LA MICRO-EVOLUTION DES MOUSSES AQUATIQUES, UN REVELATEUR DE L’IMPACT SUR LA BIODIVERSITE ET LE SUIVI A LONG TERME DE LA QUALITE

DE L’EAU A L’ECHELLE DU BASSIN VERSANT. APPLICATION A LA MISE EN ŒUVRE DE LA DIRECTIVE COMUNAUTAIRE 2000/60 EN WALLONIE.

ALAIN VANDERPOORTEN ET EMMANUEL SERUSIAUX

UNIVERSITE DE LIEGE, DEPARTEMENT DES SCIENCES ET GESTION DE

L’ENVIRONNEMENT

RAPPORT FINAL

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TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES..................................................................................................................................2 Résumé ...............................................................................................................................................................3 Summary ............................................................................................................................................................4 INTRODUCTION ET CONTEXTE DU PROJET............................................................................................5

1. Adéquation et perspectives du projet dans le contexte de l'Aquapôle........................................................5 2. Contexte et objectifs...................................................................................................................................5

2.1 La nécessité d’un suivi à long terme de la qualité des eaux .................................................................5 2.2 L’utilisation des organismes aquatiques comme bios indicateurs........................................................6 2.3 Les bryophytes aquatiques en tant que bio indicateurs ........................................................................7 2.4. Possibilités et limites actuelles de la bioindication .............................................................................8

3. Objectifs du projet ....................................................................................................................................10 RAPPORT DES ACTIVITES SCIENTIFIQUES............................................................................................11

1. Protocole de travail...................................................................................................................................11 1.1 Choix du modèle biologique ..............................................................................................................11 1.2 Echantillonnage..................................................................................................................................11

2 Résultats ....................................................................................................................................................15 2.1. Mise au point des marqueurs moléculaires .......................................................................................15 2.2 Genotypage et analyse des données ...................................................................................................15

APPORTS AU DEVELOPPEMENT SCIENTIFIQUE ..................................................................................16 BIBLIOGRAPHIE ...........................................................................................................................................17

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Résumé La directive 2000/60/CEE vise à établir un cadre pour la protection et la gestion des eaux par entité hydrographique. Sa mise en œuvre repose sur cinq étapes principales. L'une d'entre elles consiste en la mise en place, d'ici 2006, d'un programme de surveillance. Le projet que nous présentons ici vise à intégrer l'information contenue dans les organismes aquatiques pour caractériser la qualité de l'eau à l'échelle des bassins versants et suivre l'impact de celle-ci sur les communautés biologiques. Plus précisément, nous envisageons de mettre en évidence l'impact de la qualité des eaux actuelles et passée sur la structure génétique des populations de bryophytes aquatiques afin d'utiliser celles-ci comme un indicateur de la santé physico-chimique et écologique des cours d'eau. À ce titre, notre projet s'intègre dans les actions prioritaires à mener par l'Aquapôle dans le cadre de l'application de la directive 2000/60, en termes d'évaluation de la qualité physique, chimique et écologique des masses d'eau, et plus précisément du développement de nouvelles méthodes de détection et de suivi de la pollution.

En vue de la réalisation du projet, 20 individus de la mousse Platyhypnidium riparioides, choisie pour son ubiquité dans les cours d’eau wallons, ont été échantillonnées au sein de 56 populations représentant une large gamme de niveaux de pollutions historiques et contemporains. Des populations de spécimens d’herbier datant du début du 20e siècle sont également ajoutes à l’analyse en vue de servir de témoins. La structure et la diversité génétiques des populations est analysée a l’aide d’une banque de loci microsatellites construite a cet effet. Les patrons de structuration et de diversité génétiques sont analyses en termes d’aptitude à la dispersion dans l’air et dans l’eau (distances minimales entre les populations et distances linéaires le long des cours d’eau) ainsi qu’en termes de niveaux de pollution historiques et contemporains. Depuis les pics de pollution enregistrés dans les années 70-80, les bryophytes aquatiques ont recolonisés de vastes portions de cours d'eau: ces populations sont génétiquement différentes de celles qui avaient été éliminées. L'utilisation des échelles de bio indication de la qualité des cours d'eau au travers des inventaires des bryophytes aquatiques est ainsi brouillée, et ces échelles doivent être recalibrées. C'est ce que le crédit d'impulsion de l'Aquapôle a permis d'initier.

La démarche que nous proposons ici est novatrice dans la sens où elle intègre la génétique des populations et la phylogénie moléculaire à un système perfectionné de bio indication. Elle tire profit d’un contexte unique associant des connaissances enregistrées depuis plusieurs décennies sur la qualité des cours d’eau par la région Wallonne ainsi que de l’existence d’un patrimoine scientifique compose d’herbiers historiques de référence.

Ce projet permettra ainsi, outre la mise à disposition d'un système amélioré de bio monitoring directement applicable au suivi à long terme de la qualité de l'eau en Wallonie à l'échelle du bassin versant, la publication d'une série d'articles scientifiques alliant de manière originale différentes disciplines.

En développant, au cours de ce projet, des infrastructures et un pôle de recherches sur la structure génétique des populations en relation avec la qualité des eaux, nous élargirons les compétences de l'Unité d'Intégration de l'Aquapôle, tout en offrant des possibilités de recoupement avec les recherches en cours dans le domaine de l'utilisation des bios marqueurs. Notre projet pourra ainsi servir de tremplin au développement d'une nouvelle unité de recherche dans le domaine de la phylogénie et de l'évolution. Cette unité, axée autour d’ensemble de questions sur l'évolution des organismes vivants appliquée à la gestion de l'environnement, sera développée dans une perspective de collaboration avec d'autres équipes abordant sous un autre angle de telles problématiques.

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Summary The 2000/60 EEC directive aims at establishing a framework for protecting and managing water quality. The establishment of a long-term monitoring programme is one of the five foci of the directive. The proposal that we describe here aims at exploring the information contained within aquatic organisms to characterize water quality at the basin scale and monitor the impact of water quality on biological communities. More precisely, we aim at emphasizing the impact of past and present water quality on the genetic structure of aquatic bryophyte populations in order to use these organisms as bioindicators of the ecological health of the rivers. In this context, our research programme fits with the priority actions involved by the 2000/60 directive, in terms of developing new approaches to record the physico-chemical and ecological quality of water bodies.

Our strategy to characterize the impact of past and present water quality at the genetic level involved a sampling across rivers that have experienced contrasting water quality histories. We focused on the aquatic moss Platyhypnidium riparioides for its ubiquity throughout the Walloon hydrographic network. 20 specimens of the moss were sampled within each of 56 populations. Herbarium specimens dating back to the beginning of the 20th century were also incorporated into the analyses in order to serve as controls prior to the major pollution events experienced by most large rivers in the 1970s and the 1980s. The genetic structure and diversity within and among these populations is analyzed by means of microsatellite. A DNA library was specifically produced for that purpose. The patterns of variation in the microsatellite loci are being examined in terms of dispersal ability in air and water (minimum distance among populations and linear distances along streams) as well as past and present pollution levels. The preliminary results suggest that, since the pollution peaks recorded in the 1970s-1980s, massive recolonization of rivers has taken place by other genetic strains than the ones that occurred prior to the pollution events. The use of aquatic bryophytes for biomonitoring is therefore in a need of refinement and the biomonitoring scales need to be recalibrated. This is what the Aquapole grant has permitted to initiate.

The approach that is original as far as it integrates population genetics and molecular phylogenetics within an enhanced bioindication system. It takes advantage of a unique context in Wallonia that combines a long-term record of pollution levels as well as the existence of historical reference herbarium material that has been accumulated for more than 150 years.

The outputs of the programme will consist in an improved understanding of the impact of past and present pollution levels in aquatic ecosystems on micro-evolutionary processes in biocenoses. The programme will have direct implications for the long-term monitoring of water quality at the basin scale in Wallonia. He approach is, however, global and the results of the present programme will be published in international scientific journals.

By developing, in the course of this programme, an axis of research on the populations genetics of organisms in relation to water quality, we contribute to develop the scientific infrastructures at University of Liège and enlarge the domain of expertise of the Aquapole Integration Unit. This research will thus provide the appropriate template to develop a new research unit in evolutionary ecology in order to address a series of fundamental and applied issues related to environmental changes and management, together with other teams examining these issues using complementary approaches.

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INTRODUCTION ET CONTEXTE DU PROJET

1. Adéquation et perspectives du projet dans le contexte de l'Aquapôle La directive 2000/60/CEE vise à établir un cadre pour la protection et la gestion des eaux par entité hydrographique. Sa mise en œuvre repose sur cinq étapes principales. L'une d'entre elles consiste en la mise en place, d'ici 2006, d'un programme de surveillance. En accord avec les recommandations de l'UNESCO dans le cadre du programme "Man and Biosphere", le projet que nous présentons ici vise à intégrer l'information contenue dans les organismes aquatiques pour caractériser la qualité de l'eau à l'échelle des bassins versants et suivre l'impact de celle-ci sur les communautés biologiques. Plus précisément, nous envisageons de mettre en évidence l'impact de la qualité des eaux sur la structure génétique des populations de bryophytes aquatiques afin d'utiliser celles-ci comme un indicateur de la santé physico-chimique et écologique des cours d'eau. À ce titre, notre projet s'intègre dans les actions prioritaires à mener par l'Aquapôle dans le cadre de l'application de la directive 2000/60, en termes d'évaluation de la qualité physique, chimique et écologique des masses d'eau, et plus précisément du développement de nouvelles méthodes de détection et de suivi de la pollution. En développant, au cours de ce projet, des infrastructures et un pôle de recherches sur la structure génétique des populations en relation avec la qualité des eaux, nous élargirons les compétences de l'Unité d'Intégration de l'Aquapôle, tout en offrant des possibilités de recoupement avec les recherches en cours dans le domaine de l'utilisation des bios marqueurs. En effet, notre recherche pourra être poursuivie par la caractérisation écotoxicologique des souches génétiques identifiées, notamment par l'activité d'enzymes catalysant les polluants, comme par exemple la glutathion-S-transférase, dont des différences d'activité ont récemment été décelées chez différentes populations d'espèces de macrophytes aquatiques, en vue d'estimer la qualité écotoxicologique et de détecter les polluants de manière précoce. Notre projet pourra ainsi servir de tremplin au développement d'une nouvelle unité de recherche dans le domaine de la phylogénie et de l'évolution afin de répondre à un ensemble de questions d'actualité sur l'évolution des organismes vivants appliquée à la gestion de l'environnement dans une perspective de collaboration avec d'autres équipes abordant sous un autre angle de telles problématiques. La démarche que nous proposons ici est novatrice, dans la sens, où elle intègre la génétique des populations et la phylogénie moléculaire à un système perfectionné de bio indication. Ce projet permettra ainsi, outre la mise à disposition d'un système amélioré de bio monitoring directement applicable au suivi à long terme de la qualité de l'eau en Wallonie à l'échelle du bassin versant, la publication d'une série d'articles scientifiques alliant de manière originale différentes disciplines; ainsi, cette approche est-elle susceptible de connaître une large diffusion internationale.

2. Contexte et objectifs 2.1 La nécessité d’un suivi à long terme de la qualité des eaux La régularisation des grandes rivières pour le contrôle des crues, la production d’hydroélectricité et la navigation sont à la base d’une détérioration des écosystèmes d’eau douce à l’échelle du globe (Naiman 1992). En particulier, l’industrialisation des plaines alluviales a fortement contribué au déclin spectaculaire de la qualité des eaux et à des catastrophes écologiques majeures survenues dans les années 1970-1980, comme par exemple, la pollution du Rhin à l’issue de l’incendie des usines Sandoz en 1986 (Malle 1994). Ces événements de pollution spectaculaires ont agi comme un

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catalyseur pour la mise en place de protocoles internationaux visant à améliorer la qualité des écosystèmes aquatiques. L’un de ces protocoles, le Programme d’Action Rhin, implique un partenariat entre l’Allemagne, la France, la Suisse et le Grand-Duché de Luxembourg et vise à améliorer la qualité des eaux du Rhin de manière à diminuer l’émission des polluants vers la mer du Nord, à améliorer la qualité des eaux de consommation et à permettre le retour de poissons emblématiques comme le saumon (van de Kraats 1994).

Bien que la mise en œuvre de tels protocoles ait permis une amélioration sensible de la qualité des eaux (Fig. 1) (Malle 1996), des suivis à long terme indiquent que celle-ci n’a toujours pas retrouvé son état initial du début du siècle.

Fig. 1. Évolution de la demande biologique en oxygène dans différentes stations de mesures permanentes de la Seine depuis la moitié du 20e siècle (Cun et al. 1997).

En outre, la concentration en certains polluants, comme les nitrates, continue à augmenter et à menacer la santé publique (Meade 1995, Cun et al. 1997). En Europe, la préoccupation de la qualité des eaux a été stimulée à l’issue de la publication de la Directive de la Communauté Européenne sur le traitement des eaux usées (European Community 1991) et la Directive pour la gestion et la protection des eaux par entité hydrographique. Au cours de la dernière décennie, l’attention des pays européens s’est donc focalisée sur les problèmes d’eutrophisation, en utilisant largement, conformément aux recommandations de l’UNESCO dans le cadre du programme « Man and Biosphere » (http://www.unesco.org/mab/index.htm), des indicateurs biologiques de la qualité des eaux (Kelly & Whitton 1998). 2.2 L’utilisation des organismes aquatiques comme bios indicateurs Le grand défi d’un programme de suivi de la santé d’une rivière réside dans la difficulté de localiser les polluants. Ceux-ci présentent en outre une grande diversité et une forte variabilité spatio-temporelle qui nécessitent la mise en œuvre, sur un grand nombre de stations de mesures répétées régulièrement dans le temps, d’un programme à long terme particulièrement coûteux.

Les organismes aquatiques réagissent aux changements de leur environnement dans le temps. Ils constituent par conséquent des indicateurs de la qualité de l’environnement qui présentent l’avantage d’intégrer les épisodes de pollution et par conséquent de refléter la qualité des eaux dans l’espace et dans le temps (Jongman 1987).

Les techniques de bio indication font appel aux propriétés d’intégration, durant une période de temps variable suivant les cas, des épisodes de pollution des organismes aquatiques et se divisent en deux classes (Kovacs & Podani 1986). Les techniques de bio indication indirecte font appel à des

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mesures de la concentration des polluants ou à des enzymes catalysant leur métabolisme dans les organismes. Par exemple, les bryophytes aquatiques qui, en l’absence de stomates et grâce à la possession d’un limbe foliaire souvent uni stratifié, ne possèdent pas le système complexe de régulation des plantes vasculaires, sont d’excellents bios accumulateurs de polluants. Ils constituent donc des organismes utiles pour le biomonitoring, soit par la mesure des polluants présents dans les tissus (Markert et al. 1999, Samecka-Cymerman & Kempers 2000), soit la concentration des enzymes catalysant leur métabolisme (Roy et al. 1995, Christmas & Whitton 1998), ou encore par la mesure de leurs effets sur la chlorophylle (Lopez et al. 1997). Les techniques directes de bio indication, qui font l’objet de ce projet, tirent quant à elles profit des changements de la composition des communautés d’organismes aquatiques en réponse à un changement de qualité de l’environnement. Ces techniques s’appuient donc sur la mesure de l’impact des polluants sur des caractéristiques comme la composition, l’abondance et la diversité spécifiques. Elles font fréquemment appel à des analyses statistiques multi variées pour mesurer la congruence entre les caractéristiques des communautés et la concentration en polluants (Jongman et al. 1987). 2.3 Les bryophytes aquatiques en tant que bio indicateurs Une grande variété d’organisme a été utilisée en bio indication. Parmi ces organismes, les bryophytes présentent des particularités qui les rendent utiles dans ce contexte. En effet, grâce à une série de caractéristiques morphologiques et écophysiologiques comme une grande tolérance aux éclairements faibles, à la pression hydrostatique, à l’écoulement des eaux et à une large gamme de conditions physico-chimiques (Vitt & Glime 1984), les bryophytes aquatiques sont adaptées à des environnements très diversifiés où la plupart des autres organismes ne peuvent pas survivre. En outre, leurs communautés varient en fonction de différents facteurs comme l’acidité, la trophie et la concentration en métaux lourds (Stephenson et al. 1995, Thiébaut et al. 1998, Vanderpoorten 1999a). Leur ubiquité, leur abondance dans l’environnement aquatique et la succession de leurs communautés en fonction de la qualité des eaux en font par conséquent un bio indicateur de premier choix. De surcroît, et au contraire d’autres organismes bios indicateurs comme par exemple les diatomées, les bryophytes aquatiques présentent un temps de réponse comparativement très long à des épisodes de pollution en raison de la dynamique assez lente de leurs populations. Leur disparition dans des sites pollués et leur recolonisation dans des sites dépollués se font de manière progressive, de telle sorte que les populations en place témoignent le plus souvent d’un état de pollution historique (Vanderpoorten & Palm 1998).

C’est la raison pour laquelle les bryophytes aquatiques ont été communément employées pour suivre des épisodes de pollution relatifs à l’acidification ou à l’eutrophisation des eaux (Vhrovsek et al. 1984, Arts 1990, Tremp & Kohler 1993, Thiébaut et al. 1998, Vanderpoorten & Palm 1998, 2001) (Encadré 1).

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Encadré 1. L’utilisation des bryophytes aquatiques comme bios indicateurs de la qualité des eaux en Wallonie. La composition et le recouvrement des communautés de bryophytes aquatiques ont été évalués dans 34 sites appartenant au réseau wallon de surveillance permanent de la qualité des eaux, pour lesquels des données physico-chimiques détaillées et répétées dans le temps étaient disponibles. Ces données ont été utilisées pour déterminer, au moyen de la régression PLS, une équation permettant de quantifier la concentration en polluants à partir du recouvrement des différentes espèces. Afin de tester la validité du modèle ainsi obtenu, c’est-à-dire sa capacité prédictionnelle, une procédure de validation croisée a été réalisée. Dans le cas représenté en Fig. 2, les combinaisons de bryophytes aquatiques permettent de reconstituer les moyennes de concentrations en azote ammoniacal avec un R2 de validation croisée de 0.76 (Vanderpoorten & Palm 2001).

Malgré une reconstitution globalement satisfaisante, la comparaison entre les valeurs mesurées et les valeurs prédites de la concentration moyenne en azote ammoniacal à partir des combinaisons de bryophytes aquatiques indique que les valeurs prédites peuvent dans certains cas différer notablement des valeurs mesurées. Dans le cas des sites 15 et 20, notamment, les valeurs prédites sont sensiblement inférieures aux observations. Ces sites contiennent en effet des espèces qui, comme Amblystegium tenax, ont un statut habituellement oligotrophe mais sont en expansion dans le réseau hydrographique wallon depuis les années 1980, où elles sont capables d’investir des eaux de qualité médiocre (Vanderpoorten & Empain 1999). L’une des hypothèses pour expliquer ce phénomène est qu’il existe différentes souches de l’espèce qui présentent une tolérance différente à la pollution.

2. L’cobisohylesiml’ehy

Fig. 2. Valeurs observées vs valeurs prédites par régression PLS après validation croisée des concentrations en azote ammoniacal dans 34 sites du réseau de surveillance de la qualité des eaux wallonnes à partir de leurs combinaisons de bryophytes aquatiques.

4. Possibilités et limites actuelles de la bioindication

examen des résultats présentés dans l’encadré 1 montre que si, globalement, la composition des mmunautés de bryophytes aquatiques reflète la qualité des eaux, certaines estimations sont aisées en raison de la présence d’espèces à caractère indicateur dans des qualités d’eau où elles ne nt pas attendues. En effet, plusieurs espèces sont notamment en expansion dans le réseau drographique wallon, y compris dans des cours d’eau dont la qualité semblerait a priori exclure

ur présence (Vanderpoorten & Empain 1999). Ces données, corroborées par d’autres observations ilaires réalisées de manière indépendante dans d’autres régions (Frahm 1997), suggèrent

xistence d’une adaptation de ces espèces à un environnement de qualité changeante. Cette pothèse est appuyée par deux lignes d’observations supplémentaires. D’une part, certaines

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espèces présentent des courbes de réponse contrastées aux concentrations en polluants dans différents bassins (Fig. 3) (Vanderpoorten & Durwael 1999).

Amblystegium tenax

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

N-NH 4+ (µg l -1 )

GAW

Fig. 3. Probabilité d’occurrence d’Amblystegium tenax en fonction de la concentration en azote ammoniacal en Wallonie (W), en Alsace (A) et dans les deux bassins considérés simultanément (G) (Vanderpoorten & Durwael 1999). D’autre part, les populations d’une même espèce morphologique peuvent présenter des réponses différentes de croissance et de mortalité quand elles sont soumises à un gradient de concentration en polluants (Vanderpoorten 1999b). Ces populations sont génétiquement très diversifiées entre elles. Les patrons d’évolution moléculaires observés suggèrent des processus de polyploïdisation rapides et d’évolution divergente des copies de gènes paralogues chez des organismes clonaux (Vanderpoorten et al. 2004).

Chez les bryophytes, la tolérance de populations soumises à des contraintes écologiques très contrastées de températures (Kallio & Saarnio 1986) ou de concentrations élevées en métaux (Shaw 1991) ne soutient pourtant pas l’hypothèse d’un polymorphisme génétique sélectionné en réponse à la pression de l’habitat (Shaw 1992). Au contraire, il semblait, jusqu’il y a peu, que la plupart des mousses possèdent des optima physiologiques très larges et que les écotypes spécialisés sont peu courants (Shaw 1992). Néanmoins, de récentes études sur la covariation de l’environnement et de la morphologie chez les sphaignes suggèrent que, au contraire des théories généralement admises, au moins certaines espèces sont susceptibles de répondre génétiquement à de faibles variations de l’environnement (Sastad et al. 1999). Parallèlement, un ensemble de données moléculaires récentes bouleverse l'idée que les mousses actuelles émanent d’une radiation ancienne à évolution lente et suggèrent au contraire l'existence d'une spéciation cryptique entre des populations géographiquement isolées (Fig. 4) (Shaw 2001, McDaniel & Shaw 2003), qui pourraient présenter des aptitudes d’adaptation et de dispersion contrastées. Toutefois, aucune étude n’a encore été conduite pour déterminer si les populations disjointes fonctionnent comme un réseau de métapopulations ou comme un ensemble de populations génétiquement isolées susceptibles de générer, à terme, des espèces à part entière.

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Fig. 4. Phylogénie du genre Fontinalis basée sur des séquences d’ADN ribosomal indiquant que les espèces traditionnellement reconnues sur base morphologique présentent une diversité génétique qui peut largement dépasser le cadre de leur circonscription morphologique (Shaw & Allen 2000).

3. Objectifs du projet L’objectif du projet présenté ici est d’étudier la différentiation génétique au sein des espèces de mousses aquatiques dans le réseau hydrographique wallon, afin de tester les hypothèses et de répondre aux questions suivantes: i) Les populations de mousses échantillonnées dans différents bassins hydrographiques plus ou

moins déconnectés entre eux sont-elles génétiquement homogènes par échange de flux de gènes, ou y a-t-il une structuration des populations? Cette structuration correspond-elle à un patron de structuration écologique?

ii) Dans quelle mesure les épisodes de pollution au siècle dernier ont-ils influencé l'histoire des populations? Ces populations ont-elles subi une phase de goulot d'étranglement pendant les pics de pollution et sont-elles actuellement dans une phase d'expansion? Toutes les populations présentent-elles la même histoire évolutive ou bien certaines d'entre elles ne sont pas passées par une phase de réduction drastique des effectifs?

iii) Dans quelle mesure la reconnaissance des souches génétiques augmente-t-elle la précision des modèles prédictifs de la qualité de l’eau?

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RAPPORT DES ACTIVITES SCIENTIFIQUES

1. Protocole de travail

1.1 Choix du modèle biologique

Le genre de mousse aquatique Platyhypnidium a été sélectionné pour ce projet. Il présente en effet une adéquation à un ensemble de questions relatives à la micro-évolution des mousses en relation avec la qualité de l’eau, dans la perspective de comprendre les processus évolutifs de son patron de diversité génétique et de son utilisation comme bio indicateur. La circonscription et la systématique de ce genre ont en effet été récemment l’objet d’analyses phylogénétiques moléculaires (Ignatov & Huttunen 2002, Vanderpoorten et al. 2003, 2004, 2005) qui servent de support initial à ce projet. Ce genre comprend des espèces ubiquistes à très large amplitude écologique, mais dont les populations exhibent des courbes de réponses beaucoup plus étroites et spécifiques aux polluants qui peuvent laisser supposer l’existence d’une spéciation cryptique de souches avec différents niveaux de tolérance à la pollution (Vanderpoorten 1999b, Vanderpoorten & Durwael 1999).

1.2 Echantillonnage

56 stations du réseau de mesure du réseau wallon de surveillance de la qualité des eaux ont été sélectionnées de manière à balayer un éventail de conditions physico-chimiques et de niveaux de pollution très varié (tableau 1). Dans chacune de ces stations, 20 tiges individuelles ont été récoltées selon un mode aléatoire. Les plantes ont été rapportées vivantes au laboratoire où leur ADN a été immédiatement extrait a l’aide d’un protocole au CTAB standard (annexe 1) et conservé dans un tampon à –20°C.

Par ailleurs, un échantillonnage de spécimens d’herbier conservés à BR et à LG récoltés au début du 20e siècle sera effectué en vue de servir de point de comparaison de la composition génétique originelle des populations.

1.3 Collecte des données interprétatives En vue d’interpréter les patrons de structuration et de diversité génétiques, nous possédons

quatre sources d’information qui font du contexte régional de cette étude un modèle particulièrement approprié:

i) calcul des distances inter-populationnelles en vue d’estimer l’aptitude a la dispersion dans l’air (spores) et dans l’eau (spores et fragments de gamétophytes) ; - calcul des distances les plus courtes entre deux points de prélèvement - calcul des distances linéaires le long des cours d’eau

ii) donnes écologiques sur la qualité actuelle et passée des cours d’eau - relevés physico-chimiques historiques et contemporains effectués dans l’ensemble du réseau

hydrographique wallon - composition floristique des cours reflétant un niveau de pollution a la fois passée et

présente.

Tableau 1. Échantillonnage des populations de Platyhypnidium riparioides en région wallonne, localités et espèces compagnes (nomenclature de Sotiaux et al. 2007). Code Localité Habitat et espèces compagnes

FON ruisseau de St Fontaine à St Fontaine - 3BOI ruisseau des 3 Bois à Baicoyin au niveau de la confluence avec la Vesdre (IFBL F75642

5°46'E 50°34'N) -

ABS affluent du Bock à Spontin - ACO Amblève à Comblain au Pont Hygroamblystegium fluviatile, Fontinalis antipyretica, Leptodictyum riparium AER Aine à Erezée au niveau du K8 (IFBL H72334 5°32'40''E 50°17'40''N) Fontinalis antypiretica, F. squamosa, Hygroamblystegium fluviatile, Fissidens

pusillus, Chiloscyphus polyatnthos, Brachythecium plumsum, Leskea polycarpa AffNeb petit affluent du Neblon à Ouffet petite cascatelle dans un vallon très encaissé en forte pente AIB Aine à Bomal, pont à la sortie du village (IFBL G75243 5°32'E 50°22'30''N) Hygrohypnum luridum, Fontinalis antipyretica, Hygroamblystegium fluviatile,

Leptodictuim riparium, Cratoneuron filicinum ALI affluent de la Lienne, pont en aval du moulin de Rahier IFBL G75621 5°45'E 50°24'N petit ruisseau forestier ASS ruisseau forestier à Assenois béton d'un déversoir ATG1 source de l’ Antrogne (Semois) ATG2 affluent de l’Antrogne (Semois) AUL Sambre à l'abbaye d'Aulne AVE ruisseau d'Ave a Han-sur-Lesse BAI Amblève à Baicoyin au niveau de la confluence avec le ruisseau des 3 Bois (IFBL

F75642 5°46'E 50°34'N) Fontinalis antipyretica, Fissidens crassipes, Leptodictyum riparium

BERN Canal de Bernissart BRA Lienne à Bra (IFBL H72621 5°46'E 50°19'N) Fontinalis squamosa BS Bock à Spontin Leptodictyum riparium, Cinclidotus riparius, Hygroamblystegium fluviatile,

Cratoneuron filicinum CHA Sambre à Charleroi DENDRE Dendre à Lessines Leptodictyum riparium ESC Escaut à Escanalaffe Leptodictyum riparium ESC-PERS Escaut a Pers Leptodictyum riparium EUPEN petit affluent forestier de la Vesdre au barrage de la Vesdre GCO Grand Courant à Thuin Tête de Source de ruisseau forestier GUEULE Gueule à La Calamine

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Code Localité Habitat et espèces compagnes HBM Semois à Herbeumont HONEL Grande Honnelle à Quiévrain HOY Hoyoux à Marchin Leptodictyum riparium, Cratoneuron filicinum HOY-CHAT Hoyoux au château de Hoyoux Leptodictyum riparium, Cratoneuron filicinum HUCC1-20 Huccorgne source avec Fontinalis antipyretica, Cratoneuron filicinum, Pellia endiviifolia HUY 1 -20 Meuse à Huy Fissidens fontanus, Cinclidotus fontinaloides, C. riparius, Fissidens crassipes,

Hygrohypnum luridum, Hygroamblystegium fluviatile, Leskea polycarpa, Leptodictyum riparium

HWI Hoegne à Winanplanche Leptodictyum riparium IWEN Iwenne JUL Julienne à Argenteau Leptodictyum riparium LESVIL Lesse à Villers-sur-Lesse LHO Lhomme LIRA Lienne, pont en aval du moulin de Rahier (IFBL G75621 5°45'E 50°24'N) Chiloscyphus polyanthos, Hygroamblystegium fluviatile, Fontinalis squamosa,

Racomitrium aciculare, Brachythecium plumosum, Schisitdium rivulare LOU Ruisseau du Trou du Loup entre Grandmenil et Erezée au niveau du K14 (IFBL H72433

5°37'E 50°17'45''N) Brachythecium plumosum, Scapania undulata, Racomitrium aciculare, Hyocomium armoricum, Bryum pseudotriquetrum, Fissidens pusillus, Jungermannia pumila

MEH Mehaigne à Huccorgne MEUSE-FRAG Meuse à Fragnée Cinclidotus danubicus, C. riparius, Fissidens crassipes, Hygroamblystegium

fluviatile, Leptodictyum riparium MEUSE-MONS Meuse à l'Ile Monsin Cinclidotus danubicus, C. riparius, Fissidens crassipes, Hygroamblystegium

fluviatile, H. varium, Leptodictyum riparium MEUSE-NAM Meuse à Namur (La Plante) Cinclidotus danubicus, C. riparius, Cratoneuron filicinum, Fissidens crassipes,

Hygroamblystegium fluviatile, H. varium, Leptodictyum riparium, Plagiomnium rostratum

MOD Hoyoux à Modave Pellia endiviifolia, Cratoneuron filicinum, NAM Sambre à Namur NAZ Amblève à Naze (Lorcé) en amont du pont sur la route de Lorcé IFBL G74623 5°45'E

50°25'N Hygrohypnum ochraceum, Hygroamblystegium fluviatile, Fontinalis antipyretica, Fissidens pusillus, Marchantia polymorpha, Leptodictyum riparium, Racomitrium aciculare, Plagiobryum zierii

NEB2 Neblon 2km en aval de Ama NEBLON Neblon à OuffetORN Orneau à Mazy Leptodyctium riparium OUB Ourthe à Bomal le long du chemin de fer à la confluence avec un pt affluent IFBL Hygroamblystegium fluviatile, Leptodyctium riparium, Fontinalis antiyretica,

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ode Localité Habitat et espèces compagnes G75241 5°31'E 50°23'N Leskea, Syntrichia latif, Lunularia

OURTHE-TILF Ourthe en aval de Tilff (Ile Rousseau) PEP Hoegne à Pepinster, premier pont à pd la Vesdre, IFBL F75714 5°48'E 50°34'N Fontinalis antipyretica, Hygroamblystegium fluviatile PER Escaut à Péronnes Leptodyctium riparium SAMSON Samson SEINE Seine Leptodyctium riparium SON ruisseau de Songnon à Transinster au Trou du Renard (IFBL F75641 5°45'E 50°34'N) VACHAU Vachau à Viller-sur-Lesse VESDRE-VAUX Vesdre à Vaux sous Chêvremont Hygroamblystegium fluviatile, Leptodyctium riparium WIMB Wimbe à Villers-sur-Lesse

C

2 Résultats 2.1. Mise au point des marqueurs moléculaires Les microsatellites sont des séquences nucléotidiques répétées dans le génome des Eucaryotes. Leur longueur très variable entre différents individus et populations en fait un marqueur très couramment utilisé en génétique des populations. Chez les mousses, ce marqueur a déjà été utilisé dans ce sens avec beaucoup de succès dans un seul genre pour répondre à des questions relatives aux effets de la fragmentation de l’habitat sur la structure et la diversité génétiques des populations (Wilson & Provan 2003) et la structuration géographique de la diversité génétique (van der Velde & Bijlsma 2003).

À cet effet, nous avons développé une banque de loci microsatellites spécifiques à l’espèce modèle (annexe 2) dont nous envisageons de reconstituer le passé démographique en relation avec la qualité de l’eau. La création de la banque de loci, qui n’est en routine que dans de très rares laboratoires, n’avait encore été réalisée qu’une seule fois chez les bryophytes et a pu être construite grâce à un partenariat avec Ange-Marie Risterruci du CIRAD-Montpellier. C’est cette banque de 100 loci microsatellites que nous avons criblé afin d’établir les conditions PCR optimales à chacun des locus en vue d’optimaliser la lecture des résultats et de tester le niveau de polymorphisme révélé par chacun des loci (annexe 3).

A l’issue de la phase de screening, huit marqueurs facilement amplifiables et présentant un motif d’évolution pas à pas ont été retenus (annexe2).

2.2 Genotypage et analyse des données

L’ensemble des 20 individus de chacune des 56 populations décrites au tableau 1 ont été

génotypes sur les 8 loci (annexe 4). Ce travail a été réalisé en collaboration avec le Prof. A. J. Shaw lors d’un séjour à Duke University fin 2006.

Dans une première étape, nous examinerons dans quelle mesure les populations des espèces étudiées sont génétiquement homogènes, c'est-à-dire échangent des flux de gènes, ou bien présentent au contraire un patron de structuration important. Nous utiliserons ensuite l'information génétique mesurée sur les populations actuelles pour inférer l'historique de ces populations. La structure génétique des populations et l'estimation des échanges de gènes sera étudiée en partitionnant la variance génétique observée en une composante intra- et interpopupationnelle à l'aide des statistiques F classiquement utilisées en génétique des populations. La reconstruction du passé des populations se fera au moyen de méthodes basées sur la coalescence. À cet effet, nous simulerons la structure génétique d'un échantillon sous l'hypothèse d'un modèle de coalescence standard, puis sous l'hypothèse que la population dont est issu l'échantillon est passée par un goulot d'étranglement, et testerons l'écart entre nos observations par rapport à ces scénarios hypothétiques pour déterminer quel scénario évolutif décrit le mieux la structure génétique des populations étudiées.

Dans une deuxième phase, nous mettrons en relation la structure génétique observée des populations et la qualité écologique de l'environnement et interpréterons l'évolution des populations en termes de l'historique de la qualité de l'eau. À cet effet, un dendrogramme de similarité génétique sera obtenu afin de classer les individus en différents haplotypes . L’analyse de la variance sera utilisée pour tester l’hypothèse que la variabilité haplotypique correspond à une variabilité de la qualité des eaux en partionnant la variance environnementale en une composante explicable par les haplotypes et une composante résiduelle. Afin de déterminer quels facteurs physico-chimiques expliquent au mieux la différentiation génétique observée, une analyse discriminante sera mise en œuvre pour déterminer quelles combinaisons de facteurs physico-chimiques, et avec quelle

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pondération, permettent de prédire au mieux la probabilité d’occurrence des haplotypes. Enfin, nous utiliserons l'information relative à la structuration génétique des populations de manière à effectuer une prédiction de la qualité écologique de l'environnement.

Les résultats préliminaires obtenus suggèrent que, depuis les pics de pollution enregistrés dans les années 70-80, les bryophytes aquatiques ont recolonisés de vastes portions de cours d'eau: ces populations sont génétiquement différentes de celles qui avaient été éliminées. L'utilisation des échelles de bio indication de la qualité des cours d'eau au travers des inventaires des bryophytes aquatiques est ainsi brouillée, et ces échelles doivent être recalibrées.

A l'issue de ces analyses, nous serons donc à même de déterminer dans quelle mesure les populations de mousses présentent un patron de structuration génétique, dans quelle mesure ce patron correspond à la variabilité de la qualité des eaux et dans quelle mesure ce patron a historiquement été déterminé par l'évolution de la qualité des eaux, et enfin d'appliquer ces résultats à un modèle perfectionné de biomonitoring non plus basé sur la notion d'espèce, très variable chez les mousses aquatiques, mais sur la différentiation génétique des populations.

APPORTS AU DEVELOPPEMENT SCIENTIFIQUE

Initiation et développement d’un laboratoire de biologie moléculaire orienté vers la phylogénie et la génétique des populations à l’Institut de Botanique de l’ULg

La réalisation du projet proposé avait pour pré requis impératif la mis en route d’un

laboratoire de biologie moléculaire performant à l’Institut de Botanique afin de réaliser en routine des opérations de génotypage et de séquençage de l’ADN. En raison des coûts importants générés par l’acquisition d’un tel matériel, et soucieux de rentabiliser au mieux de tels équipements, nous nous sommes associés à l’équipe du Prof. Claire Remacle et du Dr Johan Michaux. Cette collaboration a comme objectifs (1) la mise en commun des ressources des deux équipes; (2) la concentration des équipements et des équipes de recherches au sein d’une même unité ; (3) la recherche en commun de sources de financements supplémentaires nécessaires à l’achat et à l’entretien d’un équipement lourd. Ces objectifs se sont concrétisés dans le courant 2006 par l’installation des deux équipes de recherches dans les mêmes locaux et l’obtention d’un crédit FRFC auprès du FNRS. Grâce à la mise en commun des crédits disponibles, le laboratoire est désormais opérationnel pour toutes les opérations allant de l’extraction de l’ADN à son amplification en PCR et son séquençage ou génotypage. En termes d’allocations des budgets, le crédit obtenu par Johan Michaux et Alain Vanderpoorten au FNRS a permis l’acquisition d’un séquenceur automatique ABI 310, ses mise à jours complètes en termes de logiciels d’analyse des séquences et des fragments microsatellites, et l’entretien de l’appareil par la firme Applied Biosystems pendant quatre ans. Le crédit d’impulsion obtenu dans le cadre de l’Aquapôle a quant à lui été essentiellement alloué à l’acquisition des autres appareils de laboratoire (verrerie, réactifs, thermocyclers, centrifugeuse, matériel d’électrophorèse…).

C’est cette infrastructure fonctionnelle qui est dorénavant mise à la disposition des utilisateurs. À côté des étudiants de licence et de masters (deux étudiantes en 2005), notre laboratoire est en effet ouvert à des visiteurs extérieurs, en particulier la visite d’une étudiante en masters portugaise et d’une post-doctorante suédoise en 2006 et la réalisation dans notre laboratoire des travaux de génotypage dans le cadre d’une thèse de doctorat d’un étudiant de l’UCL depuis septembre 2005.

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