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Fachbereich Mechatronik

Diplomarbeit

Konstruktion und Aufbau eines

Bioreaktors sowie die prozess- und

regelungstechnische Umsetzung

Durchführender: Wilhelm Gruber

Studiengang: Mechatronik

Zeitraum: 1. November 2004 bis 31. März 2005

Ort: Fachhochschule Ulm

Abteilung: Medizingerätebau

1. Betreuer: Professor Dipl.-Ing. A. Kreuttner

2. Betreuer: Professor Dr. K. Paulat

Danksagung

Diese Diplomarbeit entstand im Labor-Medizingerätebau an der FachhochschuleUlm.

An dieser Stelle möchte ich mich recht herzlich bei Herrn Professor Dipl.-Ing.Kreuttner und Herr Professor Dr. Paulat für die Betreuung der Diplomarbeit undfür die Freiheiten, die sie mir bei der Umsetzung überlassen haben, bedanken.

Ein besonderer Dank geht an Rudi Miller für die ausgezeichnete Unterstützungbeim Aufbau des Fermenters, bei der Mithilfe bei der Beschaffung der Bauteile,für die Korrektur der Arbeit und für den Kaffee.

Ein weiterer Dank geht außerdem noch an die Mitarbeiter der FH-Ulm: RainerFuest, Dieter Helferich, Gerhard Keller, Marco Keller, Mike Pfannenstein und FalkNeuner für die sehr gute und nette Zusammenarbeit.

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Zusammenfassung

Konstruktion eines mobilen Bioreaktors, sowie dessen

prozess-, regelungs- und softwaretechnische Umsetzung mit

der Prozess-Software WinErs

Ziel dieser Diplomarbeit war es, einen voll funkionsfähigen Bioreaktor aufzubauen.Ausgehend von den Fermenter-Komponenten der Firma Bioengineering: Fermen-tergefäß, Drehzahl- und Temperiereinrichtung, soll ein voll funktionsfähiger Bio-reaktor aufgebaut werden. Ergänzt wurden diese vorhandenen Komponenten miteiner Begasungs-, pH- und Antischaum-Einrichtung. Die Programmierung der Re-gelung und die Erstellung der Anwender-Software wurde mit der Prozess-SoftwareWinErs gestaltet. Für den Aufbau der Begasungsregelung mussten in Vorversu-chen die Regelungsparameter für die pO2-Sonde und des Sauerstoffüberganges er-mittelt werden. Anschließend konnten in Simulationsmodellen verschiedene Re-gelungssysteme getestet werden.Hier stellte sich ein PI-Regler mit nachgeschalte-tem Pulsweitenmodulator als die geeignetere Regelung heraus. Durch sie konnteeine stabilere und mit einer gut tolerierbaren Regeldifferenz die Begasungsrege-lung realisiert werden. Für die pH-Regelung reicht ein klassischer Zweipunktreg-ler, der nur dann zutaktet, wenn die pH-Toleranz über- bzw. unterschritten wird.Die Antischaum-Regelung wird nur dann aktiv, wenn über die Antischaum-SondeSchaum detektiert wird. In einer Testfermentaion mit der Bäckerhefe Saccharo-

myces cerevisiae konnten noch Schwächen des Fermenters gefunden werden. Alsunzureichend stellte sich die Begasungsregelung heraus, da durch das Begasungs-rohr zu große Gasblasen austreten, die nicht den gewünschten Sauerstoffeintrag insMedium brachte. Hier könnte anstatt eines Begasungsrohres ein Ringsparger bzw.ein perforierter Silikonschlauch Abhilfe schaffen. Da sich während der Reglerein-stellung (der Sauerstoffbegasung) Gasblasen an der pO2-Sonde anlagerten, und sichein unzureichender Sauerstoffeintrag herausstellte, sollte die Reglereinstellung, fürLuft- und Sauerstoffbegasung, unter optimalen Bedingungen wiederholt werden.

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Inhaltsverzeichnis

1. Aufgabenstellung 7

2. Symbolverzeichnis 8

3. Abkürzungsverzeichnis 10

4. Grundlagen 114.1. Fermentertypen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

4.1.1. Rührkessel-Fermenter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114.1.2. Blasensäulen-Fermenter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124.1.3. Airlift-Fermenter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

4.2. Zellwachstum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134.2.1. Sauerstoffversorgung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.2.1.2. Löslichkeit von Sauerstoff in Flüssigkeiten . . . . . 144.2.1.1. Kritische Sauerstoffkonzentrationen einiger Mikro-

organismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.2.1.3. Sauerstoffaufnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.2.1.4. Richtwerte für den Sauerstoffbedarf von Mikroor-

ganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.2.1.5. Sauerstoffeintrag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.2.1.6. Bestimmungsmethoden des kLa-Werts . . . . . . . 17

4.2.2. Temperatur-Einfluss auf die Wachstumsrate . . . . . . . . . 194.2.2.1. Einfluss der Temperatur auf das Wachstum und die

biologische Aktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . 194.2.3. pH-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.2.3.1. Einfluss des pH-Werts auf den Organismus . . . . . 204.2.3.2. Pufferlösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204.2.3.3. Herleitung der Henderson-Hasselbalch-Gleichnung . 214.2.3.4. Einfluss von Kohlendioxid auf den pH-Wert . . . . 22

4.3. Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224.3.1. O2-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

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Inhaltsverzeichnis

4.3.1.1. Aufbau einer pO2-Elektrode . . . . . . . . . . . . . 234.3.1.2. Funktionsprinzip O2-Elektrode . . . . . . . . . . . 244.3.1.3. Ansprechverhalten einer Sauerstoffelektrode mit gas-

durchlässiger Membran . . . . . . . . . . . . . . . . 254.3.2. Temperatur-Sonde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264.3.3. pH-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.3.3.1. Aufbau einer pH-Elektrode . . . . . . . . . . . . . 264.3.3.2. Funktionsprinzip einer pH-Elektrode . . . . . . . . 26

4.4. Prozessregelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274.4.1. Zweipunktregelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4.4.1.1. Berechnung des Mittelwerts der Regelschwingung x3 284.4.1.2. Berechnung der Schwankungsbreite 2 · x0 . . . . . . 29

4.4.2. Pulsweitenmodulierte Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . 294.4.2.1. graphische Darstellung einer PI-Regelung mit nach-

geschalteter Pulsweitenmodulation (Abb. 4.13) . . 294.4.2.2. Reglereinstellung nach der Probiermethode . . . . 29

4.4.3. pO2-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314.4.4. pH-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

4.4.4.1. Berechnung der Zugeführten Menge an Säure undLauge bei Überschreiten der pH-Toleranzgrenze amBeispiel eines Escherichia coli -Nährmediums: . . . 31

4.4.5. Antischaum-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5. Konstruktion 345.1. Konstruktionsauslegung und Materialanforderungen . . . . . . . . . 34

5.1.1. Transportwagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345.1.2. Anforderungen an die Ventile . . . . . . . . . . . . . . . . . 345.1.3. Begasungs-Schläuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345.1.4. Schlauchpumpen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345.1.5. Armaturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355.1.6. Schläuche, Schlauchkupplungen, Schlauchverbinder . . . . . 35

5.2. Aufbau des Transportwagen mit ITEM-Profile . . . . . . . . . . . . 355.2.1. Bauanleitung und Einzelteilzeichnung . . . . . . . . . . . . . 35

5.3. Begasungssystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355.3.1. Berechnung der Armaturengrößen . . . . . . . . . . . . . . . 35

5.3.1.1. Berechnung des Gasvolumenstroms . . . . . . . . . 355.3.1.2. Berechnung des Gasvolumenstroms durch das 2/2-

Wegeventil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375.3.2. pneumatischer Schaltplan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

5.4. Elektroinstallation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405.4.1. Belegung der Ein- und Ausgänge der Elektronikbox . . . . . 40

Wilhelm Gruber 5

Inhaltsverzeichnis

5.4.2. Elektroschaltplan der Magnetventile und Schlauchpumpen . 415.4.3. Anschluss der Antischaumsonde . . . . . . . . . . . . . . . . 425.4.4. Anschlussbelegung des pH-Transmitters . . . . . . . . . . . 435.4.5. Anschlussbelegung des pO2-Transmitters . . . . . . . . . . . 445.4.6. Temperaturanschluss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455.4.7. Drehzahlanschluss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455.4.8. Pin-Belegung des Verbindungssteckers . . . . . . . . . . . . 455.4.9. Definieren der Analogsignale . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

6. Regelung 476.1. Simulation verschiedener Begasungsregelungen . . . . . . . . . . . . 47

6.1.1. Ermittlung der Zeitkonstante der pO2-Sonde . . . . . . . . . 476.1.1.1. Versuchsdurchführung: Bestimmung des Ansprech-

verhaltens der pO2-Sonde . . . . . . . . . . . . . . 476.1.1.2. graphische Ermittlung der pO2-Sonden-Zeitkonstante 48

6.1.2. Ermittlung der Zeitkonstante für die Sauerstoffaufnahme . . 496.1.2.1. Versuchsdurchführung: Bestimmung des pO2-Überganges

ins Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 496.1.2.2. graphische Ermittlung des kLa-Wertes . . . . . . . 49

6.1.3. Test der Zweipunkt-Regelung am Simulationsmodell . . . . . 516.1.4. Test der PI-Regelung mit nachgeschaltetem Pulsweitenmo-

dulator am Simulationsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . 536.1.4.1. Experimentelles Einstellen der Regelparameter . . 53

6.1.5. Vergleich beider Regelungssysteme . . . . . . . . . . . . . . 566.2. Übertragung der Simulationsmodelle auf Fermenterbegasung . . . . 56

6.2.1. Zweipunktregelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 576.2.2. PI-Regelung mit nachgeschaltetem Pulsweitenmodulator . . 586.2.3. Ergebnis des Praxistests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

6.3. Aufbau der Prozess-Regelung mittels Blockstrukturen . . . . . . . . 596.3.1. Blockstrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

6.3.1.1. Begasungs-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . 616.3.1.2. pH-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 656.3.1.3. Antischaumregelung . . . . . . . . . . . . . . . . . 686.3.1.4. Aufheiz-Sicherung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 706.3.1.5. Hilfsblöcke bzw. Programmgeber . . . . . . . . . . 73

7. Prozess-Software 747.1. Hauptfenster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 747.2. Fenster für Reglereinstellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 767.3. Prozessbildeinstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

Wilhelm Gruber 6

Inhaltsverzeichnis

8. Testfermentation 798.1. Versuchsdurchführung einer Fermentation . . . . . . . . . . . . . . 798.2. Reglereinstellung der O2-Begasung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 798.3. Interpretation der Fermentationsergebnisse . . . . . . . . . . . . . . 80

A. Anhang 85A.1. Stückliste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86A.2. CAD-Zeichnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

A.2.1. Frontplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90A.2.2. linke Gehäuseplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91A.2.3. rechte Gehäuseplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92A.2.4. Tischplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93A.2.5. Abstellplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94A.2.6. Bodenplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95A.2.7. Gewindestift . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96A.2.8. Muffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97A.2.9. Verteilerbuchse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98A.2.10.Alustrebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99A.2.11.Flaschenhalter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100A.2.12.Zusammenbau der Frontplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . 101A.2.13.Zusammenbau rechte Gehäuseplatte . . . . . . . . . . . . . . 102A.2.14.Zusammenbau linke Gehäuseplatte . . . . . . . . . . . . . . 103A.2.15.Zusammenbau Flaschenhalter . . . . . . . . . . . . . . . . . 104A.2.16.Zusammenbau Fermenterwagen . . . . . . . . . . . . . . . . 105

A.3. Medienzusammensetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106A.3.1. 2,5l Nährmedium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106A.3.2. 250ml 20%-Glukoselösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106A.3.3. 250ml 0,5M Salzsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106A.3.4. 250ml 0,5M Natronlauge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

A.4. Checkliste einer Fermentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Wilhelm Gruber 7

Abbildungsverzeichnis

4.1. Rührkessel-Fermenter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114.2. Blasensäulenfermenter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124.3. Airlift-Fermenter mit innerem und äußerem Umlauf . . . . . . . . . 124.4. Wachstumskurve einer Batch-Fermentation . . . . . . . . . . . . . . 134.5. Schematische Darstellung der dynamischen Methode zur Bestim-

mung des kLa-Wertes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174.6. Wachstumsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Umgebungstempe-

ratur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194.7. Wachstumsgeschwindigkeit in Abhängigkeit vom pH-Wert der Um-

gebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204.8. Aufbau einer pO2-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234.9. pO2-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244.10. Aufbau einer pH-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264.11. Funktionsprinzip der pH-Elektrode aus [8] . . . . . . . . . . . . . . 274.12. Verlauf der Regel-und Stellgröße eines Zweipunkt-Regelkreises . . . 284.13. PI-Regelung mit nachgeschaltetem Pulsweitenmodulator . . . . . . 30

5.1. Aufbau des mobilen Fermenterwagens . . . . . . . . . . . . . . . . . 365.2. Pneumatikplan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 395.3. Elektroschaltplan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415.4. Beschaltung Antischaum-Sonde über Niveau-Wächter . . . . . . . . 425.5. Anschluss des pH-Transmitters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435.6. Anschluss des pO2-Transmitters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445.7. Anschluss Temperatursteuerung mit Elektronikbox . . . . . . . . . 455.8. Anschluss Drehzahlsteuerung mit Elektronikbox . . . . . . . . . . . 455.9. Pin-Belegung Verbindungsstecker zwischen Elektronikbox und Drehzahl-

bzw. Temperatursteuerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

6.1. Ansprechverhalten pO2-Sonde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 486.2. pO2−Übergang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 496.3. Zeitkonstantenverhältnis aus [7] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

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6.4. Verhältnis Ansprechzeit zur Zeitkonstante T1 in Abhängigkeit vomZeitkonstantenverhältnis α aus [7] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

6.5. pO2-Regelkreis mit Zweipunktregler . . . . . . . . . . . . . . . . . . 526.6. Simulation eines Zweipunkt-Reglers . . . . . . . . . . . . . . . . . . 526.7. pO2-Regelkreis mit Zweipunktregler . . . . . . . . . . . . . . . . . . 536.8. Experimentelles Einstellen der Proportionalanteiles des P-Reglers . 546.9. Experimentelles Einstellen der Integrations Zeitkonstante des I-Reglers 546.10. Simulation eines PI-Reglers mit nachgeschaltetem Pulsweitenmodu-

lator . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 556.11. Begasungsregelung mit Zweipunktregler . . . . . . . . . . . . . . . . 576.12. PI-Regelung mit nachgeschalteter Pulsweitenmodulation . . . . . . 586.13. Blockstruktur: pO2-pulsweitenmodulierte Regelung . . . . . . . . . 616.14. Blockstruktur: N2-Gegenregelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 636.15. Blockstruktur: pH-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 656.16. Blockstruktur: pH-Regelung durch CO2 Begasung . . . . . . . . . . 666.17. Blockstruktur: Antischaum-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . 686.18. Blockstruktur: Aufheizsicherung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 716.19. Vergleich des Aufheiztemperatur-Verlaufes mit und ohne Übertemperatur-

Absicherung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 726.20. Blockstruktur: Programmgeber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 736.21. Blockstruktur: Programmgeber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

7.1. Hauptfenster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 757.2. Reglereinstellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 767.3. Prozessansicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

8.1. pO2-Reglereinstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 828.2. Fermentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

A.1. Bedienplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90A.2. Aluplatte links . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91A.3. Aluplatte rechts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92A.4. Tischplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93A.5. Abstellplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94A.6. Bodenplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95A.7. Gewindestift mit Bohrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96A.8. Muffe G1/4” auf G1/8” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97A.9. Verteilerbuchse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98A.10.Alustrebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99A.11.Flaschenregal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100A.12.Explosionszeichnung Frontplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

Wilhelm Gruber 9


A.13.Explosionszeichnung Gasanschlussseite . . . . . . . . . . . . . . . . 102A.14.Explosionszeichnung Fermenterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103A.15.Explosionszeichnung Flaschenhalter . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104A.16.Zusammenbau des Fermenterwagens . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

Wilhelm Gruber 10

Tabellenverzeichnis

2.1. Symbolverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3.1. Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

4.1. Formelzeichen: Zellwachstum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144.2. Kritische Sauerstoffkonzentrationen einiger Mikroorganismen . . . . 154.3. Formelzeichen: Sauerstofflöslichkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.4. Sauerstoffbedarf von Mikroorganismen aus [2] . . . . . . . . . . . . 164.5. Formelzeichen: Sauerstofftransportgeschwindigkeit . . . . . . . . . . 174.6. Formelzeichen: Sulfit-Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194.7. Formelzeichen: Pufferkapazität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224.8. Formelzeichen: Fick’sches Gesetz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254.9. Formelzeichen: Zeitverzögerung des Messsignals . . . . . . . . . . . 254.10. Formelzeichen: Elektrodenspannung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274.11. Nährmedium nach Reader [1] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314.12. Beispielrechnung: pH-Wert-Änderung . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.1. Formelzeichen: Gasvolumenstrom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365.2. Anschlussbelegung der Elektronikbox . . . . . . . . . . . . . . . . . 405.3. Steckerbelegung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465.4. Bereichseinstellungen der analogen Sensorsignale . . . . . . . . . . . 46

6.1. Regelparameter der Simulationsmodelle . . . . . . . . . . . . . . . . 516.2. Blockstruktur-Symbolik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 606.3. Symbolik pO2-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 626.4. Symbolik pO2-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 646.5. Symbolik pH-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 676.6. Symbolik pH-Regelung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

8.1. Einstellung der Fermentationsparameter der Testfermentation . . . 798.2. Messwerte der Fermentationsproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

A.1. Nährmediumzusammenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

11

Tabellenverzeichnis

A.2. Glukoselösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106A.3. Salzsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106A.4. Natronlauge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

Wilhelm Gruber 12

1. Aufgabenstellung

Ziel dieser Diplomarbeit ist es, einen voll funktionsfähigen Bioreaktor zu konstru-ieren, konstruktiv auszulegen und aufzubauen. Hierfür sollen, ausgehend von denvorhandenen Komponenten der Firma Bioengineering: Fermenterbehälter, Rühr-und Temperiereinrichtung, der Fermenter noch mit einer mit Begasungs-, pH- undAntischaum-Einrichtung versehen werden. Außerdem soll die notwendige Rege-lungstechnik und Anwendersoftware mit der Prozess-Software WinErs umgesetztwerden.

13

KAPITEL 1. AUFGABENSTELLUNG

2. Symbolverzeichnis

Symbol Einheit BeschreibungΔp bar Druckdifferenzμ 1/s Wachstumsrateρ kg/m 3 DichteτE s ZeitkonstanteA mm2 KathodenoberflächeC g/m 3 wirkliche Sauerstoff-KonzentrationCi kg/m3 Konzentration des gelösten StoffesCE g/m3 angezeigte Sauerstoff-Konzentrationd mm Membrandicke pO2-ElektrodeipO2

A Elektrodenstromkv m 3/h Gas-DurchflusskoeffizientK A s l / mm2 mmol Konstantel LiterN 1/ml ZelldichteN0 1/ml Ausgangszelldichtep bar Druckp1 bar Eingangsdruck in Ventil / Druckmindererp2 bar Ausgangsdruck in Ventil / DruckmindererpO2 mmol/l SauerstoffpartialdruckP mm/s MembranpermeabiliätQ m 3/h Gasvolumenstromt s Zeitta s Ausschaltzeitte s Einschaltzeitt1 s Abklingzeit auf Führungsgrößet2 s Anstiegszeit auf FührungsgrößeT K TemperaturTM g TrockenmasseTP s PeriodendauerTt s TotzeitT0 s SchwingdauerT1 s Zeitkonstante

Wilhelm Gruber 14

KAPITEL 1. AUFGABENSTELLUNG

Symbol Einheit Beschreibungvvm l/(l · min) Begasungsrate (Liter Gas je Liter Fermentervolumen

pro Minute)w FührungsgrößexE EndwertxMA Mittelwertabweichungx0 Schwingamplitudex1 obere Grenzwert der Regelschwingungx2 untere Grenzwert der Regelschwingungx3 Mittelwert der RegelschwingungyR Stellgröße am Ausgang der Regeleinrichtung

Tabelle 2.1.: Symbolverzeichnis

Wilhelm Gruber 15

3. Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung BeschreibungEPDM Ethylen-Propylen-KautschukI2 JodKI KaliumjodidM MolarMs MessingNBR Acrynitril-Butadien-KautschukN NormalPE PolyethylenPV DF PolyvinylidenfluoridPWM Pulsweitenmodulation

Tabelle 3.1.: Abkürzungsverzeichnis

16

4. Grundlagen

Fermenter bieten die Möglichkeit, Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Schim-melpilze sowie pflanzliche und tierische Zellen unter sterilen und optimalen Bedin-gungen für Produktbildungen wachsen zu lassen. Hierbei werden für das Wachstumwichtige Parameter wie Sauerstoffsättigung, pH-Wert und Temperatur standard-mäßig erfasst und geregelt. Für eine Beurteilung einer erfolgreichen Fermentationkönnen in bestimmten Zeitabschnitten Proben aus dem Fermenter genommen undauf Zelldichte und Stoffwechselprodukte wie Laktat, Harnstoff sowie auf das gebil-dete Produkt hin untersucht und beurteilt werden.

4.1. Fermentertypen

In der Bioverfahrenstechnik finden je nach Verwendungszweck und Größenanfor-derung verschiedenste Arten von Bioreaktoren ihre Anwendung. Die Stärken undSchwächen der verschiedenen Reaktoren werden im Folgenden beschrieben.

4.1.1. Rührkessel-Fermenter

Der Rührkessel-Fermenter ist der wichtigste und vielseitigste Reaktortyp in derBioverfahrenstechnik. Man findet Rührkessel-Fermenter von 1 l Inhalt im Labor-betrieb bis zu mehreren Kubikmetern in Produktionsanlagen. Der Grund für dieweite Verbreitung liegt in seinem weitem Feld von Einsatzgebieten. Dieser erstrecktsich über einen großen Viskositätsbereich und der Flexibilität bei der Umsetzungder gewünschten Prozessbedingungen.

Abbildung 4.1.: Rührkessel-Fermenter

17

KAPITEL 4. GRUNDLAGEN

4.1.2. Blasensäulen-Fermenter

Blasensäulen-Fermenter sind relativ einfach gebaute Apparate, in denen im unterenAbschnitt das Gas mittels einer Vorrichtung eingeblasen wird. Dadurch das derInhalt durch das Einblasen von Gas belüftet und durchmischt wird, können sehrgroße Anlagen mit niedrigviskosen Medien kostengünstig betrieben werden. Eingroßes Einsatzgebiet ist beispielsweise die aerobe Abwasserbehandlung.

Abbildung 4.2.: Blasensäulenfermenter

4.1.3. Airlift-Fermenter

Die undefinierten Stömungsverhältnisse in der Flüssigphase der Blasensäulen-Fer-menter können durch den Einsatz von Strömungsleitrohren verbessert werden. Fol-gende Abbildungen zeigen Airlift-Fermenter mit innerem und äußerem Umlauf.Durch die Belüftung des Steigrohres und Abtrennung der Gasphase im Kopfraumentsteht zwischen Steig- und Fallrohr ein Unterschied im hydrostatischem Druck,der eine gleichförmige und relativ schnelle Zirkulationsströmung der Flüssigkeitverursacht. Aus diesem Grund kann der Airliftfermenter besonders bei großen Fer-menterhöhen Vorteile bieten.

Abbildung 4.3.: Airlift-Fermenter mit innerem und äußerem Umlauf

Wilhelm Gruber 18


4.2. Zellwachstum

Das Zellwachstum ist abhängig von den äußeren Wachstumsbedingungen. Je besserdie Umgebungsbedingungen an einen Organismus angepasst sind, um so schnellerfindet ihr Wachstum statt.

Abbildung 4.4.: Wachstumskurve einer Batch-Fermentation

1. Lag-Phase: Nach Animpfen der Kultur adaptieren die Mikroorganismen andie Bedingungen des Mediums. Hierbei stellen sich die Enzymsysteme auf dievorhandenen Nährstoffe ein. Je mehr sich Vorkultur und Medienzusammen-setzung des Fermenters unterscheiden, um so länger dauert die Lag-Phase.

2. Beschleunigungs-Phase: Ist die Phase nach der Adaption an das neueMedium in der die Wachstumsrate auf das Maximum ansteigt.

3. Logarithmische-Phase: Hier ist die Phase des maximalen Wachstums. DasWachstum wird weder durch Substratlimitierung noch durch Produktinhibi-tion gehemmt.

Das Zellwachstum in der Logarithmischen-Phase lässt sich nach folgenderFormel beschreiben.

N = N0 · expμ·t (4.1)

Wilhelm Gruber 19


Symbol Beschreibung EinheitN Zelldichte 1/mlN0 Ausgangszelldichte 1/mlμ Wachstumsrate 1/st Zeit s

Tabelle 4.1.: Formelzeichen: Zellwachstum

4. Übergangs-Phase: Nach dem starken Wachstum ist irgendein Nährstoffverbraucht bzw. der Stoffwechsel durch eigene Produktbildung gehemmt(z.B. Alkohol während der Gärung). Die Zellen verzögern ihr Wachstum.

5. Stationäre-Phase: Nachdem der Kohlenstoff aufgebraucht oder ein wachs-tumshemmendes Stoffwechselendprodukt angereichert ist, bleibt die Zellmas-se konstant. In manchen Fällen werden hier sekundäre Stoffwechselproduktewie Antibiotika synthetisiert.

6. Absterbe-Phase: In dieser Phase sind die Energiereserven der Zelle er-schöpft und sämtliche Stoffwechselaktivitäten kommen zum erliegen. In derRegel wird die Fermentation gestoppt und die Zellmasse geerntet, bevor dieAbsterbe-Phase beginnt.

4.2.1. Sauerstoffversorgung

In der Industrie finden meist aerobe Fermentationsprozesse statt. Das heißt, daßSauerstoff als wesentliches Substrat verwendet wird. Da die Löslichkeit von Sauer-stoff limitiert ist (aus der Luft nur etwa 9, 4 g/m3 bei 20 °C aus [2]) muß Sauerstoffkontinuierlich zugeführt werden. Für ein ungehindertes Wachstum benötigen Mi-kroorganismen eine minimale Sauerstoffkonzentration. Fällt der Wert des gelöstenSauerstoffs unter die kritische Konzentration verlangsamt sich ihr Wachstum. Istder gelöste Sauerstoff größer als die kritische Konzentration, so sind keine Unter-schiede feststellbar.

4.2.1.2. Löslichkeit von Sauerstoff in Flüssigkeiten

Für Luft (21 V ol. % O2):

C∗

O2=

0, 526 · p[bar]

36 + T [C][kg/m3] (4.2)

Für reinen Sauerstoff:

C∗

O2=

2, 506 · p[bar]

36 + T [C][kg/m3] (4.3)

Wilhelm Gruber 20


4.2.1.1. Kritische Sauerstoffkonzentrationen einiger Mikroorganismen

Organismus Ckrit [g/m3]Escherichia coli 0,1 -0,26Saccharomyces cerevisiae 0,12 - 0,15Pseudomonas denitrificans 0,3Penicilium chrysogenum 0,3 - 0,7Aspergillus oryzae 0,64Acetobacter vinelandii 0,6 - 1,6Pseudomonas ovalis 1,1

Tabelle 4.2.: Kritische Sauerstoffkonzentrationen einiger Mikroorganismen

Gelöste Substanzen verringern meist die Löslichkeit von Sauerstoff. Dies kanndurch die folgende Gleichung beschrieben werden:

CLosung = CWasser · e(−α·Ci) (4.4)

Symbol Beschreibung EinheitC∗

O2gelöste Sauerstoffkonzentration g/m3

p Druck barT Temperatur °Cα Löslichkeitskoeffizient m3/kgCi Konzentration des gelösten Stoffes kg/m3

Tabelle 4.3.: Formelzeichen: Sauerstofflöslichkeit

4.2.1.3. Sauerstoffaufnahme

Für das Wachstum und der Produktbildung wird in den allermeisten Fällen Sauer-stoff als Substrat verwendet. Für eine Bilanzierung müssen neben dem verwende-tem Substrat noch die Zellzahl mit berücksichtigt werden. Als Richtwerte könnenfolgende Werte für die Auslegung der Sauerstoffversorgung verwendet werden:

4.2.1.4. Richtwerte für den Sauerstoffbedarf von Mikroorganismen

4.2.1.5. Sauerstoffeintrag

Der Sauerstoffeintrag beschreibt die effektive Geschwindigkeit des Sauerstoffüber-ganges von der Gasphase in die Flüssigphase. Die Übergangsgeschwindigkeit von

Wilhelm Gruber 21


Substrat Sauerstoffbedarf[kgO2/kgTM ]

Glukose 0,6 - 0,8Ethanol 1,6 - 2,4Methanol 1,6 - 2,5Alkane 1,7 - 2,0Methan 5,0 - 5,6

Tabelle 4.4.: Sauerstoffbedarf von Mikroorganismen aus [2]

der gasförmigen in die flüssig Phase hängt von dem volumenbezogenen Stoffüber-gangskoeffizienten, dem kLa-Wert, und der Konzentrationsdifferenz zwischen ge-sättigter O2− und aktueller O2-Konzentration ab.

OTR =dCO2

dt= kLa

(C∗

O2− CO2

)(4.5)

Unter der Voraussetzung, dass zum Zeitpunkt t = 0 die die SauerstoffkonzentrationCO2

= 0 g/m3 ist und kein Sauerstoff verbraucht wird, lässt sich der Verlauf derSauerstoffkonzentration bei voller Begasung errechnen.

dCO2

C∗

O2− CO2

= kL · a · dt∫1

C∗

O2− CO2

· dCO2=

∫kL · a · dt

− ln(C∗

O2− CO2

) + Konstante = kL · a · t =⇒ für Konstante = −lnC

ln(C∗

O2− CO2

) − ln C = −kL · a · t(C∗

O2− CO2

)

C= expkL·a·t

CO2= C∗

O2− C · expkL·a·t

Durch Einsetzen der Randbedingung ergibt sich folgende Gleichung:

0 = C∗

O2− C · expkL·a·0

C = C∗

O2

CO2= C∗

O2− C∗

O2· expkL·a·t

CO2= C∗

O2

(1 − expkL·a·t

)(4.6)

Wilhelm Gruber 22


Symbol Beschreibung EinheitOTR Sauerstofftransferrate g/ (m3 · s)C∗

O2max. gelöste Sauerstoffkonzentration g/m3

CO2aktuell gelöste Sauerstoffkonzentration g/m3

kLa Volumenbezogene Stoffübergangskoeffizient 1/st Zeit s

Tabelle 4.5.: Formelzeichen: Sauerstofftransportgeschwindigkeit

4.2.1.6. Bestimmungsmethoden des kLa-Werts

Der kLa-Wert ist ein wichtiger Parameter der bei der Entwicklung von Rühror-ganen verwendnet wird. Durch ihn lässt sich die Effizienz des Sauerstoffeintra-ges greifbar machen. In der Praxis werden verschiedene Methoden für die Be-stimmung des kLa-Wertes verwendet. Da der kLa-Wert von sehr vielen Faktoren(Medium-Zusammensetzung, Rührerdrehzahl, Blasengröße, Temperatur, Druck,...) abhängt, lässt er sich nur unter gleichbleibenden Bedingungen annähernd re-produzierbar bestimmen.

dynamischen Methode

Bei der dynamischen Methode wird der kLa-Wert während der Fermentation be-stimmt. Man unterbricht dabei die Sauerstoffzufuhr für kurze Zeit und mißt miteiner schnell ansprechenden Elektrode den Verlauf des gelösten Sauerstoffs. Nach

Abbildung 4.5.: Schematische Darstellung der dynamischen Methode zur Bestim-mung des kLa-Wertes

Abdrehen der Sauerstoffzufuhr entsteht durch den Sauerstoffverbrauch eine lineare

Wilhelm Gruber 23


Abnahme der Sauerstoffkonzentration, dessen Steigung der Sauerstoffverbrauchs-rate mal der Zelldichte entspricht.

dCL

dt= kLa · (C∗ − CL) − QO2

· X (4.7)

Im stationären Zustand ist dCL

dt= 0. Durch Umstellung der Gleichung (4.7) kann

dann der kLa-Wert berechnet werden.

kLa =QO2

· XC∗ − CL

(4.8)

Die Sulfit-Methode

Die Sulfit-Methode ist für die Bestimmung des kLa-Wertes in biologischen Syste-men weniger geeignet, da sie nicht in einer Nährlösung angewendet wird. Vielmehrwird diese Methode benützt, um Begasungssysteme oder Rührereigenschaften ver-gleichbar zu machen.

Versuchsdurchführung

Bei der Sulfit-Methode wird der Reaktor anstatt des Nährmediums mit einerNatriumsulfit-Lösung (0,5 N, pH 8) befüllt. Durch den Lufteintrag wird Natri-umsulfit unter der katalytischen Wirkung von Co2+ oder Cu2+ (1 mmol) zu Na-triumsulfat oxidiert.

2 Na2SO3 + O2Co2+, Cu2+−→ 2 Na2SO4 (4.9)

Durch den totalen Verbrauch an Gelöstsauerstoff gemäß (4.9) ist die Gelöstsauer-stoffkonzentration CL = 0, so daß man die Sauerstoffübergangsrate OTR ermittelnkann. Nachdem der Nullwert bestimmt ist, wird die Lösung belüftet und während4 bis 20 min unter den zu testenden Bedingungen gerührt. Nach dieser Zeit werden5 ml Probe entnommen und sofort in eine frische 1 l Iodlösung (50 mmol I2, 240mmol KI) pipettiert.Die Rücktitration findet dann mit 0,1 N Natriumthiosulfatlö-sung mit 1% -iger Stärke-Lösung statt.Der Sauerstoffübergang OTR berechnet sich dann:

X

t· 300

[min

h

]= kLa · C∗ (4.10)

Wilhelm Gruber 24


Symbol Beschreibung EinheitX Verbrauch an 0,1 N Thiosulfat-Lösung lt Oxidationszeit in Minuten minkLa · C∗ Stoffübergang 1/h

Tabelle 4.6.: Formelzeichen: Sulfit-Methode

4.2.2. Temperatur-Einfluss auf die Wachstumsrate

Die Abbildung 4.6 verdeutlicht den starken Temperatureinfluss auf die Wachs-tumsgeschwindigkeit von Mikroorganismen. Im Bereich unterhalb des Temperatur-optimums bewirkt eine Erhöhung der Temperatur um 10 °C eine Verdoppelungder spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit. Bereits 10 °C bis 25 °C unterhalb desTemperatur-Optimums geht die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit praktischauf Null zurück. Die rasche Abnahme der spezifischen Wachstumsgeschwindig-keit oberhalb des Optimums ist auf die teilweise oder vollständige Denaturierungder makromolekularen Bestandteile, besonders der Proteine zurückzuführen. Imdenaturierten Zustand können sie ihre Funktion als Strukturkomponente oder Ka-talysator nicht mehr erfüllen.

Abbildung 4.6.: maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (μmax) vonEscherichia coli als Funktion der Wachstums-Temperatur (aus Pirt, 1975)

4.2.2.1. Einfluss der Temperatur auf das Wachstum und die biologischeAktivität

• Temperaturstabilität von Strukturen und Strukturkomponenten der Zelle

• Temperaturabhängigkeit der biochemischen Reaktionsgeschwindigkeit

Wilhelm Gruber 25


4.2.3. pH-Wert

Im Gegensatz zur Temperaturabhängigkeit ist die pH-Abhängigkeit fast symme-trisch bezüglich des Optimums. Optimales Wachstum ist innerhalb von 1 bis 2 pH-Einheiten möglich. Das Wachstum innerhalb eines Bereichs von 5 pH-Einheiten.

4.2.3.1. Einfluss des pH-Werts auf den Organismus

• Er kann das Endprodukt des Metabolismus ändern

• Er kann die elementare oder molekulare Zusammensetzung ändern

• Die Zellmorphologie kann beeinflusst werden

• Die Zusammensetzung der Zellwand und der Zellumhüllung wird verändert

Abbildung 4.7.: maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (μmax) vonEscherichia coli als Funktion des pH-Wertes der Nährlösung (aus Pirt, 1975)

4.2.3.2. Pufferlösungen

Pufferlösungen besitzen die Eigenschaft den pH-Wert einer Lösung in einem ge-wissen Bereich konstant zu halten. Dadurch, daß eine Pufferlösung relativ hoheKonzentrationen einer schwachen Säure und ihrer konjugierten Base enthält, kön-nen zugeführte H+-Ionen von der konjungierten Base und OH−-Ionen von dervorhandenen Säure abgebunden werden.

Wilhelm Gruber 26


4.2.3.3. Herleitung der Henderson-Hasselbalch-Gleichnung

Folgende Gleichung beschreibt die Dissoziation einer Säure (HA) in wässriger Lö-sung. Dabei tritt das Wasserstoff-Proton von der Säure über und kann von einemWassermolekül (Protonenakzeptor) aufgenommen werden.

HA︸︷︷︸Saure

+H2O � H3O+︸︷︷︸

Wasserstoff−

Ionenkonzentration

+ A−︸︷︷︸konjugierte

Basenkonzentration

(4.11)

Jede Säure besitzt eine unterschiedliche Fähigkeit Protonen ins Wasser abzugeben.Säuren, die eine geringe Tendenz zeigen Protonen abzugeben werden als schwacheSäuren, solche, die sehr leicht Protonen abgeben als starke Säuren bezeichnet. DieNeigung wie leicht eine Säure Protonen abgeben kann wird durch die Dissoziati-onskonstante (KS) beschrieben.

[H3O+] · [A−]

[HA] · [H2O]= KS (4.12)

Durch Eliminierung des Wassers vereinfacht sich dieser Zusammenhang wie folgt:

[H+] · [A−]

[HA]= KS (4.13)

Da der pH-Wert als negativ dekadischer Logharihmus der Wasserstoffionen-Konzentrationdefiniert ist, wird auf [H+] aufgelöst und der negative Logarithmus auf beiden Sei-ten eingeführt

[H+

]= KS · [HA]

[A−](4.14)

−log[H+

]︸︷︷︸pH

= −logKS︸︷︷︸pKS

−log[HA]

[A−](4.15)

Durch Änderung der Vorzeichen ergibt sich die Henderson-Hasselbalch-Gleichung

[pH] = pKS + log[A−]

[HA](4.16)

oder in der allgemeinen Formulierung:

[pH] = pKS + log[Protonenakzeptor]

[Protonendonor](4.17)

Wilhelm Gruber 27


Symbol Beschreibung EinheitHA Säure mol/lH+ Wasserstoff-Ionenkonzentration mol/lA− konjungierte Basenkonzentration mol/lKS Dissoziationskonstante -pH negativ dekatische Logarithmus -

der WasserstoffionenkonzentrationpKS negativ dekatische Logarithmus -

der Dissoziationskonstante

Tabelle 4.7.: Formelzeichen: Pufferkapazität

4.2.3.4. Einfluss von Kohlendioxid auf den pH-Wert

In manchen Fällen kann es vorkommen, das der pH-Wert nicht durch die Zu-gabe von Säuren und Laugen, sondern durch Kohlendioxid geregelt wird. Diesesgeschieht unter der Tatsache, daß CO2 in Wasser gelöst Kohlensäure bildet.

CO2 + H2O � H+ + HCO−

3 (4.18)

4.3. Sonden

4.3.1. O2-Elektrode

Der gelöste Sauerstoff ist in der aeroben Fermentation einer der wichtigsten Pa-rameter. Dieser wird in der Regel mit einer Sauerstoffelektrode nach dem Clark-Prinzip bestimmt.

Wilhelm Gruber 28


4.3.1.1. Aufbau einer pO2-Elektrode

Abbildung 4.8.: Aufbau einer pO2-Elektrode

Wilhelm Gruber 29


Abbildung 4.9.: pO2-Elektrode

4.3.1.2. Funktionsprinzip O2-Elektrode

Die Membran der Sauerstoffelektrode trennt den Fermenterinhalt mit dem Elektro-lyt-Elektroden-System. Sauerstoff dringt durch die Membran in die Elektrolyt-Lösung und wird dort zu OH-Ionen reduziert. Aus dieser Reaktion entsteht zwi-schen Kathode und Anode ein elektrischer Strom, der dem Sauerstoff-Partialdruckproportional ist.

Kathode : O2 + 4e− + 2H2O → 4OH−

Anode : 4Ag + 4Cl− → 4AgCl + 4e−

gesamt : O2 + 4e− + 2H2O + 4Ag + 4Cl− → 4OH− + 4AgCl + 4e−

Folgende Parameter haben Einfluss auf den eindiffundierenden Sauerstoff und da-mit auf die Größe des Elektrodenstromes:

• Sauerstoffpartialdruck

• Membran-Material und -Dicke

• Größe der Kathode

• Temperatur

• Strömungsverhältnisse in der Messlösung

Das Fick’sche Gesetz beschreibt diesen Zusammenhang

ipO2= K · A · P · pO2

d(4.19)

Wilhelm Gruber 30


Symbol Beschreibung EinheitipO2

Elektrodenstrom ApO2 Sauerstoffpartialdruck mmol/lK Konstante A s l / mm2 mmolP Membranpermeabiliät mm/sA Kathodenoberfläche mm2

d Membrandicke mm

Tabelle 4.8.: Formelzeichen: Fick’sches Gesetz

4.3.1.3. Ansprechverhalten einer Sauerstoffelektrode mit gasdurchlässigerMembran

Ein Nachteil dieser Elektrode ist die Zeitverzögerung des Messsignals, die durchdie Diffusion des Sauerstoffs durch die Membran verursacht wird. Sie kann durchfolgende Formel beschrieben werden:

CE = C(1 − exp

−tτE

)(4.20)

Die von Mettler-Toledo gelieferte pO2-Elektrode erreicht nach 90s 98% des Mes-

Symbol Beschreibung EinheitCE angezeigte Konzentration g/m3

C wirkliche Konzentration g/m3

t Zeit sτE Zeitkonstante s

Tabelle 4.9.: Formelzeichen: Zeitverzögerung des Messsignals

sendwertes. Hieraus ergibt sich für τE folgender Wert:

τE =−t

ln(1 − CE

C

) (4.21)

τE =−90s

ln(1 − 98

100

) (4.22)

τE = 23s (4.23)

Wilhelm Gruber 31


4.3.2. Temperatur-Sonde

Zur Messung der Temperatur werden in Bioreaktoren vor allem Pt-100-Wider-stands-thermometer, die in Stahlschutzrohre eingebaut sind, verwendet. Im Ge-gensatz zu Thermistoren sind sie sehr stabil und weisen einen linearen Tempera-turkoeffizienten über einen großen Temperaturbereich auf. Die Bezeichnung Pt-100bedeutet, dass bei T = 0 °C der Ohmsche Widerstand bei 100 Ω liegt.

4.3.3. pH-Elektrode

4.3.3.1. Aufbau einer pH-Elektrode

Abbildung 4.10.: Aufbau einer pH-Elektrode

4.3.3.2. Funktionsprinzip einer pH-Elektrode

Eine pH-Elektrode besteht aus einer Mess- und einer Bezugselektrode. Taucht mannun eine pH-Elektrode in ein wässriges Medium, so bildet sich an der äußeren undinneren Seite des pH-sensitiven Membranglasses eine Quellschicht aus. Je nach pH-Wert der Lösung diffundieren H+-Ionen in die Quellschicht hinein oder heraus.Ist die Messlösung sauer, so treten Wasserstoffionen in die Quellschicht hinein,wobei sich ein positives Potential an der Quellschicht-Außenseite bildet. Da dieGlasmembran an der Innenseite einen gleichbleibenden pH-Wert besitzt, ist dortdas Potential während der Messung konstant. Die entstehende Spannung resultiertaus der Potentaldifferenz zwischen Außen- und Innenseite.

Uel = U0 − S · (pHa − pHi) (4.24)

Wilhelm Gruber 32


Symbol Beschreibung EinheitUel Elektrodenspannung VU0 Nullpunktspannung VS Steilheit V/pH-EinheitpHi pH-Wert des Innenpuffers 1pHa pH-Wert des Messmediums 1

Tabelle 4.10.: Formelzeichen: Elektrodenspannung

Abbildung 4.11.: Funktionsprinzip der pH-Elektrode aus [8]

4.4. Prozessregelung

Um den Mikroorganismen im Bioreaktor ein optimales Wachstum zu ermöglichen,müssen alle für eine Fermentation benötigten Prozessparameter wie Temperatur,pH-Wert und Sauerstoffsättigung gemessen und bei Bedarf nachgeregelt werden.Da sich während einer Fermentation die Messgrößen nur langsam ändern, und Mi-kroorganismen leichte Abweichungen des Optimums gut zu tolerieren vermögen,kann auf einfache Bauteile und Regelungen zurückgegriffen werden. Bei der Re-gelung des Fermenters werden deshalb nur schaltende Bauteile wie Magnetventileund Schlauchpumpen verwendet. Im folgenden werden zwei Regelungsverfahrenbeschrieben, mit denen man die Prozessregelung realisieren kann.

4.4.1. Zweipunktregelung

Zweipunktregler gehören zu der Gruppe der unstetigen Regler. Kennzeichen dieserRegler ist, daß die Stellgröße nur zwei Zustände von 0 % und 100 % einnehmen kön-nen. In der Praxis werden diese Regler eingesetzt, wenn es darum geht, möglichstpreiswerte Alternativen zu stetigen Reglern zu finden. Infolge der ein- und aus-schaltenden Stellgröße erreicht die Regelgröße keinen Beharrungszustand, sondernführt um ihn herrum ständige Schwankungen aus (Arbeitsbewegung). Die Ampli-tude der Arbeitsbewegung ergibt sich aus der Schaltdifferenz zuzüglich der aus der

Wilhelm Gruber 33


Totzeit resultierenden Überschwingbewegungen. Durch sehr kleine Schaltdifferen-zen können sehr genaue Regelungen realisiert werden. In der Praxis werden dieseaber durch die elektromechanischen Eigenschaften der Schaltbauteile begrenzt.In folgender Grafik wird die Zweipunktregelung dargestellt werden.

Abbildung 4.12.: Zeitlicher Verlauf der Regel-und Stellgröße eines Regelkreises be-stehend aus einer P − T1-Strecke mit Totzeit und einem Zweipunktregler

4.4.1.1. Berechnung des Mittelwerts der Regelschwingung x3

x1 = w + (xE − w) ·(1 − e

−TtT1

)(4.25)

mit xE = yRmax· KS (4.26)

x2 = w · e−TtT1 (4.27)

x3 =x1 + x2

2(4.28)

x3 =1

2

[xE

(1 − e

−TtT1

)+ 2w · e

−TtT1

](4.29)

Wilhelm Gruber 34


4.4.1.2. Berechnung der Schwankungsbreite 2 · x0

2 · x0 = x1 − x2 (4.30)

2 · x0 = w + (xE − w) ·(1 − e

−TtT1

)− w · e

−TtT1 (4.31)

2 · x0 = xE

(1 − e

−TtT1

)(4.32)

(4.33)

4.4.2. Pulsweitenmodulierte Regelung

Viele Systeme wie z.B. Klimaanlagen, die lange Totzeiten bzw. große Zeitkon-stanten aufweisen, lassen sich mit einer klassischen Zweipunktregelung schlechtrealisieren. Hierfür werden andere Regelungstechniken wie PI-Regler mit nachge-schaltetem Pulsweitenmodulator verwendet. Die Funktionsweise lässt sich anhandfolgender Abbildung 4.13 erklären.

4.4.2.1. graphische Darstellung einer PI-Regelung mit nachgeschalteterPulsweitenmodulation (Abb. 4.13)

Die Regelabweichung wird durch einen PI-Regler in ein Spannungssignal umge-wandelt. Mit einem Sägezahngenerator und einem Schmitt-Trigger können nunSchaltzeiten generiert werden, die dem Spannungssignal proportional sind.

4.4.2.2. Reglereinstellung nach der Probiermethode

1. Zunächst wird Verstärkung KP des P-Reglers eingestellt. Hierfür wird dieNachstellzeit Ti des I-Reglers auf unendlich, die Verstärkung KP auf einensehr kleinen Wert gestellt.

2. Die Verstärkung des P-Reglers wird solange erhöht bis das System zu Schwin-gen anfängt.

3. Die Verstärkung KP -halbieren und dann die Nachstellzeit Ti verkleinern, bisRegeldifferenz in einer akzeptablen Zeit ausgeregelt ist.

Wilhelm Gruber 35


Abbildung 4.13.: PI-Regelung mit nachgeschaltetem Pulsweitenmodulator

Wilhelm Gruber 36


4.4.3. pO2-Regelung

Die pO2-Regelung ist neben der Temperaturregelung die wichtigste Regelung wäh-rend einer Fermentation. Während pH-Wert-Schwankungen gut tolerierbar sind,wird von der Sauerstoffversorgung das Wachstum und die Stoffwechsellage starkbeeinflußt. Die Begasung kann entweder durch Zutakten von Luft bzw., wenn diesenicht ausreichend ist, durch reinen Sauerstoff erfolgen.

4.4.4. pH-Regelung

Die gewöhnlichste Art der pH-Regelung ist die Zuführung von Säure und Lauge.Hierbei wird in der Regel die Säure und Lauge des Salzes verwendet. Das heißt,bei Verwendung eines Kalium-/Natriumphosphat-Puffers wäre die Phosphorsäu-re und Natronlauge hierfür geeignet. Bei bestimmten Zelltypen wie Säuger- undPflanzenzellen kann die pH-Regelung durch Zutaktung von CO2 erfolgen.Anhand der Abbildung 4.7 auf Seite 20 erkennt man, daß die pH-Verträglichkeiteine größere Toleranzbreite zuläßt. Für die Praxis heißt das, daß der pH-Wert erstnach Überschreiten der Toleranzgrenze nachgeregelt werden muß. Gar keine odereine zu kleine Toleranzgrenze würde zu einem ständigem Ansprechen der Säure-und Laugenpumpe führen, und somit die Salzmolarität des Nährmediums mit derZeit erhöhen.

4.4.4.1. Berechnung der Zugeführten Menge an Säure und Lauge beiÜberschreiten der pH-Toleranzgrenze am Beispiel einesEscherichia coli -Nährmediums:

Substanz Molekulargewicht Einwaage Molarität[g/mol] [g] [mmol]

Glukose (C6H12O6) 180,15 20,0 111(NH4)2 SO4 132,14 3 22,7KH2PO4 136,08 1,00 7,3K2HPO4 174,17 0,16 0,92MgSO4 · 7H2O 246,47 0,70 2,8NaCl 58,06 0,5 8,6Ca (NO3)2 · 4H2O 236,11 0,4 1,69

ad 1000 ml Leitungswasser, pH 6,3

Tabelle 4.11.: Nährmedium nach Reader [1]

In der vorliegenden Nährstoffzusammensetzung handelt es sich um ein Hydrogen-Dihydrogenphosphat-Puffersystem mit einem pKS − Wert von 6,8 nach [6]. An-

Wilhelm Gruber 37


hand der Eingewogenen Salzmengen lässt sich hier nach (4.16) der pH-Wert unddie pH-Wert-Änderungen durch Zugabe von Säure und Lauge berechnen.Mit dem Puffersystem mit den verwendeten Einwaagen an Phosphatsalzen ergibtsich ein pH Wert von:

pH = pKS − lg

[HPO2−

4

][H2PO−

4

] (4.34)

pH = 6, 8 − lg[0, 92 mmol]

[7, 3 mmol](4.35)

pH = 7, 7 (4.36)

Wird nun eine pH-Toleranzgrenze von ±0, 2 pH-Einheiten über oder unterschrit-ten, so ergeben sich folgende Zudosierungen an Säure und Lauge.

Rechenbeispiel

Dieses Rechenbeispiel ist nur eine grobe Annäherung, da hier die Einflüsse deranderen Salze, der Temperatur, des gelösen CO2 und der mehrstufigen Dissoziationder Phosphorsäure nicht berücksichtigt wurden.

pH-Wert überschreitet pH 7,9 pH-Wert unterschreitet pH 7,5Säurezugabe 0,5 M H3PO4 Laugenzugabe 0,5 M NaOH

7, 9 = 6, 8 − lg [0,92 mmol−x][7,3 mmol+x]

7, 5 = 6, 8 − lg [0,92 mmol+x][7,3 mmol−x]

7, 9 − 6, 8 = lg [0,92 mmol−x][7,3 mmol+x]

7, 5 − 6, 8 = lg [0,92 mmol+x][7,3 mmol−x]

10−1,1 = [0,92 mmol−x][7,3 mmol+x]

10−0,7 = [0,92 mmol+x][7,3 mmol−x]

0, 079 · (7, 3 mmol + x) = 0, 92 mmol − x 0, 200 · (7, 3 mmol − x) = 0, 92 mmol + x

⇒ x = 0, 315 mmol ⇒ x = 0, 4473 mmol

Wilhelm Gruber 38


Umrechnung auf 0,5 M Säure und Lauge

0,315 mmol

0,5 M= 0, 00063V ol 0,4473 mmol

0,5 M= 0, 0008953V ol

d.h. je Liter Fermentervolumen

0, 63 ml Säure 0, 9 ml Lauge

Tabelle 4.12.: Beispielrechnung: pH-Wert-Änderung

4.4.5. Antischaum-Regelung

Durch die Begasung und das Rühren entsteht im Fermenter Schaum. Dieser wirktstörend, da er Protein denaturiert und die Abluftfilter zusetzt. Durch entspre-chende Antischaum-Mittel kann diese Schaumbildung verhindert werden. DiesesAntischaum-Mittel wird erst zugegeben wenn der Schaum im Fermenter eine ge-wisse Höhe erreicht hat.

Wilhelm Gruber 39

5. Konstruktion

5.1. Konstruktionsauslegung undMaterialanforderungen

5.1.1. Transportwagen

Der Transportwagen wurde so gestaltet, daß alle Komponenten, die für den Betriebeiner Fermentation benötigt werden, in einer platzsparenden Weise untergebrachtwerden können. Die Tiefe des Wagens wurde so gewählt, daß der Fermenter durchjede Türe im Haus passt. Dadurch, daß die Gasflaschen mitgeführt werden können,wurden die Rollen so ausgewählt, daß sie dieser Belastung Stand halten.

5.1.2. Anforderungen an die Ventile

Für eine ausreichende Begasung des Fermenters werden Begasungsraten zwischen15 und 120 m3/(m3·h) verwendet. Für unseren 10 l Bioreaktor entspricht dies ei-ner Begasungsrate von 2 Liter Luft (Sauerstoff) auf einen Liter Fermenterkulturje Minute. Im Höchstfall werden also 20 Liter Luft (Sauerstoff) je Minute einge-blasen. Bei der Auswahl der Magnetventile sollte darauf geachtet werden, daß siefür Sauerstoff und für Dauerbelastung geeignet sind.

5.1.3. Begasungs-Schläuche

Die Gasschläuche im Inneren des Gehäuses bestehen aus sauerstoffbeständigemPolyurethan die sehr gut auch für den Einsatz von Steckverbindungen geeignet ist.Mit dem Außendurchmesser von 6 mm hält dieser Schlauch einem Betriebsdruckvon 10 bar stand.

5.1.4. Schlauchpumpen

Bei der Auswahl für Säure-, Lauge- und Antischaum- Schlauchpumpen genügeneinfachere Modelle, die nicht für den Dauerbetrieb geeignet sein müssen. Als geeig-net stellten sich die von der Firma Rietschle Thomas angebotenen Schlauchpumpen

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KAPITEL 5. KONSTRUKTION

SR 10/30 DC heraus, die direkt an die Digitalausgänge der Elektronikbox ange-schlossen werden können. Der Volumenstrom von 20− 80 ml/min ist vollkommenausreichend, da während des Betriebs nur kurze Impulse zugetaktet werden.

5.1.5. Armaturen

Für die Einstellung des Betriebsdruckes müssen die Druckregler und Manometerebenfalls für Sauerstoff geeignet und damit ölfrei sein. Da der Fermenter nur einenmaximalen Betriebsdruck von 1,5 bar Überdruck zulässt, sollten aufgrund der Ge-nauigkeit die Armaturen den doppelten Wert (2, 5−3bar) des Überdruckes haben.

5.1.6. Schläuche, Schlauchkupplungen, Schlauchverbinder

Wichtig für Schläuche, Schnellkupplungen und Schlauchverbinder ist, daß sie auto-klavierbar und chemikalienbeständig sind. Schläuche aus Silikon, Schlauchverbin-der aus PE und Schnellkupplungen aus PVDF mit EPDM-Dichtung entsprechenderen Anforderungen.

5.2. Aufbau des Transportwagen mitITEM-Profile

5.2.1. Bauanleitung und Einzelteilzeichnung

siehe Anhang Seite 90 Abschnitt A.2

5.3. Begasungssystem

5.3.1. Berechnung der Armaturengrößen

5.3.1.1. Berechnung des Gasvolumenstroms

Zur Berechnung der Ventilgröße wurde die im Katalog der Fa. Bürkert angegebenenBerechnungsformel verwendet.

Berechnung unterkritische Gase

p2

p1

> 0, 5 (5.1)

Q = 514 · kv ·√

Δp · p2

ρ · T (5.2)

Wilhelm Gruber 41


Abbildung 5.1.: Aufbau des mobilen Fermenterwagens

Berechnung überkritische Gase

p2

p1

< 0, 5 (5.3)

Q = 275 · kv · p1 ·1√ρ · T (5.4)

Symbol Beschreibung EinheitQ Volumenstrom m 3/hkv Durchflusskoeffizient m 3/hp1 Eingangsdruck barp2 Ausgangsdruck barΔp Druckdifferenz barρ Dichte kg/m 3

T Temperatur K

Tabelle 5.1.: Formelzeichen: Gasvolumenstrom

Wilhelm Gruber 42


5.3.1.2. Berechnung des Gasvolumenstroms durch das 2/2-Wegeventil

Der Eingangs-Gasdruck des 2/2-Wegeventil wird mit dem Flaschendruckmindererauf den halben zulässigen Druck also rund 4-5 bar gedrosselt. Anschließend wird ernochmals mittels eines Druckminderventils auf 0,2 - 0,5 bar Überdruck eingestellt.Ein folgendes 2/2-Wegeventil taktet nach Bedarf Gas in den Fermenter zu.

Ausgangsdruck des 2/2-Wegeventils

Dieser richtet sich abhängig vom eingestellten Überdruck im Fermenter und derMediums - Füllhöhe. Als Berechnungsgrundlage des entstehenden Ausgangsdrucksdes 2/2-Wegeventils werden folgende Werte angenommen:

Dichte des Mediums: 1200 kg/m 3

maximale Füllhöhe: 30 cm

p2 = ρMedium · g · hF ull + Barometerdruck + Fermenteruberdruck (5.5)

p2 = 1200kg

m3· 9, 81

m

s2· 0, 3 m + 1, 013 bar + 0, 1 bar (5.6)

p2 = 0, 035 bar + 1, 013 bar + 0, 1 bar (5.7)

p2 = 1, 148 bar

Eingangsdruck des 2/2-Wegeventils

Entspricht dem eingestellten Druck des Druckminderers von 0,2 bis 0,5 bar Über-druck gegenüber dem durch den Fermenter entgegengesetzten Ausgangsdruck. Um-gerechnet in Absolutdruck:

Minimaler Eingangsdruck: ≈1,35 barMaximaler Eingangsdruck: ≈1,65 bar

Berechnung des Ausströmverhaltens

p2

p1

=Ausgangsdruck

minimaler Eingangsdruck=

1, 148 bar

1, 35 bar= 0, 85 > 0, 5 (5.8)

Hieraus erfolgt ein unterkritisches Ausströmverhalten, so dass folgende Formel fürdie Berechnung des Durchflusskoeffizienten verwendet werden muss:

Q = 514 · kv ·√

Δp · p2

ρ · T (5.9)

Für die Auswahl an erhältlichen 2/2-Wegeventilen muss der Durchflusskoeffizientdurch Umstellen der Formel berechnet werden.

Wilhelm Gruber 43


kv =Q

514 ·√

Δp·p2

ρ·T

(5.10)

kv =1, 2 m3/h

514 ·√

(1,2 bar−1,148 bar)·1,148 bar

1,205·293

(5.11)

kv = 0, 18 m3/h

Ein geeignetes 2/2-Wegeventil mit einem kv-Wert von 0,23 m 3/h liefert die FirmaBürkert

Wilhelm Gruber 44


5.3.2. pneumatischer Schaltplan

Abbildung 5.2.: PneumatikplanWilhelm Gruber 45


5.4. Elektroinstallation

5.4.1. Belegung der Ein- und Ausgänge der Elektronikbox

Für den Anschluss der Sonden, Schlauchpumpen und Stellventile stehen 8 binäreEingänge mit einer Eingangsspannung von 24 V, 8 analoge Eingangsspannungenvon 0 - 10 V, 6 binäre Ausgänge mit 24 V und 2 analoge Ausgänge von 0 - 10 Vzur Verfügung.

Die Anschlüsse wurden folgendermaßen belegt:

binärer Belegung analoger BelegungEingang Eingang

1 Antischaum 1 Drehzahl2 - 2 Temperatursonde3 - 3 pH-Sonde4 - 4 pO2-Elektrode5 - 5 Sonde für O.D. (Optische Dichte)6 - 6 -7 - 7 -8 - 8 -

binärer Belegung analoger BelegungAusgang Ausgang

1 Pumpe - Säure 1 Temperaturregelung2 Pumpe - Lauge 2 Drehzahl3 Pumpe - Antischaum4 Wegeventil Luft5 Wegeventil Sauerstoff6 Wegeventil Stickstoff /CO2

Tabelle 5.2.: Anschlussbelegung der Elektronikbox

Wilhelm Gruber 46


5.4.2. Elektroschaltplan der Magnetventile und

Schlauchpumpen

Abbildung 5.3.: Elektroschaltplan

Wilhelm Gruber 47


5.4.3. Anschluss der Antischaumsonde

Abbildung 5.4.: Beschaltung Antischaum-Sonde über Niveau-Wächter

Wilhelm Gruber 48


5.4.4. Anschlussbelegung des pH-Transmitters

Abbildung 5.5.: Anschluss des pH-Transmitters

Wilhelm Gruber 49


5.4.5. Anschlussbelegung des pO2-Transmitters

Abbildung 5.6.: Anschluss des pO2-Transmitters

Wilhelm Gruber 50


5.4.6. Temperaturanschluss

Abbildung 5.7.: Anschluss Temperatursteuerung mit Elektronikbox

5.4.7. Drehzahlanschluss

Abbildung 5.8.: Anschluss Drehzahlsteuerung mit Elektronikbox

5.4.8. Pin-Belegung des Verbindungssteckers

Abbildung 5.9.: Pin-Belegung Verbindungsstecker zwischen Elektronikbox undDrehzahl- bzw. Temperatursteuerung

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Pin Anschluss1 Istwert (4-20mA)2 Ground3 Sollwert (4-20mA)4 -5 -

Tabelle 5.3.: Steckerbelegung

5.4.9. Definieren der Analogsignale

Die Elektronikbox kann analoge Eingangssignale von 0-10 V verarbeiten. Da alleSensoren einen Strom von max. 20 mA liefern, müssen diese Ströme über einen 500Ω-Widerstand in eine Spannung von max. 10 V umgewandelt werden. Bis auf denpH-Transmitter, der im pH-Bereich von 0-14 einen linearen Strom von 0-20 mAliefert, erzeugt der Drehzahlgeber, die Temperatursonde und der pO2-Transmittereinen Strom von 4-20 mA. Der Bereich 4-20 mA wurde bei letzteren Signalengewählt, da im Falle einer Funktionsstörung, die Fehlersuche erleichtert wird.

Bereichsumrechnung 0-10 VSensor Strombereich Untergrenze ObergrenzeDrehzahlsignal 4-20 mA -172 Upm 696 UpmTemperatursignal 4-20 mA -37,348 °C 150,255 °CpH-Transmitter 0-20 mA -0,1 14,215pO2-Transmitter 4-20 mA -124,470 % 500,46 %

Tabelle 5.4.: Bereichseinstellungen der analogen Sensorsignale

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konstruktion und aufbau eines bioreaktors sowie die ... · diese diplomarbeit entstand im...

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