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La cytométrie en flux :
une approche pertinente pour l’étude des cellules épithéliales mammaires bovines
Laurence FINOT, Eric CHANAT, Marion BOUTINAUD,
Sergine EVIN, Pierre GERMON et Frédéric DESSAUGE
XVIIIe Journées de l’animation transversale Glande mammaire, lait
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.02
Des populations/sous-populations cellulaires Un état de différenciation cellulaire Des cellules vivantes / apoptotiques / mortes
Technologie qui permet d’identifier et de caractériser demanière quantitative et qualitative des populations cellulaires.
Présence de protéines exprimées à lasurface des cellules : marqueurs de surface(CD, cluster de différenciation) .
Ces marqueurs permettent de distinguer:
La cytométrie en flux
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.03
Le principe de la cytométrie en flux
Marquage : anticorps couplés à un fluorochrome
Utilisation de la cytométrie de flux
AP
C (
marq
ueu
r 2)
FITC (marqueur 1)
Profil cytométriqueAnalyse cellule par cellule
Quantification de la fluorescence
Plusieurs paramètres analysés simultanément pour chaque cellule
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.04(1) D’après Delouis et Richard, 1991
Les cellules épithéliales dans la glande mammaire
Alvéole
lumière
cellules épithéliales
adipocyte
vaisseau sanguin
fibroblaste
Kératine 7 Kératine 14 Collagène DAPI
Marquage
KRT 14 : cellules basales /myoépithéliales
KRT7 : cellules luminales
Collagène : matrice extracellulaire
(2) Mammary Epithelial Cell Lineage Changes During Cow's Life. Finot L, Chanat E, Dessauge F. J Mammary Gland Biol Neop. 2019.
Coupe de tissu mammaire de vaches Holstein pubères (17 mois d’âge)(2) (1)
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.05
Le lignage épithélial chez la souris : de la cellule souche aux cellules différenciées
D’après Visvader and Stingl , 2014
Les MaSC et le lignage sont très étudiés chez la souris (DeOme et al, 1959) et la femme
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.06
Le lignage épithélial : enjeu pour la recherche en Agronomie
Acquérir des connaissances sur le lignage épithélial chez le bovinlaitier
Etudier la dynamique des populations épithéliales au cours de la« carrière » de la vache
Objectifs de thèse :
Lien entre cellules souches, développement et régénération du tissusécréteur mammaire : cellules cibles pour des approches visant àrenforcer le tissu sécréteur
Peu d’études chez les espèces de rente (vaches)
Intérêt grandissant en Agronomie (Ellis et Capuco, 2002 in Tissue and cell)
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.07
TISSU MAMMAIRE
Stratégie expérimentale : matériel & méthodes
CYTOMETRIE EN FLUX
Explants cryo-conservés
Digestion enzymatique pour obtention de cellules dissociées
ANIMAUXPrim’Holstein
Marqueurs de surface : validation
Stade 1 : Puberté (n=4)Stade 2 : Lactation (n=4)Stade 3 : Tarissement (n=3)
Immunofluorescence (coupe de tissu)
Western Blot (cellules triées)
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.08
• CD49f Intégrine α6 Protéine d’adhésion des cellulesépithéliales à la matrice extracellulaire /exprimée par les cellules souches adultesmammaires
Marqueurs de phénotypage des cellules épithéliales
Heat Stable Antigen
Métallo-endopeptidasemembranaire
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.09
• CD24
Marqueurs de phénotypage des cellules épithéliales
Heat Stable Antigen Protéine impliquée dans la prolifération etl’adhésion des cellules (exprimée par lescellules prolifératives / associée auxcellules souches et progénitrices)
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.010
• CD10
Marqueurs de phénotypage des cellules épithéliales
Métallo-endopeptidasemembranaire
Protéine exprimée par les cellulesbasales/myoépithéliales
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.011
• CD49f Intégrine α6
• CD24 Heat Stable Antigen
• CD10 Métallo-endopeptidasemembranaire
Protéine d’adhésion des cellulesépithéliales à la matrice extracellulaire /exprimée par les cellules souches adultesmammaires
Protéine impliquée dans la prolifération etl’adhésion des cellules (exprimée par lescellules prolifératives / associée auxcellules souches et progénitrices)
Protéine exprimée par les cellulesbasales/myoépithéliales
Marqueurs de phénotypage des cellules épithéliales
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.012
TISSU MAMMAIRE
Stratégie expérimentale : matériel & méthodes
CYTOMETRIE EN FLUX
Explants cryo-conservés
Digestion enzymatique pour obtention de cellules dissociées
ANIMAUXPrim’Holstein
Marqueurs de surface : validation
Stade 1 : Puberté (n=4)Stade 2 : Lactation (n=4)Stade 3 : Tarissement (n=3)
CD24 CD49f
Phénotypage des cellules
Marquage des protéines de surface
CD10
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.013
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
Profil cytométrique des cellules mammaires totales à la puberté
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.014
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
CD49flaible
CD24neg
CD49ffort
CD24pos
CD49ffaible
CD24pos
CD49ffort
CD24neg
Quatre sous-populations épithéliales présentes à la puberté
2%
30% 42%
21%
3%
18%
22%20%
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.015
TISSU MAMMAIRE
Phénotypage des cellules dissociées du tissu
CYTOMETRIE EN FLUX
Explants cryo-conservés
Digestion enzymatique pour obtention de cellules dissociées
Phénotypage des cellules
Marquage des protéines de surface
ANIMAUXPrim’Holstein
Stade 1 : Puberté (n=4)Stade 2 : Lactation (n=4)Stade 3 : Tarissement (n=3)
TRI CELLULAIRE
Trieur (FACSARIA II)
Caractérisation des sous-populations d’intérêt :
Expression de gènes
Activité ALDH1
Culture in vitro 3D
Immunofluorescence
Identification des sous-populations d’intérêt
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.016
Tri des sous-populations cellulaires épithéliales d’intérêt
CD49f
0 105
CD
24
104103102
0
102
103
104
105CD49f
faible CD24pos
CD49ffort CD24pos
CD49ffaible CD24neg
CD49ffort CD24neg
CD49fneg
CD24neg
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.017
Pas de mammosphère
Formation de mammosphèrePas d’expression CD10
Forte expression de CD10 Activité ALDH1
Pas d’activité ALDH1Gènes exprimés : KRT7, KRT18, KRT19, PR, PRLR
Gènes exprimés : KRT14, Vimentine, PROCR
Cellules CD49ffaible CD24neg
Cellules CD49ffort CD24neg
Cellules luminales
Pas de mammosphère
Formation de mammosphère
CD10 expression
Forte expression de CD10Activité ALDH1
Activité ALDH1Gènes exprimés : KRT7, KRT18, KI67, ELF5
Gènes exprimés : KRT14, KRT7, KRT18, ELF5
Cellules CD49ffaible CD24pos
Cellules CD49ffort CD24pos
Cellules progénitrices
Cellules souches
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
Cellules basales
Les caractéristiques des sous-populations cellulaires permettent de les identifier
Abréviations : Aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1); kératine (KRT); Récepteur de la Progestérone (PR); Récepteur de la Prolactine (PRLR); E74 like ETS transcription factor 5 (ELF5); Récepteur de la Protéine C (PROCR)
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.018
Cellules Souches Mammaires (MaSC)
cellule ductale
Progénitrice
cellule basale
cellule luminale
CD49ffort CD24pos CD10fort
CD49ffort CD24pos CD10fort
MaSC “quiescentes”
MaSC “orientées”
ALDH1neg
ALDH1pos
CD49ffaible CD24pos CD10faible
CD49ffort CD24neg CD10fort
KRT14+ Vimentine+ PROCR+
KRT7+ ALDH1+ PR+ ELF5+
CD49ffaible CD24neg CD10neg
KRT19+ KRT18+ KRT7+ PR+ PRLR+
?
Molecular signature of the putative stem/progenitor cells committed to the development of the bovine mammary gland at puberty. L. Finot, E. Chanat and F. Dessauge. Sci. Report 2018.
Le lignage épithélial mammaire à la puberté chez le bovin
?
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.019
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e30 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
CD49f
Vaches en lactationVaches pubères Vaches taries
Evolution des populations cellulaires épithéliales à 3 stades physiologiques clés chez la vache laitière
17 mois (n = 4)
4ème lactation (35kg lait/jour) (n = 4)
Tarissement de 5 ans(n = 3)
Cellules luminales (sécrétrices)Cellules progénitrices Cellules luminales et basales
Mammary Epithelial Cell Lineage Changes During Cow's Life. Finot L, Chanat E, Dessauge F. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2019.
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.020
Puberté Lactation Tarissement% de cellules (± SEM)
Cellules luminales
CD49f faible CD24 neg
CD49f med CD24 neg
19.8 (± 1.2)
1.4b (± 0.2)
21.2 (± 2.4)
7.2a (± 1.6)
28.7 (± 7.0)
7.1a (± 1.6)
Cellules basales
CD49ffort CD24 neg 22.1a (± 1.6) 2.4c (± 0.9) 11.7b (± 1.8)
Cellules progénitrices
CD49ffaible CD24 pos 18.6a (± 3.4) 1.6c (± 0.4) 3.0b (± 0.3)
Cellules souches putatives
CD49ffort CD24 pos 3.3a (± 0.3) 1.5b (± 0.5) 0.4b (± 0.0)
Comparaison des populations épithéliales selon le stade physiologique
Les différences significatives (p<0,05) entre stades physiologiques sont indiquées par des lettres (a, b et c)
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.021
L’approche de la cytométrie en flux…
OUTIL de PHENOTYPAGE des cellules épithéliales
Identifier / caractériser les populations épithéliales
- cytométrie en flux
- Tri cellulaireCD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
CELLULES LUMINALES
CELLULES PROGENITRICES
CELLULES BASALES
CELLULESSOUCHES
Identifier le type de cellules épithéliales
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.022
In vivo / Ex vivo In vitro
Approches complémentaires pour étudier les cellules mammaires en agronomie
Tissu / biopsie de glande mammaire Cellules dissociées (culture primaire)
Lignées cellules épithéliales mammaires
MatrigelAdhérent
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.023
(MAC-T)(Holstein en lactation-gravide)(1)
(BME-UV1)(Holstein en lactation)(2)
Condition 2D (adhérent) Conditions 3D (Matrigel ou ULA)
(2) Zavizion et al., 1996(1) Huyn et al., 1991
Les deux lignées cellulaires épithéliales mammaires bovines
Sélection (clonale) d’après caractéristiques morphologiques typiques épithéliales Cellules (avant transfection) cultivées en adhérentes
Expression faible des caséines
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.024
Phénotypage des lignées de cellules épithéliales mammaires bovines
175
150
125
100
75
50
25
0-1 0 1 1e1 1e2 1e3
CD49f-FITC
FSC
MAC-T175
150
125
100
75
50
25
0-1 0 1 1e1 1e2 1e3
CD49f-FITC
BME-UV1
FSC
Phenotypic and functional characterization of two bovine mammary epithelial cell lines in 2D and 3D models.Arévalo Turrubiarte M, Perruchot MH, Finot L, Mayeur F, Dessauge F. Am J Physiol Cell Physiol. 2016
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
175
150
125
100
75
50
25
0-1 0 1 1e1 1e2 1e3
CD49f-FITC
FSC
PS
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
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.025
Phénotypage des lignées de cellules épithéliales mammaires bovines
175
150
125
100
75
50
25
0-1 0 1 1e1 1e2 1e3
CD49f-FITC
FSC
BME-UV1 MAC-T
PS
MAC-T
CD49f fort CD24neg
BME-UV1
CD49f med CD24neg
Lignées de cellules luminales(sécrétrices)
PS
CD49f fort CD24neg
Lignées de cellules basales
Lignées de cellules basales
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.026
In vivo / Ex vivo In vitro
Récupérer les cellules épithéliales dans le lait pour étudier les cellules mammaires
Cellules dissociées (culture primaire)
Cellules du lait Lignées cellules épithéliales mammaires
MatrigelAdhérent
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.027
Des cellules épithéliales distinguables parmi les cellules totales du lait
KRT14 / KRT 8 / DAPI
20X
20X
ImmunoFluorescence :
Peu de cellules épithéliales
Cellules luminales, basales?
cellules basales (KRT14) cellules luminales (KRT8)
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.028
KRT14 / KRT 8 / DAPI
63X
20X
KRT14 / KRT 8 / DAPI
Après culture en support adhérent des cellules totales du lait
Les cellules épithéliales du lait sont majoritairement luminales
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.029
Phénotyper les cellules du lait pour connaître son échantillonnage
CD49f
0 1 1e1 1e2 1e3
CD
24
0
1
1e1
1e2
1e3
CD49f faible/med CD24neg
Cellules avec un phénotype luminal
4 à 15% (cellules CD49fpos )
TRI possible
Cellules du lait de vache en lactation
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.030
En conclusion
• Mise en évidence des populations épithéliales : proposition d’un lignageépithélial mammaire chez la vache laitière
L’approche de cytométrie en flux :
• Etude des populations épithéliales (stades physiologiques : puberté,lactation, tarissement)
• Développer un outil de phénotypage des cellules épithéliales
Immortaliser les différentes populations épithéliales (basales, progénitrices,luminales, souches) après tri : outil biologique
Compléter l’étude de la dynamique des populations avec d’autres stadesphysiologiques tels que la mammogénèse (pré-puberté, gestation) ou les périodesentre tarissement/lactation
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.031
Plateformes BIOSIT de RENNES : CytomeTRI & Génomique Environnementale et Humaine (GEH)
Collègues et collaborateurs de l’UMR PEGASE (St-Gilles) :Installation Expérimentale de Méjusseaume
Collègues et collaborateurs de l’UMR GABI (Jouy-en-Josas)
Pierre Germon (UMR ISP) et Sergine Even (UMR STLO)