La filosofia del QbD applicata alla bioanalitica: sviluppo di un

metodo per il monitoraggio terapeutico di elvitegravir

Unità di Farmacologia Clinica,"Luigi Sacco" University HospitalUniversità degli Studi di Milano

Sara Baldelli, Giorgio Marrubini

L’isolamento del virus dell’AIDS: 1983-1984

Pasteur InstituteLAV: lynphadenopathy -associated virus

National Cancer InstituteHTLV-III: human T lymphotropic virus III

1986: human immunodeficiency virus HIV

Dal primo farmaco: 1987-2015

ART: Terapia di combinazione

Integrase inhibitors

ART: aumento della sopravvivenza

ART: risposta virologica

Lee FJ, Amin J, Carr A (2014) PLoS ONE 9(5): e97482.

Pazientinaive

< 50% Pazienti experienced

40000

35000

30000

25000

20000

15000

10000

5000

0

Raltegra

vir

AU

C0-1

2(n

g*h/m

L)

50 pts on raltegravir 400 mg b.i.d.

- Cattaneo, J Clin Pharmacol 2011 -

L’esposizione agli ART è caratterizzata da unaelevate variabilità inter-paziente

- Cattaneo, Ther Drug Monit 2010 -

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 2 4 6 8 10 12

Time (h)

ATV (

ng/m

L)

25 pts on atazanavir 300 mg b.i.d.

Correlazione tra concentrazione plasmatica delfarmaco, vantaggio immuno-virologico e tossicità

- Cleijsen et al JAC 2007 -

0

60%**

30%

ATV Ctrough

<850 ng/mL%

hyp

erb

ilir

ub

ine

mia

*ATV Ctrough

>850 ng/mL

- Gonzalez de Requena 12th CROI, 2005 -

0

20%

100%

37%**

81%**

ATV Ctrough

<150 ng/mL

% v

iro

log

ic r

esp

on

se

*

ATV Ctrough

>150 ng/mL

40%

60%

80%

*<50 copies/mL or >2-log drop in viral load

20%

100%

40%

60%

80%

*total bilirubin >2.5 mg/dL

?Concentrazione farmaco

(ng/mL)

Range di conc di diversi ordini di grandezza

Campioni in vitro: analita + plasma di controllo

Campioni in vivo legame analita-proteinepresenza di composti presenza di metabolitipossibile interconversione

Metodi bioanalitici

Massima sensibilità

Nessun/Minimo trattamento campione

Corse cromatografiche con tempi di ritenzione molto brevi

Multipli analiti analizzati contemporaneamente

La spettrometria di massa è considerata il goldstandard per la determinazioni di farmaci e deimetaboliti

Linee guida validazione metodi bioanalitici

Usare pool di plasma diversiStudiare l’effetto della matriceReincurrent sample reanalysis

Applicazione dei principi del QbD nello sviluppo diun metodo per il monitoraggio terapeutico dielvitegravir

Cos'è il Quality by design?

1. «Un approccio sistematico allo sviluppo»

2. «si attua prestabilendo obiettivi precisi»

3. Pone in rilievo primario la comprensione e l’approfondimento del processo e del prodotto

4. …e il controllo

5. fondato sulla migliore conoscenza scientifica

6. …e la stima del rischio per la qualità

Adattato da G. Boccardi, D. Fraioli, G. Marrubini, Il Quality by

Design nello sviluppo e convalida dei metodi analitici,

presentazione al 53° Simposio AFI, Rimini 2013.

Applicazione dei principi del QbDICH Q8 (R2) per lo sviluppo e

produzione di medicinali

Applicazione dei principi del QbD nello sviluppo diun metodo per il monitoraggio terapeutico dielvitegravir

Analytical QbD (AQbD)

• [Analytical Quality by Design (AQbD) in Pharmaceutical Development, G.L. Reid et al. American Pharmaceutical Review, Posted: August 27, 2013]

• [Development of quality-by-design analytical methods, F.G. Vogt et al. Journal of Pharmaceutical Sciences, Journal of Pharmaceutical Sciences, 100, 3, 797–812]

• [Analytical Quality by Design Approach to Test Method Development and Validation in Drug Substance Manufacturing N. V. V. S. S. Raman et al., Journal of Chemistry, (2015), Article ID 435129]

Sviluppo di metodi analitici

Analisi delle materie prime

Analisi durante il processo

Rilascio del lotto

Test di stabilità

Sviluppo di metodi analitici mediante approccio AQbD

1.Obiettivo della analisi

2.Selezione della metodo

3.Analisi del rischio

4.Sviluppo del metodo

5.Strategia di controllo

6.Miglioramento continuo

Analytical Target Profile: cosa, quando e in quale matrice, misurare con quali criteri di accettabilità Critical QualityAttributes (CQAs)

Selezione della tecnica analitica appropriata. Risk assessment

Analisi dei rischi connessi ai parametri operativi del metodoCritical Process Parameters (CPPs) e della variazione delcampione. Risk assessment

[Quality by Design Approaches to Analytical Methods, Y. Tang, AAPS Meeting 2011]

Identificazione dei fattori e dello spazio/dominiosperimentale (Knowledge space /design space)

Validazione del metodo

Monitoraggio delle performance del metodo eaggiornamento, se necessario.

1. Selezione degli Analytical Target Profile (ATP)

A. Analita da quantificare ELVITEGRAVIRB. Specifiche di performance del metodo (previste dalle linee

guida)

B) Specifiche di performance del metodo

Caratteristiche Definizione

Specificità Abilità a misurare unicamente ciò che si vuole misurare anche in presenza di altri composti endo-esogeni

Linearità Abilità di dare risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione degli analiti nei campioni all'interno di un determinato campo di validità.

Accuratezza Grado di accordo tra il risultato di un procedimento analitico ed il valore di riferimento accettato.

Precisione Grado di accordo fra risultati indipendenti ottenuti con un procedimento di analisi in condizioni ben specificate

LOD Concentrazione di un analita che può essere rilevata all'interno di un campione mediante confronto con il relativo bianco ad un dato grado di rischio

LOQ Minima concentrazione di analita misurata con una precisione e accuratezza corrispondente a un coefficiente di variazione <20%

Range Intervallo di concentrazione per il quale è stato verificato che tutti i parametri caratteristici del metodo appena elencati hanno valori accettabili

Effetto matrice Capacità di non venire influenzato nei risultati finali dalla presenza della matrice

A. Analita da quantificare ELVITEGRAVIRB. Specifiche di performance del metodo (previste dalle linee

guida)C. La procedura deve essere in grado di quantificare l’analita

accuratamente e precisamente in campioni di plasma dipazienti in terapia con il farmaco [con una concentrazioneda 50 a 10000 ng/mL con una accuratezza e precisionecomprese in un intervallo di ± 15%; (LOQ 20%)]

1. Selezione degli Analytical Target Profile (ATP)

Elementi da considerare:

• Potenzialità di raggiungere Analytical Target Profile (ATP)• Disponibilità presso il laboratorio• Esperienza del personale nello sviluppo, impiego e

mantenimento delle metodica• Sicurezza per gli operatori• Tempo di lavoro• Specificità• Range• Costi di funzionamento

2. Selezione del metodo analitico

Fase MetodoPotenzialità di

raggiungere gli ATP

Disponibilità presso il

laboratorioEsperienza metodica

Automatizzazione

Sicurezza per gli operatori

Tempo di lavoro

Specificità Range

Costi di funzionamento

Punteggio

Ranking

Peso attribuito 1 1 0,8 0,5 0,8 1 1 0,5 1

Estrazione SPE 10 10 10 5 10 5 10 5 0 56 2

Liquido-liquido 10 10 10 0 5 5 5 5 5 49,5 3Precipitazione 10 10 10 5 10 10 5 10 10 68,5 1

Quantificazione HPLC - UV 10 10 10 10 10 5 0 10 10 61 4

HPLC - PDA 10 10 5 10 10 5 5 10 10 62 3HPLC - MS 10 10 10 10 10 10 7 10 5 68 2

HPLC - MS/MS 10 10 10 10 10 10 10 10 5 71 1Metodo

immunoenzimatico 0 0 10 10 10 10 10 10 0 46 5

0= Range ristretti 0= costi elevati

5= Range medi 5= costi medi

10= Range ampi

10= costi economici

Alta 10

Media 5

Bassa 0

2. Selezione del metodo analitico

Risk assesment Failure Mode Effect Analysis (FMEA)

3. Identificazione dei parametri critici del metodo analitico selezionato

Suddivisione del metodo in unità operative Per ciascuna unità individuazione delle variabili critiche Costruzione di uno schema ordinato

(Cause & Effect, Ishikawa, Fishbone diagram)

Identificazione dei parametri critici

Preparazione del campione

Preparazione degli standard

Operatore Materiali

Quantificazione degli analiti

Risultato

inattivazione HIV

Separazione aliquote

Precipitazione

Filtrazione

Centrifugazione

Precipitazione

Aggiunta a pool di plasma donatori bk

Filtrazione

Solubilizzazione

Pesata standard

Manualità dell’operatore

HPLC- Condizioni cromatografiche

Parametri del rivelatore

MS/MS

Qualità degli standard

Qualità dei solventi

Qualità dei reagenti

Colonne cromatografiche

Centrifugazione

Centrifugazione

Gas desolvGas cone

V coneCapill V

T sorgT cap

Energia coll

gas coll

Fase Parametro critico Risoluzione dei picchisimmetria

picchiRapporto segnale

rumoreProporzionalità tra le

aree Punteggio totale Potenziale anomalia Causa Effetti sul risultato Strategia sperimentale

Punteggio ATP 5Punteggio ATP

5 Punteggio ATP 5 Punteggio ATP 10Centrifugazione Velocità 1 1 1 1 55 Efficienza di estrazione Separazione plasma Errata quantificazione fissata

Tempo 1 1 1 1 55 Efficienza di estrazione Separazione plasma Errata quantificazione fissataPretrattamento del

campione Trattamento termico Temperatura 1 1 1 5 255Riduzione della concentrazione Degradazione termica Errata quantificazione Controllata

Tempo di riscaldamento 1 1 1 5 255

Riduzione della concentrazione Degradazione termica Errata quantificazione Controllata

Estrazione Precipitazione Solvente 5 5 5 5 1275 Efficienza estrazione Legame proteine Efficienza di estrazione DOEVolume plasma 1 1 10 5 2505 Efficienza estrazione proporzionalità nell'estrazione Efficienza di estrazione DOE

Rapporti tra solventi 5 5 10 5 2525diluizione /efficienza

estrazione diluizione /efficienza estrazione Efficienza di estrazione DOETempo di mescolazione 1 1 10 5 2505 Efficienza estrazione proporzionalità nell'estrazione Efficienza di estrazione DOETemperatura di centrifuga 1 1 5 5 1255 Efficienza estrazione Degradazione termica Efficienza di estrazione DOEVelocità di centrifuga 1 1 1 1 55 Efficienza estrazione efficienza estrazione Efficienza di estrazione Controllata

Filtrazione 1 1 5 1 255Efficienza pulizia del

campione interferenza Efficienza di estrazione Controllata

diluizione 1 1 5 1 255Efficienza pulizia del

campione interferenza ControllataTipo di provetta 1 1 1 1 55 Efficienza estrazione interazione con materiale Efficienza di estrazione fissataCapacità della provetta 1 1 1 1 55 Efficienza estrazione diluizione Efficienza di estrazione fissata

QuantificazioneCondizioni cromatografiche Colonna Tipo 5 5 5 5 1275 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione Fissata/controllata

Lunghezza 5 5 3 3 475 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione fissataDiametro 5 5 1 1 75 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione fissataPorosità 5 5 1 1 75 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione fissataEfficienza (storia) 5 5 1 1 75 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione Colonne DedicateTemperatura 10 10 1 1 100 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione Standard 30°C

Fase mobile Solvente 10 10 10 10 5050 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione doepH 5 5 10 5 2525 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione doeVelocità di flusso 5 5 1 5 275 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione fissata Isocratica/gradiente 5 5 5 5 1275 Separazione dei picchi efficienza separazione errata quantificazione controllata

Iniezione Volume di iniezione 1 1 5 5 1255 loq ridotto limitata sensibilità Fisso 10 µL

Parametro critico intensità del picco rumoreRapporto segnale

rumoreProporzionalità tra le

aree Punteggio totale Potenziale anomalia Causa Effetti sul risultato Strategia sperimentale

Punteggio ATP 10Punteggio ATP

5 Punteggio ATP 5 Punteggio ATP 10Parametri rivelatore pompa da vuoto Valore di vuoto 1 1 1 1 60 inefficienza inefficienza errata intensità picco fissata

parametri sorgente e 1 q portata Gas desolv 5 5 5 5 1275 inefficienza inefficienza errata intensità picco DOEportata gas Cono 5 5 5 5 1275 inefficienza inefficienza errata intensità picco DOEVoltaggio cono 10 10 5 5 1300 inefficienza inefficienza errata intensità picco DOEVoltaggio capillare 5 5 5 5 1275 inefficienza inefficienza errata intensità picco DOET desolvatazione 5 5 5 5 1275 inefficienza inefficienza errata intensità picco DOE

T T sorgente 5 5 5 5 1275 inefficienza inefficienza errata intensità picco DOEparametri 1/3 quadrupolo potenz entrata/uscita 1 1 1 1 55 inefficienza inefficienza errata intensità picco fissataparametri 2 quadrupolo energia collisione 10 5 5 5 1300 inefficienza inefficienza errata intensità picco DOE

portata gas collisione 5 5 5 5 1275 inefficienza inefficienza errata intensità picco DOEpotenziali entrata/uscita 1 1 1 1 55 inefficienza inefficienza errata intensità picco fissataenergia fotomoltiplicatore 1 1 1 1 55 inefficienza inefficienza errata intensità picco fissata

Risk assesment Failure Mode Effect Analysis (FMEA)

Estrazione del campione per precipitazione: definizione del dominio sperimentale

Screening dei fattori importanti

FATTORI PRESI IN ESAME LIVELLI

X1. Solvente precipitante

X2. Volume di plasma (µl)

X3. Rapporto in volume plasma:agente precipitante

X4. Tempo di miscelazione (sec)

X5. Temperatura centrifugazione (°C)

ALTRI PARAMETRI FISSATI

Velocità centrifugazione (rpm)

Tempo centrifugazione (min)

Filtrazione centrifugato

Diluizione 1:1 con eluente HPLC

Volume di iniezione in HPLC-MS (µl)

Valori pratici

Lo studio sistematico di tutte le combinazioni dei 5 fattori a 2 livelli richiederebbe 32

esperimenti

RISPOSTE

R1. Sensibilità (A, area del picco)R2. Sensibilità (h, altezza del picco)R3. Rapporto altezza/area del picco (h/A)R4. Rapporto segnale:rumore (S/N)R5. Simmetria del picco

Per analizzare le risposte abbiamo utilizzato la regressione multipla e icoefficienti ottenuti dalla regressione sono riportati in un grafico abarre per illustrare gli effetti e dare visivamente e in modo semplicel’informazione desiderata.

30

R2

R3

R4

R1

R5

Le 5 risposte non sono tutte ottimizzabili con un’unica scelta di fattori.

Il migliore compromesso è quello dato dalla scelta del precipitante

Da questa scelta deriva la selezione dei rapporti in V tra plasma e precipitante:

V di plasma:fisso

Il fattore b5 (T centrif.) sembra ininfluente tranne su R4.

Risultati

FATTORI PRESI IN ESAME LIVELLI (min-max, centro)

Solvente

Contenuto di HCOOH (%, v/v)

Contenuto di NH4OAc (mM)

IN QUESTA FASE SONO STATI FISSATI TUTTI GLI ALTRI PARAMETRI strumentali

cromatografici e di massa a valori obbligati (colonna HPLC, flusso, T colonna)

o “pratici” non definitivi (parametri della MS quali potenziali ionizzazione,

potenziali lenti, elettromoltiplicatore, ecc.)

Separazione cromatografica dai componenti della matrice biologica coestratti/coprecipitati

RISPOSTE

R1. Area del picco (obiettivo massimizzare sensibilità)

R2. Simmetria del picco (quanto più possibile vicina a) 1

R3. Effetto matrice% = obiettivo minimizzare effetto matrice se

presente

MF=area del picco in presenza della matrice (bk estratto e poi

spikato) / area del picco in assenza di matrice (soluzione pura

dell’analita)

RISPOSTE

R1. Intensità dello ione molecolare (proporz h picco)

R2. rapporto IC dello ione molecolare /TIC (rapporto S/N)

Iniezione diretta in massa di una soluzione standard di elvitegravir alla conc di 1000 ng/mL ricerca della massa m/z=448

intensità dello ione molecolare

il modello lineare con interazioni non funziona.La migliore % di varianza spiegata ottenibile è minore del 30% e sembra chiaro che esista una curvatura nella risposta e che serva quindi un modello quadratico per trovare l'optimum della intensità dello ione molecolare. In ogni caso è possibile individuare le tendenze dei fattori nel determinare la risposta, e queste sono le seguenti.

Risultati

Intensità ione molecolare/TICil modello lineare con interazioni spiega bene i risultati.

In particolare, la % di varianza spiegata è del 90% con un errore piccolo e una convalida soddisfacente (quasi coincidenza, a meno della varianza sperimentale, tra dato previsto al centro e dato sperimentale misurato nelle condizioni centrali del dominio sperimentale).I fattori principali sono tutti importanti ad eccezione di Capillary voltage e Cone gas che possono essere impostati ai valori che convengono di più

Risultati

36

Intercetta TSorge ConVol GasDes TDesol

TSorge·ConVo

l

TSorge·GasD

es

Tsorge·TDe

sol

ConVol*Gas

Des

ConVol·TDe

sol

GasDes·TDe

sol

TSorge^

2

ConVol^

2

GasDe

s^2

TDeso

l^2

3.46 0.090 1.07 -0.24 -0.19 -0.080 -0.19 -0.20 -0.35 -0.29 0.20 -1.64 0.017 0.41 -0.24

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

*** * ***

TSorge ConVol GasDes TDesol

IIM/TICx10

00

-1 1 -1 -1 3.66171

-1 1 1 1 2.934959

-1 -1 -1 1 0.763393

-1 1 1 -1 2.489362

-1 1 -1 1 2.700803

-1 -1 -1 -1 0.629442

-1 -1 1 1 0.776667

-1 -1 1 -1 0.769504

-1 0 0 0 1.907801

-1 0 0 0 1.958333

-1 0 0 0 1.909677

0 -1 0 0 2.503618

0 1 0 0 5.353319

0 0 -1 0 4.206009

0 0 1 0 4.444444

0 0 0 -1 3.409611

0 0 0 1 3.932432

0 0 0 0 3.75626

0 0 0 0 3.472454

0 0 0 0 2.691257

0 0 0 0 2.317802

0 0 0 0 2.916667

0 0 0 0 2.838617

1 1 1 1 1.513812

1 1 1 -1 2.379936

1 1 -1 1 2.603448

1 -1 -1 1 1.095506

1 -1 1 -1 1.154412

1 -1 -1 -1 0.96

1 -1 1 1 1.252252

1 1 -1 -1 5.502008

1 0 0 0 2.224359

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Coefficients

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0 ***

***

*

Studio quantitativo sui 4 fattori con piano FCD (+16 esperimenti)

37

Studio quantitativo dei fattori influenzantil’esperimento MRM

Esperimenti sulla transizione 448 -> 344

1) energia di collisione , intervallo 10-50 eV.

2) portata del gas di collisione , intervallo 0.25-0.35 mL/min.

8 esperimenti + 4 repliche del punto al centro del dominio sperimentale (30 eV; 0.30 mL/min).

Sono state condotte 3 serie di 12 esperimenti

Piano Face Centered Design dei 2 fattori (12 esperimenti)

Modello ipotizzato

Y = b0

+ b1·X

1+ b

2·X

2+ b

12·X

1·X

2+ b

11·X

1

2+ b

22·X

2

2

Y1: Intensità dello ione figlio (IM·106)

Y2: il rumore, N, rappresentata dalla TIC·108

Y3: il rapporto segnale/rumore, calcolato dal quoziente

IM/TIC*100

RISPOSTE

Osservazioni

Punto di massimo quasi al

centro del dominio e ampia

zona di robustezza,

compresa intorno al

massimo.

Area robustezza

X1: [0, 0.3]

X2: [-0.4, 0.2]

Si vede meglio questo nel

contour plot 3D.

Coordinate del massimo

Fattore valori codificati valori attuali

X1 Collision energy 0.17 32.34 eV

X2 Collision gas flow -0.12 0.29 mL/min

Ypred S/N (predetta) ± CI(95%) 1.82±0.67

Ysper S/N (sperim) ± CI(95%, n=8) 1.84±0.41

5. Validazione del metodo analitico: Specificità

• Valutazione della performance in presenza di elevate

concentrazioni di altri antivirali, antifungini, antibiotici,

immunosoppressori

• Valutazione dell’EFFETTO MATRICE

ELVITEGRAVIR conc (ng/mL) 25 50 150 1500 7500

Within day

Mean ± SD 26.0 ± 1.2 46.8 ± 3.2 146 ± 13 1524 ± 73 7327 ± 409

CV (%) 4.6 6.9 9.1 4.8 5.6

Accuracy (%) 104.1 93.7 97.4 101.6 97.7

Between day

Mean ± SD 22.8 ± 4.1 46.8 ± 3.7 148 ± 8 1538 ± 72 7648 ± 358

CV (%) 18.1 8.0 5.4 4.7 4.7

Accuracy (%) 91.3 93.6 98.6 102.6 102

5. Validazione del metodo analitico: Precisione e accuratezza

LLOQ

Linearità del metodo: 25-10000 ng/mL

5. Validazione del metodo analitico:Integrità nella diluizione

Differenza percentuale-3,6 ( + 2,8) %

1:1 1:4

Parameter Results (%)

150

ng/mL

1500

ng/mL

7500

ng/mL

Autosampler stability (24 hours at °C) -4.2 -1.3 -5.1

Freeze–thaw (three cycles) -5.9 +0.9 -7.5

Short-term plasma samples (18 h at

room temperature)

-4.2 +2.9 -7.2

Long-term plasma sample (30 days at

−20 ◦C)

-1.6 +2.1 -5.2

5. Validazione del metodo analitico: Stabilità

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Patient chromatogram before and after reaction with enzyme

6. Controllo del metodo

• Quando avremo raccolto un numero significativo di dati potremo

prevedere una eventuale variazione del metodo affinchè venga

se necessario migliorata la metodica

Conclusioni

• Il QbD può effettivamente aiutare a mettere a punto metodi bioanaliticirobusti

• I numeri di metodi non performanti sono destinati a diminuire notevolmente

• Anche in questo campo è necessario che se ne comprenda l’importanza

baldelli.sara@hsacco.it