasi
ini biasanya digunakan untuk menentukan jumlah asam amino yang terkandung dalam
suatu campuran.
Penentuan salah satu gugus akan memberikan indikasi untuk mengetahui derajat
hidrolisis suatu protein. Dalam titrasi ini, digunakan formaldehid yang bertujuan untuk
membentuk dimethilol sehingga gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan
mempengaruhi reaksi antara gugus karbonil (asam) dengan basa (NaOH) sehingga titik
akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Selain itu juga, agar bereaksi dengan gugus amino
yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium membuffer di daerah pH
yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan suatu
indikator. Sehingga akan didapatkan kurva hubungan banyaknya larutan NaOH yang
digunakan terhadap waktu. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan slop dan tangen.
Nilai α tersebut merupakan derajat hidrolisis suatu protein (gelatin). Sehingga dari
percoban yang dilakukan dengam memvariasikan waktu hidrolisis gelatin menggunakan
enzim tripsin, diperoleh hasil bahwa semakin lama waktu hidrolisis semakin banyak massa
nitrogen asam amino yang dihasilkan dan diperoleh derajat hidrolisis dari enzim tripsin
adalah 0,032.
Protein merupakan senyawa makromolekul polimer yang urutan liniernya adalah
asam-asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Asam amino sangat berperan
penting dalam biosintesis protein, dimana dalam protein terdapat sekitar 20 jenis asam
amino standar. Asam amino merupakan molekul organik dengan massa molekul rendah
(antara 100-200 Da) yang mengandung setidak-tidaknya satu gugus karboksil (-COOH)
dan satu gugus amino (-NH2).
Asam amino merupakan ion dipolar, yang pada umumnya mempunyai dua atau
lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, kadar asam aminonya tidak
larut di dalam eter, karena merupakan senyawa dipolar dan dalam air menunjukkan
struktur kutub ganda (zwitter ion). Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku
sebagai asam dan mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku
sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat.
Ketika protein dihidrolisis, maka jumlah asam amino yang dihasilkan tergantung
dari panjang rantai dan berat molekul itu sendiri. Selama hidrolisis suatu protein, sejumlah
gugus karboksil dan gugus amino terus bertambah. Penentuan secara kuantitatif yaitu salah
satu gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis dari suatu
protein. Menurut teori ”zwitter ion” jika suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan
basa, ini berarti ion hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Karena gugus amonium
dari asam amino adalah buffer pada pH tinggi (di atas pH 11), sehingga titrasi formal asam
amino tidak mungkin untuk menitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal yang sama
terjadi karena gugus karboksil adalah buffer pada pH rendah, tidak mungkin juga untuk
menitrasinya dengan asam.Penambahan formaldehida pada larutan asam amino tersebut
agar reaksi dengan gugus asam amino yang tidak bermuatan, sehingga memungkinkan
gugus amonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik
akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Reaksi yang terjadi dalam titrasi
dengan menggunakan formaldehid merupakan reaksi pembentukan dimethilol. Dimana,
larutan yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH), akan membentuk dimethilol.
Terbentuknya dimethilol ini, berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan
mempengaruhi reaksi antara gugus asam (karboksil) dengan basa (NaOH), sehingga titik
akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolfathalein,
yaitu terjadi perubahan warna larutan dari bening menjadi merah muda yang tidak hilang
selama 30 detik.
Reagen yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelatin, yang merupakan
produk alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin adalah protein yang
bersifat gelling agent(bahan pembuat gel) atau sebagai ion gelling egent. Sumber bahan
baku gelatin dapat berasal dari tulang dan kulit dari sapi atau babi. Gelatin terdiri dari
glisin dengan komposisi yang besar, protein dan 4-hidroksi residu dari protein yang
strukturnya adalah -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyp-Gly-Pro-.
Semua enzim murni yang telah diamati sampai saat ini adalah protein ; aktivitas
katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Sebagai contoh, jika
suatu enzim didihkan dengan asam kuat atau diinkunbasi dengan tripsin, yaitu perlakuan
yang memotong rantai polipeptida, aktivitas katalitiknya biasanya akan hancur; hal ini
memperlihatkan bahwa struktur kerangka primer protein enzim dibutuhkan untuk
aktivitasnya. Selanjutnya, jika kita mengubah berlipatnya rantai protein yang khas dari
suatu protein enzim utuh oleh panas, oleh perlakuan pH yang jauh menyimpang dari
keadaan normal, atau oleh perlakuan dengan senyawa perusak lainnya, aktivitas enzim
penting bagi aktivitas katalitiknya.
Enzim, seperti protein lain, mempunyai berat molekul yang berkisar dari kira-kira
12.000 sampai lebih dari 1 juta. Oleh karena itu, enzim berukuran amat besar dibandingkan
dengan subtrat atau gugus fungsional targetnya. Beberapa enzim hanya terdiri dari
polipeptida dan tidak mengandung gugus kimiawi selain residu asam amino.
V. ALAT DAN BAHAN
1. Alat
Gelas ukur
Beker gelas
Termometer
Pipet tetes
Statif, klem
Erlenmeyer
Biuret
2. Bahan
Larutan Gelatin 5%
NaOH 0,2 M
Phenolpthalein
HCl 0,1 M
Formaldehyde 40%. Netralkan dengan alkali.
Larutan tripsin atau pancreatin 1%
VI. PROSEDUR PERCOBAAN
Siapkan 100 ml larutan gelatin 5%. Atur temperatur 38oC. Tambahkan kedalamnya 1
ml phenolpthalein dan 0,2 M NaOH tetes demi etets sampai warna merah muda timbul.
Tambahkan 0,1 M HCl tetes demi tetes sampai tepat warna merah muda tadi hilang (pH =
8,0). Hati-hati jangan terlalu asam. Masukkan gelatin yang telah dinetralisir tadi kedalam
inkubator 38oC. Pada 40 ml larutan tripsin tambahkan beberapa tetes phenolpthalein.
Tambahkan tetes demi tetes 0,2 M NaOH sampai warna merah muda. Kemudian teteskan
0,1 M HCl sampai warna tersebut tepat hilang (pH = 8,0). Tepat pada jam “Nol”
tambahkan larutan tripsin tersebut ke dalam larutan gelatin. Aduk! Setelah tercampur rata,
ambil 10 ml campuran, masukkan ke dalam 100 ml beker gelas. Didihkan untuk merusak
enzimnya. Catat waktunya! Dinginkan. Tambahkan 15 ml formalin netral dan 3 tetes
phenolpthalein. Pada interval 15 menit lakukan hal yang sama seperti di atas (seperti
kontrol). Pada masing-masing hasil reaksi di atas pada interval 0, 15, 30, 60, 90, dan 120
menit dan dititrasi dengan NaOH 0,02 M hingga berwarna merah muda.
VII. HASIL PENGAMATAN
110 ml Gelatin 5% (tak berwarna) dipanaskan
38oC Gelatin (tak berwarna) + PP (1ml) +
NaOH (9 tetes) larutan merah muda + HCl (1 tetes) larutan tak berwarna
pH 8,05 100 ml diinkubasi
10 ml dididihkan (larutan tak berwarna) didinginkan (tak
berwarna) + 15 ml formaldehid (tak berwarna) + 3tetes PP +
NaOH 0,02M 84 tetes
35 ml Tripsin 1% (tak berwarna) dipanaskan
38oC Tripsin (tak berwarna) + PP (3 tetes) +
NaOH (3 tetes) larutan merah muda + HCl (5 tetes) larutan tak berwarna
pH 7,99 25 ml diinkubasi
10 ml dididihkan (larutan tak berwarna) didinginkan (tak
berwarna) + 15 ml formaldehid (tak berwarna) + 3tetes PP +
NaOH 0,02M 60 tetes
Campuran 100 ml gelatin + 25 ml tripsin yang telah diinkubasi
X(waktu) Y (Volume NaOH)
dalam tetes
Y (Volume NaOH)
dalam ml
0 63 tetes 3,15 ml
15 66 tetes 3,3 ml
30 70 tetes 3,5 ml
60 72 tetes 3,6 ml
90 74 tetes 3,7 ml
120 77 tetes 3,85 ml
VIII. PERSAMAAN REAKSI
Reaksi gelatin didegrasi dengan enzim tripsin
Struktur Gelatin
Asam – asam amino hasil pemecahan gelatin
O H O
R – CH – C R – C - C NH OH NH3
+ O-
Asam Amino Ion dipolar
H O H
R – C – C + CH2O R – C – COOH
NH3+ O- HOH2C – C – CH2OH
Ion dipolar formalin Metil diol
H H O
R – C – COOH + NaOH R – C – C ONa HOH2C – C – CH2OH HOH2C – C – CH2OH Metil diol Natrium Hidroksida Natrium Metil diol
IX. ANALISA DATA
Volume NaOH Vs Waktu secara praktek
X(waktu) Y (Volume
NaOH) dalam
tetes
Y (Volume
NaOH) dalam ml
0 63 tetes 3,15 ml
15 66 tetes 3,3 ml
30 70 tetes 3,5 ml
60 72 tetes 3,6 ml
90 74 tetes 3,7 ml
120 77 tetes 3,85 ml
0 15 30 60 90 1200
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
3.153.3
3.5 3.6 3.73.85
waktu
volu
me
NaO
H
Kurva Titrasi antara volume NaOH terhadap waktu
X Y XY X2
0 3,15 0 015 3,3 49,5 22530 3,5 105 90060 3,6 216 360090 3,7 333 8100120 3,85 462 14400315 21,1 1165,5 27225
Slope (A) = n . Σ XY – ΣX . ΣY n . ΣX2 – (ΣX)2
= 6( 1165,5 ) – 315( 21,1 )
6(27225) – (315)2
= 346,564125
= 0,0054
Intersept (B) = ΣY . ΣX 2 – ΣXY . ΣX n . ΣX2 – (ΣX)2
= 21,1(27225) – 1165,5(315) 6(27225) – (315)2
= 20731564125
= 3,2329
Persamaan Y = 0,0054x + 3,2329Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(0) + 3,2329 = 3,2329
Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(1) + 3,2329 = 3,2383
Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(2) + 3,2329 = 3,2437
Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(3) + 3,2329 = 3,2491
Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(4) + 3,2329 = 3,2545
Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(5) + 3,2329 =3,2599
X 0 1 2 3 4 5
Y 3,2329 3,2383 3,2437 3,2491 3,2545 3,2599
0 1 2 3 4 53.215
3.22
3.225
3.23
3.235
3.24
3.245
3.25
3.255
3.26
3.265
3.2329
3.2383
3.2437
3.2491
3.2545
3.2599
X
Y
Perhitungan mg N asam amino.Karena 1 mL NaOH 0,1 N sama dengan 1,4 mg nitrogen asam amino sedangkan dalm percobaan ini menggunakan NaOH 0.02 N maka:
0,02 N0.01 N
= X mg
1.4 mgx = 0.028 mgjadi 1 ml NaOH 0.02 N sama dengan 0.028 mg nitrogen asam amino
Mg Asam amino = V rata−rata NaOH
1mlx0.028 mg
t =0’ 3.15 ml
1 mlx 0.028 mg=0.0882 mg
t = 15’3.3 ml1ml
x 0.028 mg=0.0924 mg
t = 30’3.5 ml1 ml
x 0.028 mg=0.098 mg
t = 60’3.6 ml1ml
x 0.028 mg=0.1008 mg
t = 90’3.7 ml1 ml
x 0.028 mg=0.1036 mg
t = 120’3.85 ml
1mlx 0.028 mg=0.1078 mg
waktu (X)
Mg asam amino (Y)
XY X2 Y2
0 0.0882 0 0 0.007779215 0.0924 1.386 225 0.008537830 0.098 2.94 900 0.00960460 0.1008 6.048 3600 0.010160690 0.1036 9.324 8100 0.010733120 0.1078 12.936 14400 0.0116208
∑X = 315
∑ Y = 0.5908
∑XY =32.634
∑ X2
=27225∑ Y2
=0.0584354
Slope (A) = n .ΣXY −ΣxΣY
n ΣX2−¿¿
= (6)(32.634 )– (315)(0.5908)
(6 )(27225)−¿¿
= 195.804−186.102
163350−99225
= 9.70264125
= 0.0001
Intersept (B) = ΣX 2 ΣY −ΣxΣXYn ΣX2−¿¿
= (27225)(0.5908) – (315)(32.634)
(6 )(27225)−¿¿
= 16084.53−10279.71
163350−99225
= 5804.8264125
= 0.0905
Persamaan Garis Lurus : Y = Ax+B
= 0.0001x+ 0.0905
Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(0)+ 0.0905
= 0.0905
Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(1)+ 0.0905 = 0.0906
Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905
= 0.0001(2)+ 0.0905 = 0.0907
Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(3)+ 0.0905 = 0.0908
Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(4)+ 0.0905
= 0.0909
Y = Ax + B
= 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(5)+ 0.0905 =0.091
X 0 1 2 3 4 5
Y 0.0905 0.0906 0.0907 0.0908 0.0909 0.091
Grafik hubungan mg N asam amino dan Waktu
0 15 30 60 90 1200
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.0882 0.0924 0.0980000000000002
0.1008 0.1036 0.1078
Grafik hubungan mg asam amino dan Waktu dalam regresi linier
0 1 2 3 4 50.09020.09030.09040.09050.09060.09070.09080.0909
0.0910.0911
0.0905000000000001
0.09060.0907
0.09080.0909
0.091
waktu
mg
N a
sam
Am
ino
X. PEMBAHASAN
Praktikum ini titrasi uji formaldehid ini yaitu untuk mempelajari aktivitas enzim
dan apa saja yang dapat mempengaruhi aktivitas dari enzim tersebut. Dengan
menggunakan protein yaitu gelatin.
Sebelum melakukan percobaan larutan gelatin diinkubasi terlebih dahulu larutan
gelatin diinkubasi sekitar 38oC. Namun, suhunya harus dijaga konstan jangan sampai naik,
karena bila suhunya mencapai lebih dari 50oC protein akan terdenaturasi. Sehingga akan
merusak struktur dari protein itu sendiri.
Yang bertindak sebagai enzim adalah tripsin, yaitu enzim yang terdapat dalam
tubuh kita yaitu pada air seni. Sebagai perlakuan, gelatin ditambahkan dengan tripsin,
dengan begitu, kita melakukan pemotongan pada rantai polipeptida pada protein. Sama
seperti gelatin tadi, maka tripsin pun harus diinkubasi pada suhu 38oC, hal ini dimaksudkan
agar enzim tripsin dapat bekerja secara optimum pada suhu tersebut.
Larutan protein yang diinkubasi akan semakin banyak membutuhkan NaOH jika
dilakukan penitrasian. Hal ini disebabkan oleh semakin banyaknya gugus amino dan
karboksil pada asam amino yang terpotong oleh tripsin. Residu asam amino yang terpotong
ini akan mengikat NaOH yang dititrasikan kelarutan protein.Penitrasian dengan NaOH
pada larutan protein yang ditambahkan dengan tripsin dimaksudkan untuk melihat
kecepatan reaksi yang terjadi berdasarkan volume NaOH yang digunakan. Larutan protein
bertindak sebagai subtratnya. Jadi, kecepatan reaksi tergantung dengan konsentrasi
gelatinnya. Tapi, bila enzim tripsin seolah-olah “jenuh” dengan subtrat, artinya enzim tidak
dapat lagi menampung gelatin.
Percobaan ini, dilakukan pencampuran antara larutan gelatine dan larutan tripsin.
Pada waktu ke 0, 15, 30, 60, 90, dan 120 menit diambil sebanyak 10 mL larutan (campuran
gelatin dengan tripsin). Larutan itu didihkan pada masing-masing interval waktu yang
bertujuan untuk merusak protein. Setelah didinginkan, larutan yang diperlakukan pada
masing-masing interval waktu tersebut ditambahkan formaldehid (formalin) dan indikator
PP kemudian dilakukan titrasi. Penambahan PP digunakan untuk mengetahui dari akhir
titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang selama 30
detik. Penambahan formaldehid pada larutan asam amino agar bereaksi dengan gugusan
amino yang tak bermuatan sehingga memungkinkan gugusan ammonium membuffer di
daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir suatu indicator secara
kuantitatif. Formaldehid menghasilkan derivate hidroksimetil yang mempunyia keasaman
lebih kuat dari senyawa semula. Dengan demikian penambahan PP dan Titrasi formalin
hanya tepat untuk menunjukkan atau menentukan suatu proses terjadinya pemecahan
protein tetapi kurang tepat untuk penemuan protein.
Reaksi kimia dipengaruhi oleh suhu, sebagian enzim akan terdenaturasi pada suhu
di atas 60oC, maka reaksi antara gelatin-tripsin juga dipengaruhi oleh suhu pada waktu
melakukan inkubasi. Kenaikan suhu sebelum terjadinya proses denaturasi (atau pada saat
suhu ±38oC) maka akan dapat menaikkan kecepatan reaksi. Volume NaOH yang dititrasi
menjadi berkurang seiring dengan pertambahannya waktu dalam inkubasi.
XI. KESIMPULAN
1. Tujuan tripsin diinkubasi pada suhu 38oC, yaitu agar tripsin dapat bekerja secara
optimum pada suhu tersebut. Oleh karena itu, suhu tersebut harus dijaga konstan
agar tripsin tidak terdenaturasi.
2. Kecepatan reaksi gelatin-tripsin juga dipengaruhi oleh suhu. Kenaikan suhu
sebelum tripsin terdenaturasi maka akan menaikkan kecepatan reaksi.
3. Penambahan NaOH pada gelatin dan tripsin agar larutan tersebut bersifat basa yang
ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi warna merah muda setelah
ditambahkan indikator.
4. Penambahan formaldehid agar adanya reaksi dengan gugusan amino yang tak
bermuatan hingga memungkinkan gugusanm ammonium buffer didaerah pH yang
lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir dengan indicator PP.
5. Pemanasan pada campuran gelatin-tripsin dilakukan untuk menghentikan aktivitas
enzim tripsin agar tidak lagi bereaksi dengan substrat.
XII. DAFTAR PUSTAKA
Lehninger, A. L. (1982). Dasar - Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga. BIBLIOGRAPHY Mertanjaya, I. P. (2011). Penentuan Derajat Hidrolisis Suatu Protein Melalui Titrasi
Formal Asam Amino. Laporan Praktikum Biokimia .
Poedjiadi, A. (1994). Dasar - Dasar Biokimia . Jakarta: Universitas Indonesia.
XIII. GAMBAR ALAT
Pipet tetes Beaker Gelas
Gelas Ukur
Alat Titrasi Erlenmeyer
XIV. Jawaban pertanyaan
1. Buatlah kurva titrasi antara volum alkali (ordinat) terhadap waktu (absis)
Grafik hubungan volum NaOH dan Waktu
Grafik hubungan volum NaOH dan Waktu dalam regresi linier
0 1 2 3 4 53.215
3.223.225
3.233.235
3.243.245
3.253.255
3.263.265
3.23293.2383
3.24373.2491
3.25453.2599
X
Y
2. Buat kurva antara mg nitrogen asam amino (ordinat) terhadap waktu (absis)
Grafik hubungan mg N asam amino dan Waktu
0 15 30 60 90 1200
0.51
1.52
2.53
3.54
4.5
3.15 3.3 3.5 3.6 3.7 3.85
waktu
volu
me
NaO
H
0 15 30 60 90 1200
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.0882 0.0924 0.0980000000000002
0.1008 0.1036 0.1078
Grafik hubungan mg asam amino dan Waktu dalam regresi linier
0 1 2 3 4 50.09020.09030.09040.09050.09060.09070.09080.0909
0.0910.0911
0.0905000000000001
0.09060.0907
0.09080.0909
0.091
waktu
mg
N a
sam
Am
ino
3. Mengapa harus ditambahkan alkali pada formalin sampai merah muda dan
phenolphthalein?
Karena dengan ditambahkan alkali pada formalin maka akan terbentuk dimethiol dan
dengan terbentuknya dimetiol ini berarti gugus anionnya sudah terikat, sehigga tidak
akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa (NaOH) dan titik akhir titrasi
dapat ditentukan dengan tepat. Penambahan PP berguna untuk melihat titik akhir
titrasi tersebut, yaitu terjadi perubahan warna.
4. Apa tujuan melakukan titrasi formal ini?
Untuk mempelajari cara kerja enzim pada asam amino dan untuk mengetahui factor
– factor penyebab kecepatan reaksi enzim seperti suhi dan konsentrasi zat.