Pemisahan dan PemurnianSenyawa dari Bahan Alam

Pinus Jumaryatno, S.Si., MPhil., PhD., Apt

Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Islam Indonesia2014

Tujuan Pembelajaran

Mahasiswa memahami prinsip separasi dan purifikasisenyawa aktif dari bahan alam beserta mekanismenyadengan metode kromatografi

Mahasiswa memahami urgensi kemurnian senyawadari bahan alam serta parameter-parameter penentukemurnian senyawa

Pokok Bahasan

Prinsip kromatografiPemilihan fase gerak dan fase diamPrinsip dan mekanisme pemisahan denganmetode komatografi

Kromatografi Lapis TipisFlash Column ChromatographyVacuum Liquid ChromatographyKLT PreparatifKromatografi RadialHigh Pressure Liquid Chromatography

Pendahuluan

Prosedur Isolasi Senyawa AktifTumbuhan

Organisme Laut

Ekstrak

Fraksi

Senyawa

Ekstraksi

Fraksinasi

Identifikasi

Purifikasi

Sejarah KromatografiPada tahun 1905, W. Ramsey melakukan pemisahancampuran gas dan uap dari suatu adsorben seperti batubara → kromatografi adsorbsiPada tahun 1908, Mikhail Tsweet, seorang botanist dariRusia, menggunakan suatu teknik untuk memisahkanpigmen tanamanTeknik tersebut oleh Tsweet disebut dengankromatografi karena hasil analisanya “tertulis” dalambentuk warna sepanjang kolom pengadsorbsiKromatografi berasal dari kata:

Chroma berarti warnaGraphein berarti menulis

Pengertian dan Prinsip KromatografiKromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran senyawa-senyawa kimia berdasarkan perbedaan migrasi dari masing-masingkomponen campuran yang terpisah pada fase diam di bawah pengaruhpergerakan fase gerak

Separate• Analyze

• Identify

• Purify

• QuantifyComponentsMixture

Works by allowing the molecules present in the mixture to distribute themselves between a stationary and a mobile medium.Molecules that spend most of their time in the mobile phase are carried along faster

Klasifikasi KromatografiBerdasarkan fase geraknya, kromatografi dapat dibagi menjadi

1. Kromatografi Cair

Fase gerak: Cairan (liquid)

Misal: LC, HPLC

2. Kromatografi Gas

Fase gerak : Gas

Misal: GC

Klasifikasi Kromatografi

Berdasarkan kemasan fase diamnya, kromatografi dapat dibagi menjadi

1. Kromatografi Lapis Tipis

2. Kromatografi Kertas

3. Kromatografi Kolom

Klasifikasi Kromatografi

Berdasarkan cara pemisahannya, kromatografi dapat dibagi menjadi

1. Kromatografi Adsorpsi

2. Kromatografi Partisi

3. Kromatografi Penukar Ion

4. Kromatografi Filtrasi Gel

5. Kromatografi Afinitas

Adsorption ChromatographyAdsorption chromatography is probably one of the oldest types of chromatography around. It utilizes a mobile liquid or gaseous phase that is adsorbed onto the surface of a stationary solid phase. The equilibriation between the mobile and stationary phase accounts for the separation of different solutes.

Partition ChromatographyThis form of chromatography is based on a thin film formed on the surface of a solid support by a liquid stationary phase. Solute equilibriates between the mobile phase and the stationary liquid.

© 1997 Kevin Yip - Introduction to Biochemical Engineering

Ion Exchange ChromatographyIn this type of chromatography, the use of a resin (the stationary solid phase) is used to covalently attach anions or cations onto it. Solute ions of the opposite charge in the mobile liquid phase are attracted to the resin by electrostatic forces.

Molecular Exclusion ChromatographyAlso known as gel permeation or gel filtration, this type of chromatography lacks an attractive interaction between the stationary phase and solute. The liquid or gaseous phase passes through a porous gel which separates the molecules according to its size. The pores are normally small and exclude the larger solute molecules, but allows smaller molecules to enter the gel, causing them to flow through a larger volume. This causes the larger molecules to pass through the column at a faster rate than the smaller ones.

© 1997 Kevin Yip - Introduction to Biochemical Engineering

Affinity ChromatographyThis is the most selective type of chromatography employed. It utilizes the specific interaction between one kind of solute molecule and a second molecule that is immobilized on a stationary phase. For example, the immobilized molecule may be an antibody to some specific protein. When solute containing a mixture of proteins are passed by this molecule, only the specific protein is reacted to this antibody, binding it to the stationary phase. This protein is later extracted by changing the ionic strength or pH.

© 1997 Kevin Yip - Introduction to Biochemical Engineering

Keterangan:GSC : Gas Solid ChromatographyGLC: Gas Liquid ChromatographyLSC : Liquid Solid ChromatographyLLC : Liquid liquid ChromatographyBPC : Bonded Phase ChromatographyIEC : Ion Exchange ChromatographySEC : Size Exclusion ChromatographyGPC : Gel permeation chromatographyGFC : gel-filtration chromatographyTLC : Thin layer ChromatographyPC : Paper Chromatography

Teori Pemisahan dalam Kromatografi

Pemisahan adsorpsi

Peristiwa adsorpsi oleh fase diam terhadap fasegerak dan linarut selalu terjadi kompetitif

Kemampuan fase diam mengadsorpsi keduanyasangat tergantung terhadap topografi gugus aktifyang terdapat pada masing-masing komponen

Fase diam dari silika yang mengandung gugushidroksi dari silanol (Si-OH) dapat terjadi interaksidengan gugus pada linarut maupun fase gerak

• Contoh interaksi antara analit (senyawa aromatik) dansilika (fase diam)

Peristiwa adsorbsi umumnya terjadi padakromatografi padat cair (liquid solid chromatography, atau LSC, terjadi pada KLT).Dapat pula terjadi pada Gas solid chromatography atau Kromatografi gas (KG) yang berinteraksi antara fase diam danlinarutnyaFase gerak pada kromatografi gas, tidakmempunyai gugus aktif yang dapat berinteraksidengan fase diam

Teori Pemisahan dalam Kromatografi

Pemisahan partisiPemisahan cara partisi sangat erat kaitannyadengan kelarutan senyawa dalam pelarut

Dalam kromatografi yang didasarkan pada kelarutanlinarut dalam fase diam maupun fase gerak, makaterdapat istilah koefisien partisi, yang peristiwanyaakan mengembang menjadi koefisien distribusidimana umumnya berlaku pada kromatografi

Koefisien partisi dapat dinyatakan sebagaiperbandingan kadar (kelarutan) linarut dalam fasediam dengan kadar (kelarutan) linarut dalam fasegerak

Pemilihan Fase Diam dan Fase Gerak

Fase Diam (Stationary Phase)Disesuaikan dengan sampel yang akandikromatografi dan teknik kromatografi yang akandipergunakan

Fase Gerak (Mobile Phase)Prinsip Like disolve Like

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Pendahuluan

KLT diperkenalkan oleh Schraiber dan Izmailovpada tahun 1938

KLT adalah suatu teknik pemisahan campuranmenjadi komponennya berdasarkan perbedaanmigrasi masing-masing komponennya dalamfase diam akibat pengaruh dari fase gerak

Prinsip KLT

Memisahkan senyawa dalam campuran berdasarkanperbedaan kepolaran (like dissolves like)

Mekanisme pemisahan:AdsorpsiPartisi

Fungsi KLT

Analisa kualitatif senyawa organik(identifikasi dan cek kemurnian)Analisa kuantitatifIsolasi satu senyawa dari campuransenyawa (Isolasi skala preparatif)

Keuntungan KLTLow costShort analysis timeEase of sample preparationAdaptable to most pharmaceuticals

Organic (cellulose, polyamide)Inorganic (silica, alumina)Polar (diol, aminopropyl)Non polar (C18/RP18)Different densities of silicaDifferent surface characteristics

Uses small quantities of solventsRequires minimal trainingReliable and quickMinimal amount of equipment is neededPlate is used only onceMultidimensional

KLT Kualitatif

Analisis hasil pengembangan KLT (jumlahspot dan harga Rf senyawa)Membandingkan posisi spot dengan senyawastandarVisualisasi khusus

Misal: disemprot dengan ninhidrin, senyawayang mengandung gugus asam amino akanmenunjukkan spot warna kuning jingga

KLT KuantitatifKLT Kuantitatif, dilakukan pendekatan dengan:

Analisa langsung pada plat, dengan :Charring secara standar, kemudian digunakan densitometer untuk menentukan kuantitasnyaPengukuran radioaktivitasnya, khususnya senyawa yang ditandai dengan radioaktifDengan neutron activation analysis

Gravimetri : masing-masing komponen diisolasi, diekstrak, diuapkan dan ditimbang.

Menganalisis elemen-elemen spesifik atau gugus fungsionaldengan spektrofotometer.

KLTFase Gerak dan Fase Diam

Fase GerakSolven tunggal atau campuran

Fase DiamUmumnya silika gel, tetapi dapat jugaselulosa, kieselguhr, aluminium oksidaPada normal phase (fase normal) fasediamnya bersifat polarPada reverse phase (fase terbalik) fasediamnya bersifat non polar

Fase Diam pada KLT

Pada Fase Diam KLT Normal Phase1. Silika Gel

Sifat: sedikit asam, bebas air, diikat olehkalsium fosfat (gipsum G), polar

2. Alumina (Aluminium Oksida)Sifat: sedikit basa, polar, memiliki aktivitaspenjerapan yang tinggi

Fase Diam pada KLT3. Kieselguhr

Asam silika amorf, berasal dari kerangka diatomeaemaka lebih dikenal dengan nama tanah diatomeae, kurang bersifat adsorptif dibandingkan dengan silika

4. Magnesium SilikatNama lain dalam perdagangan dikenal dengannama fluoresil

5. SelulosaSering dipakai untuk pemisahan senyawa flavonoid

Kode Fase Diam pada plat KLT

Si atau Sil Mengandung silika60 Ukuran poriF atau UV Mengandung indikator fluoresensi254 atau 366 Setelah simbol F atau UV untuk menunjukkan

panjang gelombang eksitasi indikator fluoresensiG Pengikat gipsum (kalsium sulfat)H atau N Tanpa pengikatRP Reversed Phase, silika yang dimodifikasi dengan

hidrokarbon2, 8, 18 Panjang rantai karbon yang diikatkan pada silikaP Untuk preparatifW Untuk densitas silika paling rendah

Fase Gerak

Berupa solvent tunggal maupun campuran.

Pemilihan sistem pelarut atas dasar like dissolves like, misalnya untuk memisahkan lipida digunakan sistem pelarutheksan : eter : asam asetat = 80 : 20 : 1

Untuk memperoleh hasil pemisahan yang optimal diperlukanbeberapa kali uji coba.

Kekuatan fase gerak : eluent strength (ε)

Menggambarkan kemampuan FG untuk mengelusikomponen (pada sistem normal phase). Semakin tinggi nilaiε maka jarak elusi akan semakin besar

Analit

Chamber (Bejana KLT)

Prinsip kerja pada analisisdengan KLT

Penotolan sampelGunakan luas plat sesuai kebutuhanBuat garis dengan jarak 8 – 10 mm (u/ plat mikro) dan 1,5 – 2,0 cm (u/ plat makro) dari dasar plat.Sampel dilarutkan dalam zat pelarut yang mudah menguapLarutan sampel ditotolkan pada plat menggunakan pipet mikro atausyringe dan dibiarkan mengering sebelum penotolan berikutnyadikerjakan.Jumlah sampel yang diteteskan dapat berkisar antara 5-100µg darilarutan 0,1 %Pengeringan tetesan sampel menggunakan gas N2 untukmencegah terjadinya kerusakan sampel karena oksidasi.

Prinsip kerja pada analisisdengan KLT

Pengembangan

Menggunakan wadah tertutup yang telah dijenuhi oleh fasegerak (pelarut/solvent).

Mencelupkan dasar plat yg telah ditetesi sampel dalamsistem pelarut. Bercak totolan jangan sampai terendam

Pengembangan diakhiri bila ujung zat pelarut pada plat telahmencapai ± ¾ tinggi adsorben

Pengeringan plat dg aliran gas N2

Metode PengembanganPengembangan satu dimensi

Berjalan satu arah dengan satu macam sistem pelarutPengembangan dua dimensi

Dikerjakan 2 arahSampel di teteskan di pojok kanan bawah ( 2 cm darikanan & bawah) untuk plat 20 x 20 cmSetelah pengembangan I selesai, plat dikeringkan dg gas N2Setelah kering, plat dikembangkan lagi dg menggunakan sistem pelarut yang ke II dg memutarplat 90o.

Metode PengembanganPengembangan ganda

Dikerjakan searah (1 dimensi) dan dilaksanakan beberapa tahap(umumnya 2 tahap)Sistem pelarut yg digunakan berbedaMasing-masing tahap pengembangan diakhiri dengan pengeringansebelum dilakukan pengembangan berikutnya.

Misal: Pemisahan lipida netral dan lipida polar . Pengembang I = kloroform : metanol : aquades = 60 : 25 : 4, dihentikan setelahpermukaan pelarut mencapai 10 cm. Setelah pengeringan, dikembangkan lagi dengan sistem pelarut Heksan : Eter = 4 : 1.

••••

The ratio of distance travelled by the component (from origin) compared with the distance travelled by the solvent front (from origin) is called the Rf value.

Solvent frontSolvent frontx

a

bc

Rf of = a/x

Rf of = b/x

Rf of = c/x

Menghitung nilai Rf

Visualisasi dan IdentifikasiVisualisasi

Untuk melihat komponen penyusun yang telahterpisah setelah proses pengembanganAda dua macam teknik

Destruktif – akan “merusak” sampel secarairreversibelNon Destruktif – baik untuk KLT preparatif danisolasi

IdentifikasiMembandingkan posisi spot dengan senyawastandarVisualisasi khusus

Reagen UmumUap iodium

Spot akan berwarna coklat dg dasar putihTidak merusak komponen yg telah terpisahDapat digunakan untuk semua senyawa organik yang tidak jenuh(dengan ikatan rangkap)

Sinar UVmemberikan fluoresensi pada platsifatnya non destruktif

Charring (Pengarangan)Penyemprotan plat dengan larutan H2SO4/K2Cr2O7 kemudiandipanaskan pd suhu 125oCZat organik akan mengalami oksidasi menjadi karbon yang berwarnahitam

H2SO4 pekatsenyawa organik akan menjadi spot hitam

H2SO4 - Na2Cr2O7

senyawa organik akan menjadi spot hitamH2SO4 - K2Cr2O7

senyawa organik akan menjadi spot hitamH2SO4 – HNO3

senyawa organik akan menjadi spot hitamHClO4

senyawa organik akan menjadi spot hitamIodium

senyawa organik akan menjadi spot coklat

Untuk mendeteksi secara kualitatif & mengenaladanya gugus tertentu dalam senyawa yang dipisahkan.Reagensia ini bersifat destruktif

Reagen Spesifik

• Anilin pthalat• Spot yang terdiri dari gula-gula reduksi akan memberikan berbagai

warna• Anisaldehid dalam H2SO4 dan HOAc

• Senyawa ini untuk menunjukkan adanya karbohidrat.• Karbohidrat menunjukkan warna biru

• Antimon triklorida dalam CHCl3• Senyawa ini mendeteksi adanya senyawa steroid, steroid

glikosida,lipida alifatik dan vitamin A• Zat tersebut dengan UV akan menunjukkan berbagai warna tertentu

• Bromokresol jambon• Untuk pengenalan ion-ion halogen kecuali F & asam dikarboksilat• Senyawa tersebut akan menunjukkan warna kuning atau jingga

Reagen Spesifik

• Bromokresol hijau• Pengenal asam karboksilat• Senyawa tersebut akan memberikan warna kuning/jingga

• 2,4 Dinitrofenilhidrazin (2,4 DNPH)• Pengenal aldehid dan keton yg akan membentuk warna kuning

sampai kemerahan.

• Reagensia Dragendorff• Pengenal berbagai alkaloid dan basa organik (memberikan warna

orange)

• Feri Klorida• Senyawa fenol & menunjukkan berbagai warna.

Reagen Spesifik

• Fluorescein-Br2• Pengenal senyawa organik tidak jenuh (dengan UV akan

menunjukkan warna tertentu)• 8-Hidroksiquinolin-NH3

• Pengenal kation anorganik (dengan UV akan terlihatberbagai warna)

• Ninhidrin• Gugus amino akan berwarna biru.

Reagen Spesifik

• Reagen fosfomolibdat untuk deteksi senyawaterpenoid dan warna yang dihasilkan adalahhijau kebiruan.

• Reagen H2SO4 untuk deteksi senyawaterpenoid yang akan menghasilkan warna spot coklat, hijau, kuning, merah atau biru. Padaperlakuan H2SO4 50% kemudian dipanaskansuhu 100-110oC selama 5 menit,menghasilkanspot coklat

Problem pada KLT

OvermigrationUndermigrationDistorted spotNo separationTailing