Ematologia di Laboratorio:Percorsi diagnostici e obiettivi Clinici

L’analisi delle Piastrine e degli Indici Piastrinici in Citometria Automatizzata:

principi tecnologici, validazioni e applicazioni.

Dr Rocco VincenzoA.O. G. Rummo Benevento

Piastrine

Sono frammenti cellulari anucleati derivate dai Megacariociti di forma rotonda o ovale negli strisci effettuati da provette con EDTA.

Tipicamente, sono costituite da una parte centrale, o cromomero, che è formata da piccole granulazioni di colore rosso vivo, e da una parte periferica, o ialomero, composta da un citoplasma incolore o leggermente basofilo.

La conta delle piastrine nei soggetti sani è di 150.000-400.000/mmc; il loro Volume nei sani va da 7,7 a 11,2 fL e la durata di vita è di 10 giorni.

Perché è importante contare accuratamente le piastrine?

La valutazione clinica dei disordini quantitativi del sistema piastrine-megacariociti è a tutt’oggi basata:

• sul conteggio delle piastrine nel sangue periferico• sulla stima del numero e della morfologia dei megacariociti nel midollo osseo• sulla valutazione dell’eventuale sequestro splenico.

Evidenza di Trigger (valori soglia)

Harker and Slichter NEJM 1972 and 1978

> 100.000

< 100.000

Conta piastrine

BLEEDING

TIME

• Con piastrine > 100.000/mmc il Tempo di Sanguinamento non è inficiato

• per ogni riduzione di 10.000 piastrine (sotto 100.000) il Tempo di Sanguinamento si allunga in modo lineare

• Con piastrine < 10.000/mmc il tempo è maggiore di 30 minuti e non ècorrelato alla conta piastrinica

• Con piastrine < 5.000/mmc possono aversi sanguinamenti spontanei nel tratto gastro-intestinale

È osservazione comune che:• non esiste una correlazione tra conteggio piastrinico e comparsa di manifestazioni emorragiche.

• oltre al numero delle piastrine il rischio di sanguinamento dipende dalla causa della piastrinopenia, dalle patologie concomitanti (anemia, febbre, sepsi) e dall’uso di farmaci.

Livelli piastrinici >50.000/mmc sono sufficienti a garantire l’emostasi in corso di interventi chirurgici.

Gravi emorragie sono rare con piastrine >20.000/mmc.

3.000.000 di Unità trasfuse in un anno negli USA

(l’80% delle quali in pazienti con Malattie ematologiche)

Rischi nelle trasfusioni di piastrine

Rischio di trasmissione di malattie infettive• HIV ( 1/300.000 Unità )• HBV ( 1/200.000 Unità)• HCV ( 1/ 4.000 Unità)• HTLV-1 ( 1/70.000 Unità)• Prioni ( ? )• altro ( ? ? )

Contaminazione leucocitaria

(reazioni febbrili, Alloimmunizzazione, Graft versus Host Diease, Immunosoprressione, Infezione da CMV)

Rischio di contaminazione batterica• 0.03% delle aferesi piastriniche• 0.14% nei pool piastrinici da donatori random

Contaminazione con citochine• IL-1• IL-6

Costi delle trasfusioni di piastrine

• Reclutamento dei Donatori• Test sui Donatori• Raccolta del prodotto• Test sul prodotto• Conservazione del prodotto• Trattamenti speciali ( leucodeplezione, irradiazione)• Infusione• Trattamento delle complicanze

Almeno 1.000 Dollari (Euro) per Unità trasfusa

Consensus Conference on Platelet transfusion (Edimburgo 1997)

Soglia Profilattica

• 10.000/mmc in pazienti stabili• 20.000/mmc in pazienti in terapia eparinica, disordini della coagulazione, puntura lombare, biopsia osteo-midollare• 30.000/mmc per inserzioni di catetere per accesso venoso centrale• 50.000/mmc per interventi chirurgici minori

American Society of Clinical Oncology (2001)

Soglia Profilattica

10.000/mmc (tranne nei pazienti sottoposti a chemioterapia aggressiva per neoplasia della vescica o in caso di tumori necrotici).

British Committee for Standard in Hematology (2003)

Soglia Profilattica

• 10.000/mmc in pazienti non a rischio• 5.000/mmc (se c’è la preoccupazione che l’alloimmunizzazione possa portare alla refrattarietà piastrinica).

I clinici che utilizzano le soglie profilattiche per le trasfusioni piastriniche di 10.000/mmc e 5.000/mmc devono essere a conoscenza dei limiti nella precisione e nell’accuratezza delle conte a questi livelli.

• Metodi indiretti in cui i GBR sono contati direttamente e la proporzione con le piastrine determinata su uno striscio di sangue colorato;

• Metodo diretto manuale mediante emocitometro e microscopio;

• Metodi semiautomatici in cui le conte sono eseguite elettronicamente su plasma ricco di piastrine (PRP);

• Metodi completamente automatizzati.

Tecniche per la conta piastrinica

Metodo Indiretto

Metodi Diretti Microscopici in Contrasto di Fase (1953)

• Metodo di riferimento internazionale per molti anni;

• Poco costoso e semplice;

• Dispendioso in termini di tempo, soggettivo, tedioso;

• Scarsa precisione (CV 10-25%).

Esempi degli analizzatori ematologici correntemente

disponibili con i metodi per la conta delle Piastrine

Ditta Strumento Principio di conta

piastrinica

Abbott CELL-DYN Sapphire Impedenza, ottico e

Immunologico

ABX Petra-120 Impedenza

Siemens ADVIA2120 Ottico

Coulter LH-750 e DX-800 Impedenza

Sysmex XE-2100 Impedenza e ottico

L’introduzione del conteggio piastrinico automatizzato ha drammaticamente migliorato l’imprecisione con:

CV <3% (nel range di normalità)

PLT

RBC

Elettrodo interno

Elettrodo interno

Elettrodoesterno

Elettrodoesterno

Flusso del diluenteFlusso del diluente

Vuoto regolatoVuoto regolato

Ma la separazione delle piastrine è complicata dal fatto che esse hanno un’ampia distribuzione volumetrica , che si estende dai valori del rumore di fondo a quelli delle emazie microcitiche.

CrioglobulineBatteriRumore di fondo

Macrotrombociti MicrocitiFrammenti RBC e WBC

Coulter

Utilizzo di Algoritmi per la separazione delle grandi piastrine dai microciti e frammenti.

Sysmex (Dasit)

Utilizzo di Soglie Mobili per la separazione delle grandi piastrine dai microciti e frammenti.

Piastrine e Metodi Ottici

Nei sistemi a lettura ottica, lo scatterdella luce laser dipende da:

• grandezza delle particelle

• grado di rigonfiamento delle stesse

• indice relativo di rifrazione tra particelle in sospensione e mezzo sospendente

L’Indice di rifrazione a sua volta dipende da:

• granularità

• concentrazione dei costituenti citoplasmatici

• variazione d’aspetto delle superfici

• vacuolizzazione citoplasmatica

High angle detector5°-15°

LUCE RIFRATTA

Low angle detector2°-3°

SCATTER

Siemens –ADVIA 120 e 2120

GRANULOSITA’

VOLUME

detritidetriti

PLTPLT

MacroPLTMacroPLT MicrocitiMicrociti

FrammentiFrammenti

GhostGhost

Conta ad Impedenza e ottica sui sistemi Abbot

Conta Ottica sui sistemi Sysmex (Dasit)

RBC

Reticolociti

PLT

Frammenti

IPF

Qual è il migliore? Quale scegliere?

?

Sia le conte ad impedenza del Coulter LH 750 che del Sysmex XE-

2100 mostrano una correlazione lievemente migliore con il

metodo di riferimento rispetto alle conte ottiche sia dell’ADVIA

120 che del Sysmex XE-2100.

Questa differenza diventa ancora più apparente alle conte

piastriniche molto basse.

La conta ottica su ADVIA 120 correla meglio con

il metodo di riferimento (conta immunologica

con il metodo RBC/PLT).

Le conte ad impedenza di altri strumenti

valutati hanno una scarsa correlazione con il

metodo di riferimento.

Studi pubblicati sembrano dimostrare la

superiore performance della conta ottica

ADVIA rispetto alle conte ad impedenza.

Il metodo di riferimento utilizzato è però

quello della conta manuale diretta.

Tutti gli strumenti automatici forniscono una conta piastrinica accurata nella maggioranza dei campioni normali o con piastrine >20.000/mmc .

Ma, la performance degli attuali analizzatori automatici diventa critica per conte piastriniche a livelli bassi, proprio intorno al livello della soglia trasfusionale (10.000/mmc).

Metodo di riferimento immunologico

•Anticorpo monoclonale specifico per un antigene di superficie (CD41 o CD61) delle piastrine sia quelle a riposo che attivate;• Conta indiretta in rapporto ai Globuli Rossi;• Numero assoluto usando idonei calibratori;

10 1 10 2 10 3 10 4

FSC-Height -->

101

102

103

104

CD

41 F

ITC

-->

Plt Count = 301,600

Ratio = .078

Metodo di riferimento immunologico

• Conte accurate e precise

• Indipendenti da artefatti di pipettamento

• Indipendenti dalla presenza di sostanze interferenti

• Metodo di riferimento ICSH corrente

Immunocount su CELL-DYN 4000 e Sapphire (Abbott)

• completamente automatizzata;

• CD61 come marcatore immunologico;

• molto simile al metodo di riferimento ICSH (ma non esclude fenomeni di coincidenza);

• CV 1,6 (PLT 5.000/mmc) e 2,3 (PLT 10.000/mmc);

• costo elevato

Un caso relativamente frequente (0,07-0,1% delle determinazioni) di sottostima delle piastrine e eventuale sovrastima leucocitaria incorre in presenza di agglutinati piastrinici.

Agglutinati Piastrinici

Possono essere sospettate per:• la mancata associazione con il quadro clinico di piastrinopenia;• valori piastrinici diversi in conteggi successivi;• segnali su istogrammi e citogrammi strumentali

Possono essere divise in:• PTCP EDTA-Dipendenti• PTCP non EDTA-dipendenti

Le PTCP EDTA-dipendenti riconoscono un meccanismo autoimmune:

In EDTA esteriorizzazione della GP IIb/IIIa con esposizione di epitopi reattivi ad IgG circolanti.

Doretto P., Cappelletti P.

RiMeL 2007

Un’attenta osservazione dei Citogrammi è risolutiva per presenza di Aggregati nella maggior parte dei casi

PLT 9.000

MONO 12.3%

Senza Anticoagulante

PLT 79.000

MONO 5.4%

EDTA (subito dopo il prelievo)

PLT 76.000

MONO 6.9%

CITRATO (subito dopo il prelievo)

PLT 57.000

MONO 6.3%

EDTA (dopo 1 h)

PLT 28.000

MONO 12,9%

CITRATO (dopo 1 h)

PLT 54.000

MONO 7.3%

CITRATO (dopo 2 h)

PLT 20.000

MONO 11.7%

Le crioglobuline sono un gruppo di proteine, fisicamente e chimicamente eterogenee, che hanno la caratteristica di precipitare reversibilmente a temperature inferiori a 37°C

La crioglobulinemia è un fenomeno più frequente di quanto usualmente ritenuto. Tuttavia è spesso misconosciuta perchépiccola e/o cercata in maniera inadeguata, oppure perchésemplicemente non ci si pensa.

Crioglobuline

MALATTIE ASSOCIATE A CRIOGLOBULINEMIA

TIPO MALATTIA

I(IgM

monoclonale)

mielomamacroglobulinemiaMGUSlinfomi e leucemie linfatiche

II(2 tipi di Ig;

la paraproteina

è IgM)

malattie linfoproliferativemalattie autoimmuni (LES, AR, ecc.)epatopatie

III(più classi di

Ig, senza proteina

monoclonale)

infezioni virali (HCV, HBV, EBV, CMV,ecc)infezioni batteriche (sifilide, ecc.)infezioni fungine (coccidiomicosi)infez. Parassitarie (toxoplasmosi, ecc.)epatopatiemalattie autoimmuni

Molto più interessanti sono quelle condizioni nelle quali la crioglobulinemia non si associa ad altra patologia (crioglobulinemia essenziale) e determina un quadro clinico caratteristico che viene oggi diagnosticato sempre piùfrequentemente.

SINTOMATOLOGIA della CRIOGLOBULINEMIA

Da crioprecipitazione da Vasculite

fenomeno di Raynaudcianosi e necrosi distali

porpora ed ulcere cutaneeglomerulonefriteartralgieneuropatie periferiche

ESAMI DI LABORATORIO FALSAMENTE ALTERATI NELLA CRIOGLOBULINEMIA

• VES > o <• LEUCOCITOSI• PIASTRINOSI• ANEMIA• IPOGAMMAGLOBULINEMIA

da Tura, Ematologia Clinica, Piccin

Rilevamento delle crioglobuline mediante l’osservazione dello “spike” sull’istogramma X fornito dagli strumenti della serie H, con la caratteristica normalizzazione dello stesso istogramma (scomparsa dello spike) dopo incubazione a 37°C.

T° < 37°C a 37°C

Anche gli Istogrammi delle Piastrine prodotti dagli Strumenti ad Impedenza sono caratteristici presentando il caratteristico “spike”.

A 37°C

A T°ambiente dopo 10’

Indici Piastrinici

In rapporto alla loro tecnologia, tutti gli analizzatori hanno la possibilità di fornire i cosiddetti “indici Piastrinici”.

MPV (Volume Piastrinico Medio)

È il parametro che ha avuto maggiore fortuna.

La sua utilità clinica è legata:

• alla differenziazione delle piastrinopenie da aumentata distruzione o periferiche da quelle da diminuita produzione o centrali o ipoplasiche;

• alla differenziazione fra Trombocitosi “reattive” (MPV normale) e da malattia mieloproliferativa (MPV elevato insieme ad elevato PDW).

MPV (e Malattie Cardiovascolari)

Differenze nel MPV fra casi di AMI e controlli non-AMI

Differenze nel MPV fra casi di Restenosi e non-restenosi dopo impianto di stent.

Differente mortalità dopo AMI in pazienti con MPV normale o elevato.

Le grandi piastrine • sono metabolicamente e enzimaticamente più attive delle piccole piastrine;• contengono più materiale protrombotico con aumentato contenuto A2 e B2 per unità di volume• hanno aumentata espressione dei recettori GP IIb-IIIa • hanno aumentata aggregabilità in risposta all’ADP• hanno diminuita inibizione dell’aggregazione da parte della prostaciclina• sono più dense e contengono più α-granuli

Nelle conte ad impedenza il MPV aumenta col tempo poichéle piastrine si rigonfiano nell’EDTA.

Quando è misurato con i metodi ottici, il MPV diminuisce col tempo (per la diluizione del contenuto piastrinico).

Differenti analizzatori hanno differenti range di normalità per il MPV.

La “delusione” MPV

Gli studi di popolazione prima riportati sono poco applicabili nel singolo paziente

MPC (Mean Platelet Component) che è una misura della densitàpiastrinica;

MPM (Mean Platelet Mass) calcolato in rapporto al Volume delle piastrine e al loro MPC.

Piastrine Reticolate

Sono le piastrine di nuova formazione (analoghe dei reticolociti per i GBR).

Nella metodica citofluorimetrica viene usato il Plasma Ricco di Piastrine e l’Arancio di Tiazolo come colorante.

Utilizzo Clinico• Aumentate nelle Piastrinopenie da Iperdistruzione (ad es. ITP);• Ridotte nelle Piastrinopenia da ridotta produzione• Predicono la risalita delle piastrine dopo chemioterapia o dopo trapianto.

Frazione Piastrinica Immatura (IPF) Sysmex

La conta ottica in fluorescenza delle piastrine (eseguita nel canale reticolociti) è in grado di fornire la Frazione Piastrinica Immatura (IPF) che sembra corrisponda alle Piastrine Reticolate

ConclusioniI sofisticati analizzatori per le conte piastriniche e i costi aggiuntive per le nuove metodiche non sono giustificati in tutti i Laboratori e per tutti gli analizzatori in una sola Istituzione.

La scelta dovrà essere guidata dalla popolazione di pazienti afferenti al laboratorio e dalle richieste fatte al laboratorio.

Nei grandi Ospedali sarebbe preferibile avere delle diverse tecnologie.

Qual è la causa di questa piastrinopenia?

È da ridotta produzione o da distruzione periferica?

Qual è la causa di questa piastrinopenia?

È da ridotta produzione o da distruzione periferica?

RBC 2.680.000HgB 9.5MCV 106.9MCHC 33.1PLT 63.000

RBC 2.680.000HgB 9.5MCV 106.9MCHC 33.1PLT 63.000

• ridotto MPV (volume medio piastrinico) e assenza di macrotrombociti = ridotta produzione piastrinica, ipersplenismo

• elevato MPV (volume medio piastrinico) e/o presenza di macrotrombociti = elevata distruzione piastrinica (sepsi, pre-eclampsia, ITP).

• ridotto MPV (volume medio piastrinico) e assenza di macrotrombociti = ridotta produzione piastrinica, ipersplenismo

• elevato MPV (volume medio piastrinico) e/o presenza di macrotrombociti = elevata distruzione piastrinica (sepsi, pre-eclampsia, ITP).

Plt 61.000Plt 61.000 Plt 67.000Plt 67.000

Qual’è la causa di questa Piastrinosi?

È primitiva o reattiva?

Qual’è la causa di questa Piastrinosi?

È primitiva o reattiva?

RBC 2.680.000HgB 9.5MCV 106.9MCHC 33.1PLT 1.163.000

RBC 2.680.000HgB 9.5MCV 106.9MCHC 33.1PLT 1.163.000

• elevato PDW (anisocitosi piastrinica) e/o presenza di Macrotrombociti = Sindrome Mieloproliferativa

• normale PDW (assenza di anisocitosi) con macrotrombociti non significativamente aumentati = Trombocitosi reattiva

• elevato PDW (anisocitosi piastrinica) e/o presenza di Macrotrombociti = Sindrome Mieloproliferativa

• normale PDW (assenza di anisocitosi) con macrotrombociti non significativamente aumentati = Trombocitosi reattiva

PLT 561.000PDW aumentato

Presenza di MacroPLT

PLT 561.000PDW aumentato

Presenza di MacroPLT

Plt 1.105.000PDW normale

MacroPLT nella norma

Plt 1.105.000PDW normale

MacroPLT nella norma