kwasy nukleinowe - politechnika gdańska · 2014. 12. 2. · przedmiot: podstawy biotechnologii...

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych

Kwasy nukleinowe1. Polikondensaty zbudowane z nukleotydów2. Dwa rodzaje: DNA i RNA3. Trzy formy RNA: mRNA, tRNA i rRNA4. DNA i mRNA są nośnikami informacji genetycznej5. Cząsteczki labilne; ulegają denaturacji przy ogrzewaniu;

RNA podatne na hydrolizę alkaliczną

Struktura ogólna nukleotydu

Zasady purynowe i pirymidynowe występujące w DNA i/lub RNA

Wiązania fosfodiestrowew DNA lub RNA



Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych

Struktury przestrzenne RNA: z lewej – mRNA; z prawej - a) tRNA; b) rybozym hammerhead; c) Intron z mRNA

Model Watsona-Cricka struktury DNA



Kierunek przepływu informacji genetycznej



Możliwości zastosowania kwasów nukleinowych jako leków

1.Wprowadzenie stosunkowo krótkiego fragmentu kwasu nukleinowego w celu zablokowania ekspresji konkretnego genu.

strategia antysensu

Zadaniem wprowadzonego preparatu (RNA lub DNA) jest hybrydyzacjado specyficznego odcinka mRNA będącego celem molekularnym, zablokowanie jego ekspresji i/lub indukcja procesu unieczynnienia. Preparaty otrzymywane na drodze syntezy chemicznej (ON) lub biologicznej i są na ogół zmodyfikowane.

2.Wprowadzenie kwasu nukleinowego jako kompletnego genu w celu wywołania jego ekspresji.

terapia genowa (somatyczna, mitochondrialna)DNA-szczepionki

Substancja czynna w formie plazmidu DNA zawierającego kompletną sekwencję genu kodującego biologicznie czynne białko. Preparaty otrzymywane na drodze biosyntezy.

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii

Porównanie rodzajów strategii antysensowych


Strategie antysensowe – preparaty ON otrzymywane na drodze syntezy

Miejsca chemicznej modyfikacji oligorybonukleotydów



ODMTrO

O

Z ZOHO

O

ZODMTrO

OP

R'O NR'' R'''

ODMTrO Z

OP

OO

O

ZO

[S]

OO Z

O

ODMTrO Z

OPO S-

Strategie antysensowe – preparaty ON otrzymywane na drodze syntezy

Z –zasada azotowaDMTr – 4,4’-dimetoksytrytyl

Sekwencja reakcji: 1. Przyłączanie 3’-fosforoamidynowych pochodnychnukleozydów z grupą 5’OH ochronioną grupą DMTr do wolnejgrupy 5’OH nośnika lub poprzedniego nukleotydu.2. Pozostające wolne grupy 5’OH blokuje się poprzez acetylację.3. Po zsyntezowaniu łańcucha ON - sulfuryzacja

Produkt końcowy: mieszanina ON o długości n (produkt dominujący), n-1, n-2, itd..

Schemat syntezy ON na nośniku stałym


Zalety WadyI generacja Oporność na działanie nukleaz Generowanie chiralności

Aktywacja RNazy H Wiązanie z białkami/toksycznośćII generacja Mniejsza toksyczność Brak aktywacji RNazy H

Brak problemów stereochemicznychGapmery ON chimeryczne (środek PS, na końcach

OMe lub MOE)III generacjaPNA Niewielka toksyczność Brak indukcji RNazy H

Problemy z rozpuszczalnościąLNA Duża odporność na działanie nukleaz

Wysokie powinowactwo do mRNA

Pożądane cechy ON:

- długość 17 – 21 nukleotydów- sekwencja komplementarna do specyficznejsekwencji celu molekularnego

- unikanie sekwencji: tworzących niepożądanestruktury II-rzędowe, tworzących G-kwartety,motywów CpG

- odporność na działanie nukleaz- zdolność do indukowania działania RNazy H- brak efektów ubocznych


Strategie antysensowe – peptydowe kwasy nukleinowe


Strategie antysensowe – rybozymy i deoksyrybozymy

Modele struktur II-rzędowych rybozymu „hammerhead” i deoksyrybozymu

Model struktury przestrzennej rybozymu „hammerhead”



Antysensowe oligonukleotydy zaaprobowane do badań klinicznych

Produkt Firma Target (mRNA) Choroba Typ StatusVitravene (Fomivirsen)

ISIS Pharmaceuticals CMV IE2 CMV retinopatia

PS DNA

Akcept.

Affinitac (ISIS 3521) ISIS PKC- Nowotwór

PS DNA

Faza III

Genasense Genta Bcl2 Nowotwór PS DNA

Faza III

Alicaforsen (ISIS 2302) ISIS ICAM-1

Łuszczyca, Choroba Crohna, Wrzodziejące zapalenie jelit

PS DNA

Faza II/III

ISIS 14803 ISIS antywirusowy Żóltaczka zakaźna typu C

PS DNA Faza II

ISIS 2503 ISIS H-ras Nowotwór PS DNA Faza II

MG98 Methylgene DNA metylotransferaza Nowotwory lite

PS DNA Faza II

EPI-2010 EpiGenesis Pharmaceuticals

Receptor adenozyny A1 Astma

PS DNA Faza II

GTI 2040 Lorus Therapeutics

Reduktaza rybonukleotydowa (R2) Nowotwór

PS DNA Faza II

ISIS 104838 ISIS TNF

Reumatoidalne zapalenie stawów, Łuszczyca

II gener. Faza II

Avi4126 AVI BioPharma c-myc Nowotwory,

III gener.

Faza I/II

Gem231 Hybridon PKA RI Nowotwory lite II gener.

Faza I/II

Gem92 Hybridon HIV gag AIDS II gener. Faza I

GTI 2051 Lorus Therapeutics

Reduktaza rybonukleotydowa (R1) Nowotwory

PS DNA Faza I


Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych

Terapia genowa

Rodzaje terapii genowej: somatyczna, mitochondrialna

Substytucja – wprowadzenie genu, którego brak w organizmie chorym, a występuje w zdrowym Addycja – wprowadzany gen nie występuje także w organizmie zdrowym

Techniki somatycznej terapii genowej



Stany patologiczne/chorobowe, które mogą być leczone terapią genową

Defekty genetyczne Choroby nabyte

Niedobory metaboliczne

Deficyt enzymów cyklu mocznikowegoFenyloketonuriaChoroba Gauchera

Hemoglobinopatie

Anemia sierpowataThalasemia

Zaburzenia krzepliwości krwi

Hemofilia A i B

Choroby płuc

Zwłóknienie torbielowate (mukowiscydoza)Deficyt alfa-1 antytrypsyny

Choroby układu sercowo-naczyniowego

Rodzinna hipercholesterolemia

Choroby infekcyjne

AIDSWirusowe zapalenia wątroby typu B i C

Choroby neurologiczne

Choroba Parkinsona

Choroba Alzheimera i inne neurodegradacyjne

Choroby układu sercowo-naczyniowego

ArteriosklerozaChoroby naczyń obwodowychChoroba wieńcowa

Nowotwory

różne typy



Terapia genowa nowotworów

1. Odwrócenie fenotypu nowotworowego poprzez kontrolę ekspresji onkogenówlub wstawienie genów supesorowych

Zahamowanie ekspresji uszkodzonych genów tworzących szlak mutacyjny lub zastąpieniezmutowanego genu jego prawidłowo działającym odpowiednikiem. Stosowanie technologii siRNA

2. Poprawę odpowiedzi przeciwnowotworowej gospodarza przez uczynienie komóreknowotworowych bardziej immunogennymi

TIL- T-cell infiltrating lymphocytes (limfocyty naciekające nowotwór). Wprowadzanie genów kodujących antygeny nowotworu (czerniak, gen HLA-B7). Geny kodujące cytokiny

3. Zniszczenie komórek nowotworowych za pomocą wprowadzenia genów kodującychbiałka aktywujące proleki przeciwnowotworowe

4. Ochrona zdrowych tkanek narażonych na działanie czynników cytotoksycznych,chemoterapii lub radioterapii

Komórki szpiku – geny kodujące białka MDR

5. Wpływ na proces angiogenezy guzaGeny kodujące czynniki antyangiogenne, w tym przeciwciała anty VEGF, FGF



Problem wprowadzenia DNA do tkanek (komórek)

- DNA jest dużą cząsteczką o charakterze polianionowym, bardzo słabo przechodzącą przez błony biologiczne;

-„nagie” DNA jest podatne na działanie nukleaz

-DNA tworzy struktury supehelikalne



• Wirusowe:

- retrowirusy- lentiwirusy- adenowirusy- wirusy opryszczki - wirusy towarzyszące adenowirusom AAV

• Niewirusowe:

- „nagi” DNA

- liposomy kationowe

- związki polikationowe



Nośniki niewirusowe

• Składają się z syntetycznych związków chemicznych lub wysoko oczyszczonych substancji pochodzenia naturalnego;

• nie ma tu ryzyka aktywacji onkogenów;

• mniejsza wydajność transferu związana z ujemnym ładunkiem plazmidowego DNA i jego wielkością – potrzebna kondensacja w cząsteczkach nośnika.



Nośniki liposomowe

• Lipidy i liposomy – cząsteczki amfifilowe tworzą biwarstwęlipidową zbudowaną z lipidów kationowych i neutralnych, zwróconych do siebie częściami hydrofobowymi;

• do wnętrza wprowadzany jest skondensowany DNA;

• nośnik wprowadzany do komórek na drodzeendocytozy.



Somatyczna terapia genowa – nośniki polikationowe



Wektory wirusowe

• Wykorzystanie naturalnej zdolności wirusów do wprowadzania DNA lub RNA do komórek ssaczych;

• konstruowane za pomocą metod inżynierii genetycznej/biologii molekularnej;

• plazmidowy wektor i komórki pakujące;• całość lub część genów jest usuwana –geny odpowiadające za

replikację i kodujące białka otoczki wirusa;• na ich miejsce wprowadzany jest gen terapeutyczny zwany transgenem.


Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowychETAPY PROCESU PRODUKCYJNEGO EFEKTY Fermentacja okresowa E. coli

Zmniejszenie objętości

Usunięcie:

Fragmenty błon komórkowych, białka, genomowe DNA Osad

RNA Białka Endotoksyny

Białka

Genomowe DNA RNA Endotoksyny „open circle” plazmid

Oddzielenie komórek

(separator)

Liza alkaliczna

(NaOH/SDS) Strącanie octanem potasu

Oczyszczanie – klarowanie

(filtracja/wirowanie)

Chromatografia

anionowymienna

Strącanie

izopropanolem

Filtracja na żelu/

Chromatografia faz odwróconych

Nadanie postaci leku

Ogólny schematprocesu produkcyjnegootrzymywania terapeutycznego plazmidowego DNA

ETAPY PROCESU PRODUKCYJNEGO EFEKTY Fermentacja okresowa E. coli

Zmniejszenie objętości

Usunięcie:

Fragmenty błon komórkowych, białka, genomowe DNA Osad

RNA Białka Endotoksyny

Białka

Genomowe DNA RNA Endotoksyny „open circle” plazmid

Oddzielenie komórek

(separator)

Liza alkaliczna

(NaOH/SDS) Strącanie octanem potasu

Oczyszczanie – klarowanie

(filtracja/wirowanie)

Chromatografia

anionowymienna

Strącanie

izopropanolem

Filtracja na żelu/

Chromatografia faz odwróconych

Nadanie postaci leku

Ogólny schematprocesu produkcyjnegootrzymywania terapeutycznego plazmidowego DNA



Terapeutyczne plazmidowe DNA; typowe specyfikacje procedury zwalniającej

Test Specyfikacja

Wygląd przejrzysty, bezbarwny roztwór

Wielkość, miejsce cięcia zgodność z mapą plazmidu (elektroforezarestrykcyjnego w żelu agarozowym, analiza restrykcyjna)

Kolisty plazmid DNA (forma CCC) >95% (elektroforeza w żelu agar., HPLC)

DNA, E. coli <0,02 µg/µg plazmidowego DNA (Southern blot)

Białko niewykrywalne (oznaczenie metodą BCA)

RNA niewykrywalne (elektroforeza w żelu agar.)

Endotoksyna <0,1 EU/µg plazmidowego DNA (LAL)

Sterylność brak wzrostu po 14 dniach (USP)

Specyficzna aktywność Odpowiada standardowi referencyjnemu

kwasy nukleinowe - politechnika gdańska · 2014. 12. 2. · przedmiot: podstawy biotechnologii...

Documents