DAFTAR ISI

BAB 1 PENDAHULUAN..................................................................................................2

BAB II METODE KERJA..................................................................................................3

BAB III PEMBAHASAN...................................................................................................7

BAB IV KESIMPULAN....................................................................................................14

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................15

Page | 1

BAB I

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Air susu ibu adalah makanan yang terbaik bagi bayi, namun karena satu dan lain hal, ibu

tidak mampu menyusui bayinya, sehingga membutuhkan bantuan susu formula. Susu formula

yang diperdagangkan di Indonesia umumnya dalam bentuk formula bubuk.

Bentuk bubuk tidak memerlukan cara penyimpanan yang khusus, setelah kemasan dibuka,

susu formula cukup disimpan pada tempat yang kering dan tertutup rapat. Pelarutannya kembali,

cukup ditambahkan air matang dengan suhu minimal 70oC, maka susu formula sudah bisa

dikonsumsi (Codex Alimentarius Commission, 2007). Anjuran tersebut tidak sepenuhnya

dipatuhi oleh para ibu dalam melarutkan susu formula. Perlakuan yang tidak semestinya pada

penyimpanan dan preparasi, menjadikan susu formula sebagai pangan yang berisiko tinggi

karena kepekaan bayi terhadap bakteri enterik patogen dan respon yang berlebihan terhadap

toksin. Tetapi terlepas dari banyaknya kandungan yang ada, susu juga merupakan media yang

baik untuk pertumbuhan mikroorganisme, yang juga menjadikan susu sebagai pangan yang

berbahaya dan merupakan bahan pangan yang mudah rusak. Karena merupakan media yang baik

untuk pertumbuhan mikroorganisme, maka susu bisa menjadi sarana untuk penyebaran bakteri

patogenik. Pencemaran mikroorganisme pada susu bisa terjadi oleh lingkungan sekitarnya,

seperti kandang sapi, alat pemerah, rumput yang dimakan oleh sapi, dan bisa juga dari sapi itu

sendiri. Karena adanya mikrobiologi yang terdapat pada susu maka mutu dan keamanannya akan

menurun, yang ditandai oleh perubahan fisik dari susu tersebut, seperti perubahan rasa, warna,

bau, konsistensi, dan juga penampilannya, sehingga susu menjadi tidak layak untuk dikonsumsi.

Upaya pemerintah dalam mengatasi masalah adanya cemaran bakteri pada susu yaitu telah

dikeluarkannya acuan Standar Nasional Indonesia (SNI) No. 01-3141-1998 tentang syarat mutu

susu segar dan SNI No. 7288:2009 tentang batas maksimal cemaran mikroba dalam pangan.

Dalam SNI disebutkan bahwa cemaran bakteri maksimal untuk total bakteri (Total Plate

Count/TPC) (1×106 CFU/ml), Coliform (20/ml), Angka Paling Mungkin (Most Probable

Number/MPN) Escherrichia coli <3/ml,Staphylococcus aureus 1×102/ml, serta negatif untuk

Salmonella, Escherrichia coli (patogenik), dan Streptococcus Group B.

Page | 2

BAB II

METODE KERJA

Metode kerja untuk pengujian susu bubuk formula yang diindikasi mengandung bakteri

dapat dilakukan dengan metode berikut sesuai dari SNI 01-2970-2006 dan SNI 01-2782-1998.

Prinsip metode ini yaitu dengan meneumbuhkan bakteri pada media selektif yang mengandung

senyawa kromaganik sesuai dengan bakteri yang ingin di uji, pada kasus ini bakteri yang

diinginkan ditemukan yaitu Enterobacter Sakazakii dan Salmonella sp.

Pengujian Salmonella spp.

I. Prinsip

Pertumbuhan Salmonella pada media selektif dengan pra pengayaan (pre-enrichment), dan

pengayaan (enrichment) yang dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi.

II. Media dan Reagen

Buffered Peptone Water (BPW) 0,1 %

Media agar kromogenik berformulasi Druggan-Forsythe-Inversen (DFI) atau

Chromocult E. sakazakii

Enterobacteriaceae enrichment broth (EE broth)

Mac Conkey Agar (MCA)

Xylose lysine deoxycholate agar (XLD)

LB;

SCB;

TSB;

TTB

TSIA;

LIA;

MR-VP

RV;

XLDA

VRBG

Page | 3

III. Peralatan

cawan petri;

tabung reaksi;

tabung serologi ukuran 10 x 75 mm;

pipet ukuran 1 ml, 2 ml, 5 ml,10 ml;

botol media;

gunting;

pinset;

jarum inokulasi (ose);

stomacher;

pembakar bunsen;

pH meter;

timbangan;

magnetic stirer;

pengocok tabung (vortex);

inkubator;

penangas air temperature 45,5°C ± 0,2

°C

autoklaf;

lemari steril (clean bench);

lemari pendingin (refrigerator);

freezer.

IV. Prosedur Kerja

Setiap proses pengujian selalu disertai dengan menggunakan kontrol positif.

1. Pra-pengayaan

a) Timbang sampel bubuk formula padat dan semi padat sebanyak 25 g atau ukur

sebanyak 25 ml contoh cair secara aseptik kemudian masukkan dalam wadah

steril atau kedalam tabung Erlenmeyer. Masing-masing di lakukan 3 kali

pengulangan (triplicate).

b) Masukkan sampel susu bubuk kedalam plastic stomacher steril, Tambahkan 225

ml larutan LB ke dalam kantong steril yang berisi contoh, homogenkan dengan

stomacher selama 1 menit sampai dengan 2 menit (kecuali untuk contoh susu

cair).

c) Panaskan sampai 45,5 °C dengan penangas air. Lanjutkan dengan Inkubasikan

pada temperatur 35 °C selama 24 jam ± 2 jam.

2. Pengayaan

2.1 Enterobacter sakazakii

Page | 4

Pipet 1 ml suspensi, masukkan ke dalam botol pengenceran dan tambahkan 10 ml EE

broth.

Inkubasikan pada temperatur 36°C ± 1°C selama 24 jam.

2.2 Salmonella spp

a) Aduk perlahan biakan pra-pengayaan kemudian ambil dan pindahkan masing-masing 1

ml ke dalam media 10 ml TTB, sedangkan untuk media RV pindahkan 0,1 ml ke dalam

10 ml RV.

b) Contoh dengan dugaan cemaran Salmonella spp. tinggi (high microbial load).

Inkubasikan media RV pada temperatur 42 °C ± 0,2 °C selama 24 jam ± 2 jam.

Sedangkan untuk media TTB inkubasi pada temperatur 43 °C ± 0,2 °C selama 24 jam ± 2

jam.

c) Contoh dengan dugaan cemaran Salmonella spp. rendah (low microbial load).

Inkubasikan media RV pada temperatur 42 °C ± 0,2 °C selama 24 jam ± 2 jam.

Sedangkan untuk media TTB inkubasi pada temperatur 35 °C ± 2 °C selama 24 jam ± 2

jam.

3. Isolasi dan identifikasi

3.1 Enterobacter sakazakii

Ambil 0,1 ml sampel dan ratakan pada permukaan media VRBG agar dalam cawan Petri

dengan menggunakan batang gelas bengkok (hockey stick).

Inkubasikan pada temperatur 36°C ± 1°C selama 24 jam pada posisi terbalik.

Amati koloni tersangka (bakteri) dengan ciri berlendir dan berwarna ungu dikelilingi

dengan zona keunguan.

Ambil koloni bakteri dan inokulasikan/goreskan (streak) pada media agar kromogenik

berformulasi DFI atau Chromocult E. sakazakii.

Inkubasi pada temperatur 36 °C ± 1°C selama 24 jam pada posisi terbalik.

Amati koloni. Pendekatan hasil dilakukan secara kualitatif, satuan hasil / nilai

pengukuran dinyatakan dalam positif atau negatif. Uji positif jika Enterobacter sakazakii

(Cronobacter spp.) menunjukan warna hijau toska atau hijau-kebiruan

Pengujian Salmonella sp

Page | 5

a) Ambil dua atau lebih koloni dengan jarum ose dari masing-masing media pengayaan

yang telah diinkubasikan, dan inokulasikan pada media HE, XLD dan BSA. Inkubasikan

pada temperatur 35 °C selama 24 jam ± 2 jam. Untuk BSA apabila belum jelas dapat

dinkubasikan lagi selama 24 jam ± 2 jam.

b) Amati koloni Salmonella pada media HE terlihat berwarna hijau kebiruan dengan atau

tanpa titik hitam (H2S).

c) Pada media XLD koloni terlihat merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat

hampir seluruh koloni hitam.

d) Pada media BSA koloni terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di

sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi

hitam.

e) Lakukan identifikasi dengan mengambil koloni yang diduga dari ketiga media tersebut.

Inokulasikan ke TSIA dan LIA dengan cara menusuk ke dasar media agar, selanjutnya

digores pada media agar miring.

f) Inkubasikan pada temperatur 35 °C selama 24 jam ± 2 jam. Amati koloni spesifik

Salmonella dengan hasil reaksi seperti tercantum pada Lakukan uji Indol pada tabung tripton

borth, metal merah dan Voges-proskauer pada tabung MRVP broth. kemudian amati hasil.

Uji indole : tambahkan tiga sampai 5 tetes reagen kovac pada typtone broth dengan

menggunakan pipet pasteur. Hasil positif bila terbentuk cincin merah pada permukaan.

Uji Voges-Proskauer (VP) : pindahkan 1 ml kultur dari MR-VP broth ke tabung yang

steril, tambahkan 0,6ml naftol dan kocok. Tambahkan 0,2ml 40% larutan KOH, kemudian

dikocok. Lihat hasilnya setelah 4 jam: perubahan warna merah muda menjadi merah rubby

pada broth menunjukkan hasil positif.

Uji Methyl Red (MR) : pindahkan 5 ml MR-VP broth kedalam tabung steril. Tambahkan

lima sampai enam tetes indikator metil merah. Hasil positif bila media berwarna merah.

Uji simmons sitrat agar: hasil positif bila warna berubah dari hijau menjadi biru.

BAB III

Page | 6

PEMBAHASAN

Metode yang digunakan untuk pengujian mikrobiologi sangat ditentukan oleh persyaratan

yang diacu, umumnya pengujian dilakukan secara kualitatif dengan metode pengkayaan

(enrichment) yaitu isolasi dan identifikasi mikroba dan interpretasi hasil (negatif per gram/ml

atau negatif per 25 gram atau per 100 gram/ml).Pengujian secara kuantitatif (enumerasi) dengan

penghitungan jumlah mikroba dan interpretasi hasil berupa koloni per ml/g atau koloni/100 ml.

Untuk mendeteksi adanya Enterobacter sakazakii dapat digunakan metode FDA/BAM

(Food and Drug Analytical / Bacteriological Analytical Manual). Setelah sampel melewati tahap

pengkayaan (Pre-enrichment dan Selective enrichment) dalam media Buffered Peptone Water

(BPW) dan EE Broth. Metode tersebut menggunakan media agar Violet Red Bile Glucose

(VRBGA) dimana setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 36°C akan tampak koloni

berwarna ungu yang dikelilingi oleh halo berwarna ungu yang merupakan hasil endapan dari bile

salt. Kemudian diikuti dengan identifikasi biokimia menggunakan Tryptic Soy Agar (CASO

Agar) untuk mengamati ciri khusus, yaitu pembentukan pigmen kuning yang dimiliki E.

sakazakii setelah diinkubasi selama 48 – 72 jam pada suhu 25°C.

Metode FDA/BAM ini secara keseluruhan membutuhkan sekitar 7 hari untuk melakukan

analisa. Selain membutuhkan waktu yang sangat lama, ternyata berdasarkan penelitian yang

dilakukan oleh Iversen dan Forsythe (2007) menunjukkan bahwa sekitar 2% dari strain

Enterobacter sakazakii tidak membentuk pigmen kuning pada saat ditumbuhkan pada media

CASO Agar di suhu 25°C. Padahal, karakteristik itulah yang sering digunakan sebagai

identifikasi Enterobacter sakazakii. Bahkan beberapa penelitian sebelumnya juga menyebutkan

bahwa seringkali beberapa strain Enterobacter sakazakii tidak dapat tumbuh pada media standar

untuk bakteri Entrobacteriaceae dan Coliform.Oleh karena itulah metode baru yang lebih baik

untuk mengidentifikasi Enterobacter sakazakii kemudian dikembangkan oleh para ahli. Setelah

dilakukan berbagai penelitian, kemudian diketahui bahwa Enterobacter sakazakiimemiliki

karakteristik yang lebih spesifik dibandingkan dengan pembentukan pigmen kuning pada CASO

Agar, yaitu bakteri tersebut memiliki enzim α-D-glucosidase. Karakteristik ini dimiliki oleh

100% strain Enterobacter sakazakii dan tidak dimiliki oleh 100% strain Enterobacter lainnya.

Page | 7

a. EE BROTH (Enterobacteriaceae Enrichment Broth)

Merupakan sebuah media yang digunakan sebagai media pengkayaan untuk

Enterobacteriaceae dalam pengujian bakteriologi dalam makanan.Typical formula : (g/L)

Peptone 10.0

Glucose 5.0

Disodium hydrogen phosphate anhyd. 6.45

Disodium hydrogen phosphate anhyd. 2.0

Ox Bile purified 20.0

Brilliant green 0.0135

pH 7.2 ± 0.2 @ 25°C

b. VRBGA(Violet red bile glucose Agar) ,

A medium for the enumeration of Enterobacteriaceae in foodstuff.Typical formula :

(g/L)

Peptone 7.00

Yeast Extract 3.00

Sodium Chloride 5.00

Bile Salts No.3 1.50

Glucose 10.00

Neutral Red 0.030

Crystal Violet 0.002

Agar 12.00

pH 7.4 ± 0.2

c. Mac Conkey Agar (MCA)

Merupakan media yang mengandung garam empedu (untuk menginhibisi bakteri gram

positif), pewarna kristal violet (yang juga menginhibisi bakteri gram positif), pewarna netral

merah (digunakan untuk mikroba yang dapat memfermentasi laktosa), laktosa dan pepton.

Komposisi :

Peptone 17 g

Proteose peptone 3 g

Lactose 10 g

Bile salts 1.5 g

Sodium chloride 5 g

Neutral red 0.03 g

Agar 13.5g

Page | 8

Water - add to make 1 litre; adjust pH to 7.1 ± 0.2

Pewarna crystal violet yang mempunyai konsentrasi 0.0001% (0.001 g per liter) digunakan saat

mengecek bakteri gram positif yang sudah dihambat.

d. Xylose lysine deoxycholate agar (XLD)

XLD Agar dikembangkan oleh Taylor untuk meningkatkan efisiensi isolasi dan identifikisi dari

patogen-patogen Shigella tertentu.Patogen-patogen yang dibedakan tidak hanya dari yang dapat

memfermentasi lactose non pategenik tapi juga banyak dari non patogen yang tidak dapat memfermentasi

laktosa dan sukrosa.Ditambah lagi, medium ini sudah dapat digunakan untuk pertumbuhan Shigella, yang

mana media yang lain sering gagal untuk menumbuhkan Shigella karena dapat dimasuki oleh inhibitor

beracun. Hasil MPN yang diperoleh didukung dengan adanya efisiensi yang tinggi dari media XLD Agar ini

untuk isolasi primer Shigella dan Salmonella. Komposisi Xylose per L air murni (3.5 g) :

L-Lysine 5.0

Lactose 7.5

Sucrose 7.5

Sodium Chloride 5.0

Yeast Extract 3.0

Phenol Red 0.08

Sodium Desoxycholate 2.5

Sodium Thiosulfate 6.8

Ferric Ammonium Citrate 0.8

Agar 13.5

Metode kuantitatif (Enumerasi)

Metode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel,

umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Paling Mungkin atau

MostProbable Number (MPN). Uji Angka Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob

mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat

diamati secara visual dan dihitung, interpretasi hasil berupa angka dalam koloni(CFU) per ml/g atau

koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar. Angka

Paling Mungkin (MPN) menggunakan media cair dengan tiga replikasi dan hasil akhir berupa

kekeruhan atau perubahan warna dan atau pembentukan gas yang juga dapat diamati secara visual,

dan interpretasi hasil dengan merujuk kepada Tabel MPN. Dikenal 2 cara yaitu metode 3 tabung dan

metode 5 tabung. Metode kuantitatif dilakukan dengan beberapa tahap yaitu:

Homogenisasi sampel

Sebagai tahap pendahuluan dalam pengujian yang berguna untuk membebaskan sel bakteri yang

mungkin terlindung partikel sampel dan untuk memperoleh distribusi bakteri sebaik mungkin.Homogenisasi

dapat dilakukan menggunakan alat seperti stainless steel blender atau stomaker.Sedang sampel bentuk cair

tidak perlu menggunakan alat, cukup langsung dicampur dengan pengencer dan dikocok sampai homogen.

Tahap pengenceran

Page | 9

Menggunakan larutan pengencer yang berfungsi untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang

mungkin kehilangan vitalitasnya karena kondisi di dalam sampel yang kurang menguntungkan.

Pengenceraan suspensi sampel dilakukan untuk mendapatkan koloni yang tumbuh secara terpisah dan dapat

dihitung dengan mudah, hal ini akan sangat membantu terutama untuk sampel dengan cemaran yang sangat

tinggi. Umumnya pengencer yang digunakan adalah peptone water 0,1%, buffer fosfat atau larutan ringers (4

kali kuat), dan peptone 0,1% plus NaCL 0,85% (ISO 6887:1983).

Tahap pencampuran dengan media (padat/cair)

Media padat yang digunakan umumnya adalah Plate Count Agar (PCA) atau Nutrient Agar (NA)

sedangkan untuk inokulasi suspesi homogenat sampel ke dalam media, tergantung dengan metode yang

telah dipilih dan kesesuaian dengan sifat sampel dan mikroba yang mungkin ada dalam sampel. Pada

keadaan tertentu, media perlu ditambah dengan bahan lain seperti glukosa untuk Enterococcus, atau serum

untuk Mycoplasma dan egg yolk. Untuk bakteri tertentu misalnya yang tidak tahan panas terutama untuk

pencampuran dengan media dengan suhu kira-kira 45oC, dilakukan dengan metode sebar atau tetes dan

suhu inkubasi rendah (misal. bakteri Psychrotroph dan Psychrophiles).

Tahap inkubasi dan pengamatan

Inkubasi dilakukan pada suhu dan lama yang sesuai dan kondisi dibuat sedemikian rupa disesuaikan

dengan sifat mikroba (kondisi aerob atau anaerob):

- 0 – 10oC untuk bakteri Psikrotrof dan Psikrofil

- 20 – 32oC untuk bakteri Saprophtic mesophiles

- 35 – 37oC (atau 45oC) untuk bakteri parasites mesofil

- 55 – 63oC atau lebih tinggi untuk bakteri Termofilik

- 30 – 32oC (ISO 4833:1991)

Metode Kualitatif (Pengkayaan)

Pada metode kualitatif dilakukan perbanyakan (enrichment pengkayaan) terlebih dahulu dari sel

mikroba yang umumnya dalam jumlah yang sangat sedikit dan bahkan kadang-kadang dalam kondisi

lemah. Ada beberapa tahap yang dilakukan yaitu tahap pengkayaan (enrichment), tahap isolasi pada

media selektif, tahap identifikasi dengan reaksi biokimia, dan dilanjutkan dengan analisa antigenik

atau serologi atau immunologi dan bila diperlukan dapat juga dilakukan identifikasi DNA bakteri

dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction)

Tahap pengkayaan

Umumnya digunakan media cair yang berguna untuk memberi kesempatan supaya bakteri dapat tumbuh

pada media pengkaya, karena bakteri lain juga dapat tumbuh, maka dapat ditambahkan inhibitor untuk

mencegah atau menghambat pertumbuhan bakteri lain dan dilanjutkan dengan menumbuhkan kembali

bakteri dalam media selektif atau differensial. Pada keadaan tertentu dimana bakteri sangat lemah perlu

dilakukan terlebih dahulu tahap pra-pengkayaan (pre-enrichment) misalnya pada uji Salmonella ataupun

Page | 10

Enterobacter sakazakii, dimana media ini mengandung cukup gizi yang non selektif. Tahap ini dimaksudkan

untuk “menyembuhkan atau menguatkan” sel bakteri yang sangat lemah atau sakit disebabkan oleh proses

pengolahan makanan. Umumnya pada tahap pra-pengkayaan digunakan media Lactose Broth (LB) atau

Buffered Pepton Water (BPW), walaupun kadang-kadang media ini belum tentu sesuai untuk semua jenis

sampel. Pada makanan kering seperti yeast dan susu bubuk, sampel hanya memerlukan rekonstitusi dalam

air suling yang mengandung Brilliant Green. Sedangkan untuk sampel yang sangat berlemak seperti hasil

olahan jeroan maka ke dalam media pra-pengkaya ditambahkan Tergitol 7 sehingga memudahkan dispersi

lemak pada media.

Tahap isolasi

Setiap koloni atau galur mikroba yang akan diidentifikasi harus benar benar murni dan untuk

mendapatkan biakan murni digunakan media selektif yang memungkinkan untuk isolasi koloni mikroba

tersangka berdasarkan pada karakter biokimia dari mikroba yang akan mempengaruhi sifat pertumbuhan

bakteri pada suatu media spesifik. Identitas mikroba dapat dilihat dari pembentukan koloni yang spesifik

pada media.Saat ini, perkembangan metode pengujian cepat (rapid test) dengan menggunakan media selektif

sudah makin berkembang dimana pada media sudah ditambahkan suatu indikator/ bahan kimia tertentu yang

dapat menandai adanya hasil reaksi enzimatis sehingga terbetuk warna atau fluoresensi sehingga media

tersebut lebih spesifik lagi (misalnya media kromokult dan fluorokult).

Pengujian Enterobacter sakazakii

Tahap Pra-pengkayakan

Media kultur cair Buffered Peptone Water (BPW) untuk memulihkan kondisi bakteri yang injured,

sehingga meminimalkan terjadinya falsenegative

Tahap pengkayakan

Pada tahap pengkayaan, digunakan media EE Broth.Metode tersebut menggunakan media agar Violet

Red Bile Glucose (VRBGA). Pada media VRBGA setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 36°C, E.

sakazakiiakan tampak sebagai koloni berwarna ungu yang dikelilingi oleh halo berwarna ungu yang

merupakan hasil endapan dari bile salt.

Tahap selektif media

Penambahan media Chromogenic Enterobacter sakazakii Agar (DFI formulation) atau suatu media

chromogenic menghasilkan koloni khas berwarna biru – hijau – turqois pada media Enterobacter

sakazakii Agar, sedangkan bakteri lainnya akan tampak tidak berwarna. Warna biru-hijau-turqois

tersebut adalah hasil reaksi α-D-glucosidase (enzim yang hanya dimiliki E. sakazakii)yang

menghidrolisis senyawa 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside (x-α-Glc) yaitu senyawa

yang sengaja ditambahkan dalam media Enterobacter sakazakii Agar sebagai penanda kehadiran E.

sakazakii (Kane V, 2004) setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 45°C ± 1°C, pada posisi terbalik.

Penggunaan suhu inkubasi 45°C selama 24 jam disebutkan sebagai suhu inkubasi yang paling optimal

untuk pertumbuhan strain E. sakazakii dan paling optimal untuk menghambat pertumbuhan mikroflora

background. Metode ini lebih cepat dibandingkan metode konvensional yang biasa dilakaukan.Page | 11

Pengujian Salmonella spp

Sampel susu atau bubuk formula padat dan semi padat yang ada di dalam tabung steril, kemudian

ditambahkan TSB. Aduk hingga merata. Inkubasi selama 24jam pada suhu 37OC. TSB (tryptic soy broth)

merupakan media umum yang digunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme. Kemudian 1 ml hasil

inkubasi diinokulasikan pada TT (tetrathionate) broth dan SC ( selenite cystine) broth. Inkubasikan pada

suhu 37OC selama 24 jam. TT broth dan SC broth merupakan media selektif untuk mendeteksi dan

mengidentifikasi salmonella pada makanan. Natrium selenite pada media SC broth berfungsi untuk

menghambat bakteri coliform. Sistin untuk mengfasilitasi pertumbuhan salmonella. TT broth mengandung

natrium tiosulfat, garam empedu, proteose pepton dan kalsium karbonat. Kemudian dalam persiapan media

ditambahkan larutan iodin sehingga membentuk TT. TT yang dihasilkan ini akan menghambat pertumbuhan

bakteri coliform. Garam empedu pada media TT berfungsi untuk menghambat pertumbuhan bakteri positif.

Kalsium karbonat berfungsi sebagai buffer dan proteose pepton berfungsi sebagai penghasil nutrisi. Hasil

inkubasi dari TT broth dan SC broth masing-masing diinokulasikan pada tiga media yaitu BS broth, XLD

agar dan HE agar. Ketiga media ini digunakan untuk menseleksi dan membedakan salmonella dari bakteri

lainnya. Kemudian inkubasi pada suhu 35OC selama 24 jam. Lakukan pengamatan koloni salmonella pada

setiap media, kemudian ambil koloni yang menunjukkan hasil positif dari masing-masing media. Hasil

positif bila:

HE: koloni berwarna hijau biru atau biru, dengan atau tanpa warna hitam di tengah koloni.

BS: koloni salmonella berwarna coklat, abu-abu, hitam atau terkadang seperti metal. Media akan

berwarna coklat kemudian menjadi hitam selama waktu inkubasi.

XLD: koloni akan berwarna merah muda, dengan atau tanpa warna hitam. Koloni salmonella

seringkali berwarna hitam dan mengkilap.

Ambil koloni positif dengan cara menyentuhkan jarum yang telah ada koloninya ke permukaan

media secara zigzag dan akhiri dengan menusukkan ujung jarum tersebut pada bagian bawah tabung

media TSI (triple sugar iron) dan LIA (lysin iron) agar miring. Inkubasikan TSI dan LIA pada suhu

37OC selama 24 jam. TSI agar merupakan media yang direkomendasikan untuk identifikasi bakteri

gram negatif berdasarkan fermentasi glukosa, laktosa dan sukrosa dan produksi hidrogen sulfit. LIA

agar merupakan medium yang digunakan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan

dekarboksilase lisin dan produksi hidrogen sulfida. Ambil koloni dari media TSI agar miring yang

menghasilkan hasil positif. Inokulasikan pada triptone broth, MRVP broth dan simmons sitrat agar.

Inkubasikan triptone broth pada suhu 35OC selama 24 jam. Inkubasikan MRVP broth pada suhu 35OC

selama 48 jam. Dan inkubasikan simmons sitrat agar pada suhu 35OC selama 46 jam. Tripton broth

merupakan media hasil pencernaan kasein dan digunakan karena karena mengandung triptofan.

Media ini membedakan kultur yang dapat menghasilkan indol atau tidak menghasilkan indol. MR-

VP broth berisi glukosa, pepton, dan beberapa garam. Media ini digunakan untuk membedakan

organisme yang menggunakan asam pada metabolisme (dideteksi dengan metil merah) atau Page | 12

menggunakan butilen glikol (dideteksi dengan uji voges-proskauer). Simmon sitrat agar medium ini

digunakan untuk mengetahui organisme yang menggunakan natrium sitrat sebagai sumber karbon.

Jika natrium sitrat digunakan, product alkaline seperti NaOH dihasilkan. Indikator yang digunakan

adaah bromotimol biru, yang akan berwarna biru pada pH basa. Lakukan uji indol pada tabung

tripton broth, metil merah dan voges-proskauer pada tabung MRVP broth. Kemudian amati hasil

pada media simmons sitrat. Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah bakteri dapat

menghidrolisis asam amino triptofan menjadi senyawa indol. Uji metil merah dan voges proskauer

digunakan untuk membedakan bakteri yang mampu menggunakan asam atau tidak. .

Page | 13

BAB IV

KESIMPULAN

1. Untuk mendeteksinya adanya Enterobacter sakazakii dan Salmonella spp dalam susu bubuk dapat

digunakan dengan metode FDA/BAM

2. Ada 3 tahap untuk mendeteksi adanya bakteri Enterobacter sakazakii pada susu bubuk formula

yaitu :

Tahap Pra-pengkayaan

Tahap Pengkayaan

Tahap Selektif Media

Positif jika:

- Enterobacter sakazakii: koloni khas berwarna biru – hijau – turqois pada media Enterobacter

sakazakii Agar,

- Salmonella yaitu : TT broth dan SC broth merupakan media selektif untuk mendeteksi dan

mengidentifikasikan salmonella pada makanan. Sedangkan pada media XLD Agarakan

tampak sebagai koloni berwarna hitam dan mengkilap.

Page | 14

DAFTAR PUSTAKA

McLandsborough, Lynne;2005; Food Microbiology Laboratory; Boca Raton, London, New York,

Washington D.C; CRC press

Volk Wesley, Margaret Wheeler, 1988, MIKROBIOLOGI DASAR Edisi V, Jakarta: Erlangga

SNI 01-2970-2006, Susu bubuk.http://sisni.bsn.go.id/

SNI 01-2782-1998, metode pengujian susu segar http://sisni.bsn.go.id/

Karsinah. 1994. Batang Negatif Gram: Entrerobacteriaceae. Di dalam: Staf Pengajar FK UI Buku

Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Binarupa Aksara. hlm 150

Page | 15