kiểm nghiệm l.monocytogenes

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG

GVHD: Th.S Bùi Anh VõLớp: 10060301, 08SH1DTp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 3 năm 2013

SV thực hiện:1) Nguyễn Triết Lãm - MSSV: 610032122) Bùi Văn Thành – MSSV: 080569H

1. Giới thiệu về Listeria Monocytogenes

Listeria monocytogenes

Giới: Bacteria

Ngành: Fimicutes

Lớp: Bacili

Bộ: Bacilales

Họ: Listeriacae

Chi: Listeria

1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes

L.Monocytogenes nìn dưới kình kiển vi

Hình thái• Hình gậy ngắn, mảnh, gram dương, kị khí tùy ý.

Các thử nghiệm• Co thử nghiệm catalase (+),oxidase (-) sau 20 giờ nuôi cấy.• Có khả năng phân giải esculin và làm tan huyết trên môi trường thạch máu,

sinh acid từ rhamnose nhưng không phản ứng với xylose.• Có phản ứng CAMP (+) với Staphylococus. aureus và (-) với Rhodococus.

Equi.

Tính độc• Gây bệnh Listoriosis với 20%-30% ca tử vong• L. monocytogenes sống rất dai và có thể phát triển ở 3 đến 450C


Nguồn chứa vi khuẩn L. monocytogenes


- Sẩy thai

- Thai chết lưu

- Viêm não

- Nhiễm trùng huyết

Gây các bệnh

-Thường không phát bệnh, mà ủ bệnh rất lâu

-Thời gian ủ bệnh tung bình từ 3 tuần – 2 tháng.

-Việc chuẩn đoán bệnh rất khó

- Gây ra nhiều biếng chứng sau bệnh

Khi bị nhiễm

2. Khả năng nguy hiểm của Listeria monocytogenes

Triệu chúng khi nhiễm

• Cảm thấy mệt mỏi, đau nhức như bị cảm cúm

• Sốt nhẹ, nhức đầu, nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy và đôi khi bị chóng mặt.

Ở trẻ sơ sinh• Bệnh rất nguy hiểm và có thể có

tử số lên đến 30%

Sản phụ • Có thể bị xảo thai hoặc đẻ ra

thai chết

Khả nang miễn nhiễm

• Ít thấy có hiện tượng miễn nhiễm sau khi khỏi bệnh nhưng bệnh nhân vẫn có thể thải vi khuẩn ra ngoài trong nhiều năm

2. Khả năng nguy hiểm củaListeria monocytogenes

Bệnh Listeriosis:

Nấu kỹ thực phẩm có nguồn gốc ĐV Rửa thật sạch rau, nếu quả thì gọt bỏ vỏ

Thực phẩm phải nấu chin, nếu hâm lại phải ít nhất 10 phút Tạo thói quen rửa tay sạch trước khi chế biến thức ăn

Không dung sữa tươi chưa qua khâu khử trùng Tránh dùng thịt cá rã dông nhều lần

2. Khả năng nguy hiểm của Listeria monocytogenesBiện pháp phòng tránh:

Phát hiện L. monocytogenes dựa trên phản ứng đặc hiệu với L. monocytogenes

Phân tích L. monocytogenes với mồi LM-F76 và LM-R543 đặc hiệu với gen listeriolysin O (hlyA) được thiết kế thử nghiệm đặc hiệu với L. monocytogenes

Mồi được phát triển cho từng loại sản phẩm thực phẩm, cho phép phân tích một lượng mẫu lớn với độ chính xác cao

3. Định tính Listeria Monocytogenes1. Phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẫm thịt, sữa.

Mẫu thu

nhận

Tách lấy dịch

Nuôi cấy mẫu

Lấy mẫu sinh vật sau nuôi

cấy

Chạy PCR

3. Định tính Listeria Monocytogenes1.2 Quy trình phân tích:

Đoạn mồiDựa trên các trình tự gen hlyA của các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên ngân hàng gen

Hai cặp mồi là LM-F76 và LM-R543

Mồi được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp

3. Định tính Listeria Monocytogenes1.2.1 Mồi cho phản ứng PCR

3. Định tính Listeria Monocytogenes1.2.2 Xác định tính đặc hiệu của mồi

Trình tự sản phẩm PCR theo phương pháp của Sanger được so sánh với trình tự các gen đích hlyA của các L. monocytogendduowcsau sau đó dufng kĩ thuật

BLAST. Tính đặc hiệu của mồi được khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn DNA của vi khuẩn L. monocytogenes và không

phải L.monocytogenes trong phản ứng PCR.

Khả nang băc cặp được xác định theo phương pháp Sanger

Bao bì, dụng cụ được khử trùng trong cồn 70 độ

Cân chính xác khoảng 25g mẫu trong điều kiện vô trùng

Cho vào túi chuyên dụng chứa 225ml môi trùng LBII

Đồng hóa mẫu trên thiết bị dập mẫu Stomacher 400

Phát hiện sự có mặt của L.monocytogenes theo từng qquy trình cho sữa hay thục phẩm

3. Định tính Listeria Monocytogenes1.2.3 Tiến hành- Phương pháp chuẩn bị mẫu

25g mẫu được trộn hay dập nát trong máy Stomacher 400

Tăng sinh trong thiết bị ổn định nhiệt ở 37 độ

Tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 20h-24h

3. Định tính Listeria Monocytogenes1.2.3 Tiến hành- Tăng sinh

DNA thu nhận từ L.monocytogenes đươc đem đi làm sạch trong chloroform hoặc xử lí nhiệt ở 100 độ C trong 10 phút để phá màng tế bào, giải phóng DNA

Ly tâm 10000 vòng trong 10 phút, thu dịch chứa DNA sau khi ly tâm

Tối ưu hoá điều kiện PCR về nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi (0,1 - 0,5 pmol/mồi) và nồng độ dNTPs (100 - 250 mM/mỗi loại).

3. Định tính Listeria Monocytogenes1.2.3 Tiến hành- Phản ứng PCR và xử lý kết quả

- Đánh giá kết quả: các mẫu xuất hiện các băng DNA tương ứng với vị trí 468bp trong các phản ứng PCR với cặp mồi là các mẫu bị nhiễm L. monocytogenes Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tinh sạch được thể hiện trong hình 1-giếng 2 cho thấy một băng DNA có kích thước nằm trong khoảng kích thước sản phẩm PCR thiết kế.

Hình 11.Thang DNA chuẩn2.Mẫu chuẩn dương tính3.Mẫu chuẩn âm tính

468 bp

400 bp

3. Định tính Listeria Monocytogenes

2. Quy trình phân tích L. monocytogenes theo truyền thống

2.1 Nguyên lý phương pháp

Sử dụng phương pháp cấy đếm Listeria monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ xác định Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh vật hoá học.


2.2 Dụng cụ, môi trường và thuốc thử 2.2.1 Môi trường, thuốc thử - Nước Pepton 0,1 %. - Thạch Oxford. - Thạch Tryptone soya có 0,6% cao men (yeast extract) -TSA-YE. - Canh thang Tryptone soya có 0,6% cao men (TSB-YE) - Thạch máu cừu. - Môi trường SIM. - Môi trường Clurk-Lubs. - Canh thang đường Manitol, Xylose, Rhamnose 5%, có chỉ thị màu Bromocresol và ống Durham. - Bộ thuốc nhuộm Gram. - Hydrogen Peroxide 3%


2.3 Tiến hành 2.3.1. Bước 1 : - Đánh dấu lên đĩa thạch nồng độ dung dịch mẫu thử. - Dùng pipet 1ml vô trùng hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch thử 10-1 , nhỏ lên bề mặt đĩa thạch chọn lọc đã đánh dấu nồng độ dung dịch mẫu thử tương ứng. - Dùng que cấy kim loại hoặc que cấy thuỷ tinh ria đều để dung dịch mẫu được phân bố khắp mặt thạch sao cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều - Ủ ở 370C/48giờ.


2.3.2. Bước 2: Đọc kết quả sơ bộ sau 48 giờ. - Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có đặc tính: Tròn đều, màu nâu đen hoặc xanh đen. Đường kính: 2-3 mm và môi trường xung quanh khuẩn lạc có màu đen với trung tâm khuẩn lạc lõm xuống. Đây là đặc điểm đặc trưng của giống Listeria.


Tính kết quả theo công thức (tài liệu TN Vi sinh) :

Trong đó: -A : Số tế bào vi khuẩn (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1ml mẫu; CFU/ml- N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp đã chọn. - V: Thể tích mẫu cấy trên môi trường đĩa. - n1 : Số đĩa đếm được ứng với độ pha loãng ban đầu.

- ni : Số đĩa đếm được ứng với độ pha loãng thứ i. - fi: Hệ số pha loãng tương ứng

VfnVfn

NA

ii

...... 11


2.3.3. Bước 3: Tăng sinh thuần chủng và xác định hình thể, tính chất bắt màu. 2.3.3.1. Tăng sinh thuần chủng: - Lấy khuẩn lạc điển hình từ thạch chọn lọc cấy vào môi trường TSA-YE và ủ ấm ở 370C / 24h thu được khuẩn lạc thuần nhất tròn, trong, bóng và hơi lồi. 2.3.3.2. Hình thể và tính chất bắt màu: Từ khuẩn lạc thuần nhất nhuộm Gram xem hình thể:

Nhuộm Gram sau 16 - 24h nuôi cấy thấy: Trực khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm Gram. Đường kính 0,4 - 0,5 mm và dài 0,5 - 2 mm.


- Soi tươi trên lam kính xem tính chất di động: + Lấy 1 khuẩn lạc mọc trên TSA-YE cấy vào môi trường canh thang TSB-YE. Để ở 25oC qua đêm. + Canh trùng được soi tươi trên lam kính thấy : Hình que ngắn, mảnh, di động kiểu xoay tròn nhẹ hoặc nhào lộn. Di động kiểu bơi không phải là giống Listeria.


2.3.4 Bước 4: Tính chất sinh vật hoá học: 2.3.4.1.Tính chất di động trên thạch SIM : - Lấy canh trùng từ TSB-YE cấy vào môi trường thạch SIM . - Ủ ấm : 2-7 ngày ở 25oC. Thấy di động tạo hình cái ô. 2.3.4.2.Tính chất lên men đường: Xylose, Rhamnose, Manitol. - Dùng canh thang có chỉ thị màu Bromocresol và có ống Durham để xác định tính chất lên men các loại đường. - Để các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở tủ ấm 35oC / 4 - 7 ngày. - Quan sát hàng ngày (24-48h) để xem sự thay đổi màu (kết quả (+) màu vàng ) và sinh hơi.


Tiêu chuẩn xác định Listeria monocytogenes trong thực phẩm:

Danh mục Giới hạn (LM)

Tình trạng GMP

Hành động cần thiết

Thực phẩm làm sẵn, là nguyên nhân liên kết với bệnh Listeriosis (như phó-mát, pa-tê gan, xà lách tr n hạn sử dụng >10ô ngày, sản phẩm thịt lợn).

> 0 cfu/50g n/ad Loại I: Thu về đối với việc bán lẻ.

Tất cả các loại thực phẩm làm sẵn khác hỗ trợ cho sự tăng trưởng của Listeria monocytogenestrong điều kiện làm lạnh và hạn sử dụng >10 ngày.

> 0 cfu/25g n/a Xem xét, báo cáo cộng đồng, theo dõi tại nhà máy.Loại II: Thu hồi sản phẩm.


Thực phẩm làm sẵn hỗ trợ cho sự tăng trưởng của Listeria monocytogenestrong điều kiện làm lạnh và hạn sử dụng ≤ 10 ngày và tất cả các loại thực phẩm khác không hỗ trợ cho sự tăng trưởng của Listeria monocytogenes.

<= 100 cfu/gc Đạt GMP. Xem xét, báo công cộng, theo dõi tại nhà máy.Cho phép bán

<= 100 cfu/gc Không đầy đủ hoặc không có GMP.

Xem xét thu hồi loại II

hoặc ngừng bán.

Loại II: Thu hồi hoặc ngừng bán.

>= 100 cfu/gc n/a


3. Tài liệ tham khảo[1]. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản giáo dục, 2007.[2]. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật hoc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 1978.[3].http://www.safefood.name.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=236:nh-tinh-vibrio-cholera-trong-thc-phm&catid=49:moi-trng-khac&Itemid=226.[5]. http://my.go.vn/b/viewpost.aspx?id=77326538&pid=108796.

http://www.safefood.name.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=236:nh-tinh-vibrio-cholera-trong-thc-phm&catid=49:moi-trng-khac&Itemid=226




http://my.go.vn/b/viewpost.aspx?id=77326538&pid=108796



Cảm ơn Thầy và các bạnđã theo dõi!!!

kiểm nghiệm l.monocytogenes

Documents