la citogenÓmica como herramienta de investigaciÓn … · 2020-01-09 · empleamos la información...
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LA CITOGENOacuteMICA COMO HERRAMIENTA DE INVESTIGACIOacuteN
UNA VISIOacuteN INTEGRADORA EN ONCO-HEMATOLOGIacuteA
Juan C Cigudosa
Prof Dr Juan C Cigudosa
Scientific and Clinical Director NIMGeneticsVS Molecular Cytogenetics Unit Spanish National Cancer Research Institute (CNIO)President Spanish Association of Human GeneticsConsultor ad hoc
Agilent Technologies IncRoche DxBrystol Myers SquibbJanssen CilagCelgene
Neoplasias Hematoloacutegicas
Cambios cromosoacutemicos no casuales
Cambios geneacuteticos Fenotipo neoplaacutesico
DiagnoacutesticoPronoacutesticoTratamiento
iexcliexcl La leucemia es una enfermedad de origen geneacutetico
Consecuencia
La investigacioacuten en onco-hematologiacutea intenta descubrir la relacioacuten gen-
enfermedad
iquestCoacutemo estudiamos la
relacioacuten gen -
enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Concepto Descripcioacuten Ejemplo
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo de enfermedad con lamaacutexima discriminacioacuten posible
t(922)(q34q112)BCRABL
Biomarcadorpronoacutestico
Asociado con la evolucioacuten cliacutenica en ausencia deterapia
Biomarcador de pronoacutestico negativo
Biomarcadorpredictivo
Asociado con la respuesta a una determinadaspauta terapeuacutetica
Biomarcador predictivo positivo
Terapiaindividualizada
Empleamos la informacioacuten proporcionada portodos los tipos de biomarcadores para elegir laopcioacuten maacutes adecuada al paciente en lascondiciones de presentacioacuten
Existe una terapia individualizada para el
paciente Imatinib
Definicioacuten de biomarcadoresSituacioacuten actual Biomarcadores de origen geneacutetico
1 El caacutencer es una enfermedad geneacutetica
2 Aproximaciones posibles
- Moleculares Alteraciones geacutenicas detectadaspor teacutecnicas biologiacutea molecular
- Citogeneacutetica Alteraciones cromosoacutemicas de-tectadas por Citogeneacutetica
Estudio microscoacutepico de la dotacioacuten cromosoacutemica
Citogeneacutetica
Determinacioacuten del cariotipo
Citogeneacutetica Convencional
Citogeneacutetica Molecular
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Prof Dr Juan C Cigudosa
Scientific and Clinical Director NIMGeneticsVS Molecular Cytogenetics Unit Spanish National Cancer Research Institute (CNIO)President Spanish Association of Human GeneticsConsultor ad hoc
Agilent Technologies IncRoche DxBrystol Myers SquibbJanssen CilagCelgene
Neoplasias Hematoloacutegicas
Cambios cromosoacutemicos no casuales
Cambios geneacuteticos Fenotipo neoplaacutesico
DiagnoacutesticoPronoacutesticoTratamiento
iexcliexcl La leucemia es una enfermedad de origen geneacutetico
Consecuencia
La investigacioacuten en onco-hematologiacutea intenta descubrir la relacioacuten gen-
enfermedad
iquestCoacutemo estudiamos la
relacioacuten gen -
enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Concepto Descripcioacuten Ejemplo
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo de enfermedad con lamaacutexima discriminacioacuten posible
t(922)(q34q112)BCRABL
Biomarcadorpronoacutestico
Asociado con la evolucioacuten cliacutenica en ausencia deterapia
Biomarcador de pronoacutestico negativo
Biomarcadorpredictivo
Asociado con la respuesta a una determinadaspauta terapeuacutetica
Biomarcador predictivo positivo
Terapiaindividualizada
Empleamos la informacioacuten proporcionada portodos los tipos de biomarcadores para elegir laopcioacuten maacutes adecuada al paciente en lascondiciones de presentacioacuten
Existe una terapia individualizada para el
paciente Imatinib
Definicioacuten de biomarcadoresSituacioacuten actual Biomarcadores de origen geneacutetico
1 El caacutencer es una enfermedad geneacutetica
2 Aproximaciones posibles
- Moleculares Alteraciones geacutenicas detectadaspor teacutecnicas biologiacutea molecular
- Citogeneacutetica Alteraciones cromosoacutemicas de-tectadas por Citogeneacutetica
Estudio microscoacutepico de la dotacioacuten cromosoacutemica
Citogeneacutetica
Determinacioacuten del cariotipo
Citogeneacutetica Convencional
Citogeneacutetica Molecular
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Neoplasias Hematoloacutegicas
Cambios cromosoacutemicos no casuales
Cambios geneacuteticos Fenotipo neoplaacutesico
DiagnoacutesticoPronoacutesticoTratamiento
iexcliexcl La leucemia es una enfermedad de origen geneacutetico
Consecuencia
La investigacioacuten en onco-hematologiacutea intenta descubrir la relacioacuten gen-
enfermedad
iquestCoacutemo estudiamos la
relacioacuten gen -
enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Concepto Descripcioacuten Ejemplo
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo de enfermedad con lamaacutexima discriminacioacuten posible
t(922)(q34q112)BCRABL
Biomarcadorpronoacutestico
Asociado con la evolucioacuten cliacutenica en ausencia deterapia
Biomarcador de pronoacutestico negativo
Biomarcadorpredictivo
Asociado con la respuesta a una determinadaspauta terapeuacutetica
Biomarcador predictivo positivo
Terapiaindividualizada
Empleamos la informacioacuten proporcionada portodos los tipos de biomarcadores para elegir laopcioacuten maacutes adecuada al paciente en lascondiciones de presentacioacuten
Existe una terapia individualizada para el
paciente Imatinib
Definicioacuten de biomarcadoresSituacioacuten actual Biomarcadores de origen geneacutetico
1 El caacutencer es una enfermedad geneacutetica
2 Aproximaciones posibles
- Moleculares Alteraciones geacutenicas detectadaspor teacutecnicas biologiacutea molecular
- Citogeneacutetica Alteraciones cromosoacutemicas de-tectadas por Citogeneacutetica
Estudio microscoacutepico de la dotacioacuten cromosoacutemica
Citogeneacutetica
Determinacioacuten del cariotipo
Citogeneacutetica Convencional
Citogeneacutetica Molecular
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
iexcliexcl La leucemia es una enfermedad de origen geneacutetico
Consecuencia
La investigacioacuten en onco-hematologiacutea intenta descubrir la relacioacuten gen-
enfermedad
iquestCoacutemo estudiamos la
relacioacuten gen -
enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Concepto Descripcioacuten Ejemplo
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo de enfermedad con lamaacutexima discriminacioacuten posible
t(922)(q34q112)BCRABL
Biomarcadorpronoacutestico
Asociado con la evolucioacuten cliacutenica en ausencia deterapia
Biomarcador de pronoacutestico negativo
Biomarcadorpredictivo
Asociado con la respuesta a una determinadaspauta terapeuacutetica
Biomarcador predictivo positivo
Terapiaindividualizada
Empleamos la informacioacuten proporcionada portodos los tipos de biomarcadores para elegir laopcioacuten maacutes adecuada al paciente en lascondiciones de presentacioacuten
Existe una terapia individualizada para el
paciente Imatinib
Definicioacuten de biomarcadoresSituacioacuten actual Biomarcadores de origen geneacutetico
1 El caacutencer es una enfermedad geneacutetica
2 Aproximaciones posibles
- Moleculares Alteraciones geacutenicas detectadaspor teacutecnicas biologiacutea molecular
- Citogeneacutetica Alteraciones cromosoacutemicas de-tectadas por Citogeneacutetica
Estudio microscoacutepico de la dotacioacuten cromosoacutemica
Citogeneacutetica
Determinacioacuten del cariotipo
Citogeneacutetica Convencional
Citogeneacutetica Molecular
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
iquestCoacutemo estudiamos la
relacioacuten gen -
enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Concepto Descripcioacuten Ejemplo
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo de enfermedad con lamaacutexima discriminacioacuten posible
t(922)(q34q112)BCRABL
Biomarcadorpronoacutestico
Asociado con la evolucioacuten cliacutenica en ausencia deterapia
Biomarcador de pronoacutestico negativo
Biomarcadorpredictivo
Asociado con la respuesta a una determinadaspauta terapeuacutetica
Biomarcador predictivo positivo
Terapiaindividualizada
Empleamos la informacioacuten proporcionada portodos los tipos de biomarcadores para elegir laopcioacuten maacutes adecuada al paciente en lascondiciones de presentacioacuten
Existe una terapia individualizada para el
paciente Imatinib
Definicioacuten de biomarcadoresSituacioacuten actual Biomarcadores de origen geneacutetico
1 El caacutencer es una enfermedad geneacutetica
2 Aproximaciones posibles
- Moleculares Alteraciones geacutenicas detectadaspor teacutecnicas biologiacutea molecular
- Citogeneacutetica Alteraciones cromosoacutemicas de-tectadas por Citogeneacutetica
Estudio microscoacutepico de la dotacioacuten cromosoacutemica
Citogeneacutetica
Determinacioacuten del cariotipo
Citogeneacutetica Convencional
Citogeneacutetica Molecular
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Concepto Descripcioacuten Ejemplo
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo de enfermedad con lamaacutexima discriminacioacuten posible
t(922)(q34q112)BCRABL
Biomarcadorpronoacutestico
Asociado con la evolucioacuten cliacutenica en ausencia deterapia
Biomarcador de pronoacutestico negativo
Biomarcadorpredictivo
Asociado con la respuesta a una determinadaspauta terapeuacutetica
Biomarcador predictivo positivo
Terapiaindividualizada
Empleamos la informacioacuten proporcionada portodos los tipos de biomarcadores para elegir laopcioacuten maacutes adecuada al paciente en lascondiciones de presentacioacuten
Existe una terapia individualizada para el
paciente Imatinib
Definicioacuten de biomarcadoresSituacioacuten actual Biomarcadores de origen geneacutetico
1 El caacutencer es una enfermedad geneacutetica
2 Aproximaciones posibles
- Moleculares Alteraciones geacutenicas detectadaspor teacutecnicas biologiacutea molecular
- Citogeneacutetica Alteraciones cromosoacutemicas de-tectadas por Citogeneacutetica
Estudio microscoacutepico de la dotacioacuten cromosoacutemica
Citogeneacutetica
Determinacioacuten del cariotipo
Citogeneacutetica Convencional
Citogeneacutetica Molecular
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
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Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
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Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
1 El caacutencer es una enfermedad geneacutetica
2 Aproximaciones posibles
- Moleculares Alteraciones geacutenicas detectadaspor teacutecnicas biologiacutea molecular
- Citogeneacutetica Alteraciones cromosoacutemicas de-tectadas por Citogeneacutetica
Estudio microscoacutepico de la dotacioacuten cromosoacutemica
Citogeneacutetica
Determinacioacuten del cariotipo
Citogeneacutetica Convencional
Citogeneacutetica Molecular
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
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S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Estudio microscoacutepico de la dotacioacuten cromosoacutemica
Citogeneacutetica
Determinacioacuten del cariotipo
Citogeneacutetica Convencional
Citogeneacutetica Molecular
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Cariotipo normal 46XX
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Cariotipo normal 46XY
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Citogeneacutetica del caacutencer
1 Los tumores presentan alteraciones cromosoacutemicas
2 Las alteraciones pueden ser
- Especiacuteficas de diagnoacutestico
- No especiacuteficas de diagnoacutestico y especiacuteficas de progresioacuten yo maacutel pronoacutestico
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
LNH DEL MANTO
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
LINFOMA MALT
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
t(814)(q24q32)
LINFOMA BURKITT
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
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32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
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Conclusions
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E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
LNH FOLICULAR
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
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Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
t(122)
Leucemia Mieloide Aguda
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
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N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
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Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
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Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
t(122)
PMLRARA
EVI1AML1
ETOAML1
AF2MLL
CBPBMYH11
OTTMAL
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
La sociedad demanda tratamientos meacutedicos maacutes raacutepidos efectivos y con menos efectos secundarios =
diagnoacutestico de biomarcadores maacutes completo que permita la implantacioacuten de
medicina individualizada
Diagnoacutestico Geneacutetico Cariotipo Bordf Molecular y
FISH
Diagnoacutestico tradicional en
Patologiacutea
Situacioacuten actual
iexcliexcliexcliexcliexcl SE SECUENCIA EL GENOMA HUMANO
Diagnoacutestico mediante genoacutemica Estudiar un genoma individual
acceso a medicina individualizada
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
iquestCoacutemo estudiamos la relacioacuten gen -enfermedad
Biomarcadores- Geneacuteticos
Biomarcadores- De origen genoacutemico
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Cyclin D1
Estudiar la implicacioacuten de 1 gen en 1 patologiacutea supone
En teacuterminos genoacutemicosEstudiar la implicacioacuten de 20000 genes en 1 patologiacutea supone
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
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NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
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O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
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Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Imaacutegenes
Hojas de datos
Filtrado
ldquoClustering agrupamiento no supervisadordquo
Identificacioacuten de patrones
Aplicacioacuten de herramientas bioinformaacuteticas
Meacutetodo supervisado
Identificacioacuten de genes identificadores de una caracteriacutestica cliacutenica
En teacuterminos de anaacutelisis
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
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Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
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Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
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Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
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bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Genes que co-expresan iquestQueacute tienen
en comuacuten
Distintos fenotipos
iquestQue genes son los responsables
Preguntas
Genes que interaccionan en
una red (ABC)
iquestComo es la red
A
B C
D
E
Genes de una claseiquestQueacute patroacuten(es)
tienen y
iquesthay maacutes
Clasificacioacuten de fenotipos
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Tipo de herramienta Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNA Detecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNALee el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS (Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o DNA en estudio
Introduccioacuten de estrategias genoacutemicas de uso cliacutenico de rutina en un laboratorio de diagnoacutestico
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
ArraysDNA
NGS
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
NGS(Ultrasecuenciacioacuten) DNARNA Lee la secuencia base a base del RNA o
DNA en estudio
Aplicacioacuten de la secuenciacioacuten masiva de uacuteltima generacioacuten (NGS) al diagnoacutestico de
leucemias mieloides
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
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NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
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Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
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Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
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Universidad de Navarra Pamplona
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12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
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3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
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SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
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Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
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Leucemia Mieloide Croacutenica
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Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
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LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Los NUacuteMEROS del genoma humano
Direccioacuten de la Transcripcioacuten
Exoacuten Introacuten
El genoma humano contiene 30000 millones de pb de DNA
Estaacute dividido en 46 dobles-hebras de DNA que en metafases se visualizan como cromosomas
Los 20000 genes del genoma humano que codifican para proteiacutenas y para RNAs funcional (pej miRNA) representan el el 15 de nuestro
genoma (aprox 45 Mb)
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
El 98 del Genoma NO codifica para proteiacutenas oacute RNA funcional
gt50 elementos RepetitivosNO ldquojunk DNArdquo
15 regioacuten codificante
8 elementos
reguladores
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
La Variabilidad del Genoma Humano
Variabilidad a nivel de cromosomas (pej regiones polimoacuterficas sateacutelites)
Variabilidad a nivel de ldquograndesrdquo regiones genoacutemicas LCRs (Low number copy repeats) oacute duplicaciones segmentales
Restringidos a regiones cromosoacutemicas especiacuteficasTamantildeo 100-1000 pb
Representan el 5 del genoma humanoCNVs (Copy Number Variations) oacute duplicaciones de genes o regiones (100
Kb a Mb)
Variabilidad a nivel de nucleoacutetido SNPs (Single Nucleotiacutede Polymorphisms)1 de cada 300 pb del genoacutema es polimoacuterfica (gt1 de la poblacioacuten) lo que
implica que 2 individuos no relacionados difieren en gt3 millones de SNPsgt99 de los SNPs en regiones NO Codificante
Los SNPs pueden ldquoalterarrdquo la funcioacuten de una proteiacutena
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
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S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Rapidez
Costes
Rendimiento
Precisioacuten Debido al mayor nuacutemero de lecturas se obtiene una mayor cobertura de la regioacuten analizada lo que
redunda en mayor precisioacuten y certeza en al lectura incluso siendo las lecturas individuales de
cada carrera en NGS menos precisas
1 lectura por carrera (maacuteximo ~1kb)
Indicado en estudio de mutaciones uacutenicas
10ngrs de DNA molde para 100pb de
secuencia
300Gb de lecturas en una carrera en un chip
Indicado en el estudio de muacuteltiples mutaciones
10ngs DNA molde para 50Kbp
de secuencia
Sanger NGS
Del Sanger a la Secuenciacioacuten Masiva
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
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M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
31
Genoma
Exoma
Genes Target
Transcriptoma
Metiloma
Epigenoma(Histonas)
Illumina
454 Pyroseqg
Helicos
SOLiD
Ion Torrent
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
32
Profundidad 6x SIN coberturaCobertura 100
Cobertura
Prof
undi
dad
Conceptos baacutesicos del anaacutelisis de la secuenciacioacuten masiva (NGS)
LECTURA secuencia corta generada de cada pocillo
ALINEAMIENTOde las secuencias del genoma de referencia
COBERTURA porcentaje de la regioacuten secuenciada
PROFUNDIDAD nuacutemero de veces que cada base estaacute representada
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
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M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
33
Diagnoacutestico Geneacutetico Basado en NGS en la praacutectica cliacutenica
ExomasSecuencias del DNA que codifican para TODOSlos exones que codifican para proteiacutenas oacute RNAfuncional
Asegura una mediaalta cobertura pero variableprofundidad a nivel de las secuencias analizadas conprofundidades medias de 50 a 100X
Dirigido a la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES ldquode Novordquo en en enfermedadesgeneacuteticas con presentacioacuten cliacutenica variable eineacutespeciacutefica y con elevada heterogenicidad geneacutetica
Indicaciones Estudio de enfermedadesMendelianas (pej Retrasos del desarrollo oacuteAutismo) oacute de aquellas
Paneles DirigidosSecuencias del DNA de genes seleccionados
Asegura una alta cobertura de los genesanalizados con profuncidades medias de 100 a1000X
Dirigido al estudio de muacuteltiples genes enenfermedades con heterogenicidadgeneacutetica para la identificacioacuten de mutacionesGERMINALES yo SOMAacuteTICAS
Indicacioacutenes Caacutencer Hereditario Estudio deTumores Distrofias retinianas cardiologiacuteaGeneacutetica
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
34
1- Deteccioacuten de poblaciones minoritariasPI3KCA
2- Deteccioacuten simultaacutenea de mutacionesPI3KCA
RB1
3- Identificacioacuten de muacuteltiples clones
PI3KCARB1
PI3KCA
PI3KCAKRAS
Estos estudios NO son posibles con meacutetodos convencionales de secuenciacioacuten de genes uacutenicos
OBJETIVOS del ESTUDIO GENETICO de MUESTRAS TUMORALES
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
I En Investigacion
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
I En Investigacion
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
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Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
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Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the
preferred targets again
27 June 2012
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Outline
Background
Part I Blastic Plasmocitoid Dendritic Cell Neoplasma
Conclusions
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
I D E N T I F Y M U T A T I O N S I N P R O T E I N - C O D I N G G E N E S T H A T M I G H T S H E D L I G H T O N T H E
B I O L O G I C C H A R A C T E R I S T I C S O F T H E S E R A R E S U B T Y P E S O F L E U K E M I A S
O F F E R N E W A P P R O A C H E S T O D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N A N D T R E A T M E N T
AIMS
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Part I
E X O M E S E Q U E N C I N G I D E N T I F I E S S O M A T I C M U T A T I O N S I N B L A S T I C P L A S M O C Y T O I D
D E N D R I T I C C E L L N E O P L A S M S- B P D C N -
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
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JU LIA NE M EN EZES
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
lt1 leukemiaslymphomas
Clinical Features Skin infiltration Lymph nodes and spleen Cytopenias Blasts in bone marrow and peripheral blood
Diagnosis Myeloid vs Lymphoid cell of origin CD56+ and CD4+
Poor prognosis Overal survival less than 3 months
Treatment Chemotherapy (lymphoid leukemia) bone marrow transplantation
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Patients
National Call
Hospital Gregoacuterio Marantildeoacuten Madrid
BioBanco La Feacute Valencia
Hospital Nuestra Sentildeora de la Candelaria Tenerife
Universidad de Navarra Pamplona
Universidad de Salamanca
12 cases bone marrow aspirates30 cases FFPE of lymph node andor skin andor BM biopsy
45 BPDCN
3 patients with germinal available DNA WES
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
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JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Gonzalo GomezBioinformatics Core Unit
Francesco Acquadro Molecular Cytogenetics Group
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Orlando DominguezGenomics Core Unit
Approach
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Results
Case 1 Case 2
Case 3QCgt200
Exonic non-synonymous and deleterious mutations
QC a parameter that allows us to scale the probability of the polymorphism exists at this site given sequencing data
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Genes in the Hematological Disease Pathway
Case 2 5HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Disease Progression
DNA Methylation Hematopoiesis
Case 1 7
Case 3 4
ASXL1
TP53
U2AF1
TET1HOXB9
DNMT3A
TET2
HOXA1
Splicing
U2AF1
TET1
CDK1
DDX11
NCOR1
IKZF3
ASXL1
TP53
NBL1
UBE2G2
ZEB2
BCORL1
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
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-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
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Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
DNMT3
UTX
Epigenetics Modifications in Common Myeloid Disorders
Case 1
ASXL1 16-43
Case 2
TET1 first description
Case 3
TET2 26DNMT3A 116
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Conclusions
ASXL1 TET1 TET2 and DNMT3A mutations occur in BPDCN reinforcing the hypothesis of a myeloid origin of plasmocytoid dendritic cell
These findings open the possibility to treat these patients with Demethylating agents
The different behavior of this rare and aggressive disease may be explained by a peculiar combination of additional genetic alterations or by the cell type where these common alterations occur
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
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NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
R A R E M Y E L O I D L E U K E M I A S B A S I C A L L Y S H A R E T H E M U T A T I O N P R O F I L E W I T H O T H E R C O M M O N
M Y E L O I D D I S O R D E R S E P I G E N E T I C S A N D S P L I C E O S O M E
S T I L L ldquo N O N - C O M M O N rdquo M U T A T I O N S A R E F O U N D T H A T C O U L D E X P L A I N T H E I R ldquo U N I Q U E N E S S rdquo
N G S P R O D U C E S G E N E T I C B I O M A R K E R S F O R D I A G N O S I S C L A S S I F I C A T I O N T R E A T M E N T A N D
P R O G N O S I S
Take home messages
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
M O L E C U L A R C Y T O G E N E T I C S G R O U PH U M A N C A N C E R G E N E T I C S P R O G R A M
S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
JU LIA NE M EN EZES
S u p e r v i s o r J U A N C C I G U D O S A
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S P A N I S H N A T I O N A L C A N C E R R E S E A R C H C E N T E R ndash C N I O
NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
27 June 2012
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
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6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
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bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Leucemia Mieloide Croacutenica
iquestSon suficientes en laera de la SecuenciacioacutenMasiva
Herramientas
-Citogeneacutetica- FISH- qRT-PCR-Secuenciacioacuten por Sanger de mutaciones enABL1
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Enero 2010
Chronic Phase
bull Varoacuten 65 antildeosbull FISH BCRABL1 + 98bull qRT-PCR BCRABL1
p210(b3a2) 90
45 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Enero 2010 Enero 2011
Chronic Phase Cyt amp H remission
bull Remisioacuten Completa hematoloacutegica citogeneacutetica and parcial respuesta molecular
bull FISH negativo
bull qRT-PCR 53 a 13
45 XY rob(1314)(q10q10) [20]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Enero 2010 Enero 2011 Abril 2011 Julio 2011
Chronic Phase Complete remission Blastic crisis Exitus
44 XY t(922)(q34q112) rob(1314)(q10q10) -17 [5] 45 XY t(922)(q34q112) +10 rob(1314)(q10q10) -17 [5] 46 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 [3] 47 XY t(922)(q34q112) +8 +10 rob(1314)(q10q10) -17 +19 [2] 45 XY rob(1314)(q10q10) [5]
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Normal Genomic DNA hg19 reference sequence
Tumor Genomic DNA Informed consents
BWA for genomic alignment BEDTOOLDS for QC metric and custom scripting
PileLine for case-control variant comparisonSAMTOOLS to identify tumoral mutations amp GATK for INDELS
SIFT to annotate mutations predicting affects protein function
Filter for1 Known polymorphism (dbSNP132)
2 Changes present in matched normal DNA3 Silent changes
Library preparationSureSelect Human All Exon Kit
Target Regions 50 Mbp (160 of human genome)Sequencing Illumina Genome Analyzer (GA2) PE-76bp
Putative variants were manually reviewed and a selection of them was validated by capillary sequencing
Filter Chronic phase Complete Remission Blastic CrisisTotal 3123 7678 3306Somatic 719 1839 869Exonic 372 878 412Consequence 77 81 66Quality Control 13 7 15Frameshift stop gain and non-synonymous-deleterious
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Chronic Phase
TP53
TMEM57 UBE2G2
ZEB2
IKZF3ASXL1
ADAMTS16
C4BPA
TYRO3
ADAMTS12
CRIPAK
DYSF
KRT4
NEFH SKA3PABPC3
PPARGC1A
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
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iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
bull Un uacutenico caso presentoacute mutaciones en 20 genes diferentes
bull La mutacioacuten TP53 aparee y se mantiene en las 3 fases tumor-initiating events
bull Algunas SNSs son uacutenicas en la crisis blaacutestica leukemic transformation
bull Las mutaciones de ASXL1 UBE2G2 ZEB2 yIKZF3 son mutaciones iniciales que son simultaacuteneas a la mutacioacuten
diagnoacutestica el gen de fusioacuten BCRABL1
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
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6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
bull 26 muestras pareadas
13 chronic phase13 follow upblastic crisis
Definir las frecuencias mutaciones de TP53 ASXL1 and IKZF3
Id Type Age (years) Gender Follow-up (months) CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP BC CP Follow-up CP Follow-up CP BC CP Follow-up CP BC
60 F12 14
14 NA M 24
13 69 F 3
73 F
2 31 F 6
3
20
10
11
4 41 F 5
44 F 24
5
9 8 M 4
6 85
36 M
18M
54 M 5
70 M 3
1 65
34 M 128
587
M 7
ASXL1 IKZF3 TP53 c2035GgtT c952GgtA c730GgtA
c2035GgtT c952GgtA c730GgtA c2498_2501del wt wt c2498_2501del wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt c71CgtT wt wt c71CgtT wt
c2598AgtG wt wt c2598AgtG wt wt
wt wt wt wt wt wt c1937dup wt wt c1937dup wt wt wt wt wt
wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
wt wt wt
Los pacientes con mutaciones en ASXL1
y IKZF3 mutations blastic crisis
bull No mutaciones en TP53
bull ASXL1 23 chronic phase
23 follow upblastic crisis
bull IKZF38 chronic phase8 blastic crisis
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
RUNX1TP53
ASXL1
CDKN2AIKZF1RB1
TP53
ASXL1
IKZF3
ASXL1TP53IKZF3
BCR-ABL1
Myeloid
Lymphoid
Menezes et al Blood Cancer Journal 2013
LMC nuevas mutaciones como biomarcadores
Hospital U NSra de la CandelariaTenerife
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
NGSDNA
iquestCansados
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Tipo de herramienta
Muestra Objetivo
Array de Expresioacuten RNADetecta el perfil de expresioacuten de todos los genes (incluidos en el array)
Array de CGH DNADetecta ganancias y peacuterdidas de todas las regiones del genoma
Array de SNP DNADetecta el genotipo (secuencia) de los milesmillones de marcadores geneacuteticos polimoacuterficos incluidos en el array
Estudios de CNV en Leucemia Mieloide Aguda
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayo dirigido
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Microarray de CGH-SNP
ObjetivoDetecta ganancias y peacuterdidas de todaslas regiones del genoma
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
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0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
La hibridacioacuten genoacutemica comparativa
ADN tumoral
Plataforma aCGH con 41K BAC con 1 Mb resolucioacuten disentildeado en el laboratorio de B Weber y K Nathanson (UPENN)
ADN referenciaMarcaje por cebado
aleatorio
Cy5 Cy3
Hibridacioacuten competitiva
Cot-1 ADN
ESTUDIO DE LA VARIACIOacuteN DE LA DOTACIOacuteN GENOacuteMICA
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Ventajas
bull Screening del genoma en altaresolucioacuten
bull Poco tiempo de repuesta (2 diacuteaspara obtener resultados)
bull Resultados muy robustos ycomparables a otros estudios
bull Cada vez maacutes baratos
Limitaciones
bull Soacutelo detecta alteraciones de nuacutemero decopia (no detecta translocaciones o polipliacutediacutea)
bull Necesita una fuente de DNA pura (miacutenimo30 contenido tumoral)
bull Clonalidad del tejido complica anaacutelisis
bull Anaacutelisis de resultados requierebioinformaacutetica
Ventajas Y Limitaciones
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
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10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Tipo de muestras a analizar
bull Sangre perifeacuterica
bull Meacutedula oacutesea
bull Material incluiacutedo en Parafina
iquestCuaacutento DNA necesitamos
bull Sin amplificar 400 nanogramos
bull Con amplificacioacuten 10 nanogramos
bull Depende del tipo de array
Tipo de material que se hibrida
bull DNA genoacutemico
bull DNA seleccionado (ChIP on chip)
Tipos de Material para arrayCGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
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10
12
14
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18
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0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
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Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Favorable Prognosis Intermediate Prognosis Adverse Prognosis
t(821)
inv(16)
t(1517)
Complex Karyotype
t(69)
del(5q)
Trisomy 8
Normal Karyotype
70 Overall Survival 25 Overall Survival 8 Overall Survival
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
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0 5 10 15 20 25 30 35
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Median = 3 Median = 8
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ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Ejemplos de usos de Array-CGH en oncohematologiacutea Screening de una enfermedad
Implantacioacuten de biomarcador
Fase 0 Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
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0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
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LCa
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Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Patient Selection and Clinical Data
Median (Range) Subtype WHO n t(821)(q22q22) 4 inv(16)(p13q22) 10 Age (years) 64 (20-86) 11q23 Abnormality (MLL) 1 WBC (cells10-6L) 15980 (1000-440000) M0 6 LDH (IUL) 780 (202-16764) M1 19 M2 17 Extramedullar Infiltrate n () M4 12
Yes 8 (10) M5 25 No 75 (90) M6 6
Total Cases (1) 83 (100) Total Cases 100 ECOG n () Cytogenetic Classification (2) n ()
0 20 (25) Good 14 1 33 (41) t(821) 4 (29) 2 17 (21) inv(16) 7 (50) 3 8 (10) inv(16) + other 3 (21) 4 2 (3) Intermediate 74
Total Cases (1) 80 (100) NK 45 (61) Single Trisomy 16 (21) FLT3 n Double Trisomy 3 (4)
ITD 21 Other 10 (14) None 79 Adverse 12
Total Cases 100 Complex Karyotype 8 (70) Other 4 (30)
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
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0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
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LCa
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Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
referencegDNA
sample gDNA
Reference Digested DNA
Sample Digested DNA
Cy3-dUTPCy5-dUTP
Hybridization 65ordmC 40h
Cot I
Washes
Material amp Methods ndash CGH Array
44K 60-mer oligonucleotides (Human Agilent Platform) Spatial resolution ndash 75Kb Focus on cancer related genes (3 probes)
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
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4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Results
1 Samples with normal karyotype show small deletions involving genes as relevant as eg RUNX1 L3MBTL NPM1
2 Cases with complex karyotype display a high number of aberrations frequently involving deletions of chromosome instability related genes eg BRCA1
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Frequency of total number aberrations in AML
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
58 42
Median = 3 Median = 8
22 20
Num
bero
fAM
LCa
ses
Aberrations per case
0 to 3 Aberrations Stable Group 54
20
4 to 8 Aberrations Moderately Unstable
9+ Aberrations Highly Unstable
22
90 of AML with Genomic Aberrations
using ARRAY CGH
Graacutefico1
Hoja1
Hoja1
Hoja2
Hoja3
Genomic Instability in AML
Stable up to 3 aberrations
Moderately Unstable 4 to 8 aberrations
Highly Unstable 9 or more aberrations
Favorable
Intermediate
Adverse
12
74
14 58
22
20
6
51
1
4
4 16
7 2
9
GENOMIC INSTABILITY
CLINICAL PROGNOSIS
Cytogenetics Classification Genomic Instability Classification
Cytogenetics 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=027
Favorable n=12
Intermediate n=68
Adverse n=11
OS MedianFavorable 417 3667
Intermediate 338 840
Adverse 910 677
Intermediate group is the largest with and OS between favorable and adverse
Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=015
OS MedianStable 389 231
Mod Unstable 316 1163
Highly Unstable 111 287
Stable n=54
Moderately Unstable n=19
Highly Unstable n=18
Stable group (n=54) is the best prognosis group using instability with similar OS
M Unstable (n=19) mantains intermediate group features but minimizing the group size
H Unstable doubles adverse group mantaining OS and lowering the median months of survival
Cytogenetics
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
INTERMEDIO IOS12-37
Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
- Nuacutemero de diapositiva 17
- Nuacutemero de diapositiva 18
- Nuacutemero de diapositiva 19
- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
- Nuacutemero de diapositiva 23
- Nuacutemero de diapositiva 24
- Nuacutemero de diapositiva 25
- Nuacutemero de diapositiva 26
- Nuacutemero de diapositiva 27
- Nuacutemero de diapositiva 28
- Nuacutemero de diapositiva 29
- Nuacutemero de diapositiva 30
- Nuacutemero de diapositiva 31
- Nuacutemero de diapositiva 32
- Nuacutemero de diapositiva 33
- Nuacutemero de diapositiva 34
- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
- Nuacutemero de diapositiva 58
- Nuacutemero de diapositiva 59
- Nuacutemero de diapositiva 60
- Nuacutemero de diapositiva 61
- Nuacutemero de diapositiva 62
- Nuacutemero de diapositiva 63
- Nuacutemero de diapositiva 64
- Nuacutemero de diapositiva 65
- Nuacutemero de diapositiva 66
- Nuacutemero de diapositiva 67
- Nuacutemero de diapositiva 68
- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
- Nuacutemero de diapositiva 73
- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
- Nuacutemero de diapositiva 79
- Nuacutemero de diapositiva 80
- Nuacutemero de diapositiva 81
- Nuacutemero de diapositiva 82
- Nuacutemero de diapositiva 83
- Nuacutemero de diapositiva 84
- Nuacutemero de diapositiva 85
-
| 0 | 4 | ||
| 1 | 18 | ||
| 2 | 9 | ||
| 3 | 15 | ||
| 4 | 2 | ||
| 5 | 8 | ||
| 6 | 7 | ||
| 7 | 7 | ||
| 8 | 2 | ||
| 9 | 4 | ||
| 10 | 3 | ||
| 11 | 1 | ||
| 12 | 3 | ||
| 13 | 1 | ||
| 14 | 0 | ||
| 15 | 1 | ||
| 16 | 1 | ||
| 17 | 1 | ||
| 18 | 2 | ||
| 19 | 3 | ||
| 20 | 0 | ||
| 21 | 3 | ||
| 22 | 1 | ||
| 23 | 0 | ||
| 24 | 0 | ||
| 25 | 1 | ||
| 26 | 0 | ||
| 27 | 1 | ||
| 28 | 0 | ||
| 29 | 0 | ||
| 30 | 0 | ||
| 31 | 1 | ||
| 32 | 0 | ||
| 33 | 0 | ||
| 34 | 0 | ||
| 35 | 0 | ||
| 36 | 0 | ||
| 37 | 1 |
| 0 | |
| 1 | |
| 2 | |
| 3 | |
| 4 | |
| 5 | |
| 6 | |
| 7 | |
| 8 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 11 | |
| 12 | |
| 13 | |
| 14 | |
| 15 | |
| 16 | |
| 17 | |
| 18 | |
| 19 | |
| 20 | |
| 21 | |
| 22 | |
| 23 | |
| 24 | |
| 25 | |
| 26 | |
| 27 | |
| 28 | |
| 29 | |
| 30 | |
| 31 | |
| 32 | |
| 33 | |
| 34 | |
| 35 | |
| 36 | |
| 37 |
Hoja1
Hoja1
Hoja2
Hoja3
Genomic Instability in AML
Stable up to 3 aberrations
Moderately Unstable 4 to 8 aberrations
Highly Unstable 9 or more aberrations
Favorable
Intermediate
Adverse
12
74
14 58
22
20
6
51
1
4
4 16
7 2
9
GENOMIC INSTABILITY
CLINICAL PROGNOSIS
Cytogenetics Classification Genomic Instability Classification
Cytogenetics 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=027
Favorable n=12
Intermediate n=68
Adverse n=11
OS MedianFavorable 417 3667
Intermediate 338 840
Adverse 910 677
Intermediate group is the largest with and OS between favorable and adverse
Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=015
OS MedianStable 389 231
Mod Unstable 316 1163
Highly Unstable 111 287
Stable n=54
Moderately Unstable n=19
Highly Unstable n=18
Stable group (n=54) is the best prognosis group using instability with similar OS
M Unstable (n=19) mantains intermediate group features but minimizing the group size
H Unstable doubles adverse group mantaining OS and lowering the median months of survival
Cytogenetics
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
INTERMEDIO IOS12-37
Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
- Nuacutemero de diapositiva 17
- Nuacutemero de diapositiva 18
- Nuacutemero de diapositiva 19
- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
- Nuacutemero de diapositiva 23
- Nuacutemero de diapositiva 24
- Nuacutemero de diapositiva 25
- Nuacutemero de diapositiva 26
- Nuacutemero de diapositiva 27
- Nuacutemero de diapositiva 28
- Nuacutemero de diapositiva 29
- Nuacutemero de diapositiva 30
- Nuacutemero de diapositiva 31
- Nuacutemero de diapositiva 32
- Nuacutemero de diapositiva 33
- Nuacutemero de diapositiva 34
- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
- Nuacutemero de diapositiva 58
- Nuacutemero de diapositiva 59
- Nuacutemero de diapositiva 60
- Nuacutemero de diapositiva 61
- Nuacutemero de diapositiva 62
- Nuacutemero de diapositiva 63
- Nuacutemero de diapositiva 64
- Nuacutemero de diapositiva 65
- Nuacutemero de diapositiva 66
- Nuacutemero de diapositiva 67
- Nuacutemero de diapositiva 68
- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
- Nuacutemero de diapositiva 73
- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
- Nuacutemero de diapositiva 79
- Nuacutemero de diapositiva 80
- Nuacutemero de diapositiva 81
- Nuacutemero de diapositiva 82
- Nuacutemero de diapositiva 83
- Nuacutemero de diapositiva 84
- Nuacutemero de diapositiva 85
-
| 0 | 4 | ||
| 1 | 18 | ||
| 2 | 9 | ||
| 3 | 15 | ||
| 4 | 2 | ||
| 5 | 8 | ||
| 6 | 7 | ||
| 7 | 7 | ||
| 8 | 2 | ||
| 9 | 4 | ||
| 10 | 3 | ||
| 11 | 1 | ||
| 12 | 3 | ||
| 13 | 1 | ||
| 14 | 0 | ||
| 15 | 1 | ||
| 16 | 1 | ||
| 17 | 1 | ||
| 18 | 2 | ||
| 19 | 3 | ||
| 20 | 0 | ||
| 21 | 3 | ||
| 22 | 1 | ||
| 23 | 0 | ||
| 24 | 0 | ||
| 25 | 1 | ||
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| 27 | 1 | ||
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| 31 | 1 | ||
| 32 | 0 | ||
| 33 | 0 | ||
| 34 | 0 | ||
| 35 | 0 | ||
| 36 | 0 | ||
| 37 | 1 |
Hoja1
Hoja2
Hoja3
Genomic Instability in AML
Stable up to 3 aberrations
Moderately Unstable 4 to 8 aberrations
Highly Unstable 9 or more aberrations
Favorable
Intermediate
Adverse
12
74
14 58
22
20
6
51
1
4
4 16
7 2
9
GENOMIC INSTABILITY
CLINICAL PROGNOSIS
Cytogenetics Classification Genomic Instability Classification
Cytogenetics 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=027
Favorable n=12
Intermediate n=68
Adverse n=11
OS MedianFavorable 417 3667
Intermediate 338 840
Adverse 910 677
Intermediate group is the largest with and OS between favorable and adverse
Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=015
OS MedianStable 389 231
Mod Unstable 316 1163
Highly Unstable 111 287
Stable n=54
Moderately Unstable n=19
Highly Unstable n=18
Stable group (n=54) is the best prognosis group using instability with similar OS
M Unstable (n=19) mantains intermediate group features but minimizing the group size
H Unstable doubles adverse group mantaining OS and lowering the median months of survival
Cytogenetics
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
INTERMEDIO IOS12-37
Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
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- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
- Nuacutemero de diapositiva 17
- Nuacutemero de diapositiva 18
- Nuacutemero de diapositiva 19
- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
- Nuacutemero de diapositiva 23
- Nuacutemero de diapositiva 24
- Nuacutemero de diapositiva 25
- Nuacutemero de diapositiva 26
- Nuacutemero de diapositiva 27
- Nuacutemero de diapositiva 28
- Nuacutemero de diapositiva 29
- Nuacutemero de diapositiva 30
- Nuacutemero de diapositiva 31
- Nuacutemero de diapositiva 32
- Nuacutemero de diapositiva 33
- Nuacutemero de diapositiva 34
- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
- Nuacutemero de diapositiva 58
- Nuacutemero de diapositiva 59
- Nuacutemero de diapositiva 60
- Nuacutemero de diapositiva 61
- Nuacutemero de diapositiva 62
- Nuacutemero de diapositiva 63
- Nuacutemero de diapositiva 64
- Nuacutemero de diapositiva 65
- Nuacutemero de diapositiva 66
- Nuacutemero de diapositiva 67
- Nuacutemero de diapositiva 68
- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
- Nuacutemero de diapositiva 73
- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
- Nuacutemero de diapositiva 79
- Nuacutemero de diapositiva 80
- Nuacutemero de diapositiva 81
- Nuacutemero de diapositiva 82
- Nuacutemero de diapositiva 83
- Nuacutemero de diapositiva 84
- Nuacutemero de diapositiva 85
-
Hoja2
Hoja3
Genomic Instability in AML
Stable up to 3 aberrations
Moderately Unstable 4 to 8 aberrations
Highly Unstable 9 or more aberrations
Favorable
Intermediate
Adverse
12
74
14 58
22
20
6
51
1
4
4 16
7 2
9
GENOMIC INSTABILITY
CLINICAL PROGNOSIS
Cytogenetics Classification Genomic Instability Classification
Cytogenetics 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=027
Favorable n=12
Intermediate n=68
Adverse n=11
OS MedianFavorable 417 3667
Intermediate 338 840
Adverse 910 677
Intermediate group is the largest with and OS between favorable and adverse
Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=015
OS MedianStable 389 231
Mod Unstable 316 1163
Highly Unstable 111 287
Stable n=54
Moderately Unstable n=19
Highly Unstable n=18
Stable group (n=54) is the best prognosis group using instability with similar OS
M Unstable (n=19) mantains intermediate group features but minimizing the group size
H Unstable doubles adverse group mantaining OS and lowering the median months of survival
Cytogenetics
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
INTERMEDIO IOS12-37
Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
- Nuacutemero de diapositiva 17
- Nuacutemero de diapositiva 18
- Nuacutemero de diapositiva 19
- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
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- Nuacutemero de diapositiva 26
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- Nuacutemero de diapositiva 28
- Nuacutemero de diapositiva 29
- Nuacutemero de diapositiva 30
- Nuacutemero de diapositiva 31
- Nuacutemero de diapositiva 32
- Nuacutemero de diapositiva 33
- Nuacutemero de diapositiva 34
- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
- Nuacutemero de diapositiva 58
- Nuacutemero de diapositiva 59
- Nuacutemero de diapositiva 60
- Nuacutemero de diapositiva 61
- Nuacutemero de diapositiva 62
- Nuacutemero de diapositiva 63
- Nuacutemero de diapositiva 64
- Nuacutemero de diapositiva 65
- Nuacutemero de diapositiva 66
- Nuacutemero de diapositiva 67
- Nuacutemero de diapositiva 68
- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
- Nuacutemero de diapositiva 73
- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
- Nuacutemero de diapositiva 79
- Nuacutemero de diapositiva 80
- Nuacutemero de diapositiva 81
- Nuacutemero de diapositiva 82
- Nuacutemero de diapositiva 83
- Nuacutemero de diapositiva 84
- Nuacutemero de diapositiva 85
-
Hoja3
Genomic Instability in AML
Stable up to 3 aberrations
Moderately Unstable 4 to 8 aberrations
Highly Unstable 9 or more aberrations
Favorable
Intermediate
Adverse
12
74
14 58
22
20
6
51
1
4
4 16
7 2
9
GENOMIC INSTABILITY
CLINICAL PROGNOSIS
Cytogenetics Classification Genomic Instability Classification
Cytogenetics 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=027
Favorable n=12
Intermediate n=68
Adverse n=11
OS MedianFavorable 417 3667
Intermediate 338 840
Adverse 910 677
Intermediate group is the largest with and OS between favorable and adverse
Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=015
OS MedianStable 389 231
Mod Unstable 316 1163
Highly Unstable 111 287
Stable n=54
Moderately Unstable n=19
Highly Unstable n=18
Stable group (n=54) is the best prognosis group using instability with similar OS
M Unstable (n=19) mantains intermediate group features but minimizing the group size
H Unstable doubles adverse group mantaining OS and lowering the median months of survival
Cytogenetics
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
INTERMEDIO IOS12-37
Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
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Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
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- Nuacutemero de diapositiva 6
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- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
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- Nuacutemero de diapositiva 18
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- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
- Nuacutemero de diapositiva 58
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- Nuacutemero de diapositiva 64
- Nuacutemero de diapositiva 65
- Nuacutemero de diapositiva 66
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- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
- Nuacutemero de diapositiva 73
- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
- Nuacutemero de diapositiva 79
- Nuacutemero de diapositiva 80
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- Nuacutemero de diapositiva 82
- Nuacutemero de diapositiva 83
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- Nuacutemero de diapositiva 85
-
Genomic Instability in AML
Stable up to 3 aberrations
Moderately Unstable 4 to 8 aberrations
Highly Unstable 9 or more aberrations
Favorable
Intermediate
Adverse
12
74
14 58
22
20
6
51
1
4
4 16
7 2
9
GENOMIC INSTABILITY
CLINICAL PROGNOSIS
Cytogenetics Classification Genomic Instability Classification
Cytogenetics 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=027
Favorable n=12
Intermediate n=68
Adverse n=11
OS MedianFavorable 417 3667
Intermediate 338 840
Adverse 910 677
Intermediate group is the largest with and OS between favorable and adverse
Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=015
OS MedianStable 389 231
Mod Unstable 316 1163
Highly Unstable 111 287
Stable n=54
Moderately Unstable n=19
Highly Unstable n=18
Stable group (n=54) is the best prognosis group using instability with similar OS
M Unstable (n=19) mantains intermediate group features but minimizing the group size
H Unstable doubles adverse group mantaining OS and lowering the median months of survival
Cytogenetics
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
INTERMEDIO IOS12-37
Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
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- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
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- Conclusions
- Take home messages
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- Nuacutemero de diapositiva 68
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- Nuacutemero de diapositiva 72
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- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
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- Nuacutemero de diapositiva 84
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-
Cytogenetics 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=027
Favorable n=12
Intermediate n=68
Adverse n=11
OS MedianFavorable 417 3667
Intermediate 338 840
Adverse 910 677
Intermediate group is the largest with and OS between favorable and adverse
Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=015
OS MedianStable 389 231
Mod Unstable 316 1163
Highly Unstable 111 287
Stable n=54
Moderately Unstable n=19
Highly Unstable n=18
Stable group (n=54) is the best prognosis group using instability with similar OS
M Unstable (n=19) mantains intermediate group features but minimizing the group size
H Unstable doubles adverse group mantaining OS and lowering the median months of survival
Cytogenetics
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
INTERMEDIO IOS12-37
Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
- Nuacutemero de diapositiva 17
- Nuacutemero de diapositiva 18
- Nuacutemero de diapositiva 19
- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
- Nuacutemero de diapositiva 23
- Nuacutemero de diapositiva 24
- Nuacutemero de diapositiva 25
- Nuacutemero de diapositiva 26
- Nuacutemero de diapositiva 27
- Nuacutemero de diapositiva 28
- Nuacutemero de diapositiva 29
- Nuacutemero de diapositiva 30
- Nuacutemero de diapositiva 31
- Nuacutemero de diapositiva 32
- Nuacutemero de diapositiva 33
- Nuacutemero de diapositiva 34
- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
- Nuacutemero de diapositiva 58
- Nuacutemero de diapositiva 59
- Nuacutemero de diapositiva 60
- Nuacutemero de diapositiva 61
- Nuacutemero de diapositiva 62
- Nuacutemero de diapositiva 63
- Nuacutemero de diapositiva 64
- Nuacutemero de diapositiva 65
- Nuacutemero de diapositiva 66
- Nuacutemero de diapositiva 67
- Nuacutemero de diapositiva 68
- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
- Nuacutemero de diapositiva 73
- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
- Nuacutemero de diapositiva 79
- Nuacutemero de diapositiva 80
- Nuacutemero de diapositiva 81
- Nuacutemero de diapositiva 82
- Nuacutemero de diapositiva 83
- Nuacutemero de diapositiva 84
- Nuacutemero de diapositiva 85
-
Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
P=015
OS MedianStable 389 231
Mod Unstable 316 1163
Highly Unstable 111 287
Stable n=54
Moderately Unstable n=19
Highly Unstable n=18
Stable group (n=54) is the best prognosis group using instability with similar OS
M Unstable (n=19) mantains intermediate group features but minimizing the group size
H Unstable doubles adverse group mantaining OS and lowering the median months of survival
Cytogenetics
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
INTERMEDIO IOS12-37
Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
- Nuacutemero de diapositiva 17
- Nuacutemero de diapositiva 18
- Nuacutemero de diapositiva 19
- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
- Nuacutemero de diapositiva 23
- Nuacutemero de diapositiva 24
- Nuacutemero de diapositiva 25
- Nuacutemero de diapositiva 26
- Nuacutemero de diapositiva 27
- Nuacutemero de diapositiva 28
- Nuacutemero de diapositiva 29
- Nuacutemero de diapositiva 30
- Nuacutemero de diapositiva 31
- Nuacutemero de diapositiva 32
- Nuacutemero de diapositiva 33
- Nuacutemero de diapositiva 34
- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
- Nuacutemero de diapositiva 58
- Nuacutemero de diapositiva 59
- Nuacutemero de diapositiva 60
- Nuacutemero de diapositiva 61
- Nuacutemero de diapositiva 62
- Nuacutemero de diapositiva 63
- Nuacutemero de diapositiva 64
- Nuacutemero de diapositiva 65
- Nuacutemero de diapositiva 66
- Nuacutemero de diapositiva 67
- Nuacutemero de diapositiva 68
- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
- Nuacutemero de diapositiva 73
- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
- Nuacutemero de diapositiva 79
- Nuacutemero de diapositiva 80
- Nuacutemero de diapositiva 81
- Nuacutemero de diapositiva 82
- Nuacutemero de diapositiva 83
- Nuacutemero de diapositiva 84
- Nuacutemero de diapositiva 85
-
Conclusiones maacutes directas
- En la LMA NO HAY RECURRENCIA de alteraciones especiacuteficas de delecioacuten o duplicacioacuten
- La INESTABLIDAD GENOacuteMICA no especiacutefica es la aberracioacuten geneacutetica MAacuteS FRECUENTE en la LMA
- LMA puede segregarse mediante arrayCGH en GRUPOS DE INESTABILIDAD GENOacuteMICA con valor pronoacutestico superior al de los grupos citogeneacuteticos
- Las DELECIONES en regiones especiacuteficas estaacuten relacionadas con el grupo de alta inestabilidad genoacutemica y pueden ser empleadas como MARCADORES de mal pronoacutestico
FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
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Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
18
320
12
35
14
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AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
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- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
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- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
- Nuacutemero de diapositiva 23
- Nuacutemero de diapositiva 24
- Nuacutemero de diapositiva 25
- Nuacutemero de diapositiva 26
- Nuacutemero de diapositiva 27
- Nuacutemero de diapositiva 28
- Nuacutemero de diapositiva 29
- Nuacutemero de diapositiva 30
- Nuacutemero de diapositiva 31
- Nuacutemero de diapositiva 32
- Nuacutemero de diapositiva 33
- Nuacutemero de diapositiva 34
- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
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- Nuacutemero de diapositiva 60
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- Patient Selection and Clinical Data
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- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
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- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
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FAVORABLEOSl 69-71
ADVERSEOS 2-11
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Situacioacuten actual de los biomarcadores geneacuteticos (diagnoacutesticos y pronoacutesticos) en LMAEurepean LeukemiaNET (ELN)
1 11
8
5
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NUP98HOXA9PMLRARA
AML1ETO
NPM1 mut FLT3-ITD negCariotipo Normal
CEBPA mut(bialallelic) FLT3-ITD negCariotipo Normal
Cariotipo normal NPM1 wt FLT3-ITDNPM1 mt FLT3-ITDNPM1 wt FLT3 wt
t(911) otras alt Crom excl fav y adversas
Abn(3q)EVI-1
Alt cr 57 17p
Reord MLL t(69) Cariotipo Complejo
CBFBMYH11
INTERMEDIO IIOS8-25
La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
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- Nuacutemero de diapositiva 10
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- Nuacutemero de diapositiva 32
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- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
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- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
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- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
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- Conclusions
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La transicioacuten Geneacutetica - Genoacutemica de biomarcadores biomarcadores diagnoacutesticos
Implantacioacuten de biomarcador
Etapa Actividad
Fase 0 Exploratoria
Fase 1 Ensayos dirigidos
Fase 2 Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
Concepto Descripcioacuten
Biomarcadordiagnoacutestico
Define la presencia y el tipo deenfermedad con la maacuteximadiscriminacioacuten posible
Tipo Array de CGH
ObjetivoDetecta peacuterdidas y ganancias de ADN entodo el genoma CARIOTIPOMOLECULAR
Conclusiones
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten cliacutenica
bulliquestSon uacutetiles para investigacioacuten bioloacutegica
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores diagnoacutesticosbullEl cariotipo molecular por arrayCGHsustituiraacute al cariotipo convencional comoherramienta para generar biomarcadores
bulliquestSon uacutetiles como biomarcadores pronoacutesticosbull Hay experiencia en SMD
bullGrupo de Trabajo en SMD-Celgene
DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
Cetuximab
Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
- Nuacutemero de diapositiva 1
- Nuacutemero de diapositiva 2
- Nuacutemero de diapositiva 3
- Nuacutemero de diapositiva 4
- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
- Nuacutemero de diapositiva 17
- Nuacutemero de diapositiva 18
- Nuacutemero de diapositiva 19
- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
- Nuacutemero de diapositiva 23
- Nuacutemero de diapositiva 24
- Nuacutemero de diapositiva 25
- Nuacutemero de diapositiva 26
- Nuacutemero de diapositiva 27
- Nuacutemero de diapositiva 28
- Nuacutemero de diapositiva 29
- Nuacutemero de diapositiva 30
- Nuacutemero de diapositiva 31
- Nuacutemero de diapositiva 32
- Nuacutemero de diapositiva 33
- Nuacutemero de diapositiva 34
- Nuacutemero de diapositiva 35
- Nuacutemero de diapositiva 36
- Nuacutemero de diapositiva 37
- Nuacutemero de diapositiva 38
- Nuacutemero de diapositiva 39
- NGS of rare myeloid leukemias spliceosome and epigenetics are the preferred targets again
- Outline
- AIMS
- Part I
- Blastic Plasmocytoid Dendritic Cell Neoplasm
- Patients
- Nuacutemero de diapositiva 46
- Results
- Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
- Genes in the Hematological Disease Pathway
- Nuacutemero de diapositiva 50
- Conclusions
- Take home messages
- NGS of chronic myeloid leukemias beyond the Phrsquo Chromosome
- Nuacutemero de diapositiva 54
- Nuacutemero de diapositiva 55
- Nuacutemero de diapositiva 56
- Nuacutemero de diapositiva 57
- Nuacutemero de diapositiva 58
- Nuacutemero de diapositiva 59
- Nuacutemero de diapositiva 60
- Nuacutemero de diapositiva 61
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- Nuacutemero de diapositiva 67
- Nuacutemero de diapositiva 68
- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
- Nuacutemero de diapositiva 73
- Frequency of total number aberrations in AML
- Genomic Instability in AML
- Nuacutemero de diapositiva 76
- Genomic Instability 5 year OS Kaplan Meyer Curve
- Nuacutemero de diapositiva 78
- Nuacutemero de diapositiva 79
- Nuacutemero de diapositiva 80
- Nuacutemero de diapositiva 81
- Nuacutemero de diapositiva 82
- Nuacutemero de diapositiva 83
- Nuacutemero de diapositiva 84
- Nuacutemero de diapositiva 85
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DNA
iquestCansadosNGS
iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
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RT-PCR
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Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
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Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
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- Nuacutemero de diapositiva 5
- Nuacutemero de diapositiva 6
- Nuacutemero de diapositiva 7
- Nuacutemero de diapositiva 8
- Nuacutemero de diapositiva 9
- Nuacutemero de diapositiva 10
- Nuacutemero de diapositiva 11
- Nuacutemero de diapositiva 12
- Nuacutemero de diapositiva 13
- Nuacutemero de diapositiva 14
- Nuacutemero de diapositiva 15
- Nuacutemero de diapositiva 16
- Nuacutemero de diapositiva 17
- Nuacutemero de diapositiva 18
- Nuacutemero de diapositiva 19
- Nuacutemero de diapositiva 20
- Nuacutemero de diapositiva 21
- Nuacutemero de diapositiva 22
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- Nuacutemero de diapositiva 24
- Nuacutemero de diapositiva 25
- Nuacutemero de diapositiva 26
- Nuacutemero de diapositiva 27
- Nuacutemero de diapositiva 28
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- Nuacutemero de diapositiva 60
- Nuacutemero de diapositiva 61
- Nuacutemero de diapositiva 62
- Nuacutemero de diapositiva 63
- Nuacutemero de diapositiva 64
- Nuacutemero de diapositiva 65
- Nuacutemero de diapositiva 66
- Nuacutemero de diapositiva 67
- Nuacutemero de diapositiva 68
- Nuacutemero de diapositiva 70
- Patient Selection and Clinical Data
- Nuacutemero de diapositiva 72
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iquestY el futuro
Etapa Actividad Her2neu BCR-ABL EGFR Mama-print
LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
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LMAAmpliChip
Fase 0Desarrollo de la tecnologiacutea previa y de los reactivos
Fase 1Desarrollo de ensayo dirigido a biomarcadores seleccionados
Fase 2Evaluacioacuten inicial de la prevalencia y del uso cliacutenico
Fase 3 Confirmacioacuten prospectiva en una serie independiente
Fase 4 Desarrollo comercial
FISH
Trastuzumab
RT-PCR Imatinib
RT-PCR
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Genoacutemico (AgendiaAgilent)
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Etapa Bio genoacutemicoscaacutencer pulmoacuten
Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
Fase 1
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Bio genoacutemicoscaacutencer colon
Bio genoacutemicoscaacutencer proacutestata
Bio genoacutemicosmelanoma
Fase 0
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Fase 2
Fase 3
Fase 4
Situacioacuten actual del desarrollo e implementacioacuten de biomarcadores
Agradecimientos
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