la maquinaria proteica la cromatina rna polimerasas factores de transcripción activadores -...
TRANSCRIPT
La maquinaria proteica
• La cromatina
RNA polimerasas
Factores de transcripción
Activadores - reguladores
Elementos “cis”
Promotores
Enhancers
• Elongación – Procesamiento del transcripto primario
• Exportación
• Inicio de la transcripción
A significant difference between the transcription of
eukaryotic and prokaryotic mRNAs is that initiation at
a eukaryotic promoter involves a large number of
factors that bind to a variety of cis-acting elements.
El proceso de transcripción en EucariotesEl proceso de transcripción en Eucariotes
Nature 269, 527 - 529 (06 October 1977); doi:10.1038/269527a0
The mechanism by which actinomycin D inhibits protein synthesis in animal cellsHERBERT L. COOPER & RICHARD BRAVERMANSection on Cellular and Molecular Physiology, Laboratory of Pathophysiology, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland 20014
IN the course of studies on the regulation of protein synthesis during the activation of human lymphocytes by phytohaemagglutinin (PHA), it became necessary to determine whether an effect which occurred following treatment with actinomycin D (AMD) was secondary to the action of the drug on transcription, or resulted from a direct effect on translation. Using enucleated lymphocytes, we have shown that AMD has no effect on protein synthesis in the absence of the cell nucleus and conclude that AMD interferes with protein synthesis by its effect on transcription of RNA.
La transcripción de un gen eucariota codificante de proteínas es precedida por múltiples eventos
•Decondensación del locus
•Remodelado del nucleosoma
•Modificaciones de histonas
•Unión de activadores transcripcionales y coactivadores a enhancers y promotores
•Posicionado de la maquinaria basal de transcripción al promotor
Response to the bicyclic octapeptide α-amanitin.
RNA polymerase II is rapidly inhibited by low concentrations of α-amanitin. RNA polymerase I is not inhibited. The response of RNA polymerase III to α-amanitin is less well conserved; in animal cells it is inhibited by high levels, but in yeast and insects it is not inhibited.
Las células eucarióticas poseen 3 tipos de RNA Las células eucarióticas poseen 3 tipos de RNA polimerasas en el núcleopolimerasas en el núcleo
DNA mRNA proteína
tRNA
rRNA
RNApol II
pol III
pol I
ribosoma
La RNA pol II de levadura y de humano son virtualmente idénticas
• 12 subunidades
• 53 % de identidad
• se pueden intercambiar subunidades (10)
Maquinaria de transcripción de la RNApol II
pol II DNA unwinding
RNA polymerization
GTFs Promoter recognition
Mediator Response to regulators
TATA pol
25 bp
GTFs enables promoter recognition and initiation
General Transcription Factors
TFII subunits mass similarity to human
B 1 37 52 %
D (TBP) 1 21 81 % (TAFs) 10 662
E 2 109 53%
F 2 159 51%
H 9 570 62%
TATA pol
25 bp
activator
mediator
El complejo “mediator” es necesario para la regulación
Fue descubierta en levadura como una fracción cruda necesaria para la respuesta “in vitro”
enhancer
Transcripción por RNA pol IITranscripción por RNA pol II
Los factores de transcripción se suelen clasificar según el tipo de dominio de fijación al DNA que contienen
Proteínas con “dedos de Zn”
TFIIB, GAL4
Los factores de transcripción se suelen clasificar según el tipo de dominio de fijación al DNA que contienen
Proteínas de homeodomini
o
Proteína con cremallera de
leucina
Proteína con hélice-bucle-
hélice
c-fos and c-jun (the AP1 transcription factor), important regulators of normal development, as well as myc family members including myc, max, and mdx1. If they are overproduced or mutated in a vital area, they may generate cancer. These proteins interact with the DNA as dimers (homo- or hetero-) and are also called basic zipper proteins (bZips).
Ver simulación del proceso de transcripción en
www.dnai.org
Núcleo del promotor (“core promoter”)
Incluye los elementos de ADN que se
extienden 35 bp upstream y/o downstream del
sitio de iniciación de la transcripción. Muchos
interaccionan directamente con componentes
de la maquinaria basal de transcripción.
maquinaria basal de transcripción
Factores que son mínimamente
esenciales para la transcripción
(inclusive la RNA pol II)
Propiedades de los elementos promotores de la RNA polimerasa II
(PROPERTIES OF RNA POLYMERASE II CORE PROMOTER ELEMENTS)
Secuencia TATAAA presente a 25 to 30 bp upstream de +1
TATA Box (Goldberg-Hogness box)
•PREVALENCIA: En Drosophila 43% de 205 promotores
•TATA Box
RECONOCIMIENTO DE TATA
Roeder y colegas: transcription factor IID, TFIID es esencial para la transcripción a partir de promotores TATA.
TFIID es un complejo TBP (proteína de reconocimiento)
TBP-associated factors (TAFs),
acetil transferasas
quinasas,
actividades
activadoras y conjugantes de ubiquitina
A binding site selection analysis identified the sequence 5-TATATAAG-3 as the optimal TBP recognition sequence.
El principal determinante de la direccionalidad sería la disposición relativa de los sitios de unión de activadores, el TATA box y otros componentes del núcleo promotor
Rol de TATA en la direccionalidad de la transcripción
En un promotor que contiene sitios de unión distales para activadores
La inversión del TATA box no produce un cambio en la dirección de la transcripción
+1
+1
TATA
ATAT
TFIIB y RNA polymerasa II determinan la distancia a +1
•TATA Box
Initiator Element
Py Py A(1) N T/A Py Py
•Inr
El elemento iniciador (Inr) fue definido como un elemento discreto del núcleo promotor que es funcionalmente similar a TATA box y puede actuar independientemente
Espaciado TATA-INR y direccionalidad de la transcripción
25-30 bp los dos elementos actúan sinérgicamente
15 or 20 bp se mantiene el sinergismo pero el +1 lo dicta el TATA box
> 30 bp actúan independientemente
La inversión de Inr en el contexto de un promotor conteniendo sitios de unión para activadores, no cambia la dirección de
transcripción
• TFIID interacciona específicamente con Inr
• La acción sinérgica de TATA y Inr correlaciona con la unión cooperativa de TFIID a los dos elementos
• TFIIA es indispensable para la unión de TFIID a Inr
•Inr
• RNA polymerasa II reconoce ADN inespecíficamente, sin embargo posee una débil e intrínseca preferencia por secuencias de tipo Inr.
Downstream Promoter Element (DPE)
• El DPE actúa conjuntamente con Inr,
• Un promotor dependiente de DPE contiene Inr y DPE
• DPE
• La secuencia principal de DPE está localizada a 28 to 32 nt del A 1 en el motivo Inr
• Mutaciones en cualquiera de los dos elementos resultan en la pérdida de unión de TFIID y de actividad basal de transcripción
TFIIB Recognition Element (BRE)
Este motivo no existe en levaduras ni plantas lo cual sugiere que BRE no contribuye a la regulación génica en ellos
• BRE
TFIIB humano reconoce una secuencia de 7-bp: G/C G/C G/ACGCC
El reconocimiento es mediado por un motivo HTH del C-terminal de TFIIB
•En mamíferos la mitad de los promotores codificantes de proteínas están asociados con CpG
• CpG Islands
CpG Islands
El dinucleótido CpG es poco frecuente en genomas de vertebrados debido a
que 5-metilcitosina puede transformarse en timina (por desaminación) el
cual no es reparado
•Existen segmentos de ADN de 0.5–2 kbp que poseen una alta densidad de dinucleótidos CpG.•El genoma humano contiene 29,000 islas CpG
•Las islas CpG carecen de TATA boxes, DPE o Inr .
• Se caracterizan por la presencia de múltiples sitios de iniciación de la transcripción que abarcan una región de 100 bp o más
• presentan múltiples sitios de unión para el factor de transcripción Sp1
A maximum of 4 base pairs of unwound template DNA ahead of the 3-OH terminus of the growing transcript
9 base pair RNA-DNA hybrid that holds the newly synthesized
transcript in register with the DNA template
• a discrete RNA exit groove located near the base of the largely unstructured carboxy-terminal domain (CTD) • accepts the nascent transcript as it is separated from the coding strand of the DNA template 10 nucleotides upstream of the transcript’s 3-end
These structures provide for the first time unequivocal evidence of the RNA polymerase II elongation complex
The most notable structural difference
between free and transcribing RNA
polymerase II is the position of a large, 50
kDa hinged region referred to as the “clamp”
In free polymerase is in an open
conformation that would allow easy entry of
the DNA template into the catalytic site.
In the elongating enzyme, closes tightly
over the DNA and nascent transcript.
• mRNA is synthesized in cells, on chromatin templates,
at rates approaching 2000 nucleotides per minute.
•Purified RNA polymerase II is capable of elongating RNA
chains in vitro, even on naked DNA templates, at rates
of only 100 to 300 nucleotides per minute
¿Cómo es el proceso de ¿Cómo es el proceso de elongación?elongación?
¿Por qué se requieren de factores de elongación?
El extremo 3´-OH no es aceptor del ribonucleótido trifosfato entrante. Luego de un tiempo la enzima espontáneamente se desliza hacia delante y el extremo se realinea con el ion Mg catalítico, continuando la síntesis. La RNA detenida resulta de un retroceso irreversible de 7 to 14 nucleótidos
La RNA polimerasa II durante la elongación a cada paso de agregado de nucleótido oscila entre las conformaciones activa e inactiva (pausa)
En algunos sitios del molde de ADN, la RNA pol “en pausa” es detenida, esa situación puede ser revertida sólo por factores de elongación (SII)
La detención y la pausa sería el resultado de un movimiento en retroceso (2 – 4 nt) de la enzima y de la burbuja de transcripción
Pausa reinicio
detención
TFIIF and members of the ELL and Elongin
families, can interact directly with
elongating polymerase and increase its
elongation rate by suppressing transient
pausing by the enzyme at all or most steps
of nucleotide addition
Helping to maintain the 3-OH terminus of
the nascent transcript in proper alignment
with the polymerase catalytic site, thereby
preventing backtracking by the enzyme.
TFIIF was initially identified and purified as
an essential RNA polymerase II initiation
factor that is required for stable binding of
polymerase to TFIID and TFIIB at the
promoter and for entry of TFIIE and TFIIH
into the preinitiation complex
TFIIF
• polymerases containing hypophosphorylated CTDs preferentially enter the preinitiation complex, where they are subsequently phosphorylated during or shortly after initiation
CTD is essential for the function of RNA polymerase II
deletions that remove only a fraction of the heptapeptide repeats can be lethal
phosphorylation of the CTD in elongation by RNA polymerase II
• the CTDs of actively elongating polymerases are highly phosphorylated
ELONGATOR AND FACT PROMOTE RNA POLYMERASE II ELONGATION THROUGH
CHROMATIN
Elongator and FACT appear to promote RNA polymerase II elongation by modifying nucleosomes in ways that facilitate passage of polymerase through chromatin.
Elongator is highly conserved from yeast to man. Notable among the Elongator subunits are Elp3, a histone acetyltransferase (HAT) of the GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) family,
Mechanistic studies suggest that FACT stimulates RNA polymerase II elongation through nucleosomes by binding them and promoting removal of nucleosomal histones H2A and H2B
THE RNA POLYMERASE II ELONGATION
COMPLEX FUNCTIONS AS A PLATFORM
THAT COORDINATES mRNA PROCESSING
AND EXPORT
Formación del transcripto primario y su procesamiento durante la maduración del mRNA en células eucarióticas
Formación del transcripto primario y su procesamiento durante la maduración del mRNA en células eucarióticas
Capping of RNA polymerase II transcripts occurs when they reach a length of 25 to 30 nucleotides and requires the concerted action of three enzymes:
an RNA triphosphatase, which removes the -phosphate at the 5-end of the nascent transcript;
a guanylyltransferase, which transfers a GMP cap to the resulting diphosphate terminus of the nascent transcript;
and a methyltransferase, which adds a methyl group to the N7 position of the GMP cap to form the transcript’s mature m7G(5)ppp(5)N cap structure.
mammalian and yeast guanylyltransferase are recruited to transcribing
RNA polymerase II through specific interactions with the phosphorylated CTD
CTD phosphorylation by the TFIIH CTD kinase may provide a signal that links capping to the synthesis of nascent transcripts
• Capping
5’CAP5’CAP
the RNA polymerase CTD is required for efficient 3´ cleavage of transcripts prior to poly(A) addition by poly(A) polymerase
• Polyadenylation
CPSF: cleavage and polyadenylation specificity factor
CstF: cleavage stimulation factor
Los intrones pueden ser removidos por mecanismos diferentes
Tipo II
Tipo I Tipo III
It is likely that the CTD recruits components of the splicing
machinery to the RNA polymerase II elongation complex.
SR and snRNP proteins have been shown to interact with
phosphorylated RNA polymerase II and phosphorylated CTD
peptides.
The CTD could stimulate splicing at least in part by promoting
assembly of early splicing intermediates, such as the U1 snRNP-5
splice site complex or the U2 snRNP-branch site complex
•splicing
DNA mRNA proteína
tRNA
rRNA
RNApol II
pol III
pol I
ribosoma
Los rRNA y tRNA se generan a partir de un transcripto primario comúnLos rRNA y tRNA se generan a partir de un transcripto primario común
E.coli
EucariotasEucariotas
Síntesis de tRNA
En el nucleolo se producen las subunidades ribosomalesEn el nucleolo se producen las subunidades ribosomales
El nucleolo contiene grandes bucles de ADN que emanan de diferentes cromosomas, cada uno de los cuales contiene un conjunto de genes de rRNA
Ese conglomerado de genes forman la región organizadora nucleolar (NO).
Esta región se encuentra rodeada por un anillo de material electrón-denso denominado pars fibrosa (PF) que está constituido por rRNA recientemente transcrito
Por fuera de esta región se encuentra la denominada pars granulosa (PG) que son las ribonucleoproteínas constituyentes de los ribosomas.•El nucleolo incrementa su tamaño cuando la
célula es estimulada en la producción de
proteínas.
•El nucleolo desaparece durante la división
celular y se forma nuevamente a partir de la
región organizadora nucleolar.