BỘ GIAacuteO DỤC VAgrave ĐAgraveO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NOcircNG LAcircM THAgraveNH PHỐ HỒ CHIacute MINH

BỘ MOcircN COcircNG NGHỆ SINH HỌC

KHOAacute LUẬN TỐT NGHIỆP

PHAacuteT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO

DỰA TREcircN ĐOẠN GEN NS5B

Ngagravenh học COcircNG NGHỆ SINH HỌC

Niecircn khoaacute 2003 ndash 2007

Sinh viecircn thực hiện NGOcirc THỊ THU NGAcircN

Thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

Thaacuteng 92007

BỘ GIAacuteO DỤC VAgrave ĐAgraveO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NOcircNG LAcircM THAgraveNH PHỐ HỒ CHIacute MINH

BỘ MOcircN COcircNG NGHỆ SINH HỌC

KHOAacute LUẬN TỐT NGHIỆP

PHAacuteT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO

DỰA TREcircN ĐOẠN GEN NS5B

Giaacuteo viecircn hƣớng dẫn

PGSTS TRẦN THỊ DAcircN

KS VƢƠNG HỒ VŨ

KS LƢƠNG QUYacute PHƢƠNG

Sinh viecircn thực hiện

NGOcirc THỊ THU NGAcircN

Thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

Thaacuteng 92007

iii

LỜI CẢM TẠ

Trước tiecircn con xin gởi ngagraven lời cảm ơn đến ba mẹ kiacutenh yecircu ba mẹ đatilde luocircn hy

sinh để dagravenh những gigrave tốt đẹp nhất cho con Con xin cảm ơn tất cả người thacircn đatilde

luocircn yecircu thương quan tacircm vagrave luocircn cổ vũ cho con học tập

Em xin chacircn thagravenh cảm ơn

Ban giaacutem hiệu trường Đại học Nocircng Lacircm thagravenh phố Hồ Chiacute Minh Ban chủ

nhiệm Bộ Mocircn Cocircng nghệ sinh học cugraveng tất cả quyacute thầy cocirc đatilde truyền đạt

những kiến thức quyacute baacuteu cho em trong suốt 4 năm học

Ban giaacutem đốc cugraveng tập thể caacuten bộ Trung tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm trường

Đại học Nocircng Lacircm thagravenh phố Hồ Chiacute Minh đatilde tạo điều kiện thuận lợi vagrave tận

tigravenh giuacutep đỡ em trong suốt thời gian thực tập

Em xin tracircn trọng biết ơn cocirc Trần Thị Dacircn vagrave thầy Nguyễn Ngọc Tuacircn đatilde hết

lograveng hướng dẫn vagrave tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quaacute trigravenh thực

hiện đề tagravei tốt nghiệp

Em xin chacircn thagravenh cảm ơn anh Vương Hồ Vũ anh Lương Quyacute Phương đatilde

luocircn chỉ dẫn tận tigravenh cho em trong suốt quaacute trigravenh thực tập

Em xin gởi lời cảm ơn đến

Thầy Phaacutet anh Uacutet chị Hưng chị Trang cugraveng với caacutec anh chị ở Trung tacircm

đatilde luocircn giuacutep đỡ động viecircn em trong những luacutec khoacute khăn

Caacutec bạn lớp CNSH K29 thacircn yecircu đatilde luocircn cugraveng tocirci chia xẻ cổ vũ vagrave giuacutep đỡ

nhau trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

iv

TOacuteM TẮT KHOacuteA LUẬN

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Đại học Nocircng Lacircm TP Hồ chiacute Minh thaacuteng 92007

ldquoPHAacuteT HIỆN VIRUS DTH DỰA TREcircN ĐOẠN GEN NS5Brdquo

Hướng dẫn khoa học

PGS TS Trần Thị Dacircn

KS Vương Hồ Vũ

KS Lương Quyacute Phương

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007 tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

Gen NS5B lagrave một trong những gen của bộ gen virus DTH ngagravey cagraveng được

sử dụng nhiều trong những nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di truyền virus

DTH Do đoacute việc phaacutet hiện virus DTH bằng phương phaacutep RT-PCR khuếch đại

đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vagraveo cocircng taacutec chuẩn đoaacuten bệnh vagrave coacute thể được sử

dụng để higravenh thagravenh dữ liệu di truyền đaacutenh dấu dịch tễ virus

Kết quả đạt được như sau

1 Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

2 Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

3 Mức tỉ số OD của ELISA lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR dương tiacutenh cao

4 Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

với nhau thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh

v

SUMMARY

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Department of Biotechnology Nong Lam University

HCMC September 2007 The title of thesis ldquoDETECTION OF CLASSICAL

SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENErdquo

Thesis were carried out from 010307 to 010807 at Biochemical Analysis

and Experimental Center Nong Lam University

One of the genes of CSFV genome is NS5B gene which is widely used for

research on CSFV isolation and genetic typing Therefore CSFV detecting based

on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease

diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic

sequence data to be used for epidemiological tracing of virus

Results obtained from the study

(1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample At

LiCl 25 M concentration we collected higher pure RNA precipitate

which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product

(2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with

Taq concentration decreased from 25 UI down 2 UI but RT-PCR

product quality was not different

(3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive RT-

PCR diagnostic

(4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive

RT-PCR diagnostic result

vi

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG

Bigravea i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Toacutem tắt khoacutea luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh saacutech caacutec chữ viết tắt viii

Danh saacutech caacutec bảng ix

Danh saacutech caacutec higravenh vagrave biểu đồ x

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1

11 Đặt vấn đề 1

12 Mục tiecircu vagrave yecircu cầu 2

121 Mục tiecircu 2

122 Yecircu cầu 2

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU 3

21 Bệnh DTH 3

22 Một số bệnh tiacutech đặc trưng của bệnh DTH 5

221 DTH điển higravenh 5

222 DTH khocircng điển higravenh 6

23 Cấu truacutec bộ gen virus DTH 6

24 Một số phương phaacutep chẩn đoaacuten trong phograveng thiacute nghiệm 9

25 Sơ lược caacutec nghiecircn cứu liecircn quan 15

Chƣơng 3 NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH 17

31 Thời gian vagrave địa điểm 17

311 Thời gian 17

vii

312 Địa điểm 17

32 Nội dung nghiecircn cứu 17

33 Vật liệu vagrave hoacutea chất 17

331 Vật liệu nghiecircn cứu 17

332 Hoacutea chất 17

34 Bố triacute thiacute nghiệm 19

35 Phương phaacutep tiến hagravenh 21

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm 21

352 Ly triacutech RNA tổng số 21

353 Phản ứng RT-PCR 24

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN 27

41 Kết tủa RNA ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau 27

42 Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng 28

43 So saacutenh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR 30

44 Mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech 32

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ 34

51 Kết luận 34

52 Đề nghị 34

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 35

Tagravei liệu tiếng Việt 35

Tagravei liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 38

viii

DANH SAacuteCH CHỮ VIẾT TẮT

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhoea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv cộng taacutec viecircn

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTH Dịch tả heo

EDTA Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 IFN regulatory factor 3

IFN Interferon

M-MLV Moloney murine leukemia virus

MOPS [N-morpholino] propanesulfonic acid

3rsquoNTR 3rsquo nontranslated

NSP Nonstructural protein

PBS Phosphate buffered saline

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase ndash polymerase chain reaction

SP Structural protein

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet

UI Unit

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

BỘ GIAacuteO DỤC VAgrave ĐAgraveO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NOcircNG LAcircM THAgraveNH PHỐ HỒ CHIacute MINH

BỘ MOcircN COcircNG NGHỆ SINH HỌC

KHOAacute LUẬN TỐT NGHIỆP

PHAacuteT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO

DỰA TREcircN ĐOẠN GEN NS5B

Giaacuteo viecircn hƣớng dẫn

PGSTS TRẦN THỊ DAcircN

KS VƢƠNG HỒ VŨ

KS LƢƠNG QUYacute PHƢƠNG

Sinh viecircn thực hiện

NGOcirc THỊ THU NGAcircN

Thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

Thaacuteng 92007

iii

LỜI CẢM TẠ

Trước tiecircn con xin gởi ngagraven lời cảm ơn đến ba mẹ kiacutenh yecircu ba mẹ đatilde luocircn hy

sinh để dagravenh những gigrave tốt đẹp nhất cho con Con xin cảm ơn tất cả người thacircn đatilde

luocircn yecircu thương quan tacircm vagrave luocircn cổ vũ cho con học tập

Em xin chacircn thagravenh cảm ơn

Ban giaacutem hiệu trường Đại học Nocircng Lacircm thagravenh phố Hồ Chiacute Minh Ban chủ

nhiệm Bộ Mocircn Cocircng nghệ sinh học cugraveng tất cả quyacute thầy cocirc đatilde truyền đạt

những kiến thức quyacute baacuteu cho em trong suốt 4 năm học

Ban giaacutem đốc cugraveng tập thể caacuten bộ Trung tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm trường

Đại học Nocircng Lacircm thagravenh phố Hồ Chiacute Minh đatilde tạo điều kiện thuận lợi vagrave tận

tigravenh giuacutep đỡ em trong suốt thời gian thực tập

Em xin tracircn trọng biết ơn cocirc Trần Thị Dacircn vagrave thầy Nguyễn Ngọc Tuacircn đatilde hết

lograveng hướng dẫn vagrave tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quaacute trigravenh thực

hiện đề tagravei tốt nghiệp

Em xin chacircn thagravenh cảm ơn anh Vương Hồ Vũ anh Lương Quyacute Phương đatilde

luocircn chỉ dẫn tận tigravenh cho em trong suốt quaacute trigravenh thực tập

Em xin gởi lời cảm ơn đến

Thầy Phaacutet anh Uacutet chị Hưng chị Trang cugraveng với caacutec anh chị ở Trung tacircm

đatilde luocircn giuacutep đỡ động viecircn em trong những luacutec khoacute khăn

Caacutec bạn lớp CNSH K29 thacircn yecircu đatilde luocircn cugraveng tocirci chia xẻ cổ vũ vagrave giuacutep đỡ

nhau trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

iv

TOacuteM TẮT KHOacuteA LUẬN

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Đại học Nocircng Lacircm TP Hồ chiacute Minh thaacuteng 92007

ldquoPHAacuteT HIỆN VIRUS DTH DỰA TREcircN ĐOẠN GEN NS5Brdquo

Hướng dẫn khoa học

PGS TS Trần Thị Dacircn

KS Vương Hồ Vũ

KS Lương Quyacute Phương

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007 tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

Gen NS5B lagrave một trong những gen của bộ gen virus DTH ngagravey cagraveng được

sử dụng nhiều trong những nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di truyền virus

DTH Do đoacute việc phaacutet hiện virus DTH bằng phương phaacutep RT-PCR khuếch đại

đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vagraveo cocircng taacutec chuẩn đoaacuten bệnh vagrave coacute thể được sử

dụng để higravenh thagravenh dữ liệu di truyền đaacutenh dấu dịch tễ virus

Kết quả đạt được như sau

1 Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

2 Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

3 Mức tỉ số OD của ELISA lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR dương tiacutenh cao

4 Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

với nhau thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh

v

SUMMARY

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Department of Biotechnology Nong Lam University

HCMC September 2007 The title of thesis ldquoDETECTION OF CLASSICAL

SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENErdquo

Thesis were carried out from 010307 to 010807 at Biochemical Analysis

and Experimental Center Nong Lam University

One of the genes of CSFV genome is NS5B gene which is widely used for

research on CSFV isolation and genetic typing Therefore CSFV detecting based

on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease

diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic

sequence data to be used for epidemiological tracing of virus

Results obtained from the study

(1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample At

LiCl 25 M concentration we collected higher pure RNA precipitate

which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product

(2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with

Taq concentration decreased from 25 UI down 2 UI but RT-PCR

product quality was not different

(3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive RT-

PCR diagnostic

(4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive

RT-PCR diagnostic result

vi

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG

Bigravea i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Toacutem tắt khoacutea luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh saacutech caacutec chữ viết tắt viii

Danh saacutech caacutec bảng ix

Danh saacutech caacutec higravenh vagrave biểu đồ x

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1

11 Đặt vấn đề 1

12 Mục tiecircu vagrave yecircu cầu 2

121 Mục tiecircu 2

122 Yecircu cầu 2

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU 3

21 Bệnh DTH 3

22 Một số bệnh tiacutech đặc trưng của bệnh DTH 5

221 DTH điển higravenh 5

222 DTH khocircng điển higravenh 6

23 Cấu truacutec bộ gen virus DTH 6

24 Một số phương phaacutep chẩn đoaacuten trong phograveng thiacute nghiệm 9

25 Sơ lược caacutec nghiecircn cứu liecircn quan 15

Chƣơng 3 NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH 17

31 Thời gian vagrave địa điểm 17

311 Thời gian 17

vii

312 Địa điểm 17

32 Nội dung nghiecircn cứu 17

33 Vật liệu vagrave hoacutea chất 17

331 Vật liệu nghiecircn cứu 17

332 Hoacutea chất 17

34 Bố triacute thiacute nghiệm 19

35 Phương phaacutep tiến hagravenh 21

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm 21

352 Ly triacutech RNA tổng số 21

353 Phản ứng RT-PCR 24

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN 27

41 Kết tủa RNA ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau 27

42 Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng 28

43 So saacutenh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR 30

44 Mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech 32

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ 34

51 Kết luận 34

52 Đề nghị 34

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 35

Tagravei liệu tiếng Việt 35

Tagravei liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 38

viii

DANH SAacuteCH CHỮ VIẾT TẮT

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhoea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv cộng taacutec viecircn

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTH Dịch tả heo

EDTA Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 IFN regulatory factor 3

IFN Interferon

M-MLV Moloney murine leukemia virus

MOPS [N-morpholino] propanesulfonic acid

3rsquoNTR 3rsquo nontranslated

NSP Nonstructural protein

PBS Phosphate buffered saline

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase ndash polymerase chain reaction

SP Structural protein

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet

UI Unit

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

iii

LỜI CẢM TẠ

Trước tiecircn con xin gởi ngagraven lời cảm ơn đến ba mẹ kiacutenh yecircu ba mẹ đatilde luocircn hy

sinh để dagravenh những gigrave tốt đẹp nhất cho con Con xin cảm ơn tất cả người thacircn đatilde

luocircn yecircu thương quan tacircm vagrave luocircn cổ vũ cho con học tập

Em xin chacircn thagravenh cảm ơn

Ban giaacutem hiệu trường Đại học Nocircng Lacircm thagravenh phố Hồ Chiacute Minh Ban chủ

nhiệm Bộ Mocircn Cocircng nghệ sinh học cugraveng tất cả quyacute thầy cocirc đatilde truyền đạt

những kiến thức quyacute baacuteu cho em trong suốt 4 năm học

Ban giaacutem đốc cugraveng tập thể caacuten bộ Trung tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm trường

Đại học Nocircng Lacircm thagravenh phố Hồ Chiacute Minh đatilde tạo điều kiện thuận lợi vagrave tận

tigravenh giuacutep đỡ em trong suốt thời gian thực tập

Em xin tracircn trọng biết ơn cocirc Trần Thị Dacircn vagrave thầy Nguyễn Ngọc Tuacircn đatilde hết

lograveng hướng dẫn vagrave tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quaacute trigravenh thực

hiện đề tagravei tốt nghiệp

Em xin chacircn thagravenh cảm ơn anh Vương Hồ Vũ anh Lương Quyacute Phương đatilde

luocircn chỉ dẫn tận tigravenh cho em trong suốt quaacute trigravenh thực tập

Em xin gởi lời cảm ơn đến

Thầy Phaacutet anh Uacutet chị Hưng chị Trang cugraveng với caacutec anh chị ở Trung tacircm

đatilde luocircn giuacutep đỡ động viecircn em trong những luacutec khoacute khăn

Caacutec bạn lớp CNSH K29 thacircn yecircu đatilde luocircn cugraveng tocirci chia xẻ cổ vũ vagrave giuacutep đỡ

nhau trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

iv

TOacuteM TẮT KHOacuteA LUẬN

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Đại học Nocircng Lacircm TP Hồ chiacute Minh thaacuteng 92007

ldquoPHAacuteT HIỆN VIRUS DTH DỰA TREcircN ĐOẠN GEN NS5Brdquo

Hướng dẫn khoa học

PGS TS Trần Thị Dacircn

KS Vương Hồ Vũ

KS Lương Quyacute Phương

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007 tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

Gen NS5B lagrave một trong những gen của bộ gen virus DTH ngagravey cagraveng được

sử dụng nhiều trong những nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di truyền virus

DTH Do đoacute việc phaacutet hiện virus DTH bằng phương phaacutep RT-PCR khuếch đại

đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vagraveo cocircng taacutec chuẩn đoaacuten bệnh vagrave coacute thể được sử

dụng để higravenh thagravenh dữ liệu di truyền đaacutenh dấu dịch tễ virus

Kết quả đạt được như sau

1 Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

2 Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

3 Mức tỉ số OD của ELISA lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR dương tiacutenh cao

4 Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

với nhau thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh

v

SUMMARY

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Department of Biotechnology Nong Lam University

HCMC September 2007 The title of thesis ldquoDETECTION OF CLASSICAL

SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENErdquo

Thesis were carried out from 010307 to 010807 at Biochemical Analysis

and Experimental Center Nong Lam University

One of the genes of CSFV genome is NS5B gene which is widely used for

research on CSFV isolation and genetic typing Therefore CSFV detecting based

on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease

diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic

sequence data to be used for epidemiological tracing of virus

Results obtained from the study

(1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample At

LiCl 25 M concentration we collected higher pure RNA precipitate

which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product

(2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with

Taq concentration decreased from 25 UI down 2 UI but RT-PCR

product quality was not different

(3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive RT-

PCR diagnostic

(4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive

RT-PCR diagnostic result

vi

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG

Bigravea i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Toacutem tắt khoacutea luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh saacutech caacutec chữ viết tắt viii

Danh saacutech caacutec bảng ix

Danh saacutech caacutec higravenh vagrave biểu đồ x

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1

11 Đặt vấn đề 1

12 Mục tiecircu vagrave yecircu cầu 2

121 Mục tiecircu 2

122 Yecircu cầu 2

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU 3

21 Bệnh DTH 3

22 Một số bệnh tiacutech đặc trưng của bệnh DTH 5

221 DTH điển higravenh 5

222 DTH khocircng điển higravenh 6

23 Cấu truacutec bộ gen virus DTH 6

24 Một số phương phaacutep chẩn đoaacuten trong phograveng thiacute nghiệm 9

25 Sơ lược caacutec nghiecircn cứu liecircn quan 15

Chƣơng 3 NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH 17

31 Thời gian vagrave địa điểm 17

311 Thời gian 17

vii

312 Địa điểm 17

32 Nội dung nghiecircn cứu 17

33 Vật liệu vagrave hoacutea chất 17

331 Vật liệu nghiecircn cứu 17

332 Hoacutea chất 17

34 Bố triacute thiacute nghiệm 19

35 Phương phaacutep tiến hagravenh 21

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm 21

352 Ly triacutech RNA tổng số 21

353 Phản ứng RT-PCR 24

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN 27

41 Kết tủa RNA ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau 27

42 Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng 28

43 So saacutenh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR 30

44 Mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech 32

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ 34

51 Kết luận 34

52 Đề nghị 34

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 35

Tagravei liệu tiếng Việt 35

Tagravei liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 38

viii

DANH SAacuteCH CHỮ VIẾT TẮT

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhoea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv cộng taacutec viecircn

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTH Dịch tả heo

EDTA Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 IFN regulatory factor 3

IFN Interferon

M-MLV Moloney murine leukemia virus

MOPS [N-morpholino] propanesulfonic acid

3rsquoNTR 3rsquo nontranslated

NSP Nonstructural protein

PBS Phosphate buffered saline

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase ndash polymerase chain reaction

SP Structural protein

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet

UI Unit

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

iv

TOacuteM TẮT KHOacuteA LUẬN

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Đại học Nocircng Lacircm TP Hồ chiacute Minh thaacuteng 92007

ldquoPHAacuteT HIỆN VIRUS DTH DỰA TREcircN ĐOẠN GEN NS5Brdquo

Hướng dẫn khoa học

PGS TS Trần Thị Dacircn

KS Vương Hồ Vũ

KS Lương Quyacute Phương

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007 tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

Gen NS5B lagrave một trong những gen của bộ gen virus DTH ngagravey cagraveng được

sử dụng nhiều trong những nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di truyền virus

DTH Do đoacute việc phaacutet hiện virus DTH bằng phương phaacutep RT-PCR khuếch đại

đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vagraveo cocircng taacutec chuẩn đoaacuten bệnh vagrave coacute thể được sử

dụng để higravenh thagravenh dữ liệu di truyền đaacutenh dấu dịch tễ virus

Kết quả đạt được như sau

1 Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

2 Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

3 Mức tỉ số OD của ELISA lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR dương tiacutenh cao

4 Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

với nhau thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh

v

SUMMARY

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Department of Biotechnology Nong Lam University

HCMC September 2007 The title of thesis ldquoDETECTION OF CLASSICAL

SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENErdquo

Thesis were carried out from 010307 to 010807 at Biochemical Analysis

and Experimental Center Nong Lam University

One of the genes of CSFV genome is NS5B gene which is widely used for

research on CSFV isolation and genetic typing Therefore CSFV detecting based

on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease

diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic

sequence data to be used for epidemiological tracing of virus

Results obtained from the study

(1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample At

LiCl 25 M concentration we collected higher pure RNA precipitate

which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product

(2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with

Taq concentration decreased from 25 UI down 2 UI but RT-PCR

product quality was not different

(3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive RT-

PCR diagnostic

(4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive

RT-PCR diagnostic result

vi

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG

Bigravea i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Toacutem tắt khoacutea luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh saacutech caacutec chữ viết tắt viii

Danh saacutech caacutec bảng ix

Danh saacutech caacutec higravenh vagrave biểu đồ x

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1

11 Đặt vấn đề 1

12 Mục tiecircu vagrave yecircu cầu 2

121 Mục tiecircu 2

122 Yecircu cầu 2

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU 3

21 Bệnh DTH 3

22 Một số bệnh tiacutech đặc trưng của bệnh DTH 5

221 DTH điển higravenh 5

222 DTH khocircng điển higravenh 6

23 Cấu truacutec bộ gen virus DTH 6

24 Một số phương phaacutep chẩn đoaacuten trong phograveng thiacute nghiệm 9

25 Sơ lược caacutec nghiecircn cứu liecircn quan 15

Chƣơng 3 NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH 17

31 Thời gian vagrave địa điểm 17

311 Thời gian 17

vii

312 Địa điểm 17

32 Nội dung nghiecircn cứu 17

33 Vật liệu vagrave hoacutea chất 17

331 Vật liệu nghiecircn cứu 17

332 Hoacutea chất 17

34 Bố triacute thiacute nghiệm 19

35 Phương phaacutep tiến hagravenh 21

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm 21

352 Ly triacutech RNA tổng số 21

353 Phản ứng RT-PCR 24

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN 27

41 Kết tủa RNA ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau 27

42 Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng 28

43 So saacutenh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR 30

44 Mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech 32

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ 34

51 Kết luận 34

52 Đề nghị 34

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 35

Tagravei liệu tiếng Việt 35

Tagravei liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 38

viii

DANH SAacuteCH CHỮ VIẾT TẮT

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhoea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv cộng taacutec viecircn

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTH Dịch tả heo

EDTA Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 IFN regulatory factor 3

IFN Interferon

M-MLV Moloney murine leukemia virus

MOPS [N-morpholino] propanesulfonic acid

3rsquoNTR 3rsquo nontranslated

NSP Nonstructural protein

PBS Phosphate buffered saline

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase ndash polymerase chain reaction

SP Structural protein

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet

UI Unit

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

v

SUMMARY

Ngocirc Thị Thu Ngacircn Department of Biotechnology Nong Lam University

HCMC September 2007 The title of thesis ldquoDETECTION OF CLASSICAL

SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENErdquo

Thesis were carried out from 010307 to 010807 at Biochemical Analysis

and Experimental Center Nong Lam University

One of the genes of CSFV genome is NS5B gene which is widely used for

research on CSFV isolation and genetic typing Therefore CSFV detecting based

on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease

diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic

sequence data to be used for epidemiological tracing of virus

Results obtained from the study

(1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample At

LiCl 25 M concentration we collected higher pure RNA precipitate

which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product

(2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with

Taq concentration decreased from 25 UI down 2 UI but RT-PCR

product quality was not different

(3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive RT-

PCR diagnostic

(4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive

RT-PCR diagnostic result

vi

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG

Bigravea i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Toacutem tắt khoacutea luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh saacutech caacutec chữ viết tắt viii

Danh saacutech caacutec bảng ix

Danh saacutech caacutec higravenh vagrave biểu đồ x

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1

11 Đặt vấn đề 1

12 Mục tiecircu vagrave yecircu cầu 2

121 Mục tiecircu 2

122 Yecircu cầu 2

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU 3

21 Bệnh DTH 3

22 Một số bệnh tiacutech đặc trưng của bệnh DTH 5

221 DTH điển higravenh 5

222 DTH khocircng điển higravenh 6

23 Cấu truacutec bộ gen virus DTH 6

24 Một số phương phaacutep chẩn đoaacuten trong phograveng thiacute nghiệm 9

25 Sơ lược caacutec nghiecircn cứu liecircn quan 15

Chƣơng 3 NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH 17

31 Thời gian vagrave địa điểm 17

311 Thời gian 17

vii

312 Địa điểm 17

32 Nội dung nghiecircn cứu 17

33 Vật liệu vagrave hoacutea chất 17

331 Vật liệu nghiecircn cứu 17

332 Hoacutea chất 17

34 Bố triacute thiacute nghiệm 19

35 Phương phaacutep tiến hagravenh 21

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm 21

352 Ly triacutech RNA tổng số 21

353 Phản ứng RT-PCR 24

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN 27

41 Kết tủa RNA ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau 27

42 Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng 28

43 So saacutenh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR 30

44 Mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech 32

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ 34

51 Kết luận 34

52 Đề nghị 34

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 35

Tagravei liệu tiếng Việt 35

Tagravei liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 38

viii

DANH SAacuteCH CHỮ VIẾT TẮT

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhoea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv cộng taacutec viecircn

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTH Dịch tả heo

EDTA Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 IFN regulatory factor 3

IFN Interferon

M-MLV Moloney murine leukemia virus

MOPS [N-morpholino] propanesulfonic acid

3rsquoNTR 3rsquo nontranslated

NSP Nonstructural protein

PBS Phosphate buffered saline

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase ndash polymerase chain reaction

SP Structural protein

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet

UI Unit

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

vi

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG

Bigravea i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Toacutem tắt khoacutea luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh saacutech caacutec chữ viết tắt viii

Danh saacutech caacutec bảng ix

Danh saacutech caacutec higravenh vagrave biểu đồ x

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1

11 Đặt vấn đề 1

12 Mục tiecircu vagrave yecircu cầu 2

121 Mục tiecircu 2

122 Yecircu cầu 2

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU 3

21 Bệnh DTH 3

22 Một số bệnh tiacutech đặc trưng của bệnh DTH 5

221 DTH điển higravenh 5

222 DTH khocircng điển higravenh 6

23 Cấu truacutec bộ gen virus DTH 6

24 Một số phương phaacutep chẩn đoaacuten trong phograveng thiacute nghiệm 9

25 Sơ lược caacutec nghiecircn cứu liecircn quan 15

Chƣơng 3 NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH 17

31 Thời gian vagrave địa điểm 17

311 Thời gian 17

vii

312 Địa điểm 17

32 Nội dung nghiecircn cứu 17

33 Vật liệu vagrave hoacutea chất 17

331 Vật liệu nghiecircn cứu 17

332 Hoacutea chất 17

34 Bố triacute thiacute nghiệm 19

35 Phương phaacutep tiến hagravenh 21

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm 21

352 Ly triacutech RNA tổng số 21

353 Phản ứng RT-PCR 24

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN 27

41 Kết tủa RNA ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau 27

42 Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng 28

43 So saacutenh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR 30

44 Mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech 32

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ 34

51 Kết luận 34

52 Đề nghị 34

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 35

Tagravei liệu tiếng Việt 35

Tagravei liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 38

viii

DANH SAacuteCH CHỮ VIẾT TẮT

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhoea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv cộng taacutec viecircn

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTH Dịch tả heo

EDTA Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 IFN regulatory factor 3

IFN Interferon

M-MLV Moloney murine leukemia virus

MOPS [N-morpholino] propanesulfonic acid

3rsquoNTR 3rsquo nontranslated

NSP Nonstructural protein

PBS Phosphate buffered saline

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase ndash polymerase chain reaction

SP Structural protein

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet

UI Unit

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

vii

312 Địa điểm 17

32 Nội dung nghiecircn cứu 17

33 Vật liệu vagrave hoacutea chất 17

331 Vật liệu nghiecircn cứu 17

332 Hoacutea chất 17

34 Bố triacute thiacute nghiệm 19

35 Phương phaacutep tiến hagravenh 21

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm 21

352 Ly triacutech RNA tổng số 21

353 Phản ứng RT-PCR 24

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN 27

41 Kết tủa RNA ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau 27

42 Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng 28

43 So saacutenh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR 30

44 Mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech 32

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ 34

51 Kết luận 34

52 Đề nghị 34

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 35

Tagravei liệu tiếng Việt 35

Tagravei liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 38

viii

DANH SAacuteCH CHỮ VIẾT TẮT

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhoea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv cộng taacutec viecircn

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTH Dịch tả heo

EDTA Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 IFN regulatory factor 3

IFN Interferon

M-MLV Moloney murine leukemia virus

MOPS [N-morpholino] propanesulfonic acid

3rsquoNTR 3rsquo nontranslated

NSP Nonstructural protein

PBS Phosphate buffered saline

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase ndash polymerase chain reaction

SP Structural protein

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet

UI Unit

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

viii

DANH SAacuteCH CHỮ VIẾT TẮT

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhoea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv cộng taacutec viecircn

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTH Dịch tả heo

EDTA Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 IFN regulatory factor 3

IFN Interferon

M-MLV Moloney murine leukemia virus

MOPS [N-morpholino] propanesulfonic acid

3rsquoNTR 3rsquo nontranslated

NSP Nonstructural protein

PBS Phosphate buffered saline

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase ndash polymerase chain reaction

SP Structural protein

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet

UI Unit

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

ix

DANH SAacuteCH CAacuteC BẢNG

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR 31

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dương tiacutenh vagrave acircm tiacutenh 32

x

DANH SAacuteCH CAacuteC HIgraveNH VAgrave BIỂU ĐỒ

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus 7

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR 12

Higravenh 4 1 Sản phẩm RT-PCR của mẫu kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl 28

Higravenh 4 2 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm 33

Biểu đồ 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lượng RNA ở caacutec nồng độ LiCl 27

1

Chương 1

MỞ ĐẦU

11 ĐẶT VẤN ĐỀ

Dịch tả heo (DTH) lagrave một trong những bệnh gacircy thiệt hại kinh tế lớn nhất

cho ngagravenh chăn nuocirci heo ở nước ta noacutei riecircng vagrave caacutec nước trecircn thế giới noacutei chung

Năm 1997 bệnh đatilde quay trở lại ngay trecircn caacutec nước thagravenh viecircn của Liecircn hiệp chacircu

Acircu magrave họ nghĩ bệnh đatilde được thanh toaacuten triệt để trước đoacute (Nguyễn Tiến Dũng

1999)

DTH lagrave bệnh rất dễ lacircy sự lacircy lan chủ yếu lagrave do sự tiếp xuacutec giữa những heo

sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh hoặc những nguyecircn nhacircn

khaacutechellipTaacutec nhacircn gacircy bệnh lagrave một virus thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus

nagravey coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn chung với virus gacircy bệnh tiecircu chảy ở bograve (BVDV- Bovine

viral diarrhoea virus) vagrave virus bệnh biecircn giới ở cừu (BDV- border disease virus)

Trong cocircng taacutec chẩn đoaacuten hay phograveng vagrave trị bệnh caacutec phương phaacutep truyền

thống dựa trecircn dịch tễ lacircm sagraveng hiện ngagravey cagraveng bộc lộ nhiều khiếm khuyết khocircng

thể khắc phục vagrave khocircng thể theo kịp tigravenh higravenh hiện nay nhất lagrave mầm bệnh cagraveng ngagravey

cagraveng khoacute kiểm soaacutet Mặt khaacutec sinh học phacircn tử tuy mới đặt nền moacuteng khoảng vagravei

thập kỷ nhưng đatilde coacute những bước phaacutet triển vượt bậc với nhiều thagravenh tựu to lớn đatilde

đang vagrave sẽ đoacuteng goacutep vagraveo mọi mặt của đời sống Trong thuacute y sinh học phacircn tử với

trọng tacircm lagrave cocircng nghệ di truyền đatilde được ứng dụng khaacute sớm trong chẩn đoaacuten

phograveng vagrave trị bệnh trecircn nhiều đối tượng gacircy bệnh trong đoacute coacute dịch tả - một trong 4

bệnh ldquođỏrdquo của ngagravenh chăn nuocirci Việt Nam

Để phacircn biệt chiacutenh xaacutec virus gacircy bệnh DTH với những virus cugraveng chi

Pestivirus như BVDV BDVhellip kĩ thuật RT-PCR trở necircn hữu iacutech dựa trecircn caacutec đoạn

gen như E2 (Wirz 1993 Harding 1994 Rugg Li 1996 Knepp 2003 Risatt 2002

2004 Pereda 2005) Paton vagrave cộng sự (2000) phacircn tiacutech ba đoạn gen (E2 5rsquoNTR

2

NS5B) trong việc phacircn biệt chủng virus DTH vagrave tổng kết sự phacircn biệt chủng virus

DTH ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả chacircu Aacute kết quả cho thấy mối quan hệ giữa caacutec

chủng ở một số nước

Trong những năm gần đacircy ở Việt Nam cũng coacute rất nhiều nghiecircn cứu về

virus DTH của caacutec taacutec giả như Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv (2003) Nguyễn Thị

Phương Duyecircn vagrave ctv (2001) Kim Văn Phuacutec vagrave ctv (2004) Nguyễn Thế Vinh vagrave

ctv (2004) Hồ Thu Hương vagrave ctv (2004)hellip tuy nhiecircn chưa coacute nghiecircn cứu xaacutec định

trigravenh tự nucleotide của nhiều đoạn gen khaacutec như NS5B 5rsquoNTR của những virus

phacircn lập được từ caacutec ổ dịch Gen NS5B lagrave một trong những gen của bộ gen virus

DTH được sử dụng nhiều trong những nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di

truyền virus Vigrave vậy việc thực hiện đề tagravei ldquoPhaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5Brdquo nhằm ứng dụng vagraveo cocircng taacutec chẩn đoaacuten bệnh vagrave tạo tiền đề cho những

nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di truyền virus DTH sau nagravey

12 MỤC TIEcircU VAgrave YEcircU CẦU

121 Mục tiecircu

Xaacutec định quy trigravenh RT-PCR phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen NS5B

122 Yecircu cầu

Xaacutec định triệu chứng vagrave bệnh tiacutech của heo bệnh thu nhận mẫu bệnh phẩm

Ly triacutech RNA tổng số

Chạy RT-PCR theo dẫn liệu của Paton vagrave cộng sự (2000) để nhacircn vugraveng gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả ELISA của mẫu bệnh phẩm

3

Chương 2

TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU

21 BỆNH DTH

211 Giới thiệu

DTH lagrave một bệnh quan trọng nằm trong danh saacutech loại A của OIE Những

bệnh thuộc trong danh saacutech A được định nghĩa như lagrave những bệnh truyền nhiễm coacute

khả năng lacircy lan rất nguy hiểm vagrave nhanh choacuteng bất chấp biecircn giới quốc gia trở

thagravenh hậu quả nghiecircm trọng đối với kinh tế xatilde hội vagrave sức khoẻ cộng đồng trở necircn

quan trọng chiacutenh trong việc kinh doanh thuacute vagrave những sản phẩm từ chuacuteng (OIE

2001)

Tigravenh higravenh nhiễm bệnh DTH trecircn thế giới

DTH được mocirc tả đầu tiecircn vagraveo năm 1833 ở Ohio ndash Hoa Kỳ Những năm sau

đoacute một bệnh trecircn heo ở Chacircu Acircu biết như lagrave chứng sốt trecircn heo giống y hệt như

bệnh mocirc tả ở Hoa Kỳ Cuối thế kỷ 19 DTH phacircn taacuten khắp nơi trecircn thế giới

Với sự gia tăng hiểu biết về nguyecircn nhacircn vagrave dịch tễ học bệnh DTH nhiều

quốc gia thagravenh cocircng trong việc tiệt trừ virus bằng caacutech đưa ra những biện phaacutep

tương đối đơn giản như luật vận chuyển thuacute vagrave sự ngăn cấm cho thuacute ăn thức ăn

chưa xử lyacute như Đan Mạch (1933) Phần Lan (1956) Uacutec (1963) Canada (1964)

Thụy Sỹ (1974) vagrave Mỹ (1977)

Năm 1997 đatilde in dấu đậm neacutet trong tacircm triacute caacutec nhagrave dịch tễ học virus học

những caacuten bộ thuacute y vagrave những người hoạt động trong ngagravenh chăn nuocirci heo bệnh

DTH một bệnh magrave Liecircn hiệp chacircu Acircu từng nghĩ lagrave đatilde được thanh toaacuten đatilde quay trở

lại ngay trecircn caacutec nước thagravenh viecircn của Liecircn hiệp (tiacutenh đến ngagravey 31121997 coacute 424 ổ

dịch tại Hagrave Lan) Năm nước khối EU (Đức Hagrave Lan Italia Tacircy Ban Nha vagrave Bỉ) trở

thagravenh nạn nhacircn của bệnh DTH với hơn 10 triệu heo phải giết bỏ

4

Năm 2000 dịch bệnh xảy ra ở Anh Năm 2001 dịch bệnh nổ ra ở Đức

Slovakia Vagraveo cuối năm 2003 dịch xuất hiện tại Nhật Albania vagrave Slovakia Hiện

nay bệnh đatilde được ghi nhận khắp thế giới Chacircu Acircu Trung Phi Mexico caacutec nuớc

Trung mỹ Ấn Độ Trung Quốc Đocircng Aacute vagrave Đocircng Nam Aacute Hagraven quốc Indonesia

Philippine Thaacutei Lan Việt Nam

Tigravenh higravenh bệnh DTH tại Việt Nam

Tại Việt Nam bệnh DTH được Houdemer phaacutet hiện đầu tiecircn vagraveo năm 1923-

1924 Từ đoacute bệnh trở thagravenh mối đe doạ nghiecircm trọng đối với ngagravenh chăn nuocirci heo

nước ta

Năm 1949-1950 dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang caacutec tỉnh Phuacute

Yecircn Yecircn Baacutei Thaacutei Nguyecircn Hagrave Nội vagrave Hải Phograveng Năm 1968-1969 dịch phaacutet ra

hơn 20 tỉnh miền Bắc theo thống kecirc coacute 481 ổ dịch nổ ra

Theo baacuteo caacuteo của Cục thuacute y (1986) tại caacutec tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường

bị bội nhiễm với bệnh phoacute thuơng hagraven An Giang Long An (1984) Tiền Giang vagrave

Hậu Giang (1985) Năm 1985 tại Đồng Nai vagrave TP Hồ Chiacute Minh xuất hiện DTH

bội nhiễm với bệnh tụ huyết trugraveng

Năm 2000 coacute 18106 trường hợp bệnh DTH được baacuteo caacuteo tại Việt Nam

Hiện nay bệnh DTH vẫn cograven tồn tại ở caacutec dạng bệnh khocircng điển higravenh gacircy

trở ngại cho việc chuẩn đoaacuten

212 Dạng bệnh

DTH lagrave một bệnh truyền nhiễm riecircng của heo Nguyecircn nhacircn gacircy ra bởi virus

thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute quan hệ mật thiết với virus gacircy

bệnh tiecircu chảy ở bograve (bovine viral diarrhoea-BVD) vagrave virus gacircy bệnh biecircn giới ở cừu

(Boder disease-BD)

Bệnh DTH coacute thể xuất hiện ở nhiều dạng khaacutec nhau Tuy nhiecircn người ta

chia bệnh DTH ra lagravem 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng 1999)

5

Dạng siecircu cấp tiacutenh xuất hiện đột ngột khocircng coacute triệu chứng ban đầu sốt

cao kết hợp với trạng thaacutei thương hagraven Heo bệnh tử vong trong vograveng 24 đến 48 giờ

chưa kịp xuất hiện triệu chứng trecircn da necircn gọi lagrave DTH trắng

Dạng cấp tiacutenh gacircy sốt cao từ 41 - 420C heo bệnh biểu hiện mệt điển higravenh

như heo con nằm chất đống Sau 24 - 48 giờ mắt sưng huacutep vagrave viecircm kết mạc với caacutec

triệu chứng ngoagravei da (như vết chagravem tiacutem xuất huyết tụ huyết magraveu đỏ tại caacutec vugraveng da

mỏng tai chacircn bụng bao dương vậthellip) viecircm dạ dagravey ruột (tiecircu chảy nocircn mửahellip)

triệu chứng hocirc hấp (ho tụ huyết phổi) vagrave coacute thể xuất hiện triệu chứng thần kinh

(loạng choạng liệt liệt nhẹ caacutec chi sauhellip) tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngagravey

sau khi phaacutet bệnh

Dạng aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh diễn ra trong 3 giai đoạn

Giai đoạn đầu keacuteo dagravei 10 - 15 ngagravey toagraven bộ đagraven heo phaacutet bệnh caacutec

triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tiacutenh nhưng ở mức độ nhẹ

Giai đoạn hai lagrave giai đoạn thuyecircn giảm

Giai đoạn ba xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phaacutet bệnh toagraven thacircn với

caacutec triệu chứng cục bộ về hocirc hấp hoặc tiecircu hoaacute hoặc cả hai (viecircm phổi vagrave ruột thocircng

thường do Salmonella) Heo bệnh gầy mograven vagrave tử vong trong vograveng 1 đến 3 thaacuteng

Dạng khocircng điển higravenh biểu hiện dưới caacutec dạng rất khaacutec nhau như rối loạn

sinh sản hoặc bệnh lyacute sinh sản (sảy thai thai chết thai gỗ dị dạng gacircy run rẩy bẩm

sinh rối loạn vận động chết yểuhellip) chậm lớn chết rải raacutec Dưới dạng nagravey virus

DTH coacute thể lưu hagravenh một caacutech khocircng rotilde ragraveng nhất lagrave heo sinh sản với caacutec trường

hợp lacircm sagraveng lẻ tẻ nổ ra khi coacute caacutec điều kiện thuận lợi (như stress chuyecircn chởhellip)

22 MỘT SỐ BỆNH TIacuteCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH

221 DTH điển higravenh (cấp tiacutenh aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh)

Biểu hiện bệnh tiacutech sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ

biến đổi huyết học

6

Trecircn da xuất huyết lấm chấm hoặc từng đaacutem chagravem xanh nhất lagrave da tứ chi

(tai chacircn) xuất huyết vugraveng bụng vagrave bao quy đầu ở heo đực

Hạch bạch huyết dải hạch vugraveng xương chậu vagrave hạch ruột sưng to magraveu đaacute

hoa văn tụ huyết hoặc xuất huyết vugraveng vỏ hoặc toagraven bộ

Thận khocircng sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột magraveng bao thận

(thận trứng gagrave tacircy)

Laacutech khocircng sưng nhồi huyết becircn rigravea laacutech

Bagraveng quang niecircm mạc xuất huyết lấm chấm

Amiđan sưng to vagrave xuất huyết

Tim xuất huyết cơ tim vagrave trecircn vagravenh tim

Hệ hocirc hấp tụ huyết xuất huyết phổi tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm

Hệ tiecircu hoaacute tụ huyết vagrave xuất huyết

Giảm bạch cầu

222 DTH khocircng điển higravenh

Bệnh tiacutech thay đổi khocircng đặc hiệu xuất huyết viecircm dị dạng

Da xuất huyết

Caacutec hạch lacircm ba viecircm hạch lacircm ba coacute thể coacute xuất huyết lấm chấm

Trecircn natildeo xuất huyết

23 CẤU TROumlC BỘ GEN VIRUS DTH

Virus DTH thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute chung tiacutenh

khaacuteng nguyecircn với virus bệnh tiecircu chảy ở bograve vagrave bệnh biecircn giới ở cừu Virus DTH lagrave

một loại virus RNA chuỗi đơn dương coacute vỏ bọc đường kiacutenh 40 - 50 nm RNA virus

matilde hoaacute 4 protein cấu truacutec vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec Chỉ coacute một tyacutep huyết thanh

xaacutec định So với virus gacircy bệnh biecircn giới những dograveng virus DTH higravenh thagravenh một

nhoacutem khaacuteng nguyecircn đồng dạng coacute quan hệ với nhau nhưng coacute một vagravei thay đổi tồn

tại giữa những dograveng phacircn lập Những phản ứng cheacuteo huyết thanh với virus BVD vagrave

BD coacute thể xảy ra vagrave gacircy trở ngại trong chẩn đoaacuten huyết thanh

7

Bộ gen virus coacute chuỗi đơn RNA dagravei 123 kb Bộ gen đatilde được biết trigravenh tự

gen hoagraven toagraven chứa một khung đọc mở nằm ở becircn sườn của 5rsquo-UTR vagrave 3rsquo-UTR matilde

hoaacute một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein nagravey được cắt bởi

protease được matilde hoaacute bởi virus vagrave tế bagraveo vật chủ để tạo necircn protein trưởng thagravenh

của virus gồm 4 protein cấu truacutec (C Erns

E1 vagrave E2) p7 vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec

(Npro

NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B) Trigravenh tự của sản phẩm gen dọc

theo khung đọc mở lagrave

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus (Brett D L 2007)

Một polyprotein lớn được dịch matilde từ RNA của virus sẽ được xử lyacute thagravenh

những protein virus riecircng biệt Protein đầu tiecircn matilde hoaacute lagrave Npro

một protein khocircng

cấu truacutec coacute nhiệm vụ phacircn cắt vị triacute Npro

C Peptidase kyacute chủ phacircn cắt những vị triacute

CErns

E1E2 E2p7 vagrave p7NS2 với sự phacircn cắt khocircng hoagraven toagraven ở vị triacute E2p7

NS2-3 được phacircn cắt bởi autoprotease NS2 Sự phacircn cắt của polyprotein higravenh thagravenh

NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B được thuỷ phacircn bởi enzyme protease serine NS3-4A

Npro

lagrave autoprotease khocircng cấu truacutec coacute hoạt tiacutenh thuỷ phacircn protein Npro

khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep virus Npro

cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro

-C-Erns

-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

1

Chương 1

MỞ ĐẦU

11 ĐẶT VẤN ĐỀ

Dịch tả heo (DTH) lagrave một trong những bệnh gacircy thiệt hại kinh tế lớn nhất

cho ngagravenh chăn nuocirci heo ở nước ta noacutei riecircng vagrave caacutec nước trecircn thế giới noacutei chung

Năm 1997 bệnh đatilde quay trở lại ngay trecircn caacutec nước thagravenh viecircn của Liecircn hiệp chacircu

Acircu magrave họ nghĩ bệnh đatilde được thanh toaacuten triệt để trước đoacute (Nguyễn Tiến Dũng

1999)

DTH lagrave bệnh rất dễ lacircy sự lacircy lan chủ yếu lagrave do sự tiếp xuacutec giữa những heo

sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh hoặc những nguyecircn nhacircn

khaacutechellipTaacutec nhacircn gacircy bệnh lagrave một virus thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus

nagravey coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn chung với virus gacircy bệnh tiecircu chảy ở bograve (BVDV- Bovine

viral diarrhoea virus) vagrave virus bệnh biecircn giới ở cừu (BDV- border disease virus)

Trong cocircng taacutec chẩn đoaacuten hay phograveng vagrave trị bệnh caacutec phương phaacutep truyền

thống dựa trecircn dịch tễ lacircm sagraveng hiện ngagravey cagraveng bộc lộ nhiều khiếm khuyết khocircng

thể khắc phục vagrave khocircng thể theo kịp tigravenh higravenh hiện nay nhất lagrave mầm bệnh cagraveng ngagravey

cagraveng khoacute kiểm soaacutet Mặt khaacutec sinh học phacircn tử tuy mới đặt nền moacuteng khoảng vagravei

thập kỷ nhưng đatilde coacute những bước phaacutet triển vượt bậc với nhiều thagravenh tựu to lớn đatilde

đang vagrave sẽ đoacuteng goacutep vagraveo mọi mặt của đời sống Trong thuacute y sinh học phacircn tử với

trọng tacircm lagrave cocircng nghệ di truyền đatilde được ứng dụng khaacute sớm trong chẩn đoaacuten

phograveng vagrave trị bệnh trecircn nhiều đối tượng gacircy bệnh trong đoacute coacute dịch tả - một trong 4

bệnh ldquođỏrdquo của ngagravenh chăn nuocirci Việt Nam

Để phacircn biệt chiacutenh xaacutec virus gacircy bệnh DTH với những virus cugraveng chi

Pestivirus như BVDV BDVhellip kĩ thuật RT-PCR trở necircn hữu iacutech dựa trecircn caacutec đoạn

gen như E2 (Wirz 1993 Harding 1994 Rugg Li 1996 Knepp 2003 Risatt 2002

2004 Pereda 2005) Paton vagrave cộng sự (2000) phacircn tiacutech ba đoạn gen (E2 5rsquoNTR

2

NS5B) trong việc phacircn biệt chủng virus DTH vagrave tổng kết sự phacircn biệt chủng virus

DTH ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả chacircu Aacute kết quả cho thấy mối quan hệ giữa caacutec

chủng ở một số nước

Trong những năm gần đacircy ở Việt Nam cũng coacute rất nhiều nghiecircn cứu về

virus DTH của caacutec taacutec giả như Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv (2003) Nguyễn Thị

Phương Duyecircn vagrave ctv (2001) Kim Văn Phuacutec vagrave ctv (2004) Nguyễn Thế Vinh vagrave

ctv (2004) Hồ Thu Hương vagrave ctv (2004)hellip tuy nhiecircn chưa coacute nghiecircn cứu xaacutec định

trigravenh tự nucleotide của nhiều đoạn gen khaacutec như NS5B 5rsquoNTR của những virus

phacircn lập được từ caacutec ổ dịch Gen NS5B lagrave một trong những gen của bộ gen virus

DTH được sử dụng nhiều trong những nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di

truyền virus Vigrave vậy việc thực hiện đề tagravei ldquoPhaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5Brdquo nhằm ứng dụng vagraveo cocircng taacutec chẩn đoaacuten bệnh vagrave tạo tiền đề cho những

nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di truyền virus DTH sau nagravey

12 MỤC TIEcircU VAgrave YEcircU CẦU

121 Mục tiecircu

Xaacutec định quy trigravenh RT-PCR phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen NS5B

122 Yecircu cầu

Xaacutec định triệu chứng vagrave bệnh tiacutech của heo bệnh thu nhận mẫu bệnh phẩm

Ly triacutech RNA tổng số

Chạy RT-PCR theo dẫn liệu của Paton vagrave cộng sự (2000) để nhacircn vugraveng gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả ELISA của mẫu bệnh phẩm

3

Chương 2

TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU

21 BỆNH DTH

211 Giới thiệu

DTH lagrave một bệnh quan trọng nằm trong danh saacutech loại A của OIE Những

bệnh thuộc trong danh saacutech A được định nghĩa như lagrave những bệnh truyền nhiễm coacute

khả năng lacircy lan rất nguy hiểm vagrave nhanh choacuteng bất chấp biecircn giới quốc gia trở

thagravenh hậu quả nghiecircm trọng đối với kinh tế xatilde hội vagrave sức khoẻ cộng đồng trở necircn

quan trọng chiacutenh trong việc kinh doanh thuacute vagrave những sản phẩm từ chuacuteng (OIE

2001)

Tigravenh higravenh nhiễm bệnh DTH trecircn thế giới

DTH được mocirc tả đầu tiecircn vagraveo năm 1833 ở Ohio ndash Hoa Kỳ Những năm sau

đoacute một bệnh trecircn heo ở Chacircu Acircu biết như lagrave chứng sốt trecircn heo giống y hệt như

bệnh mocirc tả ở Hoa Kỳ Cuối thế kỷ 19 DTH phacircn taacuten khắp nơi trecircn thế giới

Với sự gia tăng hiểu biết về nguyecircn nhacircn vagrave dịch tễ học bệnh DTH nhiều

quốc gia thagravenh cocircng trong việc tiệt trừ virus bằng caacutech đưa ra những biện phaacutep

tương đối đơn giản như luật vận chuyển thuacute vagrave sự ngăn cấm cho thuacute ăn thức ăn

chưa xử lyacute như Đan Mạch (1933) Phần Lan (1956) Uacutec (1963) Canada (1964)

Thụy Sỹ (1974) vagrave Mỹ (1977)

Năm 1997 đatilde in dấu đậm neacutet trong tacircm triacute caacutec nhagrave dịch tễ học virus học

những caacuten bộ thuacute y vagrave những người hoạt động trong ngagravenh chăn nuocirci heo bệnh

DTH một bệnh magrave Liecircn hiệp chacircu Acircu từng nghĩ lagrave đatilde được thanh toaacuten đatilde quay trở

lại ngay trecircn caacutec nước thagravenh viecircn của Liecircn hiệp (tiacutenh đến ngagravey 31121997 coacute 424 ổ

dịch tại Hagrave Lan) Năm nước khối EU (Đức Hagrave Lan Italia Tacircy Ban Nha vagrave Bỉ) trở

thagravenh nạn nhacircn của bệnh DTH với hơn 10 triệu heo phải giết bỏ

4

Năm 2000 dịch bệnh xảy ra ở Anh Năm 2001 dịch bệnh nổ ra ở Đức

Slovakia Vagraveo cuối năm 2003 dịch xuất hiện tại Nhật Albania vagrave Slovakia Hiện

nay bệnh đatilde được ghi nhận khắp thế giới Chacircu Acircu Trung Phi Mexico caacutec nuớc

Trung mỹ Ấn Độ Trung Quốc Đocircng Aacute vagrave Đocircng Nam Aacute Hagraven quốc Indonesia

Philippine Thaacutei Lan Việt Nam

Tigravenh higravenh bệnh DTH tại Việt Nam

Tại Việt Nam bệnh DTH được Houdemer phaacutet hiện đầu tiecircn vagraveo năm 1923-

1924 Từ đoacute bệnh trở thagravenh mối đe doạ nghiecircm trọng đối với ngagravenh chăn nuocirci heo

nước ta

Năm 1949-1950 dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang caacutec tỉnh Phuacute

Yecircn Yecircn Baacutei Thaacutei Nguyecircn Hagrave Nội vagrave Hải Phograveng Năm 1968-1969 dịch phaacutet ra

hơn 20 tỉnh miền Bắc theo thống kecirc coacute 481 ổ dịch nổ ra

Theo baacuteo caacuteo của Cục thuacute y (1986) tại caacutec tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường

bị bội nhiễm với bệnh phoacute thuơng hagraven An Giang Long An (1984) Tiền Giang vagrave

Hậu Giang (1985) Năm 1985 tại Đồng Nai vagrave TP Hồ Chiacute Minh xuất hiện DTH

bội nhiễm với bệnh tụ huyết trugraveng

Năm 2000 coacute 18106 trường hợp bệnh DTH được baacuteo caacuteo tại Việt Nam

Hiện nay bệnh DTH vẫn cograven tồn tại ở caacutec dạng bệnh khocircng điển higravenh gacircy

trở ngại cho việc chuẩn đoaacuten

212 Dạng bệnh

DTH lagrave một bệnh truyền nhiễm riecircng của heo Nguyecircn nhacircn gacircy ra bởi virus

thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute quan hệ mật thiết với virus gacircy

bệnh tiecircu chảy ở bograve (bovine viral diarrhoea-BVD) vagrave virus gacircy bệnh biecircn giới ở cừu

(Boder disease-BD)

Bệnh DTH coacute thể xuất hiện ở nhiều dạng khaacutec nhau Tuy nhiecircn người ta

chia bệnh DTH ra lagravem 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng 1999)

5

Dạng siecircu cấp tiacutenh xuất hiện đột ngột khocircng coacute triệu chứng ban đầu sốt

cao kết hợp với trạng thaacutei thương hagraven Heo bệnh tử vong trong vograveng 24 đến 48 giờ

chưa kịp xuất hiện triệu chứng trecircn da necircn gọi lagrave DTH trắng

Dạng cấp tiacutenh gacircy sốt cao từ 41 - 420C heo bệnh biểu hiện mệt điển higravenh

như heo con nằm chất đống Sau 24 - 48 giờ mắt sưng huacutep vagrave viecircm kết mạc với caacutec

triệu chứng ngoagravei da (như vết chagravem tiacutem xuất huyết tụ huyết magraveu đỏ tại caacutec vugraveng da

mỏng tai chacircn bụng bao dương vậthellip) viecircm dạ dagravey ruột (tiecircu chảy nocircn mửahellip)

triệu chứng hocirc hấp (ho tụ huyết phổi) vagrave coacute thể xuất hiện triệu chứng thần kinh

(loạng choạng liệt liệt nhẹ caacutec chi sauhellip) tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngagravey

sau khi phaacutet bệnh

Dạng aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh diễn ra trong 3 giai đoạn

Giai đoạn đầu keacuteo dagravei 10 - 15 ngagravey toagraven bộ đagraven heo phaacutet bệnh caacutec

triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tiacutenh nhưng ở mức độ nhẹ

Giai đoạn hai lagrave giai đoạn thuyecircn giảm

Giai đoạn ba xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phaacutet bệnh toagraven thacircn với

caacutec triệu chứng cục bộ về hocirc hấp hoặc tiecircu hoaacute hoặc cả hai (viecircm phổi vagrave ruột thocircng

thường do Salmonella) Heo bệnh gầy mograven vagrave tử vong trong vograveng 1 đến 3 thaacuteng

Dạng khocircng điển higravenh biểu hiện dưới caacutec dạng rất khaacutec nhau như rối loạn

sinh sản hoặc bệnh lyacute sinh sản (sảy thai thai chết thai gỗ dị dạng gacircy run rẩy bẩm

sinh rối loạn vận động chết yểuhellip) chậm lớn chết rải raacutec Dưới dạng nagravey virus

DTH coacute thể lưu hagravenh một caacutech khocircng rotilde ragraveng nhất lagrave heo sinh sản với caacutec trường

hợp lacircm sagraveng lẻ tẻ nổ ra khi coacute caacutec điều kiện thuận lợi (như stress chuyecircn chởhellip)

22 MỘT SỐ BỆNH TIacuteCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH

221 DTH điển higravenh (cấp tiacutenh aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh)

Biểu hiện bệnh tiacutech sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ

biến đổi huyết học

6

Trecircn da xuất huyết lấm chấm hoặc từng đaacutem chagravem xanh nhất lagrave da tứ chi

(tai chacircn) xuất huyết vugraveng bụng vagrave bao quy đầu ở heo đực

Hạch bạch huyết dải hạch vugraveng xương chậu vagrave hạch ruột sưng to magraveu đaacute

hoa văn tụ huyết hoặc xuất huyết vugraveng vỏ hoặc toagraven bộ

Thận khocircng sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột magraveng bao thận

(thận trứng gagrave tacircy)

Laacutech khocircng sưng nhồi huyết becircn rigravea laacutech

Bagraveng quang niecircm mạc xuất huyết lấm chấm

Amiđan sưng to vagrave xuất huyết

Tim xuất huyết cơ tim vagrave trecircn vagravenh tim

Hệ hocirc hấp tụ huyết xuất huyết phổi tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm

Hệ tiecircu hoaacute tụ huyết vagrave xuất huyết

Giảm bạch cầu

222 DTH khocircng điển higravenh

Bệnh tiacutech thay đổi khocircng đặc hiệu xuất huyết viecircm dị dạng

Da xuất huyết

Caacutec hạch lacircm ba viecircm hạch lacircm ba coacute thể coacute xuất huyết lấm chấm

Trecircn natildeo xuất huyết

23 CẤU TROumlC BỘ GEN VIRUS DTH

Virus DTH thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute chung tiacutenh

khaacuteng nguyecircn với virus bệnh tiecircu chảy ở bograve vagrave bệnh biecircn giới ở cừu Virus DTH lagrave

một loại virus RNA chuỗi đơn dương coacute vỏ bọc đường kiacutenh 40 - 50 nm RNA virus

matilde hoaacute 4 protein cấu truacutec vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec Chỉ coacute một tyacutep huyết thanh

xaacutec định So với virus gacircy bệnh biecircn giới những dograveng virus DTH higravenh thagravenh một

nhoacutem khaacuteng nguyecircn đồng dạng coacute quan hệ với nhau nhưng coacute một vagravei thay đổi tồn

tại giữa những dograveng phacircn lập Những phản ứng cheacuteo huyết thanh với virus BVD vagrave

BD coacute thể xảy ra vagrave gacircy trở ngại trong chẩn đoaacuten huyết thanh

7

Bộ gen virus coacute chuỗi đơn RNA dagravei 123 kb Bộ gen đatilde được biết trigravenh tự

gen hoagraven toagraven chứa một khung đọc mở nằm ở becircn sườn của 5rsquo-UTR vagrave 3rsquo-UTR matilde

hoaacute một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein nagravey được cắt bởi

protease được matilde hoaacute bởi virus vagrave tế bagraveo vật chủ để tạo necircn protein trưởng thagravenh

của virus gồm 4 protein cấu truacutec (C Erns

E1 vagrave E2) p7 vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec

(Npro

NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B) Trigravenh tự của sản phẩm gen dọc

theo khung đọc mở lagrave

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus (Brett D L 2007)

Một polyprotein lớn được dịch matilde từ RNA của virus sẽ được xử lyacute thagravenh

những protein virus riecircng biệt Protein đầu tiecircn matilde hoaacute lagrave Npro

một protein khocircng

cấu truacutec coacute nhiệm vụ phacircn cắt vị triacute Npro

C Peptidase kyacute chủ phacircn cắt những vị triacute

CErns

E1E2 E2p7 vagrave p7NS2 với sự phacircn cắt khocircng hoagraven toagraven ở vị triacute E2p7

NS2-3 được phacircn cắt bởi autoprotease NS2 Sự phacircn cắt của polyprotein higravenh thagravenh

NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B được thuỷ phacircn bởi enzyme protease serine NS3-4A

Npro

lagrave autoprotease khocircng cấu truacutec coacute hoạt tiacutenh thuỷ phacircn protein Npro

khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep virus Npro

cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro

-C-Erns

-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

2

NS5B) trong việc phacircn biệt chủng virus DTH vagrave tổng kết sự phacircn biệt chủng virus

DTH ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả chacircu Aacute kết quả cho thấy mối quan hệ giữa caacutec

chủng ở một số nước

Trong những năm gần đacircy ở Việt Nam cũng coacute rất nhiều nghiecircn cứu về

virus DTH của caacutec taacutec giả như Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv (2003) Nguyễn Thị

Phương Duyecircn vagrave ctv (2001) Kim Văn Phuacutec vagrave ctv (2004) Nguyễn Thế Vinh vagrave

ctv (2004) Hồ Thu Hương vagrave ctv (2004)hellip tuy nhiecircn chưa coacute nghiecircn cứu xaacutec định

trigravenh tự nucleotide của nhiều đoạn gen khaacutec như NS5B 5rsquoNTR của những virus

phacircn lập được từ caacutec ổ dịch Gen NS5B lagrave một trong những gen của bộ gen virus

DTH được sử dụng nhiều trong những nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di

truyền virus Vigrave vậy việc thực hiện đề tagravei ldquoPhaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5Brdquo nhằm ứng dụng vagraveo cocircng taacutec chẩn đoaacuten bệnh vagrave tạo tiền đề cho những

nghiecircn cứu xaacutec định chủng phacircn loại di truyền virus DTH sau nagravey

12 MỤC TIEcircU VAgrave YEcircU CẦU

121 Mục tiecircu

Xaacutec định quy trigravenh RT-PCR phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen NS5B

122 Yecircu cầu

Xaacutec định triệu chứng vagrave bệnh tiacutech của heo bệnh thu nhận mẫu bệnh phẩm

Ly triacutech RNA tổng số

Chạy RT-PCR theo dẫn liệu của Paton vagrave cộng sự (2000) để nhacircn vugraveng gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả ELISA của mẫu bệnh phẩm

3

Chương 2

TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU

21 BỆNH DTH

211 Giới thiệu

DTH lagrave một bệnh quan trọng nằm trong danh saacutech loại A của OIE Những

bệnh thuộc trong danh saacutech A được định nghĩa như lagrave những bệnh truyền nhiễm coacute

khả năng lacircy lan rất nguy hiểm vagrave nhanh choacuteng bất chấp biecircn giới quốc gia trở

thagravenh hậu quả nghiecircm trọng đối với kinh tế xatilde hội vagrave sức khoẻ cộng đồng trở necircn

quan trọng chiacutenh trong việc kinh doanh thuacute vagrave những sản phẩm từ chuacuteng (OIE

2001)

Tigravenh higravenh nhiễm bệnh DTH trecircn thế giới

DTH được mocirc tả đầu tiecircn vagraveo năm 1833 ở Ohio ndash Hoa Kỳ Những năm sau

đoacute một bệnh trecircn heo ở Chacircu Acircu biết như lagrave chứng sốt trecircn heo giống y hệt như

bệnh mocirc tả ở Hoa Kỳ Cuối thế kỷ 19 DTH phacircn taacuten khắp nơi trecircn thế giới

Với sự gia tăng hiểu biết về nguyecircn nhacircn vagrave dịch tễ học bệnh DTH nhiều

quốc gia thagravenh cocircng trong việc tiệt trừ virus bằng caacutech đưa ra những biện phaacutep

tương đối đơn giản như luật vận chuyển thuacute vagrave sự ngăn cấm cho thuacute ăn thức ăn

chưa xử lyacute như Đan Mạch (1933) Phần Lan (1956) Uacutec (1963) Canada (1964)

Thụy Sỹ (1974) vagrave Mỹ (1977)

Năm 1997 đatilde in dấu đậm neacutet trong tacircm triacute caacutec nhagrave dịch tễ học virus học

những caacuten bộ thuacute y vagrave những người hoạt động trong ngagravenh chăn nuocirci heo bệnh

DTH một bệnh magrave Liecircn hiệp chacircu Acircu từng nghĩ lagrave đatilde được thanh toaacuten đatilde quay trở

lại ngay trecircn caacutec nước thagravenh viecircn của Liecircn hiệp (tiacutenh đến ngagravey 31121997 coacute 424 ổ

dịch tại Hagrave Lan) Năm nước khối EU (Đức Hagrave Lan Italia Tacircy Ban Nha vagrave Bỉ) trở

thagravenh nạn nhacircn của bệnh DTH với hơn 10 triệu heo phải giết bỏ

4

Năm 2000 dịch bệnh xảy ra ở Anh Năm 2001 dịch bệnh nổ ra ở Đức

Slovakia Vagraveo cuối năm 2003 dịch xuất hiện tại Nhật Albania vagrave Slovakia Hiện

nay bệnh đatilde được ghi nhận khắp thế giới Chacircu Acircu Trung Phi Mexico caacutec nuớc

Trung mỹ Ấn Độ Trung Quốc Đocircng Aacute vagrave Đocircng Nam Aacute Hagraven quốc Indonesia

Philippine Thaacutei Lan Việt Nam

Tigravenh higravenh bệnh DTH tại Việt Nam

Tại Việt Nam bệnh DTH được Houdemer phaacutet hiện đầu tiecircn vagraveo năm 1923-

1924 Từ đoacute bệnh trở thagravenh mối đe doạ nghiecircm trọng đối với ngagravenh chăn nuocirci heo

nước ta

Năm 1949-1950 dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang caacutec tỉnh Phuacute

Yecircn Yecircn Baacutei Thaacutei Nguyecircn Hagrave Nội vagrave Hải Phograveng Năm 1968-1969 dịch phaacutet ra

hơn 20 tỉnh miền Bắc theo thống kecirc coacute 481 ổ dịch nổ ra

Theo baacuteo caacuteo của Cục thuacute y (1986) tại caacutec tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường

bị bội nhiễm với bệnh phoacute thuơng hagraven An Giang Long An (1984) Tiền Giang vagrave

Hậu Giang (1985) Năm 1985 tại Đồng Nai vagrave TP Hồ Chiacute Minh xuất hiện DTH

bội nhiễm với bệnh tụ huyết trugraveng

Năm 2000 coacute 18106 trường hợp bệnh DTH được baacuteo caacuteo tại Việt Nam

Hiện nay bệnh DTH vẫn cograven tồn tại ở caacutec dạng bệnh khocircng điển higravenh gacircy

trở ngại cho việc chuẩn đoaacuten

212 Dạng bệnh

DTH lagrave một bệnh truyền nhiễm riecircng của heo Nguyecircn nhacircn gacircy ra bởi virus

thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute quan hệ mật thiết với virus gacircy

bệnh tiecircu chảy ở bograve (bovine viral diarrhoea-BVD) vagrave virus gacircy bệnh biecircn giới ở cừu

(Boder disease-BD)

Bệnh DTH coacute thể xuất hiện ở nhiều dạng khaacutec nhau Tuy nhiecircn người ta

chia bệnh DTH ra lagravem 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng 1999)

5

Dạng siecircu cấp tiacutenh xuất hiện đột ngột khocircng coacute triệu chứng ban đầu sốt

cao kết hợp với trạng thaacutei thương hagraven Heo bệnh tử vong trong vograveng 24 đến 48 giờ

chưa kịp xuất hiện triệu chứng trecircn da necircn gọi lagrave DTH trắng

Dạng cấp tiacutenh gacircy sốt cao từ 41 - 420C heo bệnh biểu hiện mệt điển higravenh

như heo con nằm chất đống Sau 24 - 48 giờ mắt sưng huacutep vagrave viecircm kết mạc với caacutec

triệu chứng ngoagravei da (như vết chagravem tiacutem xuất huyết tụ huyết magraveu đỏ tại caacutec vugraveng da

mỏng tai chacircn bụng bao dương vậthellip) viecircm dạ dagravey ruột (tiecircu chảy nocircn mửahellip)

triệu chứng hocirc hấp (ho tụ huyết phổi) vagrave coacute thể xuất hiện triệu chứng thần kinh

(loạng choạng liệt liệt nhẹ caacutec chi sauhellip) tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngagravey

sau khi phaacutet bệnh

Dạng aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh diễn ra trong 3 giai đoạn

Giai đoạn đầu keacuteo dagravei 10 - 15 ngagravey toagraven bộ đagraven heo phaacutet bệnh caacutec

triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tiacutenh nhưng ở mức độ nhẹ

Giai đoạn hai lagrave giai đoạn thuyecircn giảm

Giai đoạn ba xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phaacutet bệnh toagraven thacircn với

caacutec triệu chứng cục bộ về hocirc hấp hoặc tiecircu hoaacute hoặc cả hai (viecircm phổi vagrave ruột thocircng

thường do Salmonella) Heo bệnh gầy mograven vagrave tử vong trong vograveng 1 đến 3 thaacuteng

Dạng khocircng điển higravenh biểu hiện dưới caacutec dạng rất khaacutec nhau như rối loạn

sinh sản hoặc bệnh lyacute sinh sản (sảy thai thai chết thai gỗ dị dạng gacircy run rẩy bẩm

sinh rối loạn vận động chết yểuhellip) chậm lớn chết rải raacutec Dưới dạng nagravey virus

DTH coacute thể lưu hagravenh một caacutech khocircng rotilde ragraveng nhất lagrave heo sinh sản với caacutec trường

hợp lacircm sagraveng lẻ tẻ nổ ra khi coacute caacutec điều kiện thuận lợi (như stress chuyecircn chởhellip)

22 MỘT SỐ BỆNH TIacuteCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH

221 DTH điển higravenh (cấp tiacutenh aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh)

Biểu hiện bệnh tiacutech sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ

biến đổi huyết học

6

Trecircn da xuất huyết lấm chấm hoặc từng đaacutem chagravem xanh nhất lagrave da tứ chi

(tai chacircn) xuất huyết vugraveng bụng vagrave bao quy đầu ở heo đực

Hạch bạch huyết dải hạch vugraveng xương chậu vagrave hạch ruột sưng to magraveu đaacute

hoa văn tụ huyết hoặc xuất huyết vugraveng vỏ hoặc toagraven bộ

Thận khocircng sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột magraveng bao thận

(thận trứng gagrave tacircy)

Laacutech khocircng sưng nhồi huyết becircn rigravea laacutech

Bagraveng quang niecircm mạc xuất huyết lấm chấm

Amiđan sưng to vagrave xuất huyết

Tim xuất huyết cơ tim vagrave trecircn vagravenh tim

Hệ hocirc hấp tụ huyết xuất huyết phổi tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm

Hệ tiecircu hoaacute tụ huyết vagrave xuất huyết

Giảm bạch cầu

222 DTH khocircng điển higravenh

Bệnh tiacutech thay đổi khocircng đặc hiệu xuất huyết viecircm dị dạng

Da xuất huyết

Caacutec hạch lacircm ba viecircm hạch lacircm ba coacute thể coacute xuất huyết lấm chấm

Trecircn natildeo xuất huyết

23 CẤU TROumlC BỘ GEN VIRUS DTH

Virus DTH thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute chung tiacutenh

khaacuteng nguyecircn với virus bệnh tiecircu chảy ở bograve vagrave bệnh biecircn giới ở cừu Virus DTH lagrave

một loại virus RNA chuỗi đơn dương coacute vỏ bọc đường kiacutenh 40 - 50 nm RNA virus

matilde hoaacute 4 protein cấu truacutec vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec Chỉ coacute một tyacutep huyết thanh

xaacutec định So với virus gacircy bệnh biecircn giới những dograveng virus DTH higravenh thagravenh một

nhoacutem khaacuteng nguyecircn đồng dạng coacute quan hệ với nhau nhưng coacute một vagravei thay đổi tồn

tại giữa những dograveng phacircn lập Những phản ứng cheacuteo huyết thanh với virus BVD vagrave

BD coacute thể xảy ra vagrave gacircy trở ngại trong chẩn đoaacuten huyết thanh

7

Bộ gen virus coacute chuỗi đơn RNA dagravei 123 kb Bộ gen đatilde được biết trigravenh tự

gen hoagraven toagraven chứa một khung đọc mở nằm ở becircn sườn của 5rsquo-UTR vagrave 3rsquo-UTR matilde

hoaacute một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein nagravey được cắt bởi

protease được matilde hoaacute bởi virus vagrave tế bagraveo vật chủ để tạo necircn protein trưởng thagravenh

của virus gồm 4 protein cấu truacutec (C Erns

E1 vagrave E2) p7 vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec

(Npro

NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B) Trigravenh tự của sản phẩm gen dọc

theo khung đọc mở lagrave

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus (Brett D L 2007)

Một polyprotein lớn được dịch matilde từ RNA của virus sẽ được xử lyacute thagravenh

những protein virus riecircng biệt Protein đầu tiecircn matilde hoaacute lagrave Npro

một protein khocircng

cấu truacutec coacute nhiệm vụ phacircn cắt vị triacute Npro

C Peptidase kyacute chủ phacircn cắt những vị triacute

CErns

E1E2 E2p7 vagrave p7NS2 với sự phacircn cắt khocircng hoagraven toagraven ở vị triacute E2p7

NS2-3 được phacircn cắt bởi autoprotease NS2 Sự phacircn cắt của polyprotein higravenh thagravenh

NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B được thuỷ phacircn bởi enzyme protease serine NS3-4A

Npro

lagrave autoprotease khocircng cấu truacutec coacute hoạt tiacutenh thuỷ phacircn protein Npro

khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep virus Npro

cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro

-C-Erns

-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

3

Chương 2

TỔNG QUAN TAgraveI LIỆU

21 BỆNH DTH

211 Giới thiệu

DTH lagrave một bệnh quan trọng nằm trong danh saacutech loại A của OIE Những

bệnh thuộc trong danh saacutech A được định nghĩa như lagrave những bệnh truyền nhiễm coacute

khả năng lacircy lan rất nguy hiểm vagrave nhanh choacuteng bất chấp biecircn giới quốc gia trở

thagravenh hậu quả nghiecircm trọng đối với kinh tế xatilde hội vagrave sức khoẻ cộng đồng trở necircn

quan trọng chiacutenh trong việc kinh doanh thuacute vagrave những sản phẩm từ chuacuteng (OIE

2001)

Tigravenh higravenh nhiễm bệnh DTH trecircn thế giới

DTH được mocirc tả đầu tiecircn vagraveo năm 1833 ở Ohio ndash Hoa Kỳ Những năm sau

đoacute một bệnh trecircn heo ở Chacircu Acircu biết như lagrave chứng sốt trecircn heo giống y hệt như

bệnh mocirc tả ở Hoa Kỳ Cuối thế kỷ 19 DTH phacircn taacuten khắp nơi trecircn thế giới

Với sự gia tăng hiểu biết về nguyecircn nhacircn vagrave dịch tễ học bệnh DTH nhiều

quốc gia thagravenh cocircng trong việc tiệt trừ virus bằng caacutech đưa ra những biện phaacutep

tương đối đơn giản như luật vận chuyển thuacute vagrave sự ngăn cấm cho thuacute ăn thức ăn

chưa xử lyacute như Đan Mạch (1933) Phần Lan (1956) Uacutec (1963) Canada (1964)

Thụy Sỹ (1974) vagrave Mỹ (1977)

Năm 1997 đatilde in dấu đậm neacutet trong tacircm triacute caacutec nhagrave dịch tễ học virus học

những caacuten bộ thuacute y vagrave những người hoạt động trong ngagravenh chăn nuocirci heo bệnh

DTH một bệnh magrave Liecircn hiệp chacircu Acircu từng nghĩ lagrave đatilde được thanh toaacuten đatilde quay trở

lại ngay trecircn caacutec nước thagravenh viecircn của Liecircn hiệp (tiacutenh đến ngagravey 31121997 coacute 424 ổ

dịch tại Hagrave Lan) Năm nước khối EU (Đức Hagrave Lan Italia Tacircy Ban Nha vagrave Bỉ) trở

thagravenh nạn nhacircn của bệnh DTH với hơn 10 triệu heo phải giết bỏ

4

Năm 2000 dịch bệnh xảy ra ở Anh Năm 2001 dịch bệnh nổ ra ở Đức

Slovakia Vagraveo cuối năm 2003 dịch xuất hiện tại Nhật Albania vagrave Slovakia Hiện

nay bệnh đatilde được ghi nhận khắp thế giới Chacircu Acircu Trung Phi Mexico caacutec nuớc

Trung mỹ Ấn Độ Trung Quốc Đocircng Aacute vagrave Đocircng Nam Aacute Hagraven quốc Indonesia

Philippine Thaacutei Lan Việt Nam

Tigravenh higravenh bệnh DTH tại Việt Nam

Tại Việt Nam bệnh DTH được Houdemer phaacutet hiện đầu tiecircn vagraveo năm 1923-

1924 Từ đoacute bệnh trở thagravenh mối đe doạ nghiecircm trọng đối với ngagravenh chăn nuocirci heo

nước ta

Năm 1949-1950 dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang caacutec tỉnh Phuacute

Yecircn Yecircn Baacutei Thaacutei Nguyecircn Hagrave Nội vagrave Hải Phograveng Năm 1968-1969 dịch phaacutet ra

hơn 20 tỉnh miền Bắc theo thống kecirc coacute 481 ổ dịch nổ ra

Theo baacuteo caacuteo của Cục thuacute y (1986) tại caacutec tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường

bị bội nhiễm với bệnh phoacute thuơng hagraven An Giang Long An (1984) Tiền Giang vagrave

Hậu Giang (1985) Năm 1985 tại Đồng Nai vagrave TP Hồ Chiacute Minh xuất hiện DTH

bội nhiễm với bệnh tụ huyết trugraveng

Năm 2000 coacute 18106 trường hợp bệnh DTH được baacuteo caacuteo tại Việt Nam

Hiện nay bệnh DTH vẫn cograven tồn tại ở caacutec dạng bệnh khocircng điển higravenh gacircy

trở ngại cho việc chuẩn đoaacuten

212 Dạng bệnh

DTH lagrave một bệnh truyền nhiễm riecircng của heo Nguyecircn nhacircn gacircy ra bởi virus

thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute quan hệ mật thiết với virus gacircy

bệnh tiecircu chảy ở bograve (bovine viral diarrhoea-BVD) vagrave virus gacircy bệnh biecircn giới ở cừu

(Boder disease-BD)

Bệnh DTH coacute thể xuất hiện ở nhiều dạng khaacutec nhau Tuy nhiecircn người ta

chia bệnh DTH ra lagravem 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng 1999)

5

Dạng siecircu cấp tiacutenh xuất hiện đột ngột khocircng coacute triệu chứng ban đầu sốt

cao kết hợp với trạng thaacutei thương hagraven Heo bệnh tử vong trong vograveng 24 đến 48 giờ

chưa kịp xuất hiện triệu chứng trecircn da necircn gọi lagrave DTH trắng

Dạng cấp tiacutenh gacircy sốt cao từ 41 - 420C heo bệnh biểu hiện mệt điển higravenh

như heo con nằm chất đống Sau 24 - 48 giờ mắt sưng huacutep vagrave viecircm kết mạc với caacutec

triệu chứng ngoagravei da (như vết chagravem tiacutem xuất huyết tụ huyết magraveu đỏ tại caacutec vugraveng da

mỏng tai chacircn bụng bao dương vậthellip) viecircm dạ dagravey ruột (tiecircu chảy nocircn mửahellip)

triệu chứng hocirc hấp (ho tụ huyết phổi) vagrave coacute thể xuất hiện triệu chứng thần kinh

(loạng choạng liệt liệt nhẹ caacutec chi sauhellip) tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngagravey

sau khi phaacutet bệnh

Dạng aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh diễn ra trong 3 giai đoạn

Giai đoạn đầu keacuteo dagravei 10 - 15 ngagravey toagraven bộ đagraven heo phaacutet bệnh caacutec

triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tiacutenh nhưng ở mức độ nhẹ

Giai đoạn hai lagrave giai đoạn thuyecircn giảm

Giai đoạn ba xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phaacutet bệnh toagraven thacircn với

caacutec triệu chứng cục bộ về hocirc hấp hoặc tiecircu hoaacute hoặc cả hai (viecircm phổi vagrave ruột thocircng

thường do Salmonella) Heo bệnh gầy mograven vagrave tử vong trong vograveng 1 đến 3 thaacuteng

Dạng khocircng điển higravenh biểu hiện dưới caacutec dạng rất khaacutec nhau như rối loạn

sinh sản hoặc bệnh lyacute sinh sản (sảy thai thai chết thai gỗ dị dạng gacircy run rẩy bẩm

sinh rối loạn vận động chết yểuhellip) chậm lớn chết rải raacutec Dưới dạng nagravey virus

DTH coacute thể lưu hagravenh một caacutech khocircng rotilde ragraveng nhất lagrave heo sinh sản với caacutec trường

hợp lacircm sagraveng lẻ tẻ nổ ra khi coacute caacutec điều kiện thuận lợi (như stress chuyecircn chởhellip)

22 MỘT SỐ BỆNH TIacuteCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH

221 DTH điển higravenh (cấp tiacutenh aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh)

Biểu hiện bệnh tiacutech sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ

biến đổi huyết học

6

Trecircn da xuất huyết lấm chấm hoặc từng đaacutem chagravem xanh nhất lagrave da tứ chi

(tai chacircn) xuất huyết vugraveng bụng vagrave bao quy đầu ở heo đực

Hạch bạch huyết dải hạch vugraveng xương chậu vagrave hạch ruột sưng to magraveu đaacute

hoa văn tụ huyết hoặc xuất huyết vugraveng vỏ hoặc toagraven bộ

Thận khocircng sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột magraveng bao thận

(thận trứng gagrave tacircy)

Laacutech khocircng sưng nhồi huyết becircn rigravea laacutech

Bagraveng quang niecircm mạc xuất huyết lấm chấm

Amiđan sưng to vagrave xuất huyết

Tim xuất huyết cơ tim vagrave trecircn vagravenh tim

Hệ hocirc hấp tụ huyết xuất huyết phổi tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm

Hệ tiecircu hoaacute tụ huyết vagrave xuất huyết

Giảm bạch cầu

222 DTH khocircng điển higravenh

Bệnh tiacutech thay đổi khocircng đặc hiệu xuất huyết viecircm dị dạng

Da xuất huyết

Caacutec hạch lacircm ba viecircm hạch lacircm ba coacute thể coacute xuất huyết lấm chấm

Trecircn natildeo xuất huyết

23 CẤU TROumlC BỘ GEN VIRUS DTH

Virus DTH thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute chung tiacutenh

khaacuteng nguyecircn với virus bệnh tiecircu chảy ở bograve vagrave bệnh biecircn giới ở cừu Virus DTH lagrave

một loại virus RNA chuỗi đơn dương coacute vỏ bọc đường kiacutenh 40 - 50 nm RNA virus

matilde hoaacute 4 protein cấu truacutec vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec Chỉ coacute một tyacutep huyết thanh

xaacutec định So với virus gacircy bệnh biecircn giới những dograveng virus DTH higravenh thagravenh một

nhoacutem khaacuteng nguyecircn đồng dạng coacute quan hệ với nhau nhưng coacute một vagravei thay đổi tồn

tại giữa những dograveng phacircn lập Những phản ứng cheacuteo huyết thanh với virus BVD vagrave

BD coacute thể xảy ra vagrave gacircy trở ngại trong chẩn đoaacuten huyết thanh

7

Bộ gen virus coacute chuỗi đơn RNA dagravei 123 kb Bộ gen đatilde được biết trigravenh tự

gen hoagraven toagraven chứa một khung đọc mở nằm ở becircn sườn của 5rsquo-UTR vagrave 3rsquo-UTR matilde

hoaacute một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein nagravey được cắt bởi

protease được matilde hoaacute bởi virus vagrave tế bagraveo vật chủ để tạo necircn protein trưởng thagravenh

của virus gồm 4 protein cấu truacutec (C Erns

E1 vagrave E2) p7 vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec

(Npro

NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B) Trigravenh tự của sản phẩm gen dọc

theo khung đọc mở lagrave

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus (Brett D L 2007)

Một polyprotein lớn được dịch matilde từ RNA của virus sẽ được xử lyacute thagravenh

những protein virus riecircng biệt Protein đầu tiecircn matilde hoaacute lagrave Npro

một protein khocircng

cấu truacutec coacute nhiệm vụ phacircn cắt vị triacute Npro

C Peptidase kyacute chủ phacircn cắt những vị triacute

CErns

E1E2 E2p7 vagrave p7NS2 với sự phacircn cắt khocircng hoagraven toagraven ở vị triacute E2p7

NS2-3 được phacircn cắt bởi autoprotease NS2 Sự phacircn cắt của polyprotein higravenh thagravenh

NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B được thuỷ phacircn bởi enzyme protease serine NS3-4A

Npro

lagrave autoprotease khocircng cấu truacutec coacute hoạt tiacutenh thuỷ phacircn protein Npro

khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep virus Npro

cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro

-C-Erns

-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

4

Năm 2000 dịch bệnh xảy ra ở Anh Năm 2001 dịch bệnh nổ ra ở Đức

Slovakia Vagraveo cuối năm 2003 dịch xuất hiện tại Nhật Albania vagrave Slovakia Hiện

nay bệnh đatilde được ghi nhận khắp thế giới Chacircu Acircu Trung Phi Mexico caacutec nuớc

Trung mỹ Ấn Độ Trung Quốc Đocircng Aacute vagrave Đocircng Nam Aacute Hagraven quốc Indonesia

Philippine Thaacutei Lan Việt Nam

Tigravenh higravenh bệnh DTH tại Việt Nam

Tại Việt Nam bệnh DTH được Houdemer phaacutet hiện đầu tiecircn vagraveo năm 1923-

1924 Từ đoacute bệnh trở thagravenh mối đe doạ nghiecircm trọng đối với ngagravenh chăn nuocirci heo

nước ta

Năm 1949-1950 dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang caacutec tỉnh Phuacute

Yecircn Yecircn Baacutei Thaacutei Nguyecircn Hagrave Nội vagrave Hải Phograveng Năm 1968-1969 dịch phaacutet ra

hơn 20 tỉnh miền Bắc theo thống kecirc coacute 481 ổ dịch nổ ra

Theo baacuteo caacuteo của Cục thuacute y (1986) tại caacutec tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường

bị bội nhiễm với bệnh phoacute thuơng hagraven An Giang Long An (1984) Tiền Giang vagrave

Hậu Giang (1985) Năm 1985 tại Đồng Nai vagrave TP Hồ Chiacute Minh xuất hiện DTH

bội nhiễm với bệnh tụ huyết trugraveng

Năm 2000 coacute 18106 trường hợp bệnh DTH được baacuteo caacuteo tại Việt Nam

Hiện nay bệnh DTH vẫn cograven tồn tại ở caacutec dạng bệnh khocircng điển higravenh gacircy

trở ngại cho việc chuẩn đoaacuten

212 Dạng bệnh

DTH lagrave một bệnh truyền nhiễm riecircng của heo Nguyecircn nhacircn gacircy ra bởi virus

thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute quan hệ mật thiết với virus gacircy

bệnh tiecircu chảy ở bograve (bovine viral diarrhoea-BVD) vagrave virus gacircy bệnh biecircn giới ở cừu

(Boder disease-BD)

Bệnh DTH coacute thể xuất hiện ở nhiều dạng khaacutec nhau Tuy nhiecircn người ta

chia bệnh DTH ra lagravem 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng 1999)

5

Dạng siecircu cấp tiacutenh xuất hiện đột ngột khocircng coacute triệu chứng ban đầu sốt

cao kết hợp với trạng thaacutei thương hagraven Heo bệnh tử vong trong vograveng 24 đến 48 giờ

chưa kịp xuất hiện triệu chứng trecircn da necircn gọi lagrave DTH trắng

Dạng cấp tiacutenh gacircy sốt cao từ 41 - 420C heo bệnh biểu hiện mệt điển higravenh

như heo con nằm chất đống Sau 24 - 48 giờ mắt sưng huacutep vagrave viecircm kết mạc với caacutec

triệu chứng ngoagravei da (như vết chagravem tiacutem xuất huyết tụ huyết magraveu đỏ tại caacutec vugraveng da

mỏng tai chacircn bụng bao dương vậthellip) viecircm dạ dagravey ruột (tiecircu chảy nocircn mửahellip)

triệu chứng hocirc hấp (ho tụ huyết phổi) vagrave coacute thể xuất hiện triệu chứng thần kinh

(loạng choạng liệt liệt nhẹ caacutec chi sauhellip) tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngagravey

sau khi phaacutet bệnh

Dạng aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh diễn ra trong 3 giai đoạn

Giai đoạn đầu keacuteo dagravei 10 - 15 ngagravey toagraven bộ đagraven heo phaacutet bệnh caacutec

triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tiacutenh nhưng ở mức độ nhẹ

Giai đoạn hai lagrave giai đoạn thuyecircn giảm

Giai đoạn ba xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phaacutet bệnh toagraven thacircn với

caacutec triệu chứng cục bộ về hocirc hấp hoặc tiecircu hoaacute hoặc cả hai (viecircm phổi vagrave ruột thocircng

thường do Salmonella) Heo bệnh gầy mograven vagrave tử vong trong vograveng 1 đến 3 thaacuteng

Dạng khocircng điển higravenh biểu hiện dưới caacutec dạng rất khaacutec nhau như rối loạn

sinh sản hoặc bệnh lyacute sinh sản (sảy thai thai chết thai gỗ dị dạng gacircy run rẩy bẩm

sinh rối loạn vận động chết yểuhellip) chậm lớn chết rải raacutec Dưới dạng nagravey virus

DTH coacute thể lưu hagravenh một caacutech khocircng rotilde ragraveng nhất lagrave heo sinh sản với caacutec trường

hợp lacircm sagraveng lẻ tẻ nổ ra khi coacute caacutec điều kiện thuận lợi (như stress chuyecircn chởhellip)

22 MỘT SỐ BỆNH TIacuteCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH

221 DTH điển higravenh (cấp tiacutenh aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh)

Biểu hiện bệnh tiacutech sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ

biến đổi huyết học

6

Trecircn da xuất huyết lấm chấm hoặc từng đaacutem chagravem xanh nhất lagrave da tứ chi

(tai chacircn) xuất huyết vugraveng bụng vagrave bao quy đầu ở heo đực

Hạch bạch huyết dải hạch vugraveng xương chậu vagrave hạch ruột sưng to magraveu đaacute

hoa văn tụ huyết hoặc xuất huyết vugraveng vỏ hoặc toagraven bộ

Thận khocircng sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột magraveng bao thận

(thận trứng gagrave tacircy)

Laacutech khocircng sưng nhồi huyết becircn rigravea laacutech

Bagraveng quang niecircm mạc xuất huyết lấm chấm

Amiđan sưng to vagrave xuất huyết

Tim xuất huyết cơ tim vagrave trecircn vagravenh tim

Hệ hocirc hấp tụ huyết xuất huyết phổi tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm

Hệ tiecircu hoaacute tụ huyết vagrave xuất huyết

Giảm bạch cầu

222 DTH khocircng điển higravenh

Bệnh tiacutech thay đổi khocircng đặc hiệu xuất huyết viecircm dị dạng

Da xuất huyết

Caacutec hạch lacircm ba viecircm hạch lacircm ba coacute thể coacute xuất huyết lấm chấm

Trecircn natildeo xuất huyết

23 CẤU TROumlC BỘ GEN VIRUS DTH

Virus DTH thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute chung tiacutenh

khaacuteng nguyecircn với virus bệnh tiecircu chảy ở bograve vagrave bệnh biecircn giới ở cừu Virus DTH lagrave

một loại virus RNA chuỗi đơn dương coacute vỏ bọc đường kiacutenh 40 - 50 nm RNA virus

matilde hoaacute 4 protein cấu truacutec vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec Chỉ coacute một tyacutep huyết thanh

xaacutec định So với virus gacircy bệnh biecircn giới những dograveng virus DTH higravenh thagravenh một

nhoacutem khaacuteng nguyecircn đồng dạng coacute quan hệ với nhau nhưng coacute một vagravei thay đổi tồn

tại giữa những dograveng phacircn lập Những phản ứng cheacuteo huyết thanh với virus BVD vagrave

BD coacute thể xảy ra vagrave gacircy trở ngại trong chẩn đoaacuten huyết thanh

7

Bộ gen virus coacute chuỗi đơn RNA dagravei 123 kb Bộ gen đatilde được biết trigravenh tự

gen hoagraven toagraven chứa một khung đọc mở nằm ở becircn sườn của 5rsquo-UTR vagrave 3rsquo-UTR matilde

hoaacute một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein nagravey được cắt bởi

protease được matilde hoaacute bởi virus vagrave tế bagraveo vật chủ để tạo necircn protein trưởng thagravenh

của virus gồm 4 protein cấu truacutec (C Erns

E1 vagrave E2) p7 vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec

(Npro

NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B) Trigravenh tự của sản phẩm gen dọc

theo khung đọc mở lagrave

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus (Brett D L 2007)

Một polyprotein lớn được dịch matilde từ RNA của virus sẽ được xử lyacute thagravenh

những protein virus riecircng biệt Protein đầu tiecircn matilde hoaacute lagrave Npro

một protein khocircng

cấu truacutec coacute nhiệm vụ phacircn cắt vị triacute Npro

C Peptidase kyacute chủ phacircn cắt những vị triacute

CErns

E1E2 E2p7 vagrave p7NS2 với sự phacircn cắt khocircng hoagraven toagraven ở vị triacute E2p7

NS2-3 được phacircn cắt bởi autoprotease NS2 Sự phacircn cắt của polyprotein higravenh thagravenh

NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B được thuỷ phacircn bởi enzyme protease serine NS3-4A

Npro

lagrave autoprotease khocircng cấu truacutec coacute hoạt tiacutenh thuỷ phacircn protein Npro

khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep virus Npro

cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro

-C-Erns

-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

5

Dạng siecircu cấp tiacutenh xuất hiện đột ngột khocircng coacute triệu chứng ban đầu sốt

cao kết hợp với trạng thaacutei thương hagraven Heo bệnh tử vong trong vograveng 24 đến 48 giờ

chưa kịp xuất hiện triệu chứng trecircn da necircn gọi lagrave DTH trắng

Dạng cấp tiacutenh gacircy sốt cao từ 41 - 420C heo bệnh biểu hiện mệt điển higravenh

như heo con nằm chất đống Sau 24 - 48 giờ mắt sưng huacutep vagrave viecircm kết mạc với caacutec

triệu chứng ngoagravei da (như vết chagravem tiacutem xuất huyết tụ huyết magraveu đỏ tại caacutec vugraveng da

mỏng tai chacircn bụng bao dương vậthellip) viecircm dạ dagravey ruột (tiecircu chảy nocircn mửahellip)

triệu chứng hocirc hấp (ho tụ huyết phổi) vagrave coacute thể xuất hiện triệu chứng thần kinh

(loạng choạng liệt liệt nhẹ caacutec chi sauhellip) tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngagravey

sau khi phaacutet bệnh

Dạng aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh diễn ra trong 3 giai đoạn

Giai đoạn đầu keacuteo dagravei 10 - 15 ngagravey toagraven bộ đagraven heo phaacutet bệnh caacutec

triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tiacutenh nhưng ở mức độ nhẹ

Giai đoạn hai lagrave giai đoạn thuyecircn giảm

Giai đoạn ba xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phaacutet bệnh toagraven thacircn với

caacutec triệu chứng cục bộ về hocirc hấp hoặc tiecircu hoaacute hoặc cả hai (viecircm phổi vagrave ruột thocircng

thường do Salmonella) Heo bệnh gầy mograven vagrave tử vong trong vograveng 1 đến 3 thaacuteng

Dạng khocircng điển higravenh biểu hiện dưới caacutec dạng rất khaacutec nhau như rối loạn

sinh sản hoặc bệnh lyacute sinh sản (sảy thai thai chết thai gỗ dị dạng gacircy run rẩy bẩm

sinh rối loạn vận động chết yểuhellip) chậm lớn chết rải raacutec Dưới dạng nagravey virus

DTH coacute thể lưu hagravenh một caacutech khocircng rotilde ragraveng nhất lagrave heo sinh sản với caacutec trường

hợp lacircm sagraveng lẻ tẻ nổ ra khi coacute caacutec điều kiện thuận lợi (như stress chuyecircn chởhellip)

22 MỘT SỐ BỆNH TIacuteCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH

221 DTH điển higravenh (cấp tiacutenh aacute cấp tiacutenh hoặc matilden tiacutenh)

Biểu hiện bệnh tiacutech sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ

biến đổi huyết học

6

Trecircn da xuất huyết lấm chấm hoặc từng đaacutem chagravem xanh nhất lagrave da tứ chi

(tai chacircn) xuất huyết vugraveng bụng vagrave bao quy đầu ở heo đực

Hạch bạch huyết dải hạch vugraveng xương chậu vagrave hạch ruột sưng to magraveu đaacute

hoa văn tụ huyết hoặc xuất huyết vugraveng vỏ hoặc toagraven bộ

Thận khocircng sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột magraveng bao thận

(thận trứng gagrave tacircy)

Laacutech khocircng sưng nhồi huyết becircn rigravea laacutech

Bagraveng quang niecircm mạc xuất huyết lấm chấm

Amiđan sưng to vagrave xuất huyết

Tim xuất huyết cơ tim vagrave trecircn vagravenh tim

Hệ hocirc hấp tụ huyết xuất huyết phổi tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm

Hệ tiecircu hoaacute tụ huyết vagrave xuất huyết

Giảm bạch cầu

222 DTH khocircng điển higravenh

Bệnh tiacutech thay đổi khocircng đặc hiệu xuất huyết viecircm dị dạng

Da xuất huyết

Caacutec hạch lacircm ba viecircm hạch lacircm ba coacute thể coacute xuất huyết lấm chấm

Trecircn natildeo xuất huyết

23 CẤU TROumlC BỘ GEN VIRUS DTH

Virus DTH thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute chung tiacutenh

khaacuteng nguyecircn với virus bệnh tiecircu chảy ở bograve vagrave bệnh biecircn giới ở cừu Virus DTH lagrave

một loại virus RNA chuỗi đơn dương coacute vỏ bọc đường kiacutenh 40 - 50 nm RNA virus

matilde hoaacute 4 protein cấu truacutec vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec Chỉ coacute một tyacutep huyết thanh

xaacutec định So với virus gacircy bệnh biecircn giới những dograveng virus DTH higravenh thagravenh một

nhoacutem khaacuteng nguyecircn đồng dạng coacute quan hệ với nhau nhưng coacute một vagravei thay đổi tồn

tại giữa những dograveng phacircn lập Những phản ứng cheacuteo huyết thanh với virus BVD vagrave

BD coacute thể xảy ra vagrave gacircy trở ngại trong chẩn đoaacuten huyết thanh

7

Bộ gen virus coacute chuỗi đơn RNA dagravei 123 kb Bộ gen đatilde được biết trigravenh tự

gen hoagraven toagraven chứa một khung đọc mở nằm ở becircn sườn của 5rsquo-UTR vagrave 3rsquo-UTR matilde

hoaacute một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein nagravey được cắt bởi

protease được matilde hoaacute bởi virus vagrave tế bagraveo vật chủ để tạo necircn protein trưởng thagravenh

của virus gồm 4 protein cấu truacutec (C Erns

E1 vagrave E2) p7 vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec

(Npro

NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B) Trigravenh tự của sản phẩm gen dọc

theo khung đọc mở lagrave

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus (Brett D L 2007)

Một polyprotein lớn được dịch matilde từ RNA của virus sẽ được xử lyacute thagravenh

những protein virus riecircng biệt Protein đầu tiecircn matilde hoaacute lagrave Npro

một protein khocircng

cấu truacutec coacute nhiệm vụ phacircn cắt vị triacute Npro

C Peptidase kyacute chủ phacircn cắt những vị triacute

CErns

E1E2 E2p7 vagrave p7NS2 với sự phacircn cắt khocircng hoagraven toagraven ở vị triacute E2p7

NS2-3 được phacircn cắt bởi autoprotease NS2 Sự phacircn cắt của polyprotein higravenh thagravenh

NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B được thuỷ phacircn bởi enzyme protease serine NS3-4A

Npro

lagrave autoprotease khocircng cấu truacutec coacute hoạt tiacutenh thuỷ phacircn protein Npro

khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep virus Npro

cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro

-C-Erns

-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

6

Trecircn da xuất huyết lấm chấm hoặc từng đaacutem chagravem xanh nhất lagrave da tứ chi

(tai chacircn) xuất huyết vugraveng bụng vagrave bao quy đầu ở heo đực

Hạch bạch huyết dải hạch vugraveng xương chậu vagrave hạch ruột sưng to magraveu đaacute

hoa văn tụ huyết hoặc xuất huyết vugraveng vỏ hoặc toagraven bộ

Thận khocircng sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột magraveng bao thận

(thận trứng gagrave tacircy)

Laacutech khocircng sưng nhồi huyết becircn rigravea laacutech

Bagraveng quang niecircm mạc xuất huyết lấm chấm

Amiđan sưng to vagrave xuất huyết

Tim xuất huyết cơ tim vagrave trecircn vagravenh tim

Hệ hocirc hấp tụ huyết xuất huyết phổi tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm

Hệ tiecircu hoaacute tụ huyết vagrave xuất huyết

Giảm bạch cầu

222 DTH khocircng điển higravenh

Bệnh tiacutech thay đổi khocircng đặc hiệu xuất huyết viecircm dị dạng

Da xuất huyết

Caacutec hạch lacircm ba viecircm hạch lacircm ba coacute thể coacute xuất huyết lấm chấm

Trecircn natildeo xuất huyết

23 CẤU TROumlC BỘ GEN VIRUS DTH

Virus DTH thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae Virus nagravey coacute chung tiacutenh

khaacuteng nguyecircn với virus bệnh tiecircu chảy ở bograve vagrave bệnh biecircn giới ở cừu Virus DTH lagrave

một loại virus RNA chuỗi đơn dương coacute vỏ bọc đường kiacutenh 40 - 50 nm RNA virus

matilde hoaacute 4 protein cấu truacutec vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec Chỉ coacute một tyacutep huyết thanh

xaacutec định So với virus gacircy bệnh biecircn giới những dograveng virus DTH higravenh thagravenh một

nhoacutem khaacuteng nguyecircn đồng dạng coacute quan hệ với nhau nhưng coacute một vagravei thay đổi tồn

tại giữa những dograveng phacircn lập Những phản ứng cheacuteo huyết thanh với virus BVD vagrave

BD coacute thể xảy ra vagrave gacircy trở ngại trong chẩn đoaacuten huyết thanh

7

Bộ gen virus coacute chuỗi đơn RNA dagravei 123 kb Bộ gen đatilde được biết trigravenh tự

gen hoagraven toagraven chứa một khung đọc mở nằm ở becircn sườn của 5rsquo-UTR vagrave 3rsquo-UTR matilde

hoaacute một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein nagravey được cắt bởi

protease được matilde hoaacute bởi virus vagrave tế bagraveo vật chủ để tạo necircn protein trưởng thagravenh

của virus gồm 4 protein cấu truacutec (C Erns

E1 vagrave E2) p7 vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec

(Npro

NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B) Trigravenh tự của sản phẩm gen dọc

theo khung đọc mở lagrave

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus (Brett D L 2007)

Một polyprotein lớn được dịch matilde từ RNA của virus sẽ được xử lyacute thagravenh

những protein virus riecircng biệt Protein đầu tiecircn matilde hoaacute lagrave Npro

một protein khocircng

cấu truacutec coacute nhiệm vụ phacircn cắt vị triacute Npro

C Peptidase kyacute chủ phacircn cắt những vị triacute

CErns

E1E2 E2p7 vagrave p7NS2 với sự phacircn cắt khocircng hoagraven toagraven ở vị triacute E2p7

NS2-3 được phacircn cắt bởi autoprotease NS2 Sự phacircn cắt của polyprotein higravenh thagravenh

NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B được thuỷ phacircn bởi enzyme protease serine NS3-4A

Npro

lagrave autoprotease khocircng cấu truacutec coacute hoạt tiacutenh thuỷ phacircn protein Npro

khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep virus Npro

cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro

-C-Erns

-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

7

Bộ gen virus coacute chuỗi đơn RNA dagravei 123 kb Bộ gen đatilde được biết trigravenh tự

gen hoagraven toagraven chứa một khung đọc mở nằm ở becircn sườn của 5rsquo-UTR vagrave 3rsquo-UTR matilde

hoaacute một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein nagravey được cắt bởi

protease được matilde hoaacute bởi virus vagrave tế bagraveo vật chủ để tạo necircn protein trưởng thagravenh

của virus gồm 4 protein cấu truacutec (C Erns

E1 vagrave E2) p7 vagrave 7 protein khocircng cấu truacutec

(Npro

NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B) Trigravenh tự của sản phẩm gen dọc

theo khung đọc mở lagrave

Higravenh 2 1 Cấu truacutec bộ gen Pestivirus (Brett D L 2007)

Một polyprotein lớn được dịch matilde từ RNA của virus sẽ được xử lyacute thagravenh

những protein virus riecircng biệt Protein đầu tiecircn matilde hoaacute lagrave Npro

một protein khocircng

cấu truacutec coacute nhiệm vụ phacircn cắt vị triacute Npro

C Peptidase kyacute chủ phacircn cắt những vị triacute

CErns

E1E2 E2p7 vagrave p7NS2 với sự phacircn cắt khocircng hoagraven toagraven ở vị triacute E2p7

NS2-3 được phacircn cắt bởi autoprotease NS2 Sự phacircn cắt của polyprotein higravenh thagravenh

NS4A NS4B NS5A vagrave NS5B được thuỷ phacircn bởi enzyme protease serine NS3-4A

Npro

lagrave autoprotease khocircng cấu truacutec coacute hoạt tiacutenh thuỷ phacircn protein Npro

khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep virus Npro

cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro

-C-Erns

-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

8

khaacuteng của sự hoạt hoaacute IRF-3 vagrave sự sản xuất ra IFN ức chế sự phiecircn matilde IRF-3 ở

những tế bagraveo nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro

của virus DTH đatilde được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

Protein cấu truacutec

C (matilde hoaacute protein p14) lagrave protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C-

terminus) của protein C ở virus DTH đatilde được xaacutec định vagrave được định vị ở phần kỵ

nước của chuỗi peptide tiacuten hiệu becircn trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di

chuyển của Erns

vagraveo trong khoang mạng lưới nội chất

Erns

(matilde hoaacute protein gp4448) E1(gp33) E2(gp55) lagrave caacutec protein vỏ E2 vagrave

Erns

coacute tiacutenh khaacuteng nguyecircn mạnh nhất Erns

coacute taacutec dụng hỗ trợ thải virus qua một

magraveng đặc biệt được tiết ra từ tế bagraveo nhiễm đặc điểm nổi bật của Erns

lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease với tiacutenh chuyecircn biệt đối với gốc uridine Những khaacuteng thể ức chế hoạt

tiacutenh ribonuclease coacute khuynh hướng trung hoagrave tiacutenh nhiễm virus sự đột biến ở Erns

phaacute huỷ hoạt tiacutenh ribonuclease gacircy necircn gia tăng số lượng virus Erns

taacutei tổ hợp lagrave một

độc chất đối với tế bagraveo bạch huyết trong ống nghiệm coacute thể kết hợp với sự giảm

bạch cầu ở nhiễm tự nhiecircn Mặc dugrave độc tiacutenh tế bagraveo lagrave một đặc điểm nổi bật của

những enzyme ribonuclease hoagrave tan khaacutec nhưng người ta chưa rotilde lagrave hoạt tiacutenh

ribonuclease của Erns

coacute liecircn quan đến độc tiacutenh của noacute hay khocircng Vugraveng đầu cuối C

(C-terminal) của Erns

coacute thể khởi động sự di chuyển của noacute qua magraveng tế bagraveo coacute thể

coi như lagrave mục tiecircu hoặc chức năng trong tế bagraveo Tuy nhiecircn Erns

taacutei tổ hợp cũng coacute

thể nối một caacutech vững chắc với bề mặt tế bagraveo qua sự tương taacutec với

glycosaminoglycan vagrave ức chế sự lacircy nhiễm

E1 vagrave E2 lagrave những protein magraveng khocircng thể thiếu E2 của virus DTH taacutei tổ

hợp coacute thể kết hợp với caacutec tế bagraveo vagrave ngăn chặn sự lacircy nhiễm của virus DTH vagrave

BVD Mặc dugrave vai trograve quan trọng của những glycoprotein ở virus lagrave lắp rắp vagrave tiếp

nhận nhưng những khaacuteng thể đối với Erns

hoặc E2 coacute thể trung hoagrave tiacutenh lacircy nhiễm

của virus vagrave cả hai khaacuteng nguyecircn nagravey coacute thể tạo ra tiacutenh sinh miễn dịch bảo vệ

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

9

Protein p7 theo sau những protein cấu truacutec gồm một vugraveng đảm đương

nhiệm vụ trung tacircm đối với việc taacutech đầu cuối kỵ nước vagrave cần cho sự sản sinh của

virus lacircy nhiễm nhưng khocircng đogravei hỏi trong quaacute trigravenh sao cheacutep RNA P7 của

pestivirus được phacircn cắt một caacutech khocircng hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-

p7 khocircng phacircn cắt khocircng cần thiết đối với sự sao cheacutep trong nuocirci cấy tế bagraveo vagrave cả

hai E2-p7 vagrave p7 giuacutep tế bagraveo kết hợp với nhau Tuy nhiecircn chưa biết rotilde p7 lagrave một

protein cấu truacutec hay khocircng cấu truacutec mặc dugrave noacute khocircng được phaacutet hiện trong virus

tinh sạch Pestivirus coacute p7 thigrave coacute thể higravenh thagravenh những kecircnh ion tham gia trong sự

lắp raacutep vagrave tiếp nhận của virus

Protein khocircng cấu truacutec

Protein NS2 lagrave một enzyme thuỷ phacircn protein chứa cysteine đatilde được nhận

diện Sự phacircn cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao cheacutep RNA của pestivirus vagrave hiệu

quả phacircn cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bagraveo vagrave coacute thể xaacutec định

tiacutenh gacircy bệnh tế bagraveo Vugraveng NS2-3 tham gia lắp raacutep virus

NS3 chứa một vugraveng protease serine ở đầu cuối N vagrave một helicase RNA ở

đầu cuối C Protease serine NS3 đogravei hỏi NS4A như lagrave một yếu tố hỗ trợ Protease

serine NS3-4A phacircn cắt giữa leucine vagrave những amino acid khocircng phacircn cực nhỏ

Hoạt tiacutenh protease serine ảnh hưởng đến sự sao cheacutep RNA virusđoacuteng vai trograve thiết

yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tiacutenh protease serine NS3

NS4A vagrave NS4B khocircng đoacuteng vai trograve thiết yếu trong sự sao cheacutep RNA của virus

NS5A vagrave NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phacircn cắt hoagraven toagraven cũng

khocircng khaacutec gigrave NS5A-5B khocircng phacircn cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rotilde

NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA

dependent RNA polymerase)

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

10

24 MỘT SỐ PHƢƠNG PHAacuteP CHẨN ĐOAacuteN BỆNH DTH TRONG

PHOtildeNG THIacute NGHIỆM

(1) Phacircn lập virus

(2) Đaacutenh dấu miễn dịch phaacutet hiện virus trong nuocirci cấy tế bagraveo

(3) Phương phaacutep hoaacute mocirc

(4) ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn hoặc ELISA phaacutet hiện khaacuteng thể

(5) Phản ứng trung hoagrave

(6) Phương phaacutep reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

RT-PCR lagrave một phương phaacutep chẩn đoaacuten nhanh vagrave nhạy hơn so với phương

phaacutep ELISA vagrave phacircn lập virus thiacutech hợp trong chuẩn đoaacuten bệnh sớm traacutenh được sự

nhiễm khuẩn từ mocirci trường becircn ngoagravei

241 PCR (Polymerase chain reaction)

Khaacutei niệm PCR lagrave một tiến trigravenh lặp đi lặp lại bao gồm 3 cocircng đoạn biến

tiacutenh mẫu bởi nhiệt bắt cặp những mồi nucleotide với trigravenh tự điacutech mạch đơn keacuteo

dagravei mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tiacutenh mẫu DNA mạch đocirci biến tiacutenh ở nhiệt độ được xaacutec định bởi thagravenh

phần G+C Thagravenh phần G+C cagraveng cao thigrave nhiệt độ đogravei hỏi taacutech mạch cagraveng cao

Những phacircn tử DNA cagraveng dagravei thigrave thời gian cần ở nhiệt biến tiacutenh để taacutech hai mạch

một caacutech hoagraven toagraven cagraveng lớn Nếu nhiệt độ biến tiacutenh quaacute thấp hoặc nếu thời gian

quaacute ngắn thigrave chỉ coacute những vugraveng giagraveu AT sẽ bị biến tiacutenh Khi nhiệt độ bị giảm trễ

hơn trong chu trigravenh PCR DNA mẫu sẽ taacutei bắt cặp thagravenh một tigravenh trạng nguyecircn gốc

Trong những phản ứng PCR xuacutec taacutec bởi Taq DNA polymerase sự biến tiacutenh

được tiến hagravenh ở 94 - 950C lagrave nhiệt độ cao nhất magrave enzyme coacute thể chịu được

khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn magrave khocircng chịu được taacutec hại quaacute mức Trong chu kỳ đầu

của PCR sự biến tiacutenh thỉnh thoảng được tiến hagravenh khoảng 5 phuacutet để gia tăng khả

năng những phacircn tử DNA mẫu được biến tiacutenh đầy đủ Tuy nhiecircn thời gian biến

tiacutenh khoảng 45 giacircy ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thocircng

thường coacute thagravenh phần G+C lagrave 55 hoặc thấp hơn

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

11

Mẫu DNA giagraveu G+C (gt 55) thigrave nhiệt độ biến tiacutenh cagraveng cao DNA

polymerase phacircn lập từ Archaea thigrave chịu nhiệt hơn Taq do đoacute noacute thiacutech hợp khuếch

đại DNA giagraveu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute cao mồi

oligonucleotide bắt cặp iacutet với mẫu như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp

Nếu nhiệt độ bắt cặp quaacute thấp việc bắt cặp của mồi khocircng đặc hiệu coacute thể xảy ra

kết quả lagrave tạo ra những đoạn DNA khocircng mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ noacuteng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp necircn

tiến hagravenh một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

noacuteng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Keacuteo dagravei mồi việc keacuteo dagravei mồi được tiến hagravenh ở hoặc gần nhiệt độ thiacutech hợp

đối với sự tổng hợp DNA xuacutec taacutec bởi polymerase chịu nhiệt trong trường hợp Taq

polymerase nhiệt độ thiacutech hợp lagrave 72 - 780C

Số chu kigrave phụ thuộc vagraveo lượng DNA đưa vagraveo phản ứng hiệu quả của việc keacuteo

dagravei mồi vagrave sự khuếch đại Thocircng thường sau 30 chu kigrave tạo được khoảng 105 bản sao

242 RT-PCR

Khaacutei niệm lagrave một phương phaacutep được sử dụng để khuếch đại RNA thagravenh

cDNA Nhạy vagrave đa năng RT-PCR được sử dụng để hồi phục vagrave nhacircn đầu cuối 5rsquovagrave

3rsquo của mRNA vagrave higravenh thagravenh thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thecircm vagraveo

đoacute RT-PCR dễ dagraveng xaacutec định đột biến vagrave những đa higravenh trong những trigravenh tự được

sao lại vagrave đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiecircn lagrave chuyển RNA thagravenh cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide

được lai với RNA vagrave sau đoacute keacuteo dagravei bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-

dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thuacutec tiến trigravenh tạo cDNA

lagrave chuyển qua tiến trigravenh PCR để nhacircn lecircn một lượng lớn cDNA

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

12

Higravenh 2 2 Phản ứng RT-PCR

Khuocircn RNA

Sự gắn primer vagraveo RNA để tổng hợp cDNA

(primer coacute thể lagrave ngẫu nhiecircn oligo-dT hay

mồi chuyecircn biệt cho gene)

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị triacute của primer nhờ

enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thagravenh

Khuocircn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H

cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đocirci được higravenh thagravenh

Ba bước biến tiacutenh bắt cặp keacuteo dagravei được lặp

lại nhiều lần

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

13

243 Caacutec thagravenh phần quan trọng trong phản ứng

Dung dịch đệm (buffer)

Coacute taacutec dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Thagravenh phần dung

dịch đệm gồm KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 85 ở nhiệt độ phograveng)

MgCl2

Tạo thagravenh một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vagraveo

enzyme kiacutech thiacutech hoạt tiacutenh của enzyme polymerase tăng Tm (nhiệt độ noacuteng chảy)

của DNA vagrave tăng sự taacutec động hổ trợ của mồi vagrave DNA mẫu

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 05 ndash 5 mM với

mức tối ưu lagrave 1 ndash 2 mM nhưng nồng độ tối ưu phải được xaacutec định cho từng phản

ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

Mồi (primer)

Mồi lagrave một trong những thagravenh phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyecircn biệt của phản ứng

Trigravenh tự mồi được chọn sao cho khocircng coacute sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

vagrave đặc trưng cho trigravenh tự đoạn gen được khuếch đại khocircng trugraveng với caacutec trigravenh tự

lặp lại trecircn đoạn gen Chiều dagravei mồi khocircng được quaacute lớn thường trong khoảng 17-

25 nu phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trigravenh tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự

Nhacircn 2001) Chiều dagravei mồi cagraveng lớn sự taacutech caacutec DNA mẫu để bắt cặp với mồi cagraveng

nhỏ Chiều dagravei vagrave thagravenh phần G-C của mồi đều coacute ảnh hưởng quan trọng đối với

nhiệt độ Tm của mồi

Tm (0C) = [(số G + C) 4 + (số A + T) 2]

Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng Nồng độ mồi quaacute

cao higravenh thagravenh necircn cấu truacutec dimer (mồi gắn mồi)

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Lagrave nguyecircn liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại dATP dTTP dCTP

dGTP Sự mất cacircn bằng trong thagravenh phần dNTPs lagravem tăng caacutec lỗi sao cheacutep của

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

14

enzyme polymerase vigrave vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả caacutec dNTP đều bằng

nhau Nồng độ dNTPs thường dugraveng trong khoảng 20 ndash 200 microM dung dịch dNTPs

gốc phải giữ trung tiacutenh pH70

Taq polymerase

Lagrave một enzyme polymerase chịu nhiệt được taacutech chiết từ vi khuẩn suối

nước noacuteng coacute tecircn lagrave Thermus aquaticus Taq polymerase khocircng bị phaacute huỷ ở nhiệt

độ biến tiacutenh trong phản ứng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến caacuteo trong khoảng 1 - 25 đơn vị trecircn

100microl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng

chuyecircn biệt nồng độ Taq quaacute thấp khocircng đủ lượng enzyme xuacutec taacutec để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bugravei Chiacute Bửu 1999)

Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vagraveo lượng bản sao mẫu ban đầu

DNA mẫu lagrave 105

tương ứng với 25 - 30 chu kỳ 102

- 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Khocircng necircn vượt quaacute 40 chu kỳ vigrave hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do

Sự phacircn huỷ vagrave cạn kiệt caacutec thagravenh phần của phản ứng

Sự xuất hiện caacutec sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Caacutec bản sao vừa tổng hợp khocircng kết hợp với mồi magrave bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhacircn 2001)

Mẫu

Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg ndash 1 microg trecircn 25 microl dung dịch

phản ứng Nồng độ mẫu quaacute iacutet dẫn đến phản ứng khocircng đặc hiệu nồng độ quaacute cao

tạo ra những sản phẩm phụ khocircng mong muốn

RNAsin

Được dugraveng để ức chế enzyme phacircn huỷ RNA giữ cho mẫu khocircng bị mất

trong quaacute trigravenh thực hiện phản ứng

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

15

Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thagravenh phần khocircng thể thiếu lagrave enzyme phiecircn matilde

ngược MMLV hoạt động như lagrave một enzyme polymerase giuacutep tổng hợp sợi cDNA

từ RNA vagrave với hoạt tiacutenh của enzyme RNAse H coacute độ nhạy cao giuacutep phacircn cắt sợi

RNA trong mạch đocirci RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng

PCR

25 SƠ LƢỢC CAacuteC NGHIEcircN CỨU LIEcircN QUAN

251 Trong nƣớc

Từ năm 1996-1998 Nguyễn Thị Phương Duyecircn vagrave ctv khảo saacutet hội chứng

sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết vagrave khaacuteng nguyecircn virus DTH bằng miễn dịch huỳnh

quang vagrave ELISA ở đagraven heo sinh sản vagrave heo con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei cho

thấy virus DTH chiếm tỷ lệ khocircng nhỏ trong caacutec taacutec nhacircn gacircy hội chứng nagravey

Từ năm 2002-2003 Akemi Kamakawa vagrave ctv tiến hagravenh khảo saacutet bệnh DTH

giữa caacutec đagraven heo vagrave caacutec trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại

đoạn gen 5rsquoNTR

Nguyễn Thế Vinh vagrave ctv năm 2004 nghiecircn cứu phacircn tiacutech di truyền virus

DTH phacircn lập ở Việt Nam bằng caacutech phacircn tiacutech đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

vagrave so saacutenh chuacuteng với một số chủng đatilde được giới thiệu trecircn thế giới Kết quả đưa ra

lagrave caacutec chủng virus DTH thuộc nhoacutem 2 đang lagrave taacutec nhacircn chiacutenh gacircy bệnh DTH ở Việt

Nam

Hồ Thu Hương vagrave ctv năm 2004 so saacutenh 4 phương phaacutep chẩn đoaacuten virus

DTH (phacircn lập virus phản ứng huỳnh quang khaacuteng thể phản ứng ELISA vagrave RT-

PCR) từ mẫu được bảo quản ở caacutec điều kiện khaacutec nhau Theo caacutec taacutec giả việc lựa

chọn phương phaacutep chẩn đoaacuten phải dựa vagraveo chất lượng mẫu

Bugravei Nghĩa Vượng vagrave ctv năm 2004 chẩn đoaacuten bệnh DTH bằng phương

phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng coacute thể phaacutet hiện được

virus DTH từ caacutec mẫu giấy thấm maacuteu khocirc giữ ở 370C trong 10 thaacuteng

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

16

252 Trecircn thế giới

Với sự thiệt hại kinh tế nghiecircm trọng magrave bệnh DTH gacircy ra ở caacutec quốc gia coacute

dịch bệnh thigrave DTH lagrave một đối tượng ngagravey cagraveng coacute nhiều nghiecircn cứu về dịch tễ lacircm

sagraveng caacutec phương phaacutep chẩn đoaacuten sự lacircy nhiễm vagrave phacircn bố của caacutec chủng virus

DTH vagrave đồng thời nghiecircn cứu vaccin trong phograveng trị bệnh

Barbara vagrave ctv năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vagraveo việc phaacutet hiện vagrave

biệt hoaacute virus DTH từ caacutec pestivirus khaacutec

Nghiecircn cứu dấu hiệu lacircm sagraveng vagrave dịch tễ của bệnh DTH của caacutec taacutec giả như

Artois vagrave ctv (2002) Moennig vagrave ctv (2003)

Nhiều taacutec giả nước ngoagravei dugraveng kỹ thuật RT-PCR để nghiecircn cứu đặc điểm

dịch tễ bệnh dựa trecircn đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B 1993 Harding 1994

Rugg li1996 Knepp 2003 Risatt I 2002 2004 Pereda 2005)

Paton vagrave ctv (2000) phacircn tiacutech caacutec chủng virus DTH dựa vagraveo đoạn gen E2

NS5B vagrave 3rsquoNTR ở nhiều nơi trecircn thế giới kể cả vagravei nước chacircu Aacute kết quả cho thấy

mối quan hệ gần giữa caacutec chủng gacircy bệnh ở một số nước

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

17

Chương 3

NỘI DUNG VAgrave PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

31 THỜI GIAN VAgrave ĐỊA ĐIỂM

311 Thời gian

Đề tagravei được tiến hagravenh từ ngagravey 01 thaacuteng 03 năm 2007 đến ngagravey 01 thaacuteng 08

năm 2007

312 Địa điểm

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech của heo bệnh vagrave caacutec dữ liệu liecircn quan đến bệnh

được gởi từ tỉnh Tiền Giang

Tiến hagravenh thử nghiệm quy trigravenh phaacutet hiện virus DTH dựa trecircn đoạn gen

NS5B tại Trung tacircm Phacircn tiacutech Thiacute nghiệm Hoaacute sinh trường Đại học Nocircng Lacircm

thagravenh phố Hồ Chiacute Minh

32 NỘI DUNG NGHIEcircN CỨU

Chọn quy trigravenh ly triacutech RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech

Chọn quy trigravenh RT-PCR coacute hiệu quả nhất trong việc phaacutet hiện gen NS5B

So saacutenh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA

Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tiacutech

33 VẬT LIỆU VAgrave HOAacute CHẤT

331 Vật liệu nghiecircn cứu

Mẫu dugraveng trong ly triacutech RNA (laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA dương tiacutenh

với khaacuteng nguyecircn E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang caacutec mẫu dương tiacutenh

khi tỉ số OD từ 03 trở lecircn) vagrave phản ứng RT-PCR phaacutet hiện gen NS5B

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

18

332 Hoacutea chất

Hoaacute chất dugraveng trong ly triacutech RNA tổng số

Dung dịch D lagrave dung dịch ly giải tế bagraveo

2 M guanidium thiocyanate

25 mM sodium citrate

05 sarkosyl (wv)

100 mM -mercaptoethanol pH7

2 M sodium acetate pH4

Phenol

Chloroform

Isopropanol

Ethanol 75

Hoaacute chất dugraveng trong điện di gel biến tiacutenh

Dung dịch đệm 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml) thagravenh phần

02 M MOPS (pH7)

20 mM sodium acetate

10 mM EDTA

Dung dịch nạp mẫu 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml) thagravenh

phần

50 glycerol

10mM EDTA

025 (wv) bromophenol blue

025 (wv) xylene cyanol

Hoaacute chất vagrave dụng cụ trong điện di gel TBE

Dung dịch đệm TBE 50X

Tris 242 gl

Boric acid 571 mll

EDTA 05M pH 80 100 mll

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

19

Agarose (Biorad)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20 Ficoll 400 01 M disodium

EDTA pH 8 1 sodium dodecyl sulfate 025 bromphenol blue 025

cylene cyanol)

Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 05 mgml 50 mg

ethidium bromide 100 ml H2O Dung dịch sử dụng 05 microgml pha loatildeng

11000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm ndash bảo quản traacutenh aacutenh saacuteng)

Thang DNA chuẩn

Bộ dụng cụ điện di nằm

Bộ nguồn điện một chiều

Lược gel

Khuocircn đổ gel

Micropipette caacutec loại

Hoaacute chất dugraveng trong phản ứng RT-PCR

Rnase-free water

Buffer PCR

MgCl2

dNTPs

Mồi xuocirci

Mồi ngược

Taq polymerase

Rnasin

MMLV reverse trancriptase

Triton Xndash100

34 BỐ TRIacute THIacute NGHIỆM

Thiacute nghiệm 1 Kết tủa RNA ly triacutech ở caacutec nồng độ LiCl khaacutec nhau

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn

DNA do đoacute muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook vagrave

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

20

Russell 2001) Để khảo saacutet hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA trong quaacute

trigravenh ly triacutech mẫu chuacuteng tocirci thực hiện thu tủa RNA với caacutec nồng độ muối LiCl khaacutec

nhau Từ đoacute chọn nồng độ muối LiCl thiacutech hợp nhất trong thu tủa RNA đưa ra quy

trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp

Thiacute nghiệm nagravey được bố triacute theo kiểu hoagraven toagraven ngẫu nhiecircn Gồm 4 nghiệm

thức (LiCl 10 M LiCl 15 M LiCl 20 M LiCl 25 M) mỗi nghiệm thức được lặp

lại trecircn 5 mẫu

Chỉ tiecircu khảo saacutet lagrave tỉ số OD hagravem lượng RNA thu được vagrave sản phẩm RT-

PCR thu được từ caacutec mẫu So saacutenh sự khaacutec biệt giữa caacutec nghiệm thức chọn ra

nghiệm thức thiacutech hợp nhất

Thiacute nghiệm 2 Thử nghiệm hagravem lƣợng Taq khaacutec nhau trong phản ứng

RT-PCR

Hagravem lượng Taq được khuyến caacuteo trong khoảng 1 ndash 25 UI trecircn 100 microl dung

dịch phản ứng Nồng độ Taq quaacute cao sẽ tạo ra những sản phẩm khocircng chuyecircn biệt

(Bugravei Chiacute Bửu 1999) Vigrave vậy bước đầu chuacuteng tocirci thực hiện thiacute nghiệm thay đổi

lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng

Thiacute nghiệm được thực hiện trecircn 5 mẫu khaacutec nhau mỗi mẫu được chạy phản

ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI

Chỉ tiecircu khảo saacutet thiacute nghiệm nagravey lagrave tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thagravenh cocircng

vagrave băng sản phẩm RT-PCR được điện di trecircn gel 2

Khảo saacutet 3 So saacutenh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR

Nhằm khảo saacutet coacute hay khocircng sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD

của ELISA

Với 23 mẫu bệnh phẩm coacute kết quả OD của ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 được gởi từ Chi cục Thuacute y Tiền Giang so saacutenh với kết quả RT-PCR chuacuteng tocirci

thực hiện tại Trung Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại học Nocircng

Lacircm

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

21

Khảo saacutet 4 Khảo saacutet mối liecircn hệ giữa đặc điểm bệnh tiacutech của những

heo chẩn đoaacuten dƣơng tiacutenh với bệnh DTH bằng phƣơng phaacutep RT-PCR

Bệnh DTH với caacutec triệu chứng lacircm sagraveng bệnh tiacutech khocircng đều nhau vagrave coacute

nhiều biến đổi khocircng điển higravenh Vigrave vậy chuacuteng tocirci xem xeacutet những mẫu dương tiacutenh

trong phương phaacutep chẩn đoaacuten RT-PCR coacute những đặc điểm bệnh tiacutech như thế nagraveo

Khảo saacutet được thực hiện dựa trecircn kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở

23 mẫu laacutech với những đặc điểm bệnh tiacutech nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được

gởi từ Chi cục Thuacute Y Tiền Giang)

35 PHƢƠNG PHAacuteP TIẾN HAgraveNH

351 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Lấy mẫu khi heo coacute một số bệnh tiacutech nghi ngờ của DTH như sau

Da xuất huyết

Gan xuất huyết hoại tử

Laacutech xuất huyết nhồi huyết hoặc hoại tử ở rigravea laacutech

Thận xuất huyết xung huyết

Phổi xuất huyết tụ huyết hoại tử hoặc phổi hoaacute gan (magraveu sắc giống

gan thả vagraveo nước bị chigravem)

Tim xuất huyết

Dạ dagravey xuất huyết

Ruột xuất huyết higravenh cuacutec aacuteo

Mẫu bệnh phẩm lagrave laacutech đatilde được xeacutet nghiệm ELISA phaacutet hiện khaacuteng nguyecircn

E2 dương tiacutenh

Lấy khoảng 100 g mẫu cho vagraveo tuacutei nilocircng vocirc trugraveng được bảo quản trong

bigravenh đaacute vagrave vận chuyển về phograveng thiacute nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung

Tacircm Phacircn Tiacutech Thiacute Nghiệm Hoaacute Sinh trường Đại Học Nocircng Lacircm Thagravenh phố Hồ

Chiacute Minh cho đến khi xeacutet nghiệm

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

22

352 Ly triacutech RNA tổng số

Mẫu coacute thể đƣợc xử lyacute theo 2 caacutech

Mẫu bệnh phẩm laacutech được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bagraveo

(tỉ lệ mẫu so với dịch PBS lagrave 20)

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cắt một phần laacutech cho vagraveo cối dugraveng keacuteo cắt nhỏ cho một lượng

dịch PBS tương ứng vagraveo dugraveng chagravey nghiền nhuyễn cho đến khi khocircng cograven cặn

Bước 2 Thu dịch nghiền vagraveo eppendorf lớn giải đocircng 3 lần

Bước 3 Ly tacircm 5000 vograveng10 phuacutet ở 40C

Bước 4 Thu dịch tế bagraveo bỏ cặn Dịch tế bagraveo thu được bảo quản ở -700C

cho đến khi tiến hagravenh ly triacutech mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn

Caacutec bước tiến hagravenh

Bước 1 Cối chagravey được lagravem lạnh với nitơ lỏng -1960C cắt một lượng mẫu

cho vagraveo cối chagravey đổ vagraveo một lượng nhỏ nitơ dugraveng chagravey nghiền nhuyễn

Bước 2 Khi mẫu đatilde ở dạng bột nhuyễn thu mẫu với lượng khoảng 30 mg

cho vagraveo mỗi eppendorf Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng

Tiến hagravenh ly triacutech RNA tổng số

Nguyecircn tắc ly triacutech RNA từ mẫu dịch tế bagraveo dựa theo quy trigravenh của

Chomezynski vagrave Sacchi (1987)

Dịch tế bagraveo được đồng nhất chung với dung dịch D vagrave -mercaptoethanol

nhằm phaacute vỡ magraveng tế bagraveo phoacuteng thiacutech ra caacutec thagravenh phần nội bagraveo (DNA RNA

proteinhellip) Đồng thời guanidium thiocyanate coacute trong dung dịch D lagravem biến tiacutenh

protein mạnh vagrave ức chế hoạt động của Rnase

Phenol chloroform cho vagraveo tiếp sau đoacute nhằm kết tủa protein vagrave pH40 của

phenol coacute taacutec dụng keacuteo DNA vagraveo pha phenol Ly tacircm tốc độ cao nhằm thu được

dịch trong becircn trecircn chứa RNA nhiệt độ lạnh hạn chế sự phacircn huỷ RNA

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

23

Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA

LiCl lagrave một taacutec nhacircn khử nước mạnh với đặc tiacutenh hoagrave tan RNA thấp hơn DNA do

đoacute được dugraveng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook vagrave Russell 2001)

Tủa RNA được rửa với ethanol 75 từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl giảm

nồng độ ethanol ban đầu Tủa RNA sau khi được lagravem khocirc thigrave hoagrave tan trong nước đatilde

được khử với DEPC vagrave bảo quản ở -700C nhằm traacutenh sự phacircn huỷ của Rnase

Caacutec bước tiến hagravenh ly triacutech

Huacutet khoảng 350 microl dịch tế bagraveo vagraveo ống eppendorf

Cho vagraveo 500 microl dung dịch D vagrave 36 microl -mercaptoethanol

Đồng nhất mẫu vortex trong 10 giacircy

Sau đoacute cho thecircm 50 microl sodium acetate 2 M pH 40 500 microl phenol batildeo

hoagrave pH40 100 microl chloroform

Dugraveng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu vortex 10 giacircy

Lagravem lạnh trecircn đaacute khoảng 15 phuacutet

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet ở 40C

Huacutet khoảng 400 microl dịch nổi thecircm 400 microl ethanol + LiCl vagrave giữ ở -200C

trong 1 giờ

Li tacircm 13000 vogravengphuacutet trong 20 phuacutet bỏ dịch nổi thu tủa

Rửa tủa bằng ethanol 75 votex nhẹ li tacircm 9000 vogravengphuacutet trong 2 phuacutet

thu tủa (rửa 2 lần)

Huacutet bỏ dịch nổi tủa lagravem khocirc tự nhiecircn trong khocircng khiacute khoảng 45 phuacutet

Hoagrave tan với 30 microl nước đatilde khử DEPC

Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế

Đo độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA sau khi ly triacutech bằng quang phổ kế

(model HP 8453) ở bước soacuteng 230 nm 260 nm vagrave 280 nm

Caacutech tiến hagravenh Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đatilde khử DEPC Huacutet 995

microl nước đatilde khử DEPC cho vagraveo curvet sau đoacute thecircm 5microl mẫu rarr trộn đều rarr độ pha

loatildeng 200 lần Cuối cugraveng lagrave đặt curvet vagraveo maacutey để đo OD

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

24

Độ tinh sạch của RNA được tiacutenh bằng tỉ số OD260nm OD280nm vagrave tỉ số

OD260nm OD230nm Tỉ số OD260nmOD280nm đạt 18-20 thigrave xem như RNA ly triacutech

tương đối sạch Tỉ số nagravey sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol Tỉ số

OD260nmOD230nm đạt 15-20 coi như RNA iacutet tạp nhiễm tỉ số nagravey thấp hơn khi bị

nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa

Hagravem lượng RNA được tiacutenh theo cocircng thức

Hagravem lƣợng RNA (ngmicrol) = WL1 (OD260nm) 40 ngmicrol Độ pha loatildeng

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ngmicrol cho một dung dịch

RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1998)

RNA ly triacutech coacute thể dugraveng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR

Kiểm tra RNA bằng điện di biến tiacutenh

Xem kết quả coacute xuất hiện 2 band chuẩn 18S 28S

Nếu kết quả coacute xuất hiện 2 band 18S vagrave 28S thigrave quaacute trigravenh ly triacutech RNA thagravenh cocircng

Tiến hagravenh điện di

Chuẩn bị gel 15

Cacircn 03 g agarose thecircm vagraveo 144 ml nước đatilde khử DEPC

Nấu trong 2 phuacutet ở 650W

Để nguội đến 550C cho thecircm vagraveo

2 ml MOPS 10X

36 ml formaldehyde

Lắc đều đổ gel vagrave chờ gel nguội khoảng 45 phuacutet

Chuẩn bị RNA

Mỗi phản ứng cần

10X MOPS 2 microl

Formaldehyde 4 microl

Formamide 10 microl

RNA 10 microl

Ủ ở 650C trong 15 phuacutet

Ủ đaacute 15 phuacutet

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

25

Cho thecircm 2 microl loadingdye trộn đều vagrave bơm vagraveo giếng trecircn gel

Điện di 30V trong 180 phuacutet hoặc 50V trong 90 phuacutet

Sau đoacute lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phuacutet chụp

Cuối cugraveng lagrave chụp gel vagrave đọc kết quả

353 Phản ứng RT-PCR

Quy trigravenh RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton vagrave ctv (2000)

Cặp mồi của gen NS5B

Forward 5rsquo-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3rsquo (11138-11157)

Reverse 5rsquo-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3rsquo (11586-11567)

rarr Kiacutech thước đoạn gen lagrave 449 bp

Cặp mồi nagravey sử dụng phaacutet hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phacircn

lập (Paton 2000) Những thử nghiệm dựa trecircn sự khuếch đại gen NS5B được sử

dụng rộng ratildei trong việc phacircn loại di truyền do đoacute phương phaacutep RT-PCR dựa trecircn

đoạn gen NS5B thiacutech hợp lagrave phương phaacutep chẩn đoaacuten tiecircu chuẩn hoaacute để đi sacircu xaacutec

định chiacutenh xaacutec chủng virus DTH

Quy trigravenh RT-PCR chuẩn bị 50 microl hổn hợp phản ứng RT-PCR với caacutec thagravenh phần

phản ứng như sau

Bảng 3 1 Thagravenh phần phản ứng RT-PCR

Tecircn hoaacute chất Nồng độ cuối

Rnase- free water

Buffer PCR 1X

MgCl2 6 mM

dNTPs 04 mM

Mồi xuocirci 01 microM

Mồi ngược 01 microM

Triton X-100 02

Taq polymerase 25 UI

Rnasin 10UI

MMLreverse trancriptase 100 UI

RNA mẫu

Tổng thể tiacutech 50microl

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

26

Buffer 10X gồm 500 mM KCl 100 mM Tris-Cl (pH 83 ở nhiệt độ phograveng) 15 mM

MgCl2

Quy trigravenh nhiệt đối với gen NS5B

Giai đoạn RT 500C30 phuacutet 95

0C3phuacutet

Giai đoạn PCR 35 chu kigrave (940C1phuacutet 52

0C1phuacutet72

0C1phuacutet)

Bước keacuteo dagravei chuỗi 720C10phuacutet

Điện di trecircn gel

Caacutech tiến hagravenh

Pha loatildeng dung dịch TBE 50X để coacute dung dịch TBE 05X

Pha gel agarose với nồng độ 2 Cacircn 025 g agarose cho vagraveo 125 ml

dung dịch TBE 05X Đun socirci bằng lograve viba cho agarose tan thật đều

Để nguội đến 50-550C đổ vagraveo khuocircn cagravei lược vagraveo

Chờ 30 phuacutet để agarose đocircng

Gở lược ra rồi đặt bảng gel vagraveo buồn điện di cho đuacuteng chiều Cho dung

dịch TBE ngập gel

Load mẫu vagraveo caacutec giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye vagrave 6 μl mẫu

Chạy điện di ở điều kiện 100 V 400 mA trong 20 phuacutet hoặc 60 V 250

mA thời gian khoảng 60 phuacutet nếu chạy chung với thang chuẩn

Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phuacutet

Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV Nếu mẫu coacute sản

phẩm thigrave băng sản phẩm sẽ phaacutet saacuteng dưới dạng vạch trecircn gel điện di Độ đậm

nhạt của băng điện di phản aacutenh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT-

PCR thu được

Đọc kết quả điện di

Gen NS5B với sản phẩm thu được lagrave băng điện di coacute kiacutech thước khoảng 449 bp

36 XỬ LYacute SỐ LIỆU

Số liệu dạng liecircn tục được phacircn tiacutech bằng trắc nghiệm F So saacutenh tỉ lệ bằng

Chi bigravenh phương

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

27

Chương 4

KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

41 KẾT TỦA RNA Ở CAacuteC NỒNG ĐỘ LICL KHAacuteC NHAU

Chuacuteng tocirci thực hiện ly triacutech RNA từ mẫu laacutech dựa theo quy trigravenh của

Chomeszynski vagrave Sacchi (1987) vagrave thu tủa RNA bằng ethanol 100 kết hợp với

LiCl ở caacutec nồng độ 10 M 15 M 20 M 25 M Kết quả thu được ở bảng 41

Bảng 4 1 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Chỉ tiecircu Nồng độ LiCl

p 10 M 15 M 20 M 25 M

Tỉ số OD 189 plusmn 02 199 plusmn 02 208 plusmn 02 246 plusmn 02 023

Hagravem lượng RNA

(microgmicrol) 145 plusmn 02 161 plusmn 02 129 plusmn 02 107 plusmn 02 02

Số mẫu 5 5 5 5

189

145

199

161

208

129

246

107

0

05

1

15

2

25

1M 15M 2M 25M

Tỉ số OD

Hagravem lượng RNA (microgmicrol)

Biểu đồ 41 Tỉ số OD vagrave hagravem lƣợng RNA ở caacutec nồng độ LiCl

Kết quả bảng 41 cho thấy độ tinh sạch vagrave hagravem lượng RNA thu được ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau khocircng coacute sự khaacutec biệt coacute yacute nghĩa về phương diện thống kecirc

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

28

(P gt 005) Tuy nhiecircn sự khaacutec biệt ở thiacute nghiệm nagravey lagrave sản phẩm RT-PCR thu

được thể hiện ở higravenh 41

Higravenh 41 Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở caacutec nồng độ LiCl

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Kết tủa RNA bằng ethanol 100

2 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 10 M

3 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 15 M

4 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 20 M

5 Kết tủa RNA bằng ethanol 100 + LiCl 25 M

Từ kết quả thu được chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng sản phẩm khuếch đại ở caacutec

nồng độ LiCl khaacutec nhau thigrave khaacutec nhau băng sản phẩm điện di thu được rotilde dần vagrave

lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều nagravey coacute thể được giải

thiacutech do chất lượng RNA ly triacutech Từ higravenh 41 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5

(LiCl 25 M) rotilde nhất vagrave tạp iacutet nhất vagrave từ biều đồ 41 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao

nhất ở nồng độ LiCl 25 M Điều nagravey coacute thể giải thiacutech RNA thu được ở nồng độ

LiCl cao iacutet lẫn tạp hơn Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn nồng độ LiCl 25 M để kết tủa RNA

trong quaacute trigravenh ly triacutech mẫu

449 bp 500 bp

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

29

42 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG

Ở thiacute nghiệm nagravey chuacuteng tocirci thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq

khaacutec nhau lagrave 20 UI vagrave 25 UI mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng Kết quả thu

được ở bảng 42

Bảng 42 Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR

Số mẫu thực hiện Số mẫu thagravenh cocircng Tỉ lệ thagravenh cocircng

20 UI 5 5 100

25 UI 5 5 100

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu được ở 2 nồng độ Taq

Higravenh 42 Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq

Từ kết quả bảng 42 vagrave higravenh 42 cho thấy khocircng coacute sự khaacutec biệt giữa 2 phản

ứng ở 2 nồng độ Taq 20 UI vagrave 25 UI Vigrave vậy chuacuteng tocirci chọn phản ứng RT-PCR

với nồng độ Taq 20 UI giảm được lượng Taq phản ứng magrave chất lượng phản ứng

vẫn khocircng thay đổi giảm được chi phiacute phản ứng

449 bp

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

1 Ở nồng độ Taq 20 UI

2 Ở nồng độ Taq 25 UI

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

30

43 SO SAacuteNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR

Bảng 43 Tỉ số OD của ELISA vagrave kết quả RT-PCR

Số thứ tự Kiacute hiệu mẫu Kết quả OD của ELISA Kết quả RT-PCR

1 20 1399 +

2 22 0596 -

3 23 0613 -

4 24 1656 -

5 25 0617 -

6 26 1579 -

7 27 0641 -

8 29 2248 +

9 30 3535 +

10 33 3268 +

11 37 3327 -

12 43 2751 +

13 45 1114 -

14 53 0953 -

15 54 0928 +

16 57 2746 +

17 60 3471 -

18 9 0492 -

19 11 1006 -

20 13 0726 -

21 14 0492 -

22 16 0727 -

23 17 1307 -

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

31

Chuacuteng tocirci so saacutenh kết quả RT-PCR với 3 khoảng tỉ số OD của ELISA lagrave từ

049 ndash 1 gt 1 - 2 vagrave gt 2 ndash 35 Kết quả so saacutenh được trigravenh bagravey ở bảng 44

Bảng 44 So saacutenh caacutec mức OD của ELISA vagrave RT-PCR

TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+)

049 ndash 1 1 10 11 9

gt 1 ndash 2 1 4 5 20

gt 2 ndash 35 5 2 7 71

TỔNG 7 16 23 304

SAI BIỆT THỐNG KEcirc P = 0018

Từ kết quả bảng 44 cho thấy kết quả RT-PCR phụ thuộc vagraveo tỉ số OD của

ELISA (P lt 005) Tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với RT-PCR cao (71) tương ứng với

mức tỉ số OD gt 2 ndash 35 Điều nagravey coacute thể giải thiacutech hagravem lượng khaacuteng nguyecircn coacute

trong mẫu xeacutet nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD của ELISA Hầu hết ở caacutec khoảng tỉ

số OD đều coacute mẫu dương tiacutenh với RT-PCR tuy nhiecircn tỉ lệ () mẫu dương tiacutenh với

RT-PCR so với tổng số mẫu dương tiacutenh với ELISA khocircng cao Điều nagravey một mặt

coacute thể do ảnh hưởng yếu tố OD trong ELISA mặt khaacutec do ảnh hưởng caacutec yếu tố bất

cập trong quaacute trigravenh ly triacutech RNA (giai đoạn vortex giai đoạn phơi mẫu) bảo quản

mẫu cũng như caacutec yếu tố bất lợi của mocirci trường lagravem việc coacute thể đatilde taacutec động đến sự

phacircn hủy RNA trước khi bước vagraveo giai đoạn RT-PCR

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

32

44 MỐI LIEcircN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TIacuteCH

Bảng 4 5 Đặc điểm bệnh tiacutech caacutec mẫu RT-PCR dƣơng tiacutenh vagrave acircm tiacutenh

Cơ quan Bệnh tiacutech RT-PCR(+) RT-PCR (-)

n Tỉ lệ ( n Tỉ lệ ()

Da Xuất huyết 7 100 16 100

Thận

Xuất huyết

Sung huyết

Hoại tử điểm

Viecircm diacutenh

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

3

1

0

0

1

2

428

143

0

0

143

286

2

2

3

1

0

8

125

125

1875

625

0

50

Ruột giagrave Xuất huyết

Loeacutet cuacutec aacuteo

Khocircng biểu hiện

4

1

2

571

143

286

5

1

10

3125

625

625

Hạch

magraveng

treo ruột

Xuất huyết

Sưng

Sưng + xuất huyết

Sưng + tụ huyết

Khocircng biểu hiện

3

0

3

0

1

428

0

428

0

143

3

1

0

1

11

1875

625

0

625

6875

Bagraveng

quang

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

3

4

428

579

1

15

625

9375

Laacutech Xuất huyết

Nhồi huyết

Nhồi huyết + xuất huyết

Sưng+XH

Sưng+NH

Khocircng biểu hiện

1

5

0

1

0

0

143

714

0

143

0

0

4

9

1

0

1

1

25

5625

625

0

625

625

Van hồi

manh

tragraveng

Xuất huyết

Khocircng biểu hiện

4

3

579

421

2

14

125

875

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

33

Từ kết quả bảng 46 cho thấy caacutec mẫu dương tiacutenh với RT-PCR đều coacute biểu

hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết caacutec cơ quan (gt 42) so với caacutec bệnh tiacutech khaacutec

tuy nhiecircn ở laacutech biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao hơn (714) Đồng

thời ở caacutec mẫu RT-PCR acircm tiacutenh biểu hiện bệnh tiacutech nhồi huyết ở laacutech cũng chiếm tỉ

lệ cao 5625 nhưng caacutec bệnh tiacutech khaacutec rải raacutec chiếm tỉ lệ khocircng cao Vigrave vậy

chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng bệnh DTH thường biểu hiện bệnh tiacutech xuất huyết ở hầu hết

caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với những biểu hiện bệnh tiacutech

khocircng đều như sưng sung huyết loeacutet cuacutec aacuteohellip ở caacutec cơ quan

Thocircng thường độ chuẩn cao virus được quan saacutet trong laacutech xương những

hạch bạch huyết nội tạng vagrave những cấu truacutec dạng bạch huyết ở magraveng treo ruột non

(Artois vagrave ctv 2002) Theo quan saacutet trong khi lagravem thiacute nghiệm hầu hết caacutec mẫu bệnh

phẩm dương tiacutenh lagrave mẫu laacutech coacute nhồi huyết quanh rigravea laacutech Vigrave vậy chuacuteng tocirci cho

rằng mẫu laacutech thiacutech hợp dugraveng lagravem mẫu bệnh phẩm trong chẩn đoaacuten DTH Ngoagravei ra

từ bảng 46 cho thấy ở hạch magraveng treo ruột biểu hiện xuất huyết tỉ lệ cao (856) ở

caacutec mẫu chẩn đoaacuten dương tiacutenh trong khi ở caacutec mẫu acircm tiacutenh tỉ lệ thấp hơn (25)

Do đoacute chuacuteng tocirci nhận xeacutet rằng ngoagravei mẫu laacutech thigrave hạch magraveng treo ruột cũng được

xem lagrave mẫu thiacutech hợp dugraveng trong chuẩn đoaacuten bệnh DTH

Higravenh 4 3 Kết quả sản phẩm RT-PCR caacutec mẫu bệnh phẩm

Chuacute thiacutech

L Thang chuẩn (100 bp)

C Đối chứng (+) (cung cấp bởi

Trung tacircm Thuacute y vugraveng thagravenh

phố Hồ Chiacute Minh)

1 2 3 4 Caacutec mẫu coacute virus DTH

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

34

Chương 5

KẾT LUẬN VAgrave ĐỀ NGHỊ

51 KẾT LUẬN

(1) Xaacutec định được quy trigravenh taacutech chiết RNA thiacutech hợp từ mẫu laacutech Nồng độ

LiCl 25 M cho tủa RNA với độ tinh sạch vagrave chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

(2) Đưa ra được quy trigravenh RT-PCR một bước phaacutet hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 25 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại khocircng thay đổi

(3) Mức tỉ số OD của ELISA của caacutec mẫu lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR

dương tiacutenh cao

(4) Kết hợp được những đặc điểm bệnh tiacutech thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

thocircng qua kết quả chẩn đoaacuten RT-PCR dương tiacutenh(bệnh tiacutech xuất huyết ở

hầu hết caacutec cơ quan kết hợp với nhồi huyết ở laacutech cugraveng với một số biểu hiện

bệnh tiacutech khaacutec)

52 ĐỀ NGHỊ

(1) Thực hiện thecircm nhiều thử nghiệm trong quaacute trigravenh ly triacutech cũng như trong

phản ứng RT-PCR phaacutet hiện virus nhằm tạo ra được một quy trigravenh chẩn đoaacuten

tối ưu nhất ứng dụng trong thực tiễn chẩn đoaacuten bệnh DTH nhanh iacutet tốn keacutem

nhất

(2) Tiến hagravenh xaacutec định trigravenh tự nucleotide của sản phẩm khuếch đại để khẳng

định chiacutenh xaacutec virus DTH Đồng thời so saacutenh trigravenh tự của virus phacircn lập

được với trigravenh tự của caacutec chủng virus đatilde phacircn lập coacute trong dữ liệu NCBI

nhằm định chủng virus DTH hiện nay ở nước ta

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

35

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO

Tagravei liệu tiếng Việt

1 Bugravei Chiacute Bửu vagrave Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phacircn tử - Những

nguyecircn tắc cơ bản trong chọn giống cacircy trồng Nhagrave xuất bản Nocircng

Nghiệp trang 195 ndash 209

2 Bugravei Nghĩa Vượng Ken Inui Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn

đoaacuten bệnh dịch tả heo bằng phương phaacutep RT-PCR với mẫu maacuteu lấy bằng

giấy thấm Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2002 Sinh Học Phacircn Tử (Khaacutei niệm ndash Phương

phaacutep - Ứng dụng) Taacutei bản lần 2 NXB Giaacuteo Dục Thagravenh Phố Hồ Chiacute

Minh

4 Hồ Thu Hương Ken Inui Bugravei Trọng Nghĩa Đagraveo Thanh Vacircn Nguyễn

Thuyacute Duyecircn Kenji Kawashima vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004 So saacutenh 4

phương phaacutep chuẩn đoaacuten virut dịch tả heo từ mẫu được bảo quản ở caacutec

điều kiện khaacutec nhau Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp PTNT 13-16

5 Kim Văn Phuacutec Đặng Hugraveng Phạm Thị Vui Chris Morrissy Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Thu Hồng Trần Đigravenh Từ 2004 Nghiecircn cứu ứng

dụng kỹ thuật RT-PCR để phaacutet hiện virus dịch tả heo Baacuteo caacuteo khoa học

Chăn nuocirci Thuacute y Bộ NN amp PTNT 360-367

6 Nguyễn Thế Vinh Ken Inui Hồ Thu Hương vagrave Nguyễn Tiến Dũng 2004

Phacircn tiacutech di truyền virus dịch tả lợn ở Việt Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn

nuocirci Thuacute y Bộ NNamp PTNT 10-13

7 Nguyễn Thị Phương Duyecircn Đỗ Văn Khuyecircn Dư Đigravenh Quacircn 2001 Khảo

saacutet hội chứng sốt taacuteo boacuten bỏ ăn đến chết ở đagraven lợn sinh sản vagrave đagraven lợn

con tỉnh Khaacutenh Hoagrave vagrave Quảng Ngatildei Baacuteo caacuteo khoa học CNTY Bộ NN amp

PTNT 10-1242001

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

36

8 Nguyễn Tiến Dũng 1999 Dịch tả lợn cổ điển luocircn lagrave vấn đề thời sự Tigravenh

higravenh hiện tại về bệnh đaacuteng sợ nagravey Tạp chiacute khoa học kỹ thuật Thuacute y tập 4

21999

9 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Văn Quang Hồ Thu Hương Ngocirc Thanh

Long Đagraveo Thanh Vacircn Tigravenh higravenh nhiễm bệnh virut trong đagraven tracircu bograve Việt

Nam Baacuteo caacuteo khoa học Chăn nuocirci Thuacute y 2002-2003

10 Phan Cự Nhacircn 2001 Di truyền học động vật Nhagrave xuất bản Khoa Học vagrave

Kỹ Thuật Hagrave Nội

Tagravei liệu tiếng Anh

11 Akemi Kamakawa Ho Thi Viet Thu Shunji Yamada Masanori Kubo

Seishi Yamasaki vagrave Toshiaki Taniguchi 2003 Classical swine fever

among pig herds and its control in Cantho province Mekong delta

Department of Veterinary Medicine Faculty of Agriculture Can Tho

University

12 Artois M KR Depner V Guberti J Hars vagrave S Rossi 2002 Classical

swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int

Epiz 2002 21 (2) 287-303

13 Brett D Lindenbach Heinz-Jurgen Thiel vagrave Charles M R 2007

Flaviviridae The viruses and their replication Fields Virology 5th

Edition D M Knipe and P M Howley Eds Lippincott-Raven

Publishers Philadelphia (2007)

14 Chomczynski and Sacchi 1987 Single-step method of RNA isolation by

acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical

Biochemistry 162 156-159

15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis Technical

Part 32002

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

37

16 Harding M 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog

cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10) 2600-2602

17 Joseph Sambrook vagrave David W Russell 2001 Molecular cloning Cold

Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York

18 Paton D J A McGoldrick S Belak C Mittelholzer F Koenen H

Biagetti G M De Mia T Stadejek M A Hofmann B Thuer 2000

Classical swine fever virus a ring test to evaluate RT-PCR detection

methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174

19 Paton D J McGoldrick A Greiser-Wilke I Parchariyanon S Song

J Liou P P Stadejek T Lowings J P Bjorklund H and Belak S

2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary

Microbiology 73 137-157

20 Pereda J A 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus

(CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus

Research 110 111-118

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

PHỤ LỤC

Kết quả phacircn tiacutech thống kecirc thiacute nghiệm 1

Kết quả phacircn tiacutech tỉ số OD

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data ODMOD

Level codes ODMT

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9123689 3 3041230 1576 2342

Within groups 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 40006538 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for ODMOD - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AODMT 9123689 3 3041230 1576 2342

RESIDUAL 30882848 16 1930178

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 40006538 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for ODMOD

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 21042500 0982389 18959411 23125589

AODMT

1 5 18902000 1964779 14735822 23068178

15 5 19896000 1964779 15729822 24062178

2 5 20822000 1964779 16655822 24988178

25 5 24550000 1964779 20383822 28716178

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

Multiple range analysis for ODMOD by ODMT

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 5 18902000 X

15 5 19896000 X

2 5 20822000 X

25 5 24550000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -009940 058919

1 - 2 -019200 058919

1 - 25 -056480 058919

15 - 2 -009260 058919

15 - 25 -046540 058919

2 - 25 -037280 058919

-------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech hagravem lƣợng RNA

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data HLRRNA4

Level codes HLRN

Labels

Means plot LSD Confidence level 95 Range test LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 7887456 3 2629152 1654 2168

Within groups 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 33326432 19

0 missing value(s) have been excluded

Analysis of Variance for HLRRNA4 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares df Mean square F-ratio Sig level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

AHLRN 7887456 3 2629152 1654 2168

RESIDUAL 25438976 16 1589936

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 33326432 19

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded

All F-ratios are based on the residual mean square error

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114

Table of Least Squares Means for HLRRNA4

--------------------------------------------------------------------------------

95 Confidence

Level Count Average Stnd Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 20 13588000 0891610 11697403 15478597

AHLRN

1 5 14512000 1783220 10730806 18293194

15 5 16144000 1783220 12362806 19925194

2 5 12928000 1783220 9146806 16709194

25 5 10768000 1783220 6986806 14549194

--------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for HLRRNA4 by HLRN

--------------------------------------------------------------------------------

Method 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

25 5 10768000 X

2 5 12928000 XX

1 5 14512000 XX

15 5 16144000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +- limits

1 - 15 -016320 053474

1 - 2 015840 053474

1 - 25 037440 053474

15 - 2 032160 053474

15 - 25 053760 053474

2 - 25 021600 053474

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference

Kết quả phacircn tiacutech khảo saacutet 3

Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)

---------------------------------------------------------------------

Chi-square DF Significance

---------------------------------------------------------------------

818015 2 00167380

WARNING Expected values in 5 cells lt 5 and 1 cells lt 2

With rows With columns

Statistic Symmetric dependent dependent

---------------------------------------------------------------------

Lambda 036842 033333 042857

Uncertainty Coeff 021425 017003 028957

Somers D -051613 -064286 -043114